專(zhuān)利名稱(chēng)：滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥用生物制品制備方法，尤其涉及一種將從人尿提取的胰蛋白酶抑制劑中所含病毒滅活的方法。
背景技術(shù)：
人尿膜蛋白酶抑制劑(human Urinary Trypsin Inhibitor, hUTI)是一種從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來(lái)的糖蛋白，由143個(gè)氨基酸組成，SDS-PAGE測(cè)得的相對(duì)分子質(zhì)量范圍40kDa-45kDa(Eur.J.Biochem.，158，417-422)。其屬于蛋白酶抑制劑，對(duì)胰蛋白酶、α -糜蛋白酶等絲氨酸蛋白酶及粒細(xì)胞彈性蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、巰基酶和纖溶酶等多種酶具有抑制作用。此外，其還具有穩(wěn)定溶酶體膜，抑制溶酶體酶的釋放，抑制心肌抑制因子(MDF)產(chǎn)生，清除氧自由基及抑制炎癥介質(zhì)釋放的作用。人尿胰蛋白酶抑制劑還可改善手術(shù)刺激引起的免疫功能下降、蛋白代謝異常和腎功能降低，治療關(guān)節(jié)炎，治療嚴(yán)重急性呼吸綜合征，防止手術(shù)刺激引起的對(duì)內(nèi)臟器官與細(xì)胞的損傷以及改善休克時(shí)的循環(huán)狀態(tài)等(CN102205115A、CN101024075A、CN1751740A、CN1449823A、CN101837121A、CN101954072A、CN101954071A、CN101972471A、CN101020048A 和 CN101095948A)。對(duì)于人尿胰蛋白酶抑制劑的分離純化的研究已開(kāi)展幾十年，已知的這些純化方法有陰離子交換色譜、金屬螯合樹(shù)脂分離、超濾、凝膠過(guò)濾、親和性色譜、無(wú)機(jī)吸附劑處理、鹽析、等電點(diǎn)沉淀法、脫乙酰殼多糖吸附和不溶性胰蛋白酶處理等(特開(kāi)昭51-51579、特開(kāi)昭51-118810、特開(kāi)昭 51-123810、特開(kāi)昭 55-160724、特開(kāi)昭 56-99427、特開(kāi)昭 57-140728、特開(kāi)昭60-260518、特開(kāi)昭61-37736和特開(kāi)平5-9200)。中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利ZL 200610000200.2和ZL 200610000601.8在特開(kāi)平5-9200所公開(kāi)技術(shù)的基礎(chǔ)上分別提供了一種獲得高純度烏司他丁的方法，所得烏司他丁濃度為5萬(wàn)單位/ml時(shí)，在405nm處光吸收值不超過(guò)0.2，人尿激肽原酶含量不超過(guò)0.0005PNAU，抑制胰蛋白酶的活性不低于3500單位/mg蛋白(凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量)。由于人尿胰蛋白酶抑制劑一般從新鮮人尿中分離提取而得，具有被病毒污染的潛在風(fēng)險(xiǎn)。前述這些研究大都集中于對(duì)人尿胰蛋白酶抑制劑的分離純化，但是對(duì)于其中所可能含有的病毒(如:人免疫缺陷病毒、腦心肌炎病毒、偽狂犬病毒、水皰性口炎病毒和肝炎病毒等)去除方面所給予的關(guān)注較少。特開(kāi)昭61-37736公開(kāi)了一種去除人尿胰蛋白酶抑制劑中所含肝炎病毒的方法，該方法采用在pH2-8(尤以3-5為佳)溶液中60°C加熱處理10小時(shí)，去除混雜在原料中的病原性肝炎病毒。其結(jié)果表明經(jīng)過(guò)10小時(shí)60°C加熱處理，人尿胰蛋白酶抑制劑在 酸性下穩(wěn)定，而在PH8以上的堿性則表現(xiàn)出不穩(wěn)定。除了熱處理法(包括干熱處理、蒸汽處理和巴斯德加熱處理法)以外，其它方法如:有機(jī)溶劑/表面活性劑(S/D)處理法、胃蛋白酶處理方法、紫外線(xiàn)照射處理方法、低pH孵化法、納米膜過(guò)濾法和低溫乙醇分離法等也可被用于病毒滅活。