專利名稱：Igf-i聚乙二醇綴合物的制作方法
IGF-I聚乙二醇綴合物本文報(bào)道了用于將包含聚乙二醇?xì)埢牡谝欢嚯倪x擇性酶催化C末端綴合至第二多肽的方法，即酶催化PEG化的方法。
背景技術(shù)：
蛋白療法在過去數(shù)十年間已變得非常重要，原因在于此類藥物目標(biāo)在于以前不能治愈的疾病。由于其分子大小非常不同于常規(guī)低分子量物質(zhì)，所以蛋白藥物制劑是有挑戰(zhàn)性的。此外，蛋白質(zhì)具有若干其他特性，如其二級和三級結(jié)構(gòu)對合適的功能性是必須的。它們易受許多類型的降解或修飾，并且其制劑必須保證穩(wěn)定性并保持在其有效和安全的目標(biāo)劑量之內(nèi)。有關(guān)蛋白質(zhì)作為藥物化合物的其他問題出現(xiàn)在患者體內(nèi)，例如免疫原性反應(yīng)，快速從軀體清除導(dǎo)致降低的半衰期，以及藥物在行使其作用前被蛋白水解切割破壞(Brown，L. R.，Expert Opinion Drug Deliv. 2 (2005) 29-42)。為解決這些問題，一種方法是將化學(xué)改變引入到蛋白分子中，例如將一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇?xì)埢矁r(jià)結(jié)合到蛋白藥物。此方法稱作PEG化。PEG化的優(yōu)點(diǎn)在于所得綴合物的分子量和流體動(dòng)力學(xué)尺寸的增加。新的綴合物較不容易為蛋白水解酶以及中和抗體或免疫細(xì)胞所接近。因此，PEG化可用于使藥物免于不需要的切割并且還降低過敏副作用的可能性。增加的大小還影響從身體的清除，原因在于蛋白-PEG綴合物太大以至于不能通過腎超濾被除去(Veronese, F. M.和Pasut, G. , Drug Discovery Today (今日藥物發(fā)現(xiàn))10(2005) 1451-1458 ;Brown，L. R. , Expert Opinion Drug Deliv. 2(2005)29-42)。聚乙二醇本身極大的改善了新藥物的性質(zhì)。此外，PEG缺乏毒性是一個(gè)主要優(yōu)勢?？傊?，PEG化是用于增加蛋白藥物的血液循環(huán)壽命的眾所周知的方法(Kozlowski, A.和Harris,M. J. , Journal of Controlled Release (受控釋放雜志)72 (2001) 217-224)。多種 PEG化的蛋白藥物是市售的，例如Schering Plough的PEG-Illtron , Pfizer的Somavert 和 RochePharmaceuticals 的-Pegasys.上.(Pasut, G.等，Expert Opinion on TherapeuticPatents 14(2004)859-894)。對于具有溫和條件、高的化學(xué)和區(qū)域特異性和合適產(chǎn)物產(chǎn)量的酶催化位點(diǎn)特異性修飾存在極大的興趣。在本領(lǐng)域中已經(jīng)進(jìn)行了很多嘗試。Mao等(Mao，H.等，J. Am.Chem. Soc.(美國化學(xué)學(xué)會雜志)126 (2004) 2670-2671)開發(fā)出用于C末端修飾的分選酶(sortase)介導(dǎo)的蛋白連接方法。Sato (Sato, H. , Advanced Drug Delivery Reviews54(2002)487-504)建立了一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶將聚乙二醇位點(diǎn)特異地引入到完整蛋白和嵌合蛋白中，所述蛋白接受有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的特殊底物序列。免疫球蛋白A 蛋白酶(IgA 蛋白酶)已經(jīng)被 Lewinska 等(Lewinska, M.等，Bioconjugate Chemistry15(2004)231-234)用于修飾天然蛋白的N端。Hoess等已經(jīng)開發(fā)了突變的胰蛋白酶(W02006/015879)。發(fā)明概述本文報(bào)道了用于將多肽與一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇分子選擇性C末端共價(jià)綴合的方法。這是這樣的一種方法，其中與聚乙二醇共價(jià)綴合的小肽被通過酶催化方法轉(zhuǎn)移到要被PEG化的目的多肽。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，Strep標(biāo)簽在胰蛋白酶切割位點(diǎn)C末端的存在增強(qiáng)了 C端位點(diǎn)特異性修飾。如本文所報(bào)道的第一方面是制備與聚乙二醇?xì)埢Y合的多肽的方法，所述方法包括a)提供編碼融合多肽的核酸，其在5'至3'方向上包含i)編碼多肽的核酸，以及ii)編碼氨基酸序列SEQ ID NO 01的核酸，b)在細(xì)胞中表達(dá)a)的核酸，并且從細(xì)胞和/或培養(yǎng)基回收融合多肽，c)給目標(biāo)肽提供于C末端賴氨酸殘基處與聚乙二醇?xì)埢矁r(jià)綴合的氨基酸序列 SEQ ID NO 02,d)將融合多肽和目標(biāo)肽與胰蛋白酶突變體D189K，K60E, N143H, E151H溫育，并且e)從溫育混合物回收并由此產(chǎn)生與一個(gè)聚乙二醇?xì)埢Y合的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述溫育包括i)在緩沖溶液中將融合多肽和目標(biāo)肽與鹽酸胍溫育，ii)將胰蛋白酶突變體01891(，1(6(^，附431^15111與211(11)鹽一起溫育，iii)合并并溫育i)和ii)的溫育混合物。