專(zhuān)利名稱(chēng)：虎紋捕鳥(niǎo)蛛蛋白酶抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶抑制劑，具體涉及一種從蜘蛛毒液中獲得的蛋白酶抑制劑。
背景技術(shù)：
生物毒液中往往含有豐富的活性分子，包括蛋白酶抑制劑。它們能選擇性地作用于一些蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、纖維蛋白溶酶、血漿激肽釋放酶等。具有能被開(kāi)發(fā)成有利于人類(lèi)健康的新藥應(yīng)用前景。如，Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑BPTI(牛胰蛋白酶抑制劑)，它是到目前為止發(fā)現(xiàn)的世界上活性最強(qiáng)的蛋白酶抑制劑之一，它通過(guò)與酶的活性位點(diǎn)結(jié)合而抑制蛋白酶的活性，因而在治療胰腺炎、燒傷后休克、產(chǎn)后大出血、急性循環(huán)衰竭、出血性腦水腫、手術(shù)中及創(chuàng)傷后出現(xiàn)的纖溶亢進(jìn)性出血的防治等領(lǐng)域都表現(xiàn)出很好的療效，在愛(ài)滋病的治療方面也有一定的臨床應(yīng)用。目前在動(dòng)植物中發(fā)現(xiàn)了多種Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑，它與胰蛋白酶1∶1結(jié)合，只有一個(gè)作用位點(diǎn)。蜘蛛毒液中含有大量具有致死或麻痹活性的神經(jīng)毒素成分，在捕食時(shí)發(fā)揮著重要的作用；而蜘蛛唾液中含有大量的消化酶，有時(shí)會(huì)滲入到毒液中水解神經(jīng)毒素成分從而降低其作用。因此如何從蜘蛛毒液中獲得一種酶抑制劑是值得研究的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在從蜘蛛毒液中獲得一種抑制作用較強(qiáng)的蛋白酶抑制劑。
上述發(fā)明目的是通過(guò)以下方案實(shí)現(xiàn)的虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI的cDNA序列為ccttgtggag gaagttttct tcagaccccg gtattgtctc gccaggaatc ttggcgcttg 60tctgtcctga gataccagcg gcggcccgac ttacgcatcc ttccccagga aacctttgaa 120ggactgaagg cggtgaaaca gcaagct atg gga ata gca aga att ctc agt gca gtg ttg 180
Met Gly Ile Ala Arg Ile Leu Ser Ala Val Leu-33 -30tcc ctc agc gtt ctt ttc gtg gtg aca ttt cct gcc ctt ctc tca gcg gat cac cat gac 240Phe Leu Ser Val Leu Phe Val Val Thr Phe Pro Ala Leu Leu Ser Ala Asp His His Asp-20 -10gga agaata gat aca tgc cgtttg ccc tct gac cgt ggg aga tgcaag gca tcc ttt gaa300Gly Arg Ile Asp Thr Cys Arg Leu Pro Ser Asp Arg Gly Arg Cys Lys Ala Ser Phe Glu-1 1 10cgt tgg tac ttc aat ggc aga aca tgcgct aag ttt att tat gga ggc tgc ggt ggc aac360Arg Trp Tyr Phe Asn Gly Arg Thr Cys Ala Lys Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn20 30ggt aat aag ttc cca actcaa gag gcc tgc atg aaa aga tgt gca aaa gcataa 414Gly Asn Lys Phe Pro Thr Gln Glu Ala Cys Met Lys Arg Cys Ala Lys Ala End40 50 55cggaacacag acagagcatt atcgtcaaca cctacttgag cgcagccctg ttcaccaggg 474gtttcgatga agtttcgtca agacctcaac atggatgttt taaagtagtg ctctcaatgt 534aatgttaaat acatgtctca gcaataaaga tttatacaac gaaaaaaaaa aaaaaaaa 592下面結(jié)合附圖對(duì)本研究作進(jìn)一步的說(shuō)明。