周錫鵬等人驗(yàn)證了人尿胰蛋白酶抑制劑生產(chǎn)工藝中采用的60°C水浴10小時(shí)和乙醇處理3小時(shí)的病毒滅活方法(中國(guó)生化藥物雜志[J]，2009，6，407-410)，雖然具有較好的滅活效果，但有機(jī)溶劑(乙醇)會(huì)殘留在終產(chǎn)品中，進(jìn)而影響用藥的安全。雖然現(xiàn)有技術(shù)已在滅活人尿胰蛋白酶抑制劑所含病毒方面進(jìn)行了初步研究，但是這些技術(shù)或適用于滅活肝炎病毒，或仍對(duì)用藥安全性產(chǎn)生影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，通過(guò)綜合運(yùn)用多種病毒滅活方法，不斷調(diào)整滅活條件和其它手段相配合，進(jìn)一步提高病毒的滅活效果。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，與人尿胰蛋白酶抑制劑的分離純化過(guò)程相配合，在分離過(guò)程中實(shí)現(xiàn)病毒的滅活。本發(fā)明提供的一種滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其主要步驟如下:將從人尿中提取的人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解于PH5.0緩沖液，并于60°C加熱10小時(shí)，然后吸附于DEAE層析柱，之后使用pH4.0含NaCl濃度為0.3M的0.1M醋酸緩沖液洗脫，得DEAE洗脫液；接著將DEAE洗脫液于1.5M-2.5M硫酸銨溶液上樣，并吸附于疏水層析柱，之后使用IM硫酸銨溶液洗脫，得疏水洗脫液；疏水洗脫液經(jīng)超濾后，于25°C，低pH孵化5小時(shí)后，再經(jīng)凝膠過(guò)濾層析得病毒滅活的人尿胰蛋白酶抑制劑。人尿胰蛋白酶抑制劑粗品的配置濃度，與病毒的去除有一定的關(guān)聯(lián)。本發(fā)明優(yōu)先選擇濃度為50mg/ml-100mg/ml的溶液。本發(fā)明采用的低pH孵化，其pH為1.5-4.5，優(yōu)先選擇2.5-4,如:但不僅限于，2.5、
2.7、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9 和 4。
`
本發(fā)明吸附于DEAE層析柱所用的緩沖液為pH4.0含NaCl濃度為0.1M的0.1M醋
酸緩沖液。本發(fā)明超濾所用的超濾膜分子量為10K。本發(fā)明提供的另一種滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其主要步驟如下:將從人尿中提取的人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解于pH5.0緩沖液，制成濃度為50mg/ml-100mg/ml的溶液，并于60°C加熱10小時(shí)，然后將溶液于pH4.0含NaCl濃度為0.1M的0.1M醋酸緩沖液中上樣，并吸附于DEAE層析柱，之后使用pH4.0含NaCl濃度為0.3M的
0.1M醋酸緩沖液洗脫，得DEAE洗脫液；接著將DEAE洗脫液于1.5M-2.5M硫酸銨溶液上樣，并吸附于疏水層析柱，之后使用IM硫酸銨溶液洗脫，得疏水洗脫液；疏水洗脫液經(jīng)IOK膜超濾后，于25°C，pH2.5-3.5條件5小時(shí)后，再經(jīng)凝膠過(guò)濾層析得病毒滅活的人尿胰蛋白酶抑制劑。本發(fā)明所使用的人尿胰蛋白酶抑制劑粗品，其活性為200單位/mg-3000單位/mg，可采用目前現(xiàn)有各種方法制得，如:但不僅限于，特開(kāi)昭51-51579、特開(kāi)昭51-118810、特開(kāi)昭 51-123810、特開(kāi)昭 55-160724、特開(kāi)昭 56-99427、特開(kāi)昭 57-140728、特開(kāi)昭 60-260518、特開(kāi)昭61-37736、特開(kāi)平5-9200、中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利ZL200610000200.2和中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利ZL200610000601.8。