在如本文所報(bào)道的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，融合多肽在N至C末端方向上包含要被PEG化的多肽，胰蛋白酶-4x-突變體切割位點(diǎn)和Strep標(biāo)簽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼融合多肽的核酸在5’至3’方向上包含i)編碼要被PEG化的多肽的核酸，ii)編碼氨基酸序列SEQ ID NO 01的核酸，以及iii)編碼SEQ ID NO : 13或27的Str印標(biāo)簽的核酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，溫育總共150分鐘至180分鐘。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼融合多肽的核酸還包含iii)編碼氨基酸序列SEQ ID N0:13的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽是人IGF-I。在一個(gè)實(shí)施方案中，溫育是在HEPES緩沖溶液中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在HEPES緩沖溶液中的溫育為至少20小時(shí)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，溫育為20小時(shí)至54小時(shí)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在20 °C進(jìn)行溫育。在一個(gè)實(shí)施方案中，融合多肽具有選自SEQ ID NO 10, SEQ ID N0:11或SEQ IDNO 12的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼融合多肽的核酸是編碼具有氨基酸序列SEQ ID NO : 10 或 SEQ ID NO :11 或 SEQ ID NO 12 的多肽的核酸。如本文所報(bào)道的另一個(gè)方面是具有氨基酸序列SEQ ID N0:28或SEQ ID N0:29并
且在C末端賴氨酸殘基與一個(gè)聚乙二醇?xì)埢Y合的多肽。如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是一種藥物組合物，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:28或SEQ ID NO 29并且在C末端賴氨酸殘基與一個(gè)聚乙二醇?xì)埢Y合的多肽或用如本文所報(bào)道的方法獲得的多肽。如本文所報(bào)道的另一個(gè)方面是具有氨基酸序列SEQ ID NO : 28或SEQID NO : 29并且在C末端賴氨酸殘基與一個(gè)聚乙二醇?xì)埢Y合的多肽或用如本文所報(bào)道的方法獲得的多肽在制備用于治療阿爾茨海默病的藥物中的用途。如本文所報(bào)道的另一個(gè)方面是具有氨基酸序列SEQ ID N0:28或SEQ ID N0:29并且在C末端賴氨酸殘基與一個(gè)聚乙二醇?xì)埢Y合的多肽或用如本文所報(bào)道的方法獲得的多肽，所述多肽用作藥物。如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是具有氨基酸序列SEQ ID N0:28或SEQ ID N0:29并且在C末端賴氨酸殘基與一個(gè)聚乙二醇?xì)埢Y合的多肽或用如本文所報(bào)道的方法獲得的多肽，所述多肽用于治療或預(yù)防阿爾茨海默病。如本文所報(bào)道的另一方面是一種治療方法，所述方法包括向需要其的受試者給予治療有效量的具有氨基酸序列SEQ ID N0:28或SEQ ID NO :29并且在C末端賴氨酸殘基與一個(gè)聚乙二醇?xì)埢Y合的多肽或用如本文所報(bào)道的方法獲得的多肽。如本文所報(bào)道的另一個(gè)方面是包含氨基酸序列SEQ ID N0:28或SEQ ID N0:29并且在C末端賴氨酸殘基與一個(gè)聚乙二醇?xì)埢Y合的多肽。
如本文所報(bào)道的另一個(gè)方面是一種藥物組合物，其包括包含氨基酸序列SEQID N0:28或SEQ ID NO :29并且在C末端賴氨酸殘基與一個(gè)聚乙二醇?xì)埢Y合的多肽。如本文所報(bào)道的另一方面是包含氨基酸序列SEQ ID N0:28或SEQ ID NO :29并且在C末端賴氨酸殘基與一個(gè)聚乙二醇?xì)埢Y合的多肽，所述多肽用于治療神經(jīng)變性疾病(neurodegenerative disorder)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述神經(jīng)變性疾病是阿爾茨海默病(Alzheimer’ s disease)。發(fā)明詳述本文報(bào)道了用于將多肽與一個(gè)(或多個(gè))聚乙二醇?xì)埢x擇性C末端共價(jià)綴合的方法。這是這樣的一種方法，其中與聚乙二醇共價(jià)綴合的小肽被通過酶催化轉(zhuǎn)移到要被PEG化的多肽。如本文所報(bào)道的酶催化方法給常規(guī)的需要化學(xué)品和特殊底物的方法提供了備選方案。通過實(shí)施本發(fā)明的方法，由于僅獲得單一的位點(diǎn)特異性修飾，所以不再需要分離同種型。此外，溫和的反應(yīng)條件防止蛋白變性并且，因此，限制產(chǎn)物損失。此外，可能對天然存在的多肽進(jìn)行位點(diǎn)特異的單PEG化，其使得經(jīng)工程改造的突變體變得多余。術(shù)語“氨基酸”當(dāng)在本文中使用時(shí)是指羧基a-氨基酸的組，其可以直接或以前體的形式為核酸所編碼。