專利名稱：一種從橄欖葉提取橄欖苦甙和穗花杉雙黃酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物化學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從橄欖葉中分離提取高純度橄欖苦甙和穗花杉雙黃酮的方法。
背景技術(shù)：
油橄欖(Olea europaea L.),又稱洋橄欖、齊墩果,為木犀科(Oledceae)木犀欖屬(Olea L)植物，昌世界名貴常綠木本油料和果用樹種。油橄欖原產(chǎn)小亞細(xì)亞，經(jīng)引種進(jìn)入我國，現(xiàn)有油橄欖面積約50萬畝。油橄欖以葉和果實(shí)入藥用于治療多種疾病，橄欖葉的煎劑或浸劑在地中海國家常作為糖尿病的民間用藥，有一定的療效。油橄欖葉提取可用做膳食補(bǔ)充劑以增強(qiáng)免疫功能。 現(xiàn)有資料表明油橄欖具有抗心率不齊，抗真菌，抗高膽固醇，降血糖，降血壓，抗炎，抗氧化，抗病毒，利尿等多種藥理活性。從油橄欖葉中分離得到的化學(xué)成分可分為黃酮類、糖類、萜類、有機(jī)酸類及其它化合物。橄欖苦昔的藥理作用主要有降血壓、抗氧化、抗微生物和抗癌等作用。橄欖葉中還含有穗花杉雙黃酮，依賴性地清除二苯代苦味酰肼(DPPH)自由基，并能顯著減輕溶血性磷脂酰膽堿(LPC)所致的ECV304細(xì)胞損傷。穗花杉雙黃酮可通過抑制轉(zhuǎn)錄因子NF- K B的活化，抑制一氧化氮合酶的誘導(dǎo)生成，從而發(fā)揮抗炎活性，另外還具有體外降糖的效果。目前國內(nèi)有報(bào)道用橄欖葉提取加工橄欖葉提取物，但大多采用簡單水提或醇提后直接噴霧干燥成分，產(chǎn)品中橄欖苦甙、總酚及黃酮含量低。在2007年《青橄欖葉的化學(xué)成分研究》文獻(xiàn)中報(bào)道了從橄欖葉分離到了穗花杉雙黃酮。王成章也報(bào)道了橄欖苦甙在橄欖葉中比果實(shí)和樹皮中含量要高得多。公開號(hào)為CN101955503A的中國專利介紹了一種橄欖苦甙的制備方法，取多花素馨花作為原料，采用超臨界CO2萃取技術(shù)進(jìn)行提取，有機(jī)溶劑萃取，大孔樹脂吸附分離，濃縮過濾，結(jié)晶重結(jié)晶得到橄欖苦甙。此方法因?yàn)樵牧鲜腔ú糠?，對大?guī)模制備橄欖苦甙有一定難度，另外，在目前生產(chǎn)過程中超臨界CO2萃取技術(shù)很少應(yīng)用，主要是一次投料生產(chǎn)量小，生產(chǎn)設(shè)備成本過高，所以這一技術(shù)很難應(yīng)用于生產(chǎn)。公開號(hào)為CN102060893A的中國專利介紹了一種從油橄欖葉中同步制備橄欖苦苷和橄欖總黃酮的工藝方法，雖然采用了大孔吸附樹脂串聯(lián)吸附、梯度解吸附，分離開了大部分的物質(zhì)，但將解吸液回收有機(jī)溶劑后直接噴霧干燥，分別得到較高含量的橄欖苦苷和橄欖總黃酮提取物產(chǎn)品。此方法分離過程太長，造成其有效成分得率過低，另外將解吸液直接噴霧干燥，解吸液中金屬離子以鹽的形式存在于產(chǎn)品中，其它雜質(zhì)也會(huì)降低其有效成分含量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括干燥過后的油橄欖葉經(jīng)用乙醇溶液提取、過濾、減壓濃縮，萃取，然后用樹脂吸附、乙醇洗脫、將洗脫液濃縮，結(jié)晶與重結(jié)晶制得橄欖苦甙和穗花杉雙黃酮純品。
因此，本發(fā)明提供一種從橄欖葉提取橄欖苦甙和穗花杉雙黃酮的方法，步驟包括(I)粉碎橄欖葉，并將橄欖葉、60%乙醇按重量(kg) /體積比(L) =1:1-8進(jìn)行混合，加熱至50°C左右進(jìn)行回流提?。?2)過濾除渣后，在50°C減壓濃縮至無乙醇味；(3)將濃縮液用2-3倍體積的乙酸乙酯分三次進(jìn)行萃取，分離得到三次乙酸乙酯層萃取液，合并其萃取液，并在50°C將其萃取液進(jìn)行減壓濃縮，直至獲得干燥物；(4)將干燥物用等重量水進(jìn)行溶解，上H—103大孔樹脂進(jìn)行吸附，用40%乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液I，再用70%乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液II ；