為配合本發(fā)明病毒滅活方法，本發(fā)明提供的一種人尿胰蛋白酶抑制劑的分離方法，其步驟如下:I)將新鮮收集的尿液傾入攪拌池中，邊攪拌，邊將pH調(diào)至8.5-9.0，靜置后取上清尿液；2)調(diào)節(jié)上清尿液pH至4.5-6.5后，按每噸上清尿液加入25kg脫乙酰殼多糖，邊加邊攪拌，靜置后取沉淀，并濾干得吸附物。3)所得吸附物加入3倍重量的水漂洗并濾干，重復(fù)2次以上；4)每千克吸附物加入1.0-2.0升pH為10.5-12.0的3N氨水溶液，洗脫吸附物，并收集氨水洗脫液；5)根據(jù)按每升氨水洗脫液加入400g_450g固體硫酸銨，至全部溶解，靜置過(guò)夜；6)以硅藻土作底，抽濾，即得抽濾物；7)每公斤抽濾物加入10升水溶解，將pH調(diào)至5.5-6.5后，離心，取上清液；8)上清液用IOK超濾膜，得超濾濃縮液；9)每升超濾濃縮液加入I倍體積無(wú)水乙醇沉淀，并靜置過(guò)夜；之后取下層混懸液離心，得清液，再加入和清液相同體積的無(wú)水乙醇沉淀，并靜置過(guò)夜；再取下層混懸液離心，將沉淀物干燥，即得人尿胰蛋白酶抑制劑粗品。本發(fā)明提供的人尿胰蛋白酶抑制劑的分離方法，與本發(fā)明滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法相配合，能在分離過(guò)程中實(shí)現(xiàn)病毒的滅活，無(wú)需再經(jīng)其它病毒滅活步驟即可完成。

本發(fā)明技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的有益效果:本發(fā)明提供的滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，通過(guò)綜合運(yùn)用多種病毒滅活方法，尤其是先經(jīng)熱處理法再由低PH孵化法兩種病毒滅活手段，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)品無(wú)有機(jī)溶劑殘留，提高了用藥安全性。此外，還綜合了其它分離介質(zhì)(陰離子和疏水介質(zhì))實(shí)現(xiàn)了多種病毒(如:人免疫缺陷病毒、腦心肌炎病毒、偽狂犬病毒和水皰性口炎病毒)的滅活，進(jìn)一步提高了人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒滅活效果，使用藥的安全性得到進(jìn)一步提聞。本發(fā)明還通過(guò)與人尿胰蛋白酶抑制劑的分離方法的綜合，在分離人尿胰蛋白酶抑制劑的過(guò)程中實(shí)現(xiàn)了其中所含病毒的同步滅活，無(wú)需再經(jīng)其它病毒滅活步驟即可完成，有效減少了物料損失。
具體實(shí)施例方式以下詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。本發(fā)明實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。本發(fā)明所用的試劑若未明確指明，則均購(gòu)自于西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)。實(shí)施例1I)將新鮮收集的尿液傾入攪拌池中，邊攪拌，邊將pH調(diào)至8.5，靜置后取上清尿液；
2)調(diào)節(jié)上清尿液pH至4.5后，按每噸上清尿液加入25kg脫乙酰殼多糖，邊加邊攪拌，靜置后取沉淀，并濾干得吸附物。3)所得吸附物加入3倍重量的水漂洗并濾干，重復(fù)2次；4)每千克吸附物加入1.0升pH為10.5的3N氨水溶液,洗脫吸附物,并收集氨水洗脫液；5)根據(jù)按每升氨水洗脫液加入400固體硫酸銨，至全部溶解，靜置過(guò)夜；6)以硅藻土作底，抽濾，即得抽濾物；7)每公斤抽濾物加入10升水溶解，將pH調(diào)至5.5后，離心，取上清液；8)上清液用IOK超濾膜，得超濾濃縮液；9)每升超濾濃縮液加入I倍體積無(wú)水乙醇沉淀，并靜置過(guò)夜；之后取下層混懸液離心，得清液，再加入和清液相同體積的無(wú)水乙醇沉淀，并靜置過(guò)夜；再取下層混懸液離心，將沉淀物干燥，即得人尿胰蛋白酶抑制劑粗品；10)人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