個(gè)體氨基酸為由三個(gè)核苷酸組成的核酸(所謂的密碼子或堿基三聯(lián)體)所編碼。每個(gè)氨基酸由至少一個(gè)密碼子所編碼。這稱作“遺傳密碼的簡并性”。術(shù)語“氨基酸”當(dāng)在本申請中使用時(shí)是指天然存在的羧基a-氨基酸，包括丙氨酸(三字母代碼ala，單字母代碼A)，精氨酸(arg，R)，天冬酰胺(asn，N)，天冬氨酸(asp，D)，半胱氨酸(cys，C)，谷氨酰胺(gln，Q)，谷氨酸(glu，E)，甘氨酸(gly，G)，組氨酸(his，H)，異亮氨酸(ile, I)，亮氨酸(leu, L)，賴氨酸(lys, K),甲硫氨酸(met, M)，苯丙氨酸(phe, F),脯氨酸(pro, P)，絲氨酸(ser, S)，蘇氨酸(thr, T)，色氨酸(trp, W)，酪氨酸(tyr, Y)和纟顏氨酸(val, V)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于實(shí)施本發(fā)明的方法和技術(shù)描述于例如Ausubel，F(xiàn). M.(編輯)，Current Protocols in Molecular Biology (當(dāng)今分子生物學(xué)方法)，卷 I 至III (1997) ,Wiley and Sons ;Sambrook 等，Molecular Cloning A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊)，Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N. Y. (1989)。當(dāng)用于本文時(shí)，“藥用載體”包括任何以及所有生理學(xué)相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收/再吸收延遲劑等。在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體適于注射或輸注。藥用載體包括無菌水溶液或分散液以及用于制備無菌水溶液或分散液的無菌粉末。這樣的介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域中已知的。除了水，載體可以是例如等滲緩沖鹽溶液。術(shù)語“聚乙二醇?xì)埢被?PEG”或“PEG分子"是指包含聚乙二醇作為主要級分或部分的分子或殘基。這種聚乙二醇可以包含一個(gè)或多個(gè)另外的化學(xué)基團(tuán)，所述一個(gè)或多個(gè)另外的化學(xué)基團(tuán)是結(jié)合反應(yīng)所必需的，由分子的化學(xué)合成產(chǎn)生，或是用于所述分子的各個(gè)部分的最佳距離的間隔區(qū)(spacer)。這些另外的化學(xué)基團(tuán)不用于計(jì)算聚乙二醇的分子量。此外，這樣的聚乙二醇可以包含一個(gè)或連在一起的多個(gè)聚乙二醇鏈。具有超過一個(gè)聚乙二醇鏈的聚乙二醇被稱作多臂或分支聚乙二醇。分支聚乙二醇可以例如通過將聚環(huán)氧乙烷添加到多種多元醇制備，所述多元醇包括甘油、季戊四醇和山梨糖醇。分支聚乙二醇報(bào)道于例如EP 0473084和US 5，932，462中。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚乙二醇?xì)埢欠肿恿繛?0-35kDa的聚乙二醇?xì)埢⑶沂侵辨溇垡叶細(xì)埢Ｔ诹硪粋€(gè)實(shí)施方案中，聚乙二醇?xì)埢欠肿恿砍^35kDa (尤其是具有40kDa)的聚乙二醇?xì)埢?，并且是分支聚乙二醇?xì)埢?。在另一個(gè)實(shí)施方案中聚乙二醇?xì)埢姆肿恿繛?0kDa并且是雙臂聚乙二醇?xì)埢?術(shù)語"PEG化"是指聚乙二醇分子在多肽的N端和/或內(nèi)部的賴氨酸殘基處的共價(jià)連接。多肽的PEG化在現(xiàn)有技術(shù)中是廣泛已知的并且由例如Veronese，F(xiàn). M.，Biomaterials 22 (2001) 405-417進(jìn)行了綜述。可以使用不同的官能團(tuán)和具有不同分子量的聚乙二醇分子、直鏈和分支PEG以及不同的連接基團(tuán)將PEG分子與多肽連接(同樣參見 Francis, G.E.等，Int. J. Hematol (國際血液學(xué)雜志) 68 (1998) 1-18 ;Delgado, C.等，Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9(1992)249-304)。多妝的 PEG 化可以在水溶液中進(jìn)行，使用例如在WO 00/44785中所述的PEG化試劑，在一個(gè)實(shí)施方案中，使用NHS活化的分子量在5kDa和40kDa之間的直鏈或分支PEG分子。根據(jù)Lu, Y.等，Reactive Polymers22(1994) 221-229，PEG化也能夠在固相進(jìn)行。非隨機(jī)地，也可以根據(jù)WO 94/01451制備N末端PEG化的多肽。"多肽"是自然產(chǎn)生的或合成的由通過肽鍵共價(jià)結(jié)合的氨基酸殘基組成的聚合物。少于約20個(gè)氨基酸殘基的多肽可以稱為"肽"，而由兩個(gè)或多個(gè)多肽組成或包含一個(gè)長度超過100個(gè)氨基酸殘基的多肽的分子可以稱作“蛋白質(zhì)”。多肽也可以包含非氨基酸組分，如碳水化合物基團(tuán)，金屬離子或羧酸酯。非氨基酸組分可以由表達(dá)該多肽的細(xì)胞添加，并且可以隨細(xì)胞類型而變化。本文中根據(jù)其氨基酸骨架結(jié)構(gòu)或編碼其的核酸來定義多肽。雖然如碳水化合物基團(tuán)之類的添加通常不被指明，但是其可以存在。Hoess等制備了胰蛋白酶突變體D189K，K60E, N143H，E151H(胰蛋白酶_4x_突變體)，所述突變體能夠克服胰蛋白酶對水解的占優(yōu)勢的親和性。