圖1是虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI(HWTX-XI)的分離純化圖譜其中1-I是離子交換圖譜，E表示目的峰、1-II是第一次反相HPLC圖譜，12.5min表示出峰時(shí)間、1-III是目的毒素的第二次反相HPLC圖譜、1-IV是虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI(HWTX-XI)的質(zhì)譜鑒定圖2是虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI(HWTX-XI)的一級(jí)化學(xué)結(jié)構(gòu)圖3是表達(dá)的虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI(HWTX-XI)的Tricine SDS-PAGE圖譜其中1為低分子量標(biāo)準(zhǔn)、2為天然的虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI(HWTX-XI)、3為表達(dá)的虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI(HWTX-XI)圖4是虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI(HWTX-XI)抑制胰蛋白酶的濃度依賴(lài)性圖譜圖5是虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI(HWTX-XI)與胰蛋白酶的生物大分子相互作用圖譜圖6是虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI(HWTX-XI)與胰凝乳蛋白酶的生物大分子相互作用圖譜虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI(HWTX-XI)可通過(guò)兩種途徑獲得從虎紋捕鳥(niǎo)蛛粗毒中提取和通過(guò)基因表達(dá)的途徑獲得，具體操作如下1.毒液的采集和虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI的分離純化方法(1)毒液的采集方法將3-4根長(zhǎng)為4cm、內(nèi)徑為1.5mm的透明塑料軟管捆成一束作為誘物，用大鑷子從側(cè)面夾住虎紋捕鳥(niǎo)蛛的胸部，蜘蛛便張開(kāi)螯瓜，這時(shí)將軟管束誘物送入螯瓜下，它即用觸肢抱住軟管束，將螯瓜有力地刺入軟管內(nèi)并射出毒液。射毒后從螯瓜下慢慢抽出軟管束，用微量注射器將其中的毒液抽出，經(jīng)冰凍干燥后即可得到帶淺金黃色的干粉，即為粗毒。
(2)虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI的分離純化方法根據(jù)蛋白質(zhì)的帶電荷性質(zhì)和蛋白質(zhì)的疏水性進(jìn)行兩次分離，結(jié)合陽(yáng)離子交換和反相HPLC色譜法。將5毫克上述粗度溶于6毫升雙蒸水中，上樣到事先用0.1M磷酸鹽緩沖液平衡好的Water Protein PakCM 8HR陽(yáng)離子交換柱(5×50毫米)中，用0-81％氯化鈉線(xiàn)性梯度洗脫，時(shí)間為60分鐘，流速為3mL/min。收集最后一個(gè)峰進(jìn)一步反相HPLC純化。用C18反相分析柱在40min內(nèi)以20-40％的乙腈(含0.1％三氟乙酸)線(xiàn)性梯度洗脫，收集保留時(shí)間為12.5min的峰進(jìn)一步反相HPLC，得到單一目的峰(圖1)，質(zhì)譜儀檢測(cè)為單一組分并測(cè)得準(zhǔn)確分子量為6166.23(圖1)。
虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI經(jīng)491-A測(cè)序儀得到其一級(jí)蛋白序列(圖2)，由55個(gè)氨基酸殘基組成，含6個(gè)半胱氨酸。根據(jù)理論分子量和質(zhì)譜測(cè)定分子量的差值，可以推斷6個(gè)半胱氨酸形成了三對(duì)二硫鍵。該毒素的物理化學(xué)性質(zhì)為純化凍干粉為白色或類(lèi)白色疏松體，無(wú)氣味，極易溶解于水，水溶液近于無(wú)色透明。該蛋白質(zhì)的最大紫外吸收波長(zhǎng)為280nm，等電點(diǎn)為9.45，為堿性蛋白。
從虎紋捕鳥(niǎo)蛛粗毒中分離獲得的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑，它對(duì)胰蛋白酶有很強(qiáng)的抑制作用，抑制常數(shù)為5.54×10-13M，同時(shí)對(duì)別的一些絲氨酸蛋白酶也有一定的抑制作用。
2.基因工程克隆表達(dá)虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI(HWTX-XI)(1)虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI的全長(zhǎng)cDNA序列的獲得①3′RACE首先從虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒腺中快速抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄總RNA得到總cDNA。根據(jù)已知虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI的氨基酸序列設(shè)計(jì)基因特異性簡(jiǎn)并引物p1-a5′-TT(T/C)GA(A/G)(A/C)G(A/T/C/G)TGG TA(T/C)TT(T/C)AA(C/T)-3′和p1-b5′-TG(T/C)GC(A/T/C/G)AA(G/A)TT(T/C)AT(A/C/T)TA(T/C)GG-3′。用基因特異性引物和AUAP與少量cDNA鏈進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到大小在300bp左右的一段cDNA鏈，純化后克隆入pGEM Teasy載體(購(gòu)自Promega公司)，進(jìn)行測(cè)序。