解于pH5.0緩沖液，制成濃度為50mg/ml的溶液，并于60°C加熱10小時(shí)，然后將溶液于pH4.0含NaCl濃度為0.1M的0.1M醋酸緩沖液中上樣，并吸附于DEAE層析柱，之后使用pH4.0含NaCl濃度為0.3M的0.1M醋酸緩沖液洗脫，得DEAE洗脫液；接著將DEAE洗脫液于2.0M硫酸銨溶液上樣，并吸附于疏水層析柱，之后使用IM硫酸銨溶液洗脫，得疏水洗脫液；疏水洗脫液經(jīng)IOK膜超濾后，于25°C，pH3±0.1條件5小時(shí)后，再經(jīng)凝膠過(guò)濾層析得病毒滅活的人尿胰蛋白酶抑制劑。選擇不同的種類(lèi)的病毒為代表分別進(jìn)行病毒滅活效果檢測(cè)，如:以人免疫缺陷病毒代表逆轉(zhuǎn)錄病毒；腦心肌炎病毒和`水皰性口炎病毒代表單鏈RNA病毒；偽狂犬病毒代表雙鏈DNA病毒。將制得的人尿胰蛋白酶抑制劑送至軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所和上海生物制品研究所分別進(jìn)行人免疫缺陷病毒(HIV-1)和腦心肌炎病毒、偽狂犬病毒以及水皰性口炎病毒的病毒滅活委托檢測(cè)。結(jié)果表明，60°C條件下，經(jīng)10小時(shí)可使初始滴度值(LgTCID50Ail) % 11.50 的 HIV-1 病毒下降 6 個(gè) Lg 以上，初始滴度值(LgTCID50M)為 6.50的腦心肌炎病毒病毒60°C 1/2小時(shí)處理后下降4個(gè)Lg，I小時(shí)后檢測(cè)不到活體病毒。25°C，pH3±0.1條件下，經(jīng)5小時(shí)可使初始滴度值(LgTCID5tZml)為5.6的偽狂犬病毒下降4個(gè)Lg以上，初始滴度值(LgTCID5Q/ml)為6.50的水皰性口炎病毒病毒下降4個(gè)Lg以上。熱處理(pH5.0，60°C，10小時(shí))蛋白回收彡90%，效價(jià)回收95%。低pH孵化法(25°C, pH3±0.1，5小時(shí))蛋白回收彡90%，效價(jià)回收95%。實(shí)施例2I)將新鮮收集的尿液傾入攪拌池中，邊攪拌，邊將pH調(diào)至9.0，靜置后取上清尿液；2)調(diào)節(jié)上清尿液pH至6.5后，按每噸上清尿液加入25kg脫乙酰殼多糖，邊加邊攪拌，靜置后取沉淀，并濾干得吸附物。3)所得吸附物加入3倍重量的水漂洗并濾干，重復(fù)3次；4)每千克吸附物加入2.0升pH為12.0的3N氨水溶液,洗脫吸附物,并收集氨水洗脫液；5)根據(jù)按每升氨水洗脫液加入450g固體硫酸銨，至全部溶解，靜置過(guò)夜；
6)以硅藻土作底，抽濾，即得抽濾物；7)每公斤抽濾物加入10升水溶解，將pH調(diào)至6.5后，離心，取上清液；8)上清液用1OK超濾膜，得超濾濃縮液；9)每升超濾濃縮液加入I倍體積無(wú)水乙醇沉淀，并靜置過(guò)夜；之后取下層混懸液離心，得清液，再加入和清液相同體積的無(wú)水乙醇沉淀，并靜置過(guò)夜；再取下層混懸液離心，將沉淀物干燥，即得人尿胰蛋白酶抑制劑粗品。10)人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解于pH5.0緩沖液，制成濃度為70mg/ml的溶液，并于60°C加熱10小時(shí)，然后將溶液于pH4.0含NaCl濃度為0.1M的0.1M醋酸緩沖液中上樣，并吸附于DEAE層析柱，之后使用pH4.0含NaCl濃度為0.3M的0.1M醋酸緩沖液洗脫，得DEAE洗脫液；接著將DEAE洗脫液于2.0M硫酸銨溶液上樣，并吸附于疏水層析柱，之后使用IM硫酸銨溶液洗脫，得疏水洗脫液；疏水洗脫液經(jīng)IOK膜超濾后，于25°C，pH3±0.1條件5小時(shí)后，再經(jīng)凝膠過(guò)濾層析得病毒滅活的人尿胰蛋白酶抑制劑。將制得的人尿胰蛋白酶抑制劑按實(shí)施例1的方法分別進(jìn)行人免疫缺陷病毒HIV-1和腦心肌炎病毒、偽狂犬病毒以及水皰性口炎病毒的病毒滅活委托檢測(cè)。結(jié)果表明，60°C條件下，經(jīng)10小時(shí)可使初始滴度值(LgTCID5ciAil)為11.31的HIV-1病毒下降6個(gè)Lg以上，初始滴度值(LgTCID5ciAil)為6.70的腦心肌炎病毒病毒60°C 1/2小時(shí)處理后下降4個(gè)Lg，1小時(shí)后檢測(cè)不到活體病毒。