此外，此突變體不顯示顯著的賴氨酸和精氨酸的蛋白水解C末端。胰蛋白酶-4x-突變體識別特異性基序，即序列酪氨酸-精氨酸-組氨酸(YRH)。胰蛋白酶-4x-突變體能夠通過構(gòu)建涉及組氨酸殘基之間的Zn2+離子的螯合物而與此識別位點(diǎn)特異性地相互作用。此識別序列出現(xiàn)在人多肽中的可能性非常小。因此，多位點(diǎn)特異性修飾和/或不需要的切割不太可能發(fā)生。為保證胰蛋白酶-4x-突變體的最佳識別，對此序列的進(jìn)一步修飾導(dǎo)致特殊標(biāo)簽的開發(fā)，所述特殊標(biāo)簽是一種經(jīng)修飾的“胰蛋白酶位點(diǎn)”，其由氨基酸序列酪氨酸-精氨酸-組氨酸-丙氨酸-丙氨酸-甘氨酸(YRHAAG) (SEQ ID NO :01)組成。此肽可以融合到多肽的C端，由此形成胰蛋白酶-4x-突變體的底物。此外，目標(biāo)肽是必需的，以使位點(diǎn)特異性PEG化成為可能。此肽應(yīng)當(dāng)與“胰蛋白酶位點(diǎn)”重疊，并由氨基酸序列精氨酸-組氨酸-丙氨酸-賴氨酸(RHAK)(SEQ ID N0:02)組成?？梢酝ㄟ^酶催化將此目標(biāo)肽轉(zhuǎn)移到多種分子。胰蛋白酶-4x-突變體切割酪氨酸和組氨酸殘基之間的肽鍵，由此除去部分的“胰蛋白酶位點(diǎn)”(RHAAG) (SEQID N0:03)。短的非天然氨基酸序列(YRHAK) (SEQ ID NO 04)保留在蛋白和結(jié)合的親核體(nucleophile)之間。然而，此短的延伸被結(jié)合的親核體例如聚乙二醇?xì)埢m度屏蔽，并且因此，此肽不太可能有免疫原活性。胰蛋白酶-4x-突變體中的修飾不能夠完全排除水解副反應(yīng)。因此，僅在通過添加乙二胺四乙酸(EDTA)以絡(luò)合Zn2+離子來將反應(yīng)在正確的時(shí)間停止時(shí)(如在如本文所報(bào)道的方法的一個(gè)實(shí)施方案中那樣)或通過將PH調(diào)節(jié)至酸性水平使pH范圍為適當(dāng)?shù)拿腹δ苄运匦钑r(shí)(如在如本文所報(bào)道的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中那樣)才能獲得最大產(chǎn)率?！┲亟M蛋白包含特殊的融合標(biāo)簽，例如用于方便隨后的純化步驟或只是允許構(gòu)建體的表達(dá)(否則太小就難以保證其在宿主細(xì)胞中的合適生產(chǎn))。一些已確立的標(biāo)簽是六 組氨酸標(biāo)簽(His標(biāo)簽)或Strep標(biāo)簽。His標(biāo)簽可以用于通過金屬-親和層析來純化融合蛋白，而Strep標(biāo)簽被應(yīng)用于使用鏈霉抗生物素蛋白柱來純化融合蛋白(Terpe, K. , Appl.Microbiol. Biotechnol. 60(2003)523-533)。在某些條件下，必須將這些標(biāo)簽切除，例如對于藥物或僅是為了保證正確的再折疊(如果需要)。使用具有定義的識別位點(diǎn)的蛋白酶的酶切是最合乎需要的方法。來源于淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)的免疫球蛋白A蛋白酶(IgA蛋白酶)被用于如本文所報(bào)道的方法的一個(gè)實(shí)施方案。據(jù)報(bào)道，IgA蛋白酶的識別位點(diǎn)是Yaa Pro丨Xaa Pro (Yaa代表Pro或者(很少地)代表與Ala, Gly或Thr組合的Pro :Pro Ala、Pro Gly或Pro Thr ;Xaa代表Thr、Ser或Ala)。來自淋病奈瑟球菌的IgA蛋白酶的合成肽底物是已知的蛋白自水解位點(diǎn)(參見例如Wood和Burton, Infectionand Immunity (感染和免疫)59 (1991) 1818-1822)。已知的IgA蛋白酶的識別位點(diǎn)包括以下序列，其中“丨”表示被切割的鍵的位置Pro-Ala-Pro 丨 Ser-Pro(SEQ ID NO :05),Pro-Pro 丨 Ser-Pro(SEQ ID NO :06),Pro-Pro 丨 Ala-Pro(SEQ ID NO :07),Pro-Pro 丨 Thr-Pro(SEQ ID NO :08),Pro-Pro I Gly-Pro(SEQ ID NO :09),Ala-Pro 丨 Arg-Pro(SEQ ID NO :14),Pro-Ala-Pro 丨 Arg-Pro(SEQ ID NO :15),Pro-Ala-Pro 丨 Gly-Pro(SEQ ID NO :16)，Pro-Pro-Thr-Pro 丨 Ser-Pro (SEQ ID NO :17),Pro-Arg-Pro-Pro 丨 Thr-Pro (SEQ ID NO :18),Pro-Arg-Pro-Pro 丨 Ser-Pro (SEQ ID NO :19),Pro-Arg-Pro-Pro 丨 Ala-Pro (SEQ ID NO :20),Pro-Arg-Pro-Pro 丨 Gly-Pro (SEQ ID NO :21),Lys-Pro-Ala-Pro 丨 Ser-Pro (SEQ ID NO :22),Ser-Thr-Pro-Pro 丨 Thr-Pro (SEQ ID NO :23),
Val-Ala-Pro-Pro 丨 Ser-Pro (SEQ ID NO :24),Ala-Pro-Arg-Pro-Pro 丨 Gly_Pro(SEQ ID NO :25),Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro 丨 Gly_Pro(SEQ ID NO :26),其中選擇頻率較高的是前三個(gè)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，融合多肽在N到C末端方向上包含His標(biāo)簽、間隔區(qū)、IgA蛋白酶切割位點(diǎn)(IgA位點(diǎn))、目的多肽、胰蛋白酶-4x-突變體切割位點(diǎn)(tryp位點(diǎn))以及任選地鏈霉抗生物素蛋白標(biāo)簽(strep標(biāo)簽)。、
