專利名稱：基因重組vpac2受體特異激動劑dbayl及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基因重組VPAC2型受體特異激動劑 DBAYL及其制備方法，與其用于制備治療VPAC2型受體相關(guān)疾病的藥物，如促進(jìn)葡萄糖依賴的胰島素分泌，提高機(jī)體對高濃度血糖的應(yīng)急能力，有效降低血糖濃度，保護(hù)胰腺β細(xì)胞功能、增加β細(xì)胞數(shù)量和抑制β細(xì)胞凋亡及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能等作用。
背景技術(shù)：
垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(PACAP)是1990年被發(fā)現(xiàn)由腦垂體分泌的具有重要生物學(xué)功能的神經(jīng)多肽，是促胰液素/高血糖素/VIP家族中的新成員。PACAP有兩種存在形式PACAP38，由38個氨基酸組成；PACAP27，由PACAP38氮端的27個氨基酸組成。PACAP通過激活其特異的G蛋白偶聯(lián)受體，提高靶細(xì)胞cAMP等第二信使的濃度，從而發(fā)揮廣泛而重要的生物學(xué)功能。PACAP有三類G蛋白偶聯(lián)受體PAC1、VPAC1和VPAC2 ；三類受體在生物體中分布不同，所起的作用也不相同。其中VPAC2型受體分布于胰島等組織，與能量代謝密切相關(guān)，從臨床觀點(diǎn)看，作為VPAC2型受體特異激動劑的特定PACAP衍生物可有效地降低血液葡萄糖水平，保護(hù)β-細(xì)胞功能及阻止疾病發(fā)展的潛力，且無低血糖癥風(fēng)險，可用于糖尿病的任何病期，作為具有廣泛作用的神經(jīng)多肽，對于二期和三期糖尿病患者具有優(yōu)于其他藥物的綜合治療作用，為公認(rèn)的治療II型糖尿病的新型藥物。PACAP與VPAC2受體作用主要與腺苷酸環(huán)化酶(AC)藕聯(lián)通過cAMP信號傳導(dǎo)通路，激活A(yù)C，催化ATP轉(zhuǎn)化為cAMP，cAMP隨之激活其依賴性蛋白激酶A (PKA)，PKA可使細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)磷酸化，產(chǎn)生生理效應(yīng)，尤其是在促進(jìn)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄有重要作用。PACAP通過 VPAC2受體介導(dǎo)的生物學(xué)功能主要有神經(jīng)遞質(zhì)/調(diào)質(zhì)、促進(jìn)激素分泌，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌平衡；調(diào)節(jié)性腺功能和生殖細(xì)胞的產(chǎn)生；調(diào)節(jié)能量代謝平衡等。研究表明，VPAC2型受體特異激動劑可有效促進(jìn)葡萄糖依賴的胰島素分泌，提高機(jī)體對高濃度血糖的應(yīng)急能力有效降低血糖濃度，保護(hù)胰腺β細(xì)胞功能、增加β細(xì)胞數(shù)量和抑制β細(xì)胞凋亡。但PACAP及其許多衍生物，如ΒΑΥ55-9837等，在體內(nèi)很快被二肽基肽酶IV (DPPIV)降解；而且由于自身結(jié)構(gòu)中含有影響其液體環(huán)境中穩(wěn)定性的氨基酸組成， 許多藥物肽在生物體內(nèi)穩(wěn)定性較差。因此，研發(fā)生理環(huán)境下新型高穩(wěn)定性VPAC2受體特異激動劑是PACAP及其衍生多肽用于II型糖尿病治療及臨床應(yīng)用急待解決的問題，研發(fā)作為 VPAC2型受體特異激動劑的高穩(wěn)定性PACAP衍生多肽，具有重要的藥用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種具有更高穩(wěn)定性和更高生物活性的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL。本發(fā)明的另一目的在于提供所述基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的制備方法。該制備方法根據(jù)PACAP衍生多肽DBAYL的氨基酸序列及大腸桿菌密碼子的偏好性，設(shè)計(jì)DBAYL在原核表達(dá)系統(tǒng)的基因序列，采用基因工程技術(shù)，結(jié)合蛋白內(nèi)含肽(intein)的可誘導(dǎo)剪切功能實(shí)現(xiàn)目的多肽DBAYL的高效制備；該制備方法生產(chǎn)效率高，生產(chǎn)成本低。