25°C，pH3±0.1條件下，經(jīng)5小時(shí)可使初始滴度值(LgTCID5tl/ml)為5.5的偽狂犬病毒下降4個(gè)Lg以上，初始滴度值(LgTCID5(l/ml)為6.50的水皰性口炎病毒病毒下降4個(gè)L g以上。熱處理(pH5.0，60°C，10小時(shí))蛋白回收≥90%，效價(jià)回收95%。低pH孵化法(25°C，pH3±0.1，5小時(shí))蛋白回收≥90%，效價(jià)回收95%。實(shí)施例31)將新鮮收集的尿液傾入攪拌池中，邊攪拌，邊將pH調(diào)至9.0，靜置后取上清尿液；2)調(diào)節(jié)上清尿液pH至6.5后，按每噸上清尿液加入25kg脫乙酰殼多糖，邊加邊攪拌，靜置后取沉淀，并濾干得吸附物。3)所得吸附物加入3倍重量的水漂洗并濾干，重復(fù)2次以上；4)每千克吸附物加入1.5升pH為11.0的3N氨水溶液,洗脫吸附物,并收集氨水洗脫液；5)根據(jù)按每升氨水洗脫液加入450g固體硫酸銨，至全部溶解，靜置過(guò)夜；6)以硅藻土作底，抽濾，即得抽濾物；7)每公斤抽濾物加入10升水溶解，將pH調(diào)至6.5后，離心，取上清液；8)濾過(guò)液用IOK超濾膜，得超濾濃縮液；9)每升超濾濃縮液加入I倍體積無(wú)水乙醇沉淀，并靜置過(guò)夜；之后取下層混懸液離心，得清液，再加入和清液相同體積的無(wú)水乙醇沉淀，并靜置過(guò)夜；再取下層混懸液離心，將沉淀物干燥，即得人尿胰蛋白酶抑制劑粗品。10)人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解于ρΗ5.0緩沖液，制成濃度為100mg/ml的溶液，并于60°C加熱10小時(shí)，然后將溶液于pH4.0含NaCl濃度為0.1M的0.1M醋酸緩沖液中上樣，并吸附于DEAE層析柱，之后使用pH4.0含NaCl濃度為0.3M的0.1M醋酸緩沖液洗脫，得DEAE洗脫液；接著將DEAE洗脫液于2.0M硫酸銨溶液上樣，并吸附于疏水層析柱，之后使用IM硫酸銨溶液洗脫，得疏水洗脫液；疏水洗脫液經(jīng)IOK膜超濾后，于25°C，pH3±0.1條件5小時(shí)后，再經(jīng)凝膠過(guò)濾層析得病毒滅活的人尿胰蛋白酶抑制劑。將制得的人尿胰蛋白酶抑制劑按實(shí)施例1的方法分別進(jìn)行人免疫缺陷病毒HIV-1和腦心肌炎病毒、偽狂犬病毒以及水皰性口炎病毒的病毒滅活委托檢測(cè)。結(jié)果表明，60°C條件下，經(jīng)10小時(shí)可使初始滴度值(LgTCID5tZml)為12.1的HIV-1病毒下降7個(gè)Lg以上，初始滴度值(LgTCID5ciAil)為6.40的腦心肌炎病毒病毒60°C經(jīng)半小時(shí)處理后下降4個(gè)Lg，I小時(shí)后檢測(cè)不到活體病毒。25°C，pH3±0.1條件下，經(jīng)5小時(shí)可使初始滴度值(LgTCID5tl/ml)為5.5的偽狂犬病毒下降4個(gè)Lg以上，初始滴度值(LgTCID5Q/ml)為6.44的水皰性口炎病毒病毒下降4個(gè)Lg以上。熱處理(pH5.0，60°C，10小時(shí))蛋白回收彡90%，效價(jià)回收95%。低pH孵化法(25°C，pH3±0.1，5小時(shí))蛋白回收彡90%，效價(jià)回收95%。實(shí)施例4根據(jù)特開(kāi)昭51-51579公開(kāi)的方法制得的人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解于pH5.0緩沖液，制成濃度為50mg/ml的溶液，并于60°C加熱10小時(shí)，然后將溶液于pH4.0含NaCl濃度為0.1M的0.1M醋酸緩沖液中上樣，并吸附于DEAE層析柱，之后使用pH4.0含NaCl濃度為0.3M的0.1M醋酸緩沖液洗脫，得DEAE洗脫液；接著將DEAE洗脫液于2.0M硫酸銨溶液上樣，并吸附于疏水層析柱，之后使用IM硫酸銨溶液洗脫，得疏水洗脫液；疏水洗脫液經(jīng)超濾IOK后，于25°C，pH3±0.1條件5小時(shí)后，再經(jīng)凝膠過(guò)濾層析得病毒滅活的人尿胰蛋白酶抑制劑。