使用胰蛋白酶-4x-突變體的位點(diǎn)特異性修飾的酶催化技術(shù)使得必須制備帶有此類修飾所需附件(appendage)的特殊構(gòu)建體。因此，在如本文所報(bào)道的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，融合多肽在N至C末端的方向上包含要被PEG化的多肽、胰蛋白酶-4x-突變體切割位點(diǎn)和Str印標(biāo)簽。在另一個(gè)實(shí)施方案中編碼融合多肽的核酸在5’至3’方向上包含i)編碼要被PEG化的多肽的核酸，ii)編碼氨基酸序列SEQ ID NO 01的核酸，以及iii)編碼Str印標(biāo)簽SEQ ID NO :13或27的核酸。因而，如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是制備與聚乙二醇?xì)埢Y合的多肽的方法，所述方法包括以下步驟a)將融合多肽和目標(biāo)多肽與胰蛋白酶突變體D189K，K60E, N143H, E151H溫育，所述融合多肽由在5’至3’方向上包含i)編碼該多肽的核酸，以及ii)編碼氨基酸序列SEQID NO :01的核酸的核酸編碼，所述目標(biāo)多肽具有氨基酸序列SEQ ID N0:02并且在C末端賴氨酸殘基處與聚乙二醇?xì)埢矁r(jià)綴合，并且b)從溫育混合物回收并因此生產(chǎn)與一個(gè)聚乙二醇?xì)埢Y合的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，融合多肽被這樣的核酸編碼，所述核酸在5’至3’方向上包含i)編碼要被PEG化的多肽的核酸，ii)編碼氨基酸序列SEQ IDNO 01的核酸，以及iii)編碼氨基酸序列SEQ ID NO : 13或27的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括以下作為第一步a-1)培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼融合多肽的核酸，所述核酸在5’至3’方向上包含i)編碼要被PEG化的多肽的核酸，ii)編碼氨基酸序列SEQ ID NO 01的核酸，以及iii)編碼氨基酸序列SEQ ID NO : 13或27的核酸，并且從細(xì)胞和/或培養(yǎng)基回收
融合多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述溫育包括i)將融合多肽和目標(biāo)肽與鹽酸胍在緩沖溶液中溫育ii)將胰蛋白酶突變體01891(，1(6(^，附431^15111與211(11)-鹽溫育，iii)合并并溫育i)和ii)的溫育混合物。以下通過使用IGF-I蛋白來舉例說明本發(fā)明，在進(jìn)行本發(fā)明時(shí)在本實(shí)驗(yàn)室中可以獲得充足量的所述IGF-I蛋白。這不應(yīng)被解釋為限制，它只是作為實(shí)例提供，原因在于本發(fā)明可以利用幾乎任何多肽來實(shí)施。本發(fā)明的真正范圍在所附權(quán)利要求中闡明。示例性構(gòu)建體攜帶His標(biāo)簽、間隔區(qū)和IgA蛋白酶切割位點(diǎn)(IgA位點(diǎn))(IGF-I多肽的N端(部分))以及胰蛋白酶切割位點(diǎn)(tryp位點(diǎn))以及任選地鏈霉抗生物素蛋白標(biāo)簽(str印標(biāo)簽)(IGF-I-多肽的C端(部分))(同樣參見圖I)His 標(biāo)簽-間隔區(qū)-IgA 位點(diǎn)-wt-hlGF-tryp 位點(diǎn)-strep 標(biāo)簽(SEQ ID NO 10)His 標(biāo)簽-間隔區(qū)-IgA 位點(diǎn)-wt-hlGF-tryp 位點(diǎn)(SEQ ID NO 11)His 標(biāo)簽-間隔區(qū)-IgA 位點(diǎn)-hIGF(K27R，K65R) -tryp 位點(diǎn)(SEQ ID NO : 12)
可以在低至400iil的終體積中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定由胰蛋白酶-4x_突變體催化的酯交換反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)。可以在酶反應(yīng)前，將包含IGF-I的要被位點(diǎn)特異修飾的融合多肽與2M三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)緩沖液(終濃度為0. 2M)，pH 8. 0，親核體(RHAK-6CF(SEQ ID NO 02)或RHAK-MCa-PEG20000 (SEQ ID NO :02))，以及鹽酸胍(Gdm-HCl)溫育。不受限于理論，以此方式IGF構(gòu)建體的可溶性可以得到保持并且低濃度的鹽酸胍可能引入部分變性，并且因此，在酶反應(yīng)期間提供具有“胰蛋白酶位點(diǎn)”的C端的更好的可接近性。胰蛋白酶-4x-突變體可以在存在Zn2+離子的情況下預(yù)溫育?？梢酝ㄟ^合并兩種反應(yīng)混合物A和B來獲得良好的酶活性，其中混合物A包含含有IGF-I的融合多肽，混合物B包含胰蛋白酶-4x-突變體。反應(yīng)混合物可以具有的PH值為pH 8.0。總反應(yīng)混合物可以在30°C溫育，同時(shí)輕輕振動(dòng)?？梢允褂肐SOmin的總反應(yīng)時(shí)間，并且每30min取一次樣品?？