一種牛乳鐵蛋白肽畢赤酵母工程菌的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種牛乳鐵蛋白肽畢赤酵母工程菌的制備方法，所述一種牛乳鐵蛋白肽LFB和編碼該蛋白的基因Lfcin?B，其DNA序列如序列表中1所示，該基因編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中2所示。本發(fā)明根據(jù)酵母偏愛密碼子重新設(shè)計(jì)新的Lfcin?B抗菌肽基因，合成其DNA序列轉(zhuǎn)化于畢赤酵母中表達(dá)，形成抗菌肽基因的畢赤酵母工程菌，同時優(yōu)化該菌發(fā)酵條件，達(dá)到高密度發(fā)酵和高效表達(dá)的效果。本發(fā)明的有益效果是：該工程菌發(fā)酵液對Gram+菌、Gram-菌及真菌等均有明顯的抑制作用，將發(fā)酵液經(jīng)處理的產(chǎn)品添加到豬的飼料中，均達(dá)到較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該抗菌肽制品能夠代替抗生素，能夠預(yù)防消化道疾病、促進(jìn)生長、增加體重，可以作為畜禽飼料添加劑。
【專利說明】一種牛乳鐵蛋白肽畢赤酵母工程菌的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說是一種牛乳鐵蛋白肽畢赤酵母工程菌的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]抗菌肽是基因編碼的肽類抗菌分子，是生物機(jī)體在抵御病原微生物的防御反應(yīng)中所產(chǎn)生的一類抗微生物和一些惡性細(xì)胞的短肽。由于這類多肽具有廣譜高效殺菌活性，因而最初被命名為“antibacterial peptides, ABP”,譯為抗菌肽。它們不僅對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有較強(qiáng)的殺滅作用，對某些真菌、原生動物，尤其是對耐藥性細(xì)菌也具有殺滅作用，極有可能成為一種高效、低毒且無殘留危害的抗菌、抗病毒、抗癌新藥，甚至可以通過基因工程的方法將抗菌肽基因?qū)胫参?、動物和微生物體內(nèi)，用于大批量生產(chǎn)或進(jìn)行動植物的抗病育種。
[0003]1972年,瑞典科學(xué)家Boman等首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)抗菌肽及其免疫功能。Steiner等人于1981年研究了來自天蠶蛹的抗菌多肽cecropins,該肽在昆蟲天然免疫中發(fā)揮著重要的作用，它也被認(rèn)為是第I個真正意義上的抗菌肽。隨后，人們又在細(xì)菌、真菌、兩棲類、哺乳動物、植物和人類中相繼發(fā)現(xiàn)并分離得到了抗菌肽。
[0004]牛乳鐵蛋白肽(Bovine Lactoferricin,簡寫為Lfcin B)是經(jīng)胃蛋白酶從牛乳鐵蛋白(bLF)N-端(17~41)水解的25個氨基酸殘基，分子量約為3.1kd0 Lfcin是bLF的抗菌活性中心，對bLF抗菌活性起重要的作用(Kanget al, 1996)。而Lfcin B是所有Lfcin中活性最高的，抑菌效果是牛乳鐵蛋白400倍，能在胃腸道中發(fā)揮更重要的作用。在水溶液中呈親水脂的兩個反向β折疊結(jié)構(gòu)，具有耐熱、在消化道不易被降解、無抗原性的特征，能調(diào)節(jié)免疫作用，具有廣譜抗菌作用，不干擾腸道有益菌等特性。其對許多G+和G.均有抗菌作用，如大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等，但不作用于雙歧桿菌等對人體有益細(xì)菌、同時還能刺激細(xì)胞的生長、參與免疫調(diào)節(jié)。由于其特殊的功能作用，作為飼料添加劑以及食品防腐劑的研究開發(fā)，已經(jīng)受到國內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)和制造商的重視，成為研究熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種新的抗菌肽LFB和編碼該蛋白的基因Lfcin B。
[0006]本發(fā)明的另一個目的在于提供該抗菌肽制品的生產(chǎn)方法。
[0007]本發(fā)明的進(jìn)一步目的在于提供該抗菌肽在飼料添加劑中的應(yīng)用。
[0008]牛乳鐵蛋白肽(Lfcin B)是抗菌肽中的一個重要成員，它是由牛乳鐵蛋白在酸性環(huán)境下經(jīng)胃蛋白酶作用從N端釋放的一段由25個氨基酸殘基組成的小肽。研究發(fā)現(xiàn)，LfcinB具有廣譜抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒和抗腫瘤等多種生物學(xué)活性，Lfcin B獨(dú)特的生物學(xué)活性使其成為一種理想的新型抗微生物藥物開發(fā)的靶蛋白。
[0009]Lfcin B的二級結(jié)構(gòu)是在一級結(jié)構(gòu)的肽鏈上折疊而成，Schibi等(1999)通過核磁共振技術(shù)對Lfcin B的活性中心的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，Lfcin B是兩性分子結(jié)構(gòu)，堿性的Arg殘基和疏水的Trp殘基充分分離形成了兩性分子結(jié)構(gòu)，Arg殘基在分子的一側(cè)，Trp殘基在分子的另一側(cè)，Gln在分子的中間。Hwang等(1998)研究了 Lfcin B溶液的三維結(jié)構(gòu)，利用核磁共振(NMR)的X衍射分析發(fā)現(xiàn)，Lfcin B的空間構(gòu)象為扭曲的反向平行的β-折疊。這種結(jié)構(gòu)與Lfcin B的抗菌和抗病毒功能分不開。
[0010]抗菌肽LFB還具有良好的熱穩(wěn)定性，特別是在酸性條件下，加熱甚至是高溫高壓處理對其抗菌活性沒有影響，因此不僅能夠耐受飼料加工過程中高溫高壓的劇烈條件，并且可以在飼料保存過程中持續(xù)發(fā)揮其功能，保持飼料品質(zhì)，延長貯存期限?？咕腖FB做為新一代的綠色飼料添加劑，是很好的傳統(tǒng)抗生素替代品，能有效地解決人和動物藥殘和病原菌耐藥性的問題。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1:合成抗菌肽基因Lfcin B流程圖。