結(jié)果表明，經(jīng)60°C條件下，經(jīng)10小時(shí)可使初始滴度值(LgTCID5Q/ml)為11.50的HIV-1病毒下降4個(gè)lg，初始滴度值(LgTCID5tZml)為6.50的腦心肌炎病毒病毒下降4個(gè)Ig ;25°C, pH3±0.1條件5小時(shí)可使初始滴度值(LgTCID5(l/ml)為5.6的偽狂犬病毒下降3個(gè)lg，初始滴度值(LgTCID5ci`Ail)為6.50的水皰性口炎病毒病毒下降3個(gè)lg。熱處理(pH5.0，60°C，10小時(shí))蛋白回收彡90%，效價(jià)回收90%。低pH孵化法(25°C, pH3±0.1，5小時(shí))蛋白回收彡90%，效價(jià)回收90%。比較1:根據(jù)特開(kāi)昭51-51579公開(kāi)的方法制得的人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解于pH5.0緩沖液，制成濃度為50mg/ml的溶液，并于25°C，pH3±0.1條件5小時(shí)然后將溶液于pH4.0含NaCl濃度為0.1M的0.1M醋酸緩沖液中上樣，并吸附于DEAE層析柱，之后使用pH4.0含NaCl濃度為0.3M的0.1M醋酸緩沖液洗脫，得DEAE洗脫液；接著將DEAE洗脫液于2.0M硫酸銨溶液上樣，并吸附于疏水層析柱，之后使用IM硫酸銨溶液洗脫，得疏水洗脫液；疏水洗脫液經(jīng)超濾IOK后，于60°C加熱10小時(shí)，后，再經(jīng)凝膠過(guò)濾層析得病毒滅活的人尿胰蛋白酶抑制劑。結(jié)果表明，25 °C，pH3±0.1條件5小時(shí)可使初始滴度值(LgTCID5Q/ml)為5.6的偽狂犬病毒下降3個(gè)Lg，初始滴度值(LgTCID5tZml)為6.50的水皰性口炎病毒病毒下降3個(gè)Lg ;60°C條件下，經(jīng)10小時(shí)可使初始滴度值(LgTCID50Ail)為11.50的HIV-1病毒下降4個(gè)Lg，初始滴度值(LgTCID5tZml)為6.50的腦心肌炎病毒病毒下降3個(gè)Lg。低pH孵化法(25°C，pH3±0.1，5小時(shí))蛋白回收彡85%，效價(jià)回收80%。熱處理(ρΗ5.0，60。。，10小時(shí))蛋白回收彡85%，效價(jià)回收80%。
權(quán)利要求
1.一種滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其主要步驟如下: 將從人尿中提取的人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解于PH5.0緩沖液，并于60°C加熱10小時(shí)，然后吸附于DEAE層析柱，之后使用pH4.0含NaCl濃度為0.3M的0.1M醋酸緩沖液洗脫，得DEAE洗脫液；接著將所述DEAE洗脫液于1.5M-2.5M硫酸銨溶液上樣，并吸附于疏水層析柱，之后使用IM硫酸銨溶液洗脫，得疏水洗脫液；所述疏水洗脫液經(jīng)超濾后，于25°C，低pH孵化5小時(shí)后，再經(jīng)凝膠過(guò)濾層析得病毒滅活的人尿胰蛋白酶抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其特征在于吸附于DEAE層析柱所用的緩沖液為pH4.0含NaCl濃度為0.1M的0.1M醋酸緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其特征在于所述低PH孵化采用pH為1.5-4.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其特征在于所述超濾所用的超濾膜分子量為10K。
5.一種滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其主要步驟如下: 將從人尿中提取的人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解于PH5.0緩沖液，制成濃度為，并于60°C加熱10小時(shí)，然后將所述溶液于pH4.0含NaCl濃度為0.1M的0.1M醋酸緩沖液中上樣，并吸附于DEAE層析柱，之后使用pH4.0含NaCl濃度為0.3M的0.1M醋酸緩沖液洗脫，得DEAE洗脫液；接著將所述DEAE洗脫液于1.5M-2.5M硫酸銨溶液上樣，并吸附于疏水層析柱，之后使用IM硫酸銨溶液洗脫，得疏水洗脫液；所述疏水洗脫液經(jīng)超濾IOK后，于25°C，pH2.5-3.5條件5小時(shí)后，再經(jīng)凝膠過(guò)濾層析得病毒滅活的人尿胰蛋白酶抑制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其特征在于所述人尿胰蛋白酶抑制劑粗品的配置濃度為50mg/ml-100mg/ml的溶液。`