本發(fā)明的再一目的在于提供所述基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種基因重組VPAC2型受體特異激動劑 DBAYL，其氨基酸序列如下所示MHSDAVFTDQYTRLRKQLAAKKYLQSLKQKRY ；編碼所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的苷酸序列為 ATGCATAGCGATGCGGTGTTTACCGATCAGTATACCCGTCTGCGTAAACAGCTGGCGGCGAAAAAATAT CTGCAGAGCATTAAACAGAAACGTTAT ；所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的制備方法，包括以下步驟(1)設(shè)計(jì)并合成DBAYL基因采用3條引物兩步法合成DBAYL基因引物Fl:5，-GGTGGT CATATG' CATAGCGATGCGGTGTTTACCGATCAGTATACCCGTCTGCGTAAA-3，；引物F2:5’ -CAGATATTTTTTCGCCGCCAGCTGTTTACGCAGACGGGT-3，；引物F3:5 ’ -CCACCA TGCTCTTCCGCA ATAACGTTTCTGTTTAATGCTCTGCAGATATTTTTT-3 ’ ；其中，GGTGGT或 CCACCA 為保護(hù)堿基,CATATG為 NdeI 酶切位點(diǎn)，TGCTCTTCCGCA 為SapI酶切位點(diǎn)；首先將引物Fl和引物F2進(jìn)行鏈延伸反應(yīng)，然后以其產(chǎn)物為DNA模板，以Fl和F3 為引物，PCR反應(yīng)制得DBAYL基因；(2)構(gòu)建重組載體 pKY-DBAYL 用Ndel酶和Sapl酶分別對質(zhì)粒pKYB和步驟(1)制得的DBAYL基因進(jìn)行雙酶切， 再將雙酶切后的DBAYL基因和雙酶切后的質(zhì)粒pKYB連接，得到重組載體pKY-DBAYL ；(3)制備表達(dá)工程菌 pKY-DBAYL/ER2566 用重組載體pKY-DBAYL轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌大腸桿菌E coli Strain ER2566，得到表達(dá)工程菌 pKY-DBAYL/ER2566 ；(4)表達(dá)和純化①誘導(dǎo)表達(dá)工程菌pKY-DBAYL/ER2566表達(dá)由目的多肽、蛋白內(nèi)含肽和幾丁質(zhì)結(jié)合域(Chitin binding domain，CBD)組成的“三元”融合蛋白；②得到的“三元”融合蛋白用幾丁質(zhì)柱進(jìn)行純化，“三元”融合蛋白吸附于幾丁質(zhì)柱中，然后含有硫醇的溶液過柱并充滿幾丁質(zhì)柱環(huán)境中，反應(yīng)；硫醇的作用是誘導(dǎo)蛋白內(nèi)含肽的N端切割，釋放目的多肽C端硫酯；接著洗脫幾丁質(zhì)柱，得到目的多肽C端硫酯，透析目的多肽C端硫酯，從而產(chǎn)生穩(wěn)定的水解產(chǎn)物；③利用高效液相色譜技術(shù)純化目的多肽，得到基因重組VPAC2型受體特異激動劑 DBAYL0步驟(1)中所述的鏈延伸反應(yīng)的條件優(yōu)選為94°C IOmin;降至58°C 5min;72 0C IOmin ；步驟(1)中所述的PCR反應(yīng)的條件優(yōu)選為95°C 5min ；95°C lmin、55°C lmin、 72°C lmin, 32 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin ；步驟(4)②中所述含有硫醇的溶液的組成如下20mM Tris_HCI，0. 5M NaCl,lmM EDTA，50mM3 -巰基乙醇，pH 8.0;步驟⑷②中所述反應(yīng)的條件優(yōu)選為25V反應(yīng)M小時；步驟(4)②中所述洗脫幾丁質(zhì)柱的溶液的組成優(yōu)選如下20mM Tris-HCl, 500mM NaCI，ImM EDTA,pH 8. 0 ；步驟(4)③中所述利用高效液相色譜技術(shù)純化目的多肽DBAYL的步驟如下A、流動相A為在體積百分比5%乙腈(CNCH3,溶質(zhì)為純水)中添加三氟乙酸(TFA) 得到，TFA的終濃度為體積百分比0. 1% ；流動相B為100%乙腈(CNCH3)中添加三氟乙酸 (TFA)，TFA的終濃度為體積百分比0. 