[0012]圖2:質(zhì)粒載體pPIC3.5Κ的物理圖譜。
[0013]圖3:pPIC3 .5K-Lfcin B 重組質(zhì)粒載體的 PCR鑒定，圖中:M 為 DNA MarkerDL2000 ；
[0014]I為以空載體pPIC3.5K質(zhì)粒為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物；2、3、4、5為pPIC3.5K_Lfcin B轉(zhuǎn)化子的擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0015]圖4:重組酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定，M為DNA Marker DL2000 ；1為陰性對照；2、3、
4、5、6、7為酵母重組菌株的菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0016]圖5:抗菌肽基因酵母重組載體構(gòu)建的流程圖。
[0017]圖6:抗菌肽Lfcin B對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、尿腸球菌(耐藥)、動物致病大腸桿菌抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖中:1表示氨芐青霉素的抗菌活性；2為陰性對照ddH20 ;3、4、5、為畢赤酵母工程菌表達(dá)抗菌肽的抗菌活性。
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例1重組酵母表達(dá)抗菌肽Lfcin B產(chǎn)品的生產(chǎn)方法
[0019]1.抗菌肽基因Lfcin B的合成
[0020]根據(jù)酵母偏愛密碼子對抗菌肽基因Lfcin B進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，分別合成Primerl及Primerf兩段引物，兩段引物之間有15bp的互補(bǔ)配對序列，互為模板做PCR擴(kuò)增。合成抗菌肽基因Lfcin B流程圖如圖1所示。
[0021]Primerl:
[0022]5’-CGGGATCCACCATGTTT AAG TGT AGA AGA TGG CMTGG AGA ATG AAG AAG TTG GGTGCT-Sj
[0023]Primer2:
[0024]5，
[0025]-CGGAATTCTCATTAGAAAGCTCTTCTAACACAAGTAATAGATGGAGCACCCAACTTCTT-3’
[0026]反應(yīng)條件:
[0027]
【權(quán)利要求】
1.一種牛乳鐵蛋白肽畢赤酵母工程菌，其特征是一種抗菌肽基因Lfcin B轉(zhuǎn)化GS115、KM71和X33等畢赤酵母菌株而制得的工程菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛乳鐵蛋白肽畢赤酵母工程菌，其特征在于所述的載體是pPIC3.5K、pPIC9K、pPICZ a A、pGAPZ α A 等畢赤酵母表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛乳鐵蛋白肽畢赤酵母工程菌，其特征在于所述的基因是抗菌肽基因 Lfcin B，其核苷酸序列如下:TTT MG TGT AGA AGA TGG CAA TGG AGA ATG MGAAG TTG GGT GCT CCA TCT ATT ACT TGT GTT AGAAGA GCT TTC。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗菌肽基因，其特征在于，經(jīng)酵母偏愛密碼子優(yōu)化的DNA序列為:TTT AAG TGT AGA AGA TGG CAA TGG AGA ATG AAG AAG TTG GGT GCT CCA TCT ATTACT TGT GTT AGA AGA GCT TTC。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述基因編碼蛋白LFB，其特征在于，其氨基酸序列為:FKCRRffQffRMKKLGAPSITCVRRAF。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌肽LFB制品，其特征在于，制備方法包括如下步驟: (1)將抗菌肽基因LfcinB經(jīng)酵母偏愛密碼子優(yōu)化后設(shè)計(jì)引物合成基因序列； (2)將抗菌肽基因LfcinB克隆到表達(dá)載體pPIC3.5K，得到重組表達(dá)載體pPIC3.5K-LfcinB ；
(3)將重組表達(dá)載體pPIC3.5K-LfcinB電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115 ； (4)在pH6.0的培養(yǎng)基，以濃度為1%的甲醇，對上述重組酵母基因工程菌誘導(dǎo)表達(dá)5天; (5)放料，發(fā)酵液經(jīng)80°C以上高溫處理后，噴霧干燥得到轉(zhuǎn)抗菌肽LFB的制品。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌肽LFB制品，其特征在于所敘述的抗菌肽在養(yǎng)殖中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌肽LFB制品，其特征在于，所述及的應(yīng)用是在制備飼料添加劑，促進(jìn)家禽家畜的生長。
【文檔編號】C07K14/79GK103602603SQ201210149873
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2012年5月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月15日
【發(fā)明者】李本濤, 李帥偉 申請人:廣州格拉姆生物科技有限公司