梢酝ㄟ^將Zn2+離子與EDTA絡(luò)合來終止酶反應(yīng)。最后，可以通過添加緩沖溶液(緩沖液S，其含IOOmM TRIS, 150mMNaCl,pH 8.0)將體積調(diào)節(jié)至最終的稀釋因子為I : 2。樣品可以通過SEC分析。取決于所使用的標(biāo)記，可以應(yīng)用不同的SEC柱。例如，對于RHAK-6CF可以使用分離范圍為100_7000Da的Superdex 肽柱，對于RHAK-MCa_PEG20000可以使用分離范圍為3000_70000Da的Superdex 75 柱(GE Healthcare)。利用RHAK-6CF的位點(diǎn)特異性修飾的產(chǎn)率可以確定如下?？梢灾苽溆坞xRHAK-6CF的濃度稀釋系列(0. 5，1，5，10，25，50和100iig/ml)。緩沖液S可以用作溶劑，因?yàn)镽HAK-6CF熒光對pH敏感。校準(zhǔn)樣品可以通過SEC分析。可以對不同的濃度確定由514nm處的輻射發(fā)射產(chǎn)生的包含RHAK-6CF的峰的峰面積并作圖，因此提供校準(zhǔn)曲線。反應(yīng)樣品可以通過SEC以與校準(zhǔn)樣品相同的方式進(jìn)行分析，并且可以確定熒光產(chǎn)物的峰面積?？梢酝ㄟ^使用校準(zhǔn)曲線來確定形成的RHAK-6CF的量，并因此確定具有此親核體的位點(diǎn)特異性修飾的產(chǎn)率。對于所有構(gòu)建體，產(chǎn)率隨時(shí)間增加。在大約150min后，可以獲得最大產(chǎn)率。構(gòu)建體wt-hlGF-胰蛋白酶位點(diǎn)-str印標(biāo)簽提供最好的結(jié)果，在150min后產(chǎn)率為17. 5%。相對t匕，wt-hlGF-胰蛋白酶位點(diǎn)和mut-hIGF(K27R，K65R)提供較低和相對相等的最大結(jié)果(分別為)150min后為11. 9%而180min后為13. 0%。在使用RHAK-6CF的位點(diǎn)特異性修飾期間產(chǎn)量隨時(shí)間的增加顯示在圖2B中。當(dāng)RHAK-MCa_PEG20000用作親核體時(shí)，在游離的、未綴合的RHAK-MCa_PEG20000和RHAK-MCa-PEG20000標(biāo)記的IGF-I的分離中產(chǎn)生問題。這可能是由于親核體及綴合產(chǎn)物相似的大小。因此，在此情況下，不可能通過產(chǎn)物的增加來確定位點(diǎn)特異性修飾的產(chǎn)率，而需要不同的方法。因?yàn)閮H發(fā)生單個(gè)位點(diǎn)特異性修飾，所以未修飾的IGF-I (離析物)的減少可以等同于綴合產(chǎn)物的增加。未修飾的IGF-I的減少通過由在226nm處的吸光度產(chǎn)生的HPLC層析譜峰面積來評估。如同使用RHAK-6CF的修飾一樣，使用RHAK-MCa_PEG20000的修飾的產(chǎn)率隨時(shí)間增加(圖3和4)。使用構(gòu)建體wt-hlGF-tryp位點(diǎn)-str印標(biāo)簽，令人驚奇地，在180min后可以獲得23. I %的最高產(chǎn)率。mut-IGF (K27R，K65R)-tryp位點(diǎn)(180min后20. 6% )和wt-hlGF-tryp位點(diǎn)(180min后19. 9% )獲得幾乎相等的結(jié)果。表 I : 比較使用RHAK-6CF或RHAK-MCa_PEG20000的位點(diǎn)特異性修飾的產(chǎn)率
IGF-I構(gòu)建體親核體最大產(chǎn)率最大產(chǎn)率所需的溫育時(shí)間
[min]
wt-hlGF-tryp 位 RHAK-6CF17.5150點(diǎn)-Strep標(biāo)簽 RHAK-MCa-PEG20
23.1180
000
wt-hlGF-tryp 位 RHAK-6CF
119150
點(diǎn)RHAK-MCa-PEG20
19.9180
000
IGF-I構(gòu)建體親核體最大產(chǎn)率最大產(chǎn)率所需的溫育時(shí)間
Tininl----
mut-hlGF-trvp RHAK-6CF
^13.0180
位點(diǎn)RHAK-MCa-PEG20
20.6180
000對使用RHAK-6CF或RHAK-MCa-PEG20000進(jìn)行位點(diǎn)特異性修飾的不同融合多肽的比較顯示在表I中?？傮w上，使用RHAK-MCa-PEG20000的修飾比使用RHAK-6CF的修飾具有更高的產(chǎn)率。但是要被PEG化的多肽對產(chǎn)率也有影響。使用構(gòu)建體wt-hlGF-tryp位點(diǎn)-strep標(biāo)簽可以獲得最高的產(chǎn)率而與目標(biāo)多肽(或親核體)無關(guān)。構(gòu)建體wt-hlGF-tryp位點(diǎn)和mut-hlGF-tryp位點(diǎn)產(chǎn)生幾乎相等的結(jié)果。因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn),Strep標(biāo)簽的存在加強(qiáng)了 C端位點(diǎn)特異性酶催化修飾。為證實(shí)單一和C端位點(diǎn)特異性修飾，標(biāo)記的IGF-I構(gòu)建體可以通過質(zhì)譜進(jìn)行分析。為此，可以使用每個(gè)構(gòu)建體的RHAK-6CF的位點(diǎn)特異性修飾的400 ill反應(yīng)。該反應(yīng)可以在30°C溫育150min并且隨后通過添加200 u I IOmM EDTA溶液終止。之后可以通過添加200 Ul緩沖液S將反應(yīng)溶液稀釋至I : 2。整個(gè)標(biāo)記反應(yīng)可以通過尺寸排阻層析來純化。包含RHAK-6CF的IGF-I融合多肽的可以被收集和濃縮。隨后可以通過質(zhì)譜技術(shù)分析純化的位點(diǎn)特異性修飾的IGF-I構(gòu)建體的總分子量。