1% ；流速lmL/min，25min線性梯度洗脫；B、線性梯度洗脫中流動相B由0 60% (ν/ν)，收集目的多肽洗脫峰，光吸收檢測波長為218nm ；并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL應(yīng)用于制備治療如下疾病的藥物糖尿病及其并發(fā)癥，高血糖癥，高血壓，血栓癥，肥胖癥、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心臟及腎衰竭。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果(1)本發(fā)明所制備的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL，是PACAP衍生多肽，與野生型PACAP相比，在其N端多了一個甲硫氨酸，并具有特殊的氨基酸序列，即在C端通過巰酯鍵結(jié)合硫醇，成為多肽硫酯，多肽硫酯可以水解產(chǎn)生天然的羧基端，也可特異水解成為硫代羧酸。(2)該VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的氨基酸序列不同于其他與PACAP同源或非同源的VPAC2型受體特異激動劑，與BAY55-9837的區(qū)別點(diǎn)在于突變原BAY55-9837的第九位氨基酸天冬酰胺(N)為谷氨酰胺⑴)，突變原BAY55-9837的第十七位氨基酸纈氨酸 (V)為亮氨酸(L)，突變原BATO5-9837的第二十八位氨基酸天冬酰胺(N)為谷氨酰胺⑴)。這些區(qū)別使得DBAYL在生理環(huán)境中具有更高的穩(wěn)定性和對VPAC2受體更高的特異激活活性，與VPAC2受體特異結(jié)合后，促進(jìn)胰島素的產(chǎn)生和分泌，保護(hù)胰腺β細(xì)胞功能、增加β細(xì)胞數(shù)量和抑制β細(xì)胞凋亡，并激活胰島素受體信號通路，從而發(fā)揮治療II型糖尿病的功效。(3)本發(fā)明所制備的高穩(wěn)定性VPAC2型受體特異激動劑DBAYL在治療糖尿病及其并發(fā)癥，高血糖癥，高血壓，血栓癥，肥胖癥、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心臟及腎衰竭疾病中有顯著的療效。(4)利用本發(fā)明所述的制備方法得到的重組多肽DBAYL的穩(wěn)定性比化學(xué)合成 DBAYL多肽提高約7倍，比化學(xué)合成ΒΑΥ55-9837多肽的穩(wěn)定性提高約25倍。本發(fā)明的表達(dá)方法效率高、成本低，應(yīng)用前景廣闊。


圖1為重組多肽DBAYL的制備示意圖。
圖2為DBAYL基因合成及重組表達(dá)質(zhì)粒pKY_DBAYL構(gòu)建示意圖；圖中MCS_多克隆位點(diǎn)；CBD-幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域；intein-內(nèi)含肽。圖3為SDS-PAGE檢測融合蛋白htein-CBD-DBAYL表達(dá)的鑒定圖；其中，泳道1是 IPTG誘導(dǎo)前菌體破碎上清液；泳道2是IPTG誘導(dǎo)后菌體破碎上清液。圖4為制備的重組多肽DBAYL的飛行質(zhì)譜鑒定圖。圖5為重組多肽DBAYL與BAY55-9837的穩(wěn)定性比較與檢測結(jié)果圖。圖6為重組多肽DBAYL/BAY55-9837和[125I]PACAP38對VPAC2受體的競爭性結(jié)合檢測結(jié)果圖。圖7為重組多肽DBAl與BAY55-9837促進(jìn)CH0-VPAC2細(xì)胞cAMP生成的活性測定
結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的制備基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的制備過程如圖1所示，具體步驟如下(1) DBAYL編碼序列的獲得按照大腸桿菌的密碼偏好性設(shè)計(jì)編碼DBAYL的cDNA，設(shè)計(jì)3條引物，采用兩步法獲得該序列(如圖2所示)引物Fl:5， -GGT GGT CAT ATG CAT AGC GAT GCG GTG TTT ACC GAT CAG TAT ACC CGT CTGCGT AAA-3，；引物F2:5' -CAG ATA TTT TTT CGC CGC CAG CTG TTT ACG CAG ACG GGT-3'；引物F3:5’ -CCA CCA TGC TCT TCC GCA ATA ACG TTT CTG TTT AAT GCT CTG CAG ATA TTT TTT-3'；其中，GGT GGT或CCA CCA為保護(hù)堿基，CATATG為Nde I酶切位點(diǎn)，TGC TCT TCC GCA為SapI酶切位點(diǎn)；①鏈延伸反應(yīng)反應(yīng)體系為引物FK250yM/L)2y L，弓丨物 F2 Q50 μ M/L) 2 μ L， 10 X iTaKaRaBuffer (含有 4mmol/L MgCl2) 2 μ L, dNTP 2 μ L, H2O 11. 