(5)將洗脫液I進(jìn)行減壓濃縮至原有體積的1/4-1/5，加入三倍體積的無水乙醇進(jìn)行結(jié)晶和重結(jié)晶，得橄欖苦甙；(6)將洗脫液II進(jìn)行減壓濃縮至原有體積的1/5-1/6，加入二倍體積的丙酮進(jìn)行結(jié)晶和重結(jié)晶，得穗花杉雙黃酮。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟⑵的回流提取時(shí)間為5小時(shí)至18小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(2)的過濾過程是紗布過濾、陶瓷膜過濾。其中，優(yōu)選是三層紗布過濾2次、陶瓷膜過濾I次。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(5)、(6)中進(jìn)行結(jié)晶和重結(jié)晶時(shí)結(jié)晶溫度在低溫下進(jìn)行，優(yōu)選是在4 °C左右。技術(shù)效果I、本發(fā)明方法中所用的原料、設(shè)備均為常見的普通原料、設(shè)備，避免了工業(yè)化生產(chǎn)過程中對于昂貴原材料、儀器的依賴，大大地降低了生產(chǎn)成本。2、本發(fā)明所用的試劑均為無毒、廉價(jià)、量產(chǎn)的化學(xué)試劑，整個(gè)過程中可利用成熟的試劑回收的常規(guī)技術(shù)，這極大地降低了向環(huán)境排放廢棄物。3、經(jīng)過長期摸索，本發(fā)明確定了采用高濃度乙醇在低溫條件下進(jìn)行結(jié)晶，橄欖苦甙的純度是最高，可達(dá)到97. 37-98. 23%。4、由于能同時(shí)提取出橄欖苦甙和穗花杉雙黃酮，極大地降低了其生產(chǎn)成本，又節(jié)約了橄欖葉資源。


圖I :橄欖苦甙標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC曲線圖，其中縱坐標(biāo)表示峰面積，橫坐標(biāo)表示分離時(shí)間。圖2:從橄欖葉中提取的橄欖苦甙的純度HPLC曲線圖，其中縱坐標(biāo)表示峰面積，橫坐標(biāo)表示分離時(shí)間。圖3 :穗花杉雙黃酮純品的C-NMR譜圖4 :穗花杉雙黃酮純品的H-NMR譜
具體實(shí)施例方式下面，本發(fā)明將用實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步的說明，但是它并不限于這些實(shí)施例的任一個(gè)或類似實(shí)例。
實(shí)施例I稱取IOOkg橄欖葉，普通粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，加入400L的60%乙醇進(jìn)行混合，加熱至50°C左右進(jìn)行回流提取10小時(shí)后，采用三層紗布過濾2次、陶瓷膜過濾I次；進(jìn)行過濾除渣后，在50°C減壓濃縮至無乙醇味，得濃縮液80L ;將濃縮液用200L的乙酸乙酯分三次進(jìn)行萃取，分離得到三次的乙酸乙酯層，合并乙酸乙酯萃取液220L，將其萃取液進(jìn)行50°C減壓濃縮，直至獲得干燥物2. 65kg ;將干燥物用2. 65kg水進(jìn)行溶解，上H —103大孔樹脂進(jìn)行吸附，用40%乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液I 40L，再用70%乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液
II30L ;將洗脫液I進(jìn)行減壓濃縮至8L，加入24L的無水乙醇在4°C進(jìn)行結(jié)晶和重結(jié)晶，得橄欖苦甙I. 17kg ;將洗脫液II進(jìn)行減壓濃縮至5L，加入IOL的丙酮在4°C進(jìn)行結(jié)晶和重結(jié)晶，得穗花杉雙黃酮0. 36kg。所得重結(jié)晶樣品進(jìn)行純度，其檢測儀器為AgilentllOO高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，色譜柱為Shim-pack ODS C18柱(4. 6 X 150mm，5 y m)，流動(dòng)相為0. 2%磷酸溶液一乙睛(79:21，V/V)，檢測波長254nm ;柱溫30°C ;流速1. OmL/min ;上樣量為10 u L，檢測所得到橄欖苦甙的純度為98. 43%。流動(dòng)相為0. 5%磷酸二氫鈉溶液一甲醇(40:60, V/V)，檢測波長330nm ;柱溫30°C ;流速1. OmL/min ;上樣量為IOy L，檢測所 得到穗花杉雙黃酮的純度為97. 68%。實(shí)施例2稱取200kg橄欖葉，普通粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，加入600L的60%乙醇進(jìn)行混合，加熱至50°C左右進(jìn)行回流提取10小時(shí)后，采用三層紗布過濾2次、陶瓷膜過濾I次；進(jìn)行過濾除渣后，在50°C減壓濃縮至無乙醇味，得濃縮液150L ;將濃縮液用350L的乙酸乙酯分三次進(jìn)行萃取，分離得到三次的乙酸乙酯層，合并乙酸乙酯萃取液380L，將其萃取液進(jìn)行50°C減壓濃縮，直至獲得干燥物5. 48kg ;將干燥物用5. 48kg水進(jìn)行溶解，上H —103大孔樹脂進(jìn)行吸附，用40%乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液I 60L，再用70%乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液II 45L ;將洗脫液I進(jìn)行減壓濃縮至12L，加入36L的無水乙醇在4°C進(jìn)行結(jié)晶和重結(jié)晶，得橄欖苦甙