來源于消化(Asp-N消化)的片段的分子量證實(shí)所有構(gòu)建體的具有RHAK-6CF的單個(gè)、C端位點(diǎn)特異性修飾。因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了使用胰蛋白酶_4x突變體修飾工程化的多肽(例如帶有“胰蛋白酶位點(diǎn)”的IGF-I)的C端位點(diǎn)特異性修飾的新的酶催化方法。使用此新的技術(shù)，可能位點(diǎn)特異地修飾多肽，例如野生型人IGF-I，而沒有獲得不均一的、活性減弱的修飾的風(fēng)險(xiǎn)。這些不需要的副產(chǎn)品在過去經(jīng)常限制PEG化應(yīng)用。此新的酶學(xué)方法可以容易地用于PEG化蛋白質(zhì)藥物的制備。可以使用其他可能的親核體來代替PEG包含于目標(biāo)多肽中，如目標(biāo)多肽包含/綴合有熒光染料、生物素、糖類等等。簡單的添加短肽RHAK(SEQ ID NO :02)可以使這些能夠用于使用胰蛋白酶-4x-突變體系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)移。wt-hlGF-tryp位點(diǎn)-strep標(biāo)簽構(gòu)建體的酶催化PEG化的反應(yīng)條件通過減少標(biāo)記(RHAK-MCa-PEG20000)的量和胰蛋白酶_4x_突變體的量以及用HEPES緩沖液替代TRIS緩沖液進(jìn)一步得到優(yōu)化。提供以下實(shí)施例、序列表和附圖
來幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真正范圍由所附權(quán)
利要求闡明。要理解，可以對所述程序在不背離本發(fā)明的精神的情況下進(jìn)行修飾。序列列表描述SEQ ID NO 01修飾的胰蛋白酶位點(diǎn)(tryp位點(diǎn))SEQ ID NO 02位點(diǎn)特異性PEG化所需的目標(biāo)肽SEQ ID NO :03胰蛋白酶位點(diǎn)的置換部分SEQ ID N0:04 剩余肽序列SEQ ID NO 05至09以及14至26 IgA-蛋白酶切割位點(diǎn)SEQ ID NO :IOHis 標(biāo)簽-間隔區(qū)-IgA 位點(diǎn)-wt-hlGF-tryp 位點(diǎn)-strep 標(biāo)簽SEQ ID NO =IlHis 標(biāo)簽-間隔區(qū)-IgA 位點(diǎn)-wt-hlGF-tryp 位點(diǎn)SEQ ID NO 12His 標(biāo)簽-間隔區(qū)-IgA 位點(diǎn) _hIGF(K27R，K65R) -tryp 位點(diǎn)SEQ ID NO :13 和 27Str印標(biāo)簽SEQ ID NO :28包含N端his標(biāo)簽和IgA蛋白酶切割位點(diǎn)的單PEG化的人IGF-I的氨基酸序列SEQ ID NO :29單PEG化的人IGF-I的氨基酸序列附圖描述圖I不同構(gòu)建體的示意圖。圖2校準(zhǔn)曲線RHAK-6CF (A)和產(chǎn)率RHAK-6CF標(biāo)記(B)。A:使用SEC分析在IOOmM Tris, 150mM NaCl, pH 8. 0中制備的具有以下濃度的稀釋系列0. 5、l、5、10、25、50、100ii g/ml。確定在514nm處的RHAK-6CF輻射的峰面積并相對于濃度制圖。決定系數(shù)(R2)和應(yīng)用的趨勢線的方程得到顯示。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果并且顯示土標(biāo)準(zhǔn)差。B :根據(jù)4. 3. 8準(zhǔn)備RHAK-6CF標(biāo)記的標(biāo)記反應(yīng)。樣品通過SEC進(jìn)行分析。(左)wt-hlGF-tryp 位點(diǎn)-strep 標(biāo)簽，(中)wt-hIGF-tryp 位點(diǎn)，(右):mut_hIGF (K27R,K65R) -tryp 位點(diǎn)。圖3使用RHAK-6CF或RHAK-MCa_PEG20000的位點(diǎn)特異性修飾的產(chǎn)率的比較。(左)RHAK-6CF，(右)RHAK-MCa-PEG20000。圖4在優(yōu)化條件下C端修飾的IGF-I的依賴于時(shí)間的增加(親核體RHAK-MCa-PEG20000)。縮寫
“胰蛋白酶側(cè)”氨基酸序列YRHAAG6-CF羧基熒光素Gdm-HCl鹽酸胍His標(biāo)簽聚組氨酸標(biāo)簽MCa甲基香豆素PEG聚乙二醇Strep鏈霉抗生物素蛋白
TRIS2-氨基-I-羥甲基-I，3-丙二醇Tryp“胰蛋白酶位點(diǎn)”IGF-I胰島素樣生長因子I胰蛋白酶-4x-突變體突變體胰蛋白酶D189K，K60E, N143H，E151H材料和方法分析型尺寸排阻層析緩沖液:0.5M TRIS,0. 15M NaCl，pH 7. 5柱Superdex Peptide 10/300GL系統(tǒng)Dionex方法以0. 5ml/min的流速進(jìn)行等度洗脫?？偟难h(huán)時(shí)間為70min。注射50 yl樣品。通過跟蹤220和280nm處的吸光度信號來追蹤分離的過程。標(biāo)記期間的尺寸排阻層析緩沖液:IOOmMTRIS, 150mM NaCl，pH 8. 0柱Superdex P印tide 10/300GL (RHAK-6CF 標(biāo)記)Superdex 7510/300GL (RHAK-MCa-PEG2OOOO 標(biāo)記)系統(tǒng)Gynkotek(RHAK-6CF 標(biāo)記)Dionex (RHAK-MCa-PEG20000 標(biāo)記，參見表 8)RHAK-6CF標(biāo)記方法以0. 5ml/min的流速進(jìn)行等度洗脫?？偟难h(huán)時(shí)間為60min。RHAK-MCa-PEG20000標(biāo)記方法以0. 75ml/min的流速進(jìn)行等度洗脫?？偟难h(huán)時(shí)間為45min。注射50 u I樣品(250 u I用于制備)。通過跟蹤220nm、280nm、320nm處的吸光度信號(RHAK-MCa-PEG20000 標(biāo)記)以及熒光信號(消光=490nm，發(fā)射=514nm) (RHAK-6CF標(biāo)記)來追蹤分離的過程。實(shí)施例I位點(diǎn)特異性修飾使用RHAK-6CF和RHAK-MCa_PEG20000來完成IGF-I構(gòu)建體的位點(diǎn)特異性標(biāo)記。表2:位點(diǎn)特異性修飾的組分。給出儲液的濃度和說明。