5 μ L，TaKaRa Taq 酶 0. 5μ L ；反應(yīng)條件為94°C，IOmin；降至 58°C 5min ；72°C IOmin ；得到延伸反應(yīng)液。②PCR 反應(yīng)反應(yīng)體系為以延伸反應(yīng)液為DNA模板，引物Fl (25 μ M/L) 2 μ L，F(xiàn)3 (25 μ M/ L) 2 μ L，延伸反應(yīng)液 1· 5 μ L，dNTP 2 μ L，10XTaKaRa Ex Buffer 2 μ L, TaKaRa Taq 酶0. 5μ L, H2O 10μ L ；反應(yīng)條件為94"C 5min ；94 "C 30s, 55 "C 30s, 72 "C 30s, 32 個循環(huán)；72 °C 延伸 IOmin ；得到長度為12!3bp的PCR產(chǎn)物(2)構(gòu)建重組載體pKY-DBAYL，如圖2所示用NdeI和SapI進(jìn)行酶切步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物，利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化(根據(jù)說明書進(jìn)行操作)。純化后的PCR產(chǎn)物先進(jìn)行LguI (SapI的同功酶，F(xiàn)ermatas 產(chǎn)品)單酶切，酶切條件為在IXTango buffer反應(yīng)體系中，1 μ g PCR產(chǎn)物加入15unit LguI (3 μ L), 37°C酶切4h ；LguI單酶切完成后，加入適量體積的10 X Tango buffer,使得反應(yīng)體系成為 2 X Tango buffer 體系，加入 20unit NdeI (2 μ L, !^ermatas 產(chǎn)品)，37°C酶切4h ；質(zhì)粒pKYB(New England Biolabs(NEB)公司)的雙酶切=LguI (SapI 的同功酶)和 NdeI的雙酶切條件同上。將雙酶切后的DBAYL基因和雙酶切后的質(zhì)粒pKYB連接，連接體系和連接時間、大腸桿菌DH5ci (購自大連寶生物公司)感受態(tài)細(xì)胞的制作、轉(zhuǎn)化以及篩選(卡那霉素)，根據(jù) 《分子克隆》進(jìn)行操作。將DBAYL基因克隆到質(zhì)粒pKYB的NdeI和SapI位點(diǎn)間，得到重組載體 pKY-DBAYL。(3)表達(dá)和純化①將重組質(zhì)粒pKY-DBAYL 轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌 E. coli Strain ER2566 (New England Biolabs (NEB)公司)，得到表達(dá)工程菌pKY_DBAYL/ER2566 ；挑取單克隆于5mL含50 μ g/mL 卡那霉素的Luria-Bertani (broth)培養(yǎng)基(簡稱LB培養(yǎng)基)，搖菌培養(yǎng)過夜，再擴(kuò)大，以體積比為1 100的比例接于IL含50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37°C搖菌至OD600為0. 6，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG))至終濃度0. 6mmol/L，37°C誘導(dǎo)表達(dá)6h。IOOOOrpm 離心 20min 收集菌體，將菌體重懸于60mL Buffer A溶液(20mM Tris-HCl, 500mM NaCI, ImM EDTA, pH 8.0)中，然后用低溫超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎儀進(jìn)行破碎，破碎條件為=BufferA溶液稀釋菌體的濃度為18% (m/v)，破碎壓力為1700bar，制冷溫度為3°C。破碎產(chǎn)物在4°C，IOOOOrpm離心30min，收集上清，該上清稱為破碎上清。SDS-PAGE 檢測融合蛋白Intein-CBD-DBAYL的表達(dá)，鑒定結(jié)果如圖3所示。取25mL幾丁質(zhì)珠(NEB公司產(chǎn)品#S6651L)裝填4. 