2.35kg ;將洗脫液II進(jìn)行減壓濃縮至8L，加入16L的丙酮在4°C進(jìn)行結(jié)晶和重結(jié)晶，得穗花杉雙黃酮0. 84kg。按實(shí)施例I中檢測方法進(jìn)行檢測所得到橄欖苦甙的純度為98. 26%，穗花杉雙黃酮的純度為98. 25%。實(shí)施例3稱取500kg橄欖葉，普通粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，加入2000L的60%乙醇進(jìn)行混合，加熱至50°C左右進(jìn)行回流提取10小時(shí)后，采用三層紗布過濾2次、陶瓷膜過濾I次；進(jìn)行過濾除渣后，在50°C減壓濃縮至無乙醇味，得濃縮液300L ;將濃縮液用800L的乙酸乙酯分三次進(jìn)行萃取，分離得到三次的乙酸乙酯層，合并乙酸乙酯萃取液850L，將其萃取液進(jìn)行50°C減壓濃縮，直至獲得干燥物11. 28kg ;將干燥物用11. 28kg水進(jìn)行溶解，上H—103大孔樹脂進(jìn)行吸附，用40%乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液I 150L，再用70%乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液
II120L ;將洗脫液I進(jìn)行減壓濃縮至30L，加入90L的無水乙醇在4°C進(jìn)行結(jié)晶和重結(jié)晶，得橄欖苦甙5. 74kg ;將洗脫液II進(jìn)行減壓濃縮至20L，加入40L的丙酮在4°C進(jìn)行結(jié)晶和重結(jié)晶，得穗花杉雙黃酮1.95kg。按實(shí)施例I中檢測方法進(jìn)行檢測所得到橄欖苦甙的純度為98. 78%，穗花杉雙黃酮的純度為97. 83%。
權(quán)利要求
1.一種從橄欖葉提取橄欖苦甙和穗花杉雙黃酮的方法，其具體步驟包括 (1)粉碎油橄欖葉，并將橄欖葉、50%乙醇按重量(kg)/體積比(L)=1:1-8進(jìn)行混合，力口熱回流提?。? (2)過濾除渣后，減壓濃縮至無乙醇味； (3)將濃縮液用2-3倍體積的乙酸乙酯萃取三次，分離乙酸乙酯層并進(jìn)行濃縮，直至獲得干燥物； (4)將干燥物用等重量水進(jìn)行溶解，上H —103大孔樹脂進(jìn)行吸附，用40%乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液I，再用70%乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液II ； (5)將洗脫液I進(jìn)行減壓濃縮至原有體積的1/4-1/5，加入三倍體積的無水乙醇進(jìn)行結(jié)晶和重結(jié)晶，得橄欖苦甙； (6)將洗脫液II進(jìn)行減壓濃縮至原有體積的1/5-1/6，加入二倍體積的石油醚進(jìn)行結(jié)晶和重結(jié)晶，得穗花杉雙黃酮。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，步驟(2)的過濾過程是紗布過濾、陶瓷膜過濾，其中，優(yōu)選是三層紗布過濾2次、陶瓷膜過濾I次。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的方法，其中步驟(5)、(6)中進(jìn)行結(jié)晶和重結(jié)晶時(shí)結(jié)晶溫度在低溫下進(jìn)行，優(yōu)選是在4°C左右。
全文摘要
一種從橄欖葉提取橄欖苦甙和穗花杉雙黃酮的方法。干燥過后的油橄欖葉經(jīng)用乙醇溶液提取、過濾、減壓濃縮，萃取,然后用樹脂吸附、乙醇洗脫、將洗脫液濃縮，結(jié)晶與重結(jié)晶制得橄欖苦甙和穗花杉雙黃酮純品。所用的試劑均為無毒、廉價(jià)、量產(chǎn)的化學(xué)試劑，整個(gè)過程中可利用成熟的試劑回收的常規(guī)技術(shù)，這極大地降低了向環(huán)境排放廢棄物。由于能同時(shí)提取出橄欖苦甙和穗花杉雙黃酮，極大地降低了其生產(chǎn)成本，又節(jié)約了橄欖葉資源。
文檔編號(hào)C07H1/08GK102731592SQ20121020915
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月25日
發(fā)明者代洪波, 李蘭嵐, 王斯成 申請人:向華