②5′RACE根據(jù)已得到的3′RACE測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)并合成5′RACE的反義引物p2-a5′-AATGCTCTGACTGTGTTCCG-3′和p2-b5′-TCTTTTCATGCAGGCCTCTTG-3′。用基因特異性引物和巢氏引物做PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化后克隆入pGEM Teasy載體(購(gòu)自Promega公司)進(jìn)行測(cè)序。
③全長(zhǎng)cDNA將3′RACE和5′RACE測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，得到虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI的全長(zhǎng)cDNA序列。它包括3′非翻譯序列、5′非翻譯序列、編碼分子前體的可讀框、一個(gè)成熟的毒素序列和一個(gè)插入的pro序列。
(2)虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI的表達(dá)根據(jù)虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI的成熟蛋白序列設(shè)計(jì)引物p3-a5′-CGTCTAGATAAGAGAATAGATACATGC-3′和p3-d5′-CCGAAGC TTTATGCTTTTGCACATC-3′進(jìn)行PCR，得到成熟蛋白的cDNA，克隆測(cè)序，準(zhǔn)備HWTX-XI的表達(dá)。用pVT102U載體(中科院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所戚正武院士贈(zèng)送)連接cDNA并轉(zhuǎn)化DH5α，再轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞S-78酵母中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。用硫酸銨沉淀proPVT表達(dá)500mL，離心后取上清與處理好的DE52纖維素共靜置半小時(shí)，抽濾，濾出液即為去色素上清。將濾出液用醋酸調(diào)pH至4.2，然后上CM-Sepharose32柱，分級(jí)洗脫，取目標(biāo)峰進(jìn)一步反相HPLC純化。用C18反相分析柱在40min內(nèi)以20-40％的乙腈(含0.1％三氟乙酸)線(xiàn)性梯度洗脫，收集保留時(shí)間為13min的峰進(jìn)一步反相HPLC。然后用MALDI-TOF質(zhì)譜和Tricine SDS-PAGE進(jìn)行鑒定。(圖3)。
用這種方法可得到表達(dá)產(chǎn)量為12.5mg/L。
為了更好地說(shuō)明和揭示該毒素分子的作用，我們利用分光光度計(jì)和生物大分子相互作用儀測(cè)定了天然虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI和表達(dá)虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI對(duì)胰蛋白酶的抑制活性，同時(shí)與牛胰蛋白酶抑制劑BPTI的活性大小進(jìn)行了比較。
1.主要材料和儀器虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI按上述兩種方法得到，同時(shí)通過(guò)HPLC和MALDI-TOF質(zhì)譜儀鑒定了其純度在99％以上；胰蛋白酶(TPCK處理)為Sigma產(chǎn)品，苯甲酰-DL-精胺酰對(duì)硝基苯胺(BAPNA)、胰凝乳蛋白酶為上海伯奧生物公司產(chǎn)品，其他化學(xué)試劑均達(dá)到分析純。
實(shí)驗(yàn)儀器U-2000型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本HITACHI產(chǎn)品)，表面等離子共振生物傳感器(BIAcore X，瑞典Uppsala產(chǎn)品)。