權(quán)利要求
1.制備與聚乙二醇?xì)埢Y合的多肽的方法，所述方法包括以下步驟 a)將融合多肽和目標(biāo)多肽與胰蛋白酶突變體D189K，K60E,N143H, E151H溫育，所述融合多肽由核酸編碼，所述核酸在5’至3’方向上包含i)編碼所述多肽的核酸和ii)編碼氨基酸序列SEQ ID NO 01的核酸，所述目標(biāo)多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO 02并且在C末端賴氨酸殘基處與聚乙二醇?xì)埢矁r(jià)綴合，和 b)回收并由此產(chǎn)生與一個(gè)聚乙二醇?xì)埢Y合的多肽。
2.權(quán)利要求I的方法，其特征在于所述溫育包括 i)將所述融合多肽和所述目標(biāo)肽與鹽酸胍在緩沖溶液中溫育， ii)將胰蛋白酶突變體D189K，K60E,N143H, E151H與Zn(II)-鹽溫育，和 iii)合并并且溫育i)和ii)的溫育混合物。
3.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述融合多肽由核酸編碼，所述核酸在.5’至3’方向上包含 i)編碼所述多肽的核酸， ii)編碼氨基酸序列SEQID NO 01的核酸，以及 iii)編碼氨基酸序列SEQID NO : 13或SEQ ID NO 27的核酸。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述溫育為150分鐘至180分鐘。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于步驟a)中的核酸還包含 iii)編碼氨基酸序列SEQ ID NO 13的核酸。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述溫育是在HEPES緩沖溶液中。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述多肽是人IGF-I。
8.權(quán)利要求7的方法，其特征在于所述融合多肽具有選自SEQID NO 10, SEQ ID NO:11或SEQ ID NO 12的氨基酸序列。
9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述編碼融合多肽的核酸是編碼具有氨基酸序列SEQ ID NO 10的多肽的核酸。
10.多肽，其具有氨基酸序列SEQID NO:28或SEQ ID NO :29并且在C末端賴氨酸殘基處與一個(gè)聚乙_■醇?xì)埢Y合。
11.藥物組合物，其包含權(quán)利要求10的多肽或使用權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)的方法獲得的多肽。
12.權(quán)利要求10的多肽或使用權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)的方法獲得的多肽在制備用于治療阿爾茨海默病的藥物中的用途。
13.權(quán)利要求10的多肽或使用權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)的方法獲得的多肽，所述多肽用作藥物。
14.權(quán)利要求10的多肽或使用權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)的方法獲得的多肽，所述多肽用于治療或預(yù)防阿爾茨海默病。
15.治療方法，所述方法包括向需要其的受試者給予治療有效量的權(quán)利要求10的多肽或使用權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)的方法獲得的多肽。
全文摘要
本文報(bào)道了制備與一個(gè)聚乙二醇綴合的多肽的方法，所述方法包括a)提供編碼表達(dá)構(gòu)建體的核酸，所述核酸在5′至3′方向上包含編碼多肽的核酸，以及編碼胰蛋白酶位點(diǎn)SEQ ID NO01的核酸，b)在細(xì)胞中表達(dá)a)的核酸，并且從細(xì)胞和/或培養(yǎng)基回收表達(dá)構(gòu)建體，c)給目標(biāo)肽提供于C末端賴氨酸殘基處與聚乙二醇共價(jià)綴合的氨基酸序列SEQ ID NO02，d)將表達(dá)構(gòu)建體和目標(biāo)肽與胰蛋白酶突變體D189K，K60E，N143H，E151H溫育，并且e)從溫育混合物回收并由此產(chǎn)生與一個(gè)聚乙二醇綴合的多肽。
文檔編號C07K14/65GK102740896SQ201180008318
公開日2012年10月17日 申請日期2011年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月11日
發(fā)明者E·M·特羅斯特-格羅斯, E·赫斯, F·黑塞, S·米勒 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司