7.一種滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其主要步驟如下: 1)將新鮮收集的尿液傾入攪拌池中，邊攪拌，邊將PH調(diào)至8.5-9.0，靜置后取上清尿液； 2)調(diào)節(jié)所述上清尿液pH至4.5-6.5后，按每噸所述上清尿液加入25kg脫乙酰殼多糖，邊加邊攪拌，靜置后取沉淀，并濾干得吸附物。
3)所得吸附物加入3倍重量的水漂洗并濾干，重復(fù)2次以上； 4)每千克所述吸附物加入1.0-2.0升pH為10.5-12.0的3N氨水溶液，洗脫所述吸附物，并收集氨水洗脫液； 5)根據(jù)按每升所述氨水洗脫液加入400g-450g固體硫酸銨，至全部溶解，靜置過(guò)夜； 6)以硅藻土作底，抽濾，即得抽濾物； 7)每公斤所述抽濾物加入10升水溶解，將pH調(diào)至5.5-6.5后，離心，取上清液； 8)所述上清液用IOK超濾膜，得超濾濃縮液； 9)每升所述超濾濃縮液加入I倍體積無(wú)水乙醇沉淀，并靜置過(guò)夜；之后取下層混懸液離心，得清液，再加入和所述清液相同體積的無(wú)水乙醇沉淀，并靜置過(guò)夜；再取下層混懸液離心，將沉淀物干燥，即得人尿胰蛋白酶抑制劑粗品； 10)將從人尿中提取的所述人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解于pH5.0緩沖液，制成濃度為50mg/ml-100mg/ml的溶液，并于60°C加熱10小時(shí)，然后將所述溶液于pH4.0含NaCl濃度為0.1M的0.1M醋酸緩沖液中上樣，并吸附于DEAE層析柱，之后使用pH4.0含NaCl濃度為0.3M的0.1M醋酸緩沖液洗脫，得DEAE洗脫液；接著將所述DEAE洗脫液于1.5M-2.5M硫酸銨溶液上樣，并吸附于疏水層析柱，之后使用IM硫酸銨溶液洗脫，得疏水洗脫液；所述疏水洗脫液經(jīng)IOK膜超濾后，于25°C，pH2.5-3.5條件5小時(shí)后，再經(jīng)凝膠過(guò)濾層析得病毒滅活的人尿胰蛋白酶抑制劑。
8.根據(jù) 權(quán)利要求1、5和7之一所述的滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其特征在于所述病毒為人免疫缺陷病毒、腦心肌炎病毒、偽狂犬病毒、水皰性口炎病毒和肝炎病毒之一種或幾種。
全文摘要
一種滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，將從人尿中提取的人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解于緩沖液中，并于60℃加熱，然后吸附于DEAE層析柱后洗脫，得DEAE洗脫液；接著將DEAE洗脫液于硫酸銨溶液上樣，并吸附于疏水層析柱，之后使用1M硫酸銨溶液洗脫，得疏水洗脫液；疏水洗脫液經(jīng)超濾后，于低pH孵化，再經(jīng)凝膠過(guò)濾層析得病毒滅活的人尿胰蛋白酶抑制劑。本發(fā)明通過(guò)綜合運(yùn)用多種病毒滅活方法，尤其是先經(jīng)熱處理法再由低pH孵化法兩種病毒滅活手段，并綜合了其它分離介質(zhì)實(shí)現(xiàn)了多種病毒的滅活，進(jìn)一步提高了人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒滅活效果，提高用藥的安全性。
文檔編號(hào)C07K1/18GK103102409SQ20111036006
公開(kāi)日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2011年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月14日
發(fā)明者紀(jì)向陽(yáng) 申請(qǐng)人:上海楓華制藥有限公司