2.實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果2.1用分光光度計(jì)測(cè)定虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI對(duì)胰蛋白酶抑制活性以BAPNA(5×10-4M)為底物，加入一定量的胰蛋白酶，取不同量的虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI與之反應(yīng)，整個(gè)反應(yīng)在pH8.0、濃度為0.05mol/L的Tris-HCL緩沖體系中進(jìn)行，反應(yīng)溫度為25℃。在405nm測(cè)定光吸收值。結(jié)果表明虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI對(duì)胰蛋白酶有很強(qiáng)的抑制作用，且呈現(xiàn)出濃度依賴(lài)性關(guān)系，當(dāng)虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI與胰蛋白酶的物質(zhì)的量之比為1∶1時(shí)，胰蛋白酶被完全抑制，見(jiàn)圖4。
2.2表面等離子共振測(cè)定生物大分子相互作用把虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI偶連到CM5芯片上，用不同濃度的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶溶液流經(jīng)芯片表面。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI與胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶的結(jié)合呈現(xiàn)出非常明顯的濃度依賴(lài)性關(guān)系。選用BIA數(shù)據(jù)處理軟件自動(dòng)處理所得數(shù)據(jù)，可得虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI與胰蛋白酶在系統(tǒng)溫度為25℃、緩沖液pH值為7.4的條件下結(jié)合非常強(qiáng)，解離常數(shù)為5.54×10-13M?；⒓y捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI與胰凝乳蛋白酶的解離常數(shù)為1.07×10-7M。(圖5、圖6)。
2.3虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI與牛胰蛋白酶抑制劑BPTI的抑制活性大小比較以BAPNA(5×10-4M)為底物，加入一定量的胰蛋白酶，分別取不同量的天然虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI、表達(dá)虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI和牛胰蛋白酶抑制劑BPTI與之反應(yīng)，整個(gè)反應(yīng)在pH8.0、0.05mol/L的Tris-HCL緩沖體系中進(jìn)行，反應(yīng)溫度為25℃。在405nm測(cè)定光吸收值。結(jié)果表明天然虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI與胰蛋白酶結(jié)合的解離常數(shù)為3.07×10-8M，表達(dá)虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI與胰蛋白酶結(jié)合的解離常數(shù)為2.91×10-8M，牛胰蛋白酶抑制劑BPTI與胰蛋白酶結(jié)合的解離常數(shù)為6.85×10-8M。
上述三個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI是一種很強(qiáng)的胰蛋白酶抑制劑，它的抑制活性高于BPTI。天然虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI和表達(dá)虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI的活性基本一致，表明這種表達(dá)系統(tǒng)能產(chǎn)生正確的分子折疊。
本發(fā)明的虎紋捕鳥(niǎo)蛛蛋白抑制劑即可從蜘蛛粗毒中分離純化，也可克隆獲得，而且抑制活性高于BPIT，是一種很強(qiáng)的胰蛋白酶抑制劑。
虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI的cDNA序列為ccttgtggag gaagttttct tcagaccccg gtattgtctc gccaggaatc ttggcgcttg 60tctgtcctga gataccagcg gcggcccgac ttacgcatcc ttccccagga aacctttgaa 120ggactgaagg cggtgaaaca gcaagct atg gga ata gca aga att ctc agt gca gtg ttg 180Met Gly Ile Ala Arg Ile Leu Ser Ala Val Leu-33 -30tcc ctc agc gtt ctt ttc gtg gtg aca ttt cct gcc ctt ctc tca gcg gat cac cat gac 240Phe Leu Ser Val Leu Phe Val Val Thr Phe Pro Ala Leu Leu Ser Ala Asp His His Asp-20 -10gga agaata gat aca tgc cgtttg ccc tct gac cgt ggg aga tgcaag gca tcc ttt gaa300Gly Arg Ile Asp Thr Cys Arg Leu Pro Ser Asp Arg Gly Arg Cys Lys Ala Ser Phe Glu-1 1 10cgt tgg tac ttc aat ggc aga aca tgcgct aag ttt att tat gga ggc tgc ggt ggc aac360Arg Trp Tyr Phe Asn Gly Arg Thr Cys Ala Lys Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn20 30ggt aat aag ttc cca actcaa gag gcc tgc atg aaa aga tgt gca aaa gcataa 414Gly Asn Lys Phe Pro Thr Gln Glu Ala Cys Met Lys Arg Cys Ala Lys Ala End40 50 55cggaacacag acagagcatt atcgtcaaca cctacttgag cgcagccctg ttcaccaggg 474gtttcgatga agtttcgtca agacctcaac atggatgttt taaagtagtg ctctcaatgt 534aatgttaaat acatgtctca gcaataaaga tttatacaac gaaaaaaaaa aaaaaaaa 59權(quán)利要求
1.一種虎紋捕鳥(niǎo)蛛蛋白酶抑制劑，其特征在于從虎紋捕鳥(niǎo)蛛粗毒中分離純化的虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-XI，該毒素的cDNA序列如下ccttgtggaggaagttttcttcagaccccggtattgtctcgccaggaatcttggcgcttg 60tctgtcctgagataccagcggcggcccgacttacgcatccttccccaggaaacctttgaa 120ggactgaaggcggtgaaacagcaagct atg gga ata gca aga att ctc agt gca gtg ttg 180Met Gly Ile Ala Arg Ile Leu Ser Ala Val Leu-33 -30tcc ctc agc gtt ctt ttc gtg gtg aca ttt cct gcc ctt ctc tca gcg gat cac cat gac 240Phe Leu Ser Val Leu Phe Val Val Thr Phe Pro Ala Leu Leu Ser Ala Asp His His Asp-20 -10gga agaata gat aca tgc cgt ttg ccc tct gac cgt ggg aga tgc aag gca tcc ttt gaa300Gly Arg Ile Asp Thr Cys Arg Leu Pro Ser Asp Arg Gly Arg Cys Lys Ala Ser Phe Glu-1 1 10cgt tgg tac ttc aat ggc aga aca tgc gct aag ttt att tat gga ggc tgc ggt ggc aac360Arg Trp Tyr Phe Asn Gly Arg Thr Cys Ala Lys Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn20 30ggt aat aag ttc cca act caa gag gcc tgc atg aaa aga tgt gca aaa gcataa 414Gly Asn Lys Phe Pro Thr Gln Glu Ala Cys Met Lys Arg Cys Ala Lys Ala End40 50 55cggaacacagacagagcattatcgtcaacacctacttgagcgcagccctgttcaccaggg 474gtttcgatgaagtttcgtcaagacctcaacatggatgttttaaagtagtgctctcaatgt 534aatgttaaatacatgtctcagcaataaagatttatacaacgaaaaaaaaaaaaaaaaa 59全文摘要
本發(fā)明涉及一種從蜘蛛毒液中獲得的蛋白酶抑制劑，它的cDNA全長(zhǎng)592bp，一級(jí)化學(xué)結(jié)構(gòu)由55個(gè)氨基酸殘基組成，該毒素的理化性狀為純化凍干粉為白色或類(lèi)白色疏松體，無(wú)氣味，極易溶解于水，水溶液近于無(wú)色透明，該蛋白質(zhì)的最大紫外吸收波長(zhǎng)為280nm，等電點(diǎn)為9.45；它對(duì)胰蛋白酶有很強(qiáng)的抑制作用，抑制常數(shù)為5.54×10
文檔編號(hào)A61K38/57GK1546171SQ200310110608
公開(kāi)日2004年11月17日 申請(qǐng)日期2003年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月5日
發(fā)明者梁宋平, 袁春華, 謝錦云 申請(qǐng)人:湖南師范大學(xué)