5X 20cm層析柱，以10倍柱體積的BufferA溶液洗柱；破碎上清以0. 5mL/min的流速上注；用10倍柱體積的Buffer A溶液以2mL/min過柱，以洗去雜蛋白或未親和結(jié)合的融合蛋白，用80mL Buffer B溶液(20mM Tris-HCI,0. 5M NaCl，ImM EDTA，50mM β -巰基乙醇，pH 8.0)自然過柱，使β-巰基乙醇均勻分布并浸泡柱內(nèi)填料，然后封閉進(jìn)、出口端，上述反應(yīng)體系在25°C反應(yīng)Mh，以誘導(dǎo)蛋白內(nèi)含肽的N端切割，釋放目的多肽C端硫酯。用Buffer A溶液洗脫并用潔凈的燒杯收集目的多肽溶液C端硫酯，4°C透析過夜除去β -巰基乙醇并使目的多肽C端硫酯水解，再經(jīng)高效液相色譜(HPLC)純化、制備得到純度為質(zhì)量百分比96%以上的重組多肽DBAYL，目的多肽的制備條件為流動相A[在體積百分比5%乙腈(CNCH3，溶質(zhì)為純水)中添加三氟乙酸 (TFA)得到，TFA的終濃度為體積百分比0. ]，流動相Β[100%乙腈(CNCH3)中添加三氟乙酸(TFA)，TFA的終濃度為體積百分比0. ]，流速lmL/min，25min線性梯度洗脫，線性
8梯度洗脫中流動相B由0 60 % (ν/ν)，收集目的多肽洗脫峰，光吸收檢測波長為218nm。 目的多肽DBAYL的純度通過分析性HPLC測定(條件同目的多肽的制備條件)。制備的高穩(wěn)定性VPAC2型受體特異激動劑DBAYL利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定(如圖4所示)，質(zhì)譜檢測分子量為 3. 916kDa.，與其理論值相符合。實(shí)施例2重組肽DBAYL (即實(shí)施例1制備的DBAYL)的體外穩(wěn)定性測定重組肽DBAYL、化學(xué)合成DBAYL(與重組肽DBAYL相比，其N端無甲硫氨酸)和 BAY55-9837 (Tocris Bioscience 公司產(chǎn)品 #2711)以終濃度 lmg/ml 分別溶解在 2OmM 磷酸鈉緩沖液(PH 8.0，含150mM氯化鈉)，37°C水浴鍋中孵育，在不同的時間點(diǎn)取樣，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MQ檢測多肽在水溶液環(huán)境中隨時間的存留量，以確定重組肽DBAYL在體外水溶液環(huán)境中的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖5所示孵育1周時，BAY55-9837消減35. 2%，孵育2周時，BAY55-9837消減75. 1%，孵育3周和4周時，BAY55-9837分別消減88. 9%和96. 7% ；化學(xué)合成DBAYL多肽在孵育2周時，消減25. 8%，孵育4周時，消減 51.6% ；而重組肽DBAYL在孵育2周時，僅消減2.5%，孵育4周時，僅消減7.7%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)處理表明，重組肽DBAYL的體外半衰期約為BAY55-9837的25倍，約為化學(xué)合成 DBAYL多肽的7倍。實(shí)施例3重組肽DBAYL對VPAC2受體的競爭性結(jié)合活性測定VPAC2-CH0細(xì)胞Qnvitrogen公司)接種至12孔板上培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前2h，用0. 5mL無血清Ham’ s F-12培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次。然后，細(xì)胞用含2% (mg/ml)牛血清白蛋白(BSA) 和IOmM葡萄糖的Ham，s F-12培養(yǎng)液4°C培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)液中加入0. InM[125I]PACAP38和待測多肽(即為BAY55-9837或重組肽DBAYL)，并逐步提高待測多肽濃度(10_"Μ 。 培養(yǎng)完畢后，棄掉上清液，用冰冷PBS (0. 01Μ, ρΗ值為7. 4)洗細(xì)胞3次，細(xì)胞在室溫下用 0. 5mL 0. 5M NaOH和0. 1 % (mg/ml) SDS混合lOmin，然后用、計(jì)數(shù)法測定細(xì)胞裂解物放射量，計(jì)算重組肽 DBAYL 或 BAY55-9837 的半抑制量(IC50，half-maximal inhibitory concentration)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6，BATO5-9837對VPAC2受體的半抑制量IC50為68. 3士8. InM ；重組肽DBAYL對VPAC2受體的半抑制量IC50為48. 4士6. 9nM ；結(jié)果表明，重組肽DBAYL對VPAC2 受體的競爭性結(jié)合活性高于VPAC2受體特異激動劑BAY55-9837。實(shí)施例4 重組肽DBAYL促進(jìn)VPAC2-CH0細(xì)胞cAMP生成的活性測定取對數(shù)生長期的VPAC2-CH0細(xì)胞，PBS (0. 01M, ρΗ值為7. 4)洗2次，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為ι χ lOVmL,分別加入相同濃度的多肽DBAYL或BAY55-9837 (Tocris Bioscience 公司產(chǎn)品#2711)，調(diào)節(jié)多肽的濃度至KT11M 10_%，371溫育201^11。再將分別被多肽 DBAYL和BAY55-9837作用過的各100 μ L細(xì)胞懸浮液與200 μ L 0. 2Μ HCl溶液混合，室溫放置20min，tip頭吹打溶解細(xì)胞并混勻，1500g離心lOmin，吸取上清按Cyclic AMP Enzyme Immunoassay Kit 說明測定 cAMP 的量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7，BAY55-9837對VPAC2受體的半激活濃度EC50 (half-maximal stimulatory concentration)為 1. 10士0. 23nM ；多肽 DBAYL 對 VPAC2 受體的半激活濃度EC50為0. 68士0. 2InM ；結(jié)果表明，多肽DBAYL對VPAC2受體的選擇性激活活性明顯高于 BAY55-9837o實(shí)施例5重組多肽DBAYL對ICR小鼠血糖及胰島素水平的影響正常雄性ICR小鼠(購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證編號 SCXK[京]2002-000 按體重均分為3組，正常對照組、BAY55-9837組(50 μ g/kg)、重組肽 DBAYL組(50 μ g/kg)。動物禁食過夜(1池)，取空腹血(Omin)后，腹腔注射給藥，正常對照組注射生理鹽水，分別于給藥后15min灌胃給予葡萄糖溶液(2g/kg)，并在給糖后20min時取血，用OneTouch Ultra Meter血糖儀(Johnson公司)測定血糖值，利用RIA kit (Linco Research公司)測定胰島素水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示重組肽DBAYL可有效促進(jìn)胰島素的分泌和明顯降低葡萄糖依賴的血糖水平，效果明顯優(yōu)于BAY55-9837。表IICR小鼠血糖及胰島素水平檢測
權(quán)利要求
1.一種基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL，其特征在于編碼所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.權(quán)利要求1或2所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)設(shè)計(jì)并合成DBAYL基因采用3條引物兩步法合成DBAYL基因引物Fl 5’ -GGTGGT CATATG CATAGCGATGCGGTGTTTACCGATCAGTATACCCGTCTGCGTAAA-3 ’ ；引物F2 5' -CAGATATTTTTTCGCCGCCAGCTGTTTACGCAGACGGGT-3’ ；引物F3 5，-CCACCA TGCTCTTCCGCA ATAACGTTTCTGTTTAATGCTCTGCAGATATTTTTT-3'；其中，GGTGGT或CCACCA為保護(hù)堿基，CATATG為NdeI酶切位點(diǎn)，TGCTCTTCCGCA為 SapI酶切位點(diǎn)；首先將引物Fl和引物F2進(jìn)行鏈延伸反應(yīng)，然后以其產(chǎn)物為DNA模板，以Fl和F3為引物，PCR反應(yīng)制得DBAYL基因；(2)構(gòu)建重組載體pKY-DBAYL用Ndel酶和Sapl酶分別對質(zhì)粒pKYB和步驟(1)制得的DBAYL基因進(jìn)行雙酶切，再將雙酶切后的DBAYL基因和雙酶切后的質(zhì)粒pKYB連接，得到重組載體pKY-DBAYL ；(3)制備表達(dá)工程菌pKY-DBAYL/ER2566用重組載體pKY-DBAYL轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌大腸桿菌E coli Strain ER2566，得到表達(dá)工程菌 pKY-DBAYL/ER2566 ；(4)表達(dá)和純化①誘導(dǎo)表達(dá)工程菌PKY-DBAYL/ER2566表達(dá)由目的多肽、蛋白內(nèi)含肽和幾丁質(zhì)結(jié)合域組成的“三元”融合蛋白；②得到的“三元”融合蛋白用幾丁質(zhì)柱進(jìn)行純化，“三元”融合蛋白吸附于幾丁質(zhì)柱中， 然后含有硫醇的溶液過柱并充滿幾丁質(zhì)柱環(huán)境中，反應(yīng)；硫醇的作用是誘導(dǎo)蛋白內(nèi)含肽的 N端切割，釋放目的多肽C端硫酯；接著洗脫幾丁質(zhì)柱，得到目的多肽C端硫酯，透析目的多肽C端硫酯，從而產(chǎn)生穩(wěn)定的水解產(chǎn)物；③利用高效液相色譜技術(shù)純化目的多肽，得到基因重組VPAC2型受體特異激動劑 DBAYL。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的鏈延伸反應(yīng)的條件為94°C IOmin ；降至58°C 5min ；72°C IOmin0
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的PCR反應(yīng)的條件為95°C 5min ；95°C lmin、55°C lmin、72°C lmin， 32個循環(huán)；72°C延伸IOmin。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的制備方法，其特征在于步驟(4)②中所述含有硫醇的溶液的組成如下20mMTris-HCI，0. 5M NaCl, ImM EDTA，50mM3 -巰基乙醇，pH 8.0;步驟(4)②中所述反應(yīng)的條件為25V反應(yīng)M小時；步驟⑷②中所述洗脫幾丁質(zhì)柱的溶液的組成如下20mM Tris-HCl,500mMNaCI,lmM EDTA, pH 8· 0。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的制備方法，其特征在于步驟(4)③中所述利用高效液相色譜技術(shù)純化目的多肽DBAYL的步驟如下Α、流動相A為在體積百分比5%乙腈中添加三氟乙酸得到，三氟乙酸的終濃度為體積百分比0. 1% ；流動相B為100%乙腈中添加三氟乙酸得到，三氟乙酸的終濃度為體積百分比0. ；流速lmL/min,25min線性梯度洗脫；B、線性梯度洗脫中流動相B由體積百分比0 60%，收集目的多肽洗脫峰，光吸收檢測波長為218nm ；并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。
8.權(quán)利要求1或2所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL的應(yīng)用，其特征在于所述的基因重組VPAC2型受體特異激動劑DBAYL用于制備治療如下疾病的藥物糖尿病及其并發(fā)癥，高血糖癥，高血壓，血栓癥，肥胖癥、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心臟及腎衰竭。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種如SEQ ID NO.1所示基因重組VPAC2受體特異激動劑DBAYL及其制備方法與應(yīng)用。通過關(guān)鍵氨基酸突變得到的DBAYL，與現(xiàn)有VPAC2型受體特異激動劑相比，在血液中具有更高的穩(wěn)定性和生理活性，顯著提高了其對VPAC2型受體的特異激活活性。該激動劑DBAYL對VPAC2受體的特異性半激活濃度EC50為0.68±0.21nM(BAY55-9837的EC50為1.10±0.23nM)，表明其對VPAC2型受體的選擇性激活活性明顯高于BAY55-9837，且實(shí)驗(yàn)證明該重組激動劑DBAYL的體外半衰期約為BAY55-9837的25倍，約為化學(xué)合成DBAYL多肽的7倍，表明其穩(wěn)定性顯著高于BAY55-9837。該重組激動劑DBAYL可應(yīng)用于制備具有如下功能的藥物治療糖尿病及其并發(fā)癥，治療高血糖癥，治療高血壓，治療血栓癥，治療肥胖癥、心血管疾病等。
文檔編號C07K14/47GK102558335SQ201210005129
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者洪岸, 馬義 申請人:暨南大學(xué)