專利名稱：一種以魚皮為原料制備高純度膠原蛋白的方法
一種以魚皮為原料制備高純度膠原蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種膠原蛋白提取的方法，尤其是一種以魚皮為原料制備高純度膠原蛋白的方法。
背景技術(shù)：
膠原蛋白是一種是由3條多肽鏈以右手螺旋形式組成的纖維狀蛋白質(zhì)，作為細胞外基質(zhì)的重要成份幾乎存在于所有組織，是動物體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)。膠原蛋白因具有低免疫原性、良好的生物相容性和可生物降解性等特點使其在功能食品、保健品、生物材料、組織工程和生物醫(yī)用材料等領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛。常用的膠原蛋白主要是哺乳動物的皮膚和骨組織以及魚皮或魚磷等。膠原蛋白在許多領(lǐng)域中的應(yīng)用與其分子量范圍和純度密切相關(guān)，生物和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中應(yīng)用的膠原蛋白主要是高分子量和高純度的膠原蛋白，在食品領(lǐng)域用于食品定型等方面的膠原蛋白主要是高分子量膠原蛋白，因此制備高分子量和高純膠原蛋白是拓展其應(yīng)用范圍的關(guān)鍵。由于膠原蛋白在常溫下難于溶于水溶液且難于被體內(nèi)的生物酶降解，因此制備膠原蛋白常使用酸法、堿法、濃鹽法、酶法、熱降解法或這些方法的組合將其降解后溶出。曾少葵等報道了利用酸溶液從羅非魚魚鱗中提取膠原蛋白并使用酶法制備膠原蛋白多肽的方法(上海海洋大學(xué)學(xué)報，2009，18 (5) =599-603);劉艷等研究了使用酶法從4種淡水魚魚鱗中提取膠原蛋白的方法(水產(chǎn)科學(xué)，2010，29 (4) =221-224)；曾嶸報道了鹽酸脫鈣、酶與檸檬酸結(jié)合提取膠原蛋白的方法(生物加工過程，2008，6 (5)27-30);陳勝軍等研究了堿法制備膠原蛋白的工藝(水產(chǎn)科學(xué)，2004，23 (6) :45-46);此夕卜，單獨使用熱降解法也可以使得膠原蛋白溶出(內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報，2010，25(5)525-529)。專利(申請?zhí)?01010513190. 9)公布了一種屬于酸提取-酸性蛋白酶酶解的復(fù)合工藝，專利(申請?zhí)?01010192216. 4)公布了一種使用柱層析技術(shù)并結(jié)合膜分離工藝制備膠原蛋白方法；盡管提取膠原蛋白的研究已有許多，但傳統(tǒng)的膠原蛋白提取方法存在許多缺陷，主要包括(I)膠原蛋白分子量范圍寬，由于這些傳統(tǒng)方法主要是將膠原蛋白降解后提高其水溶性導(dǎo)致制備出的膠原蛋白分子量范圍過寬，常常是幾百到二十幾萬道爾頓。(2)蛋白質(zhì)純度不高，傳統(tǒng)方法制備膠原蛋白過程中非膠原類的蛋白溶出后混入到膠原蛋白溶液，導(dǎo)致制備出的膠原蛋白純度較低。(3)膠原蛋白序列發(fā)生變化，膠原蛋白的氨基酸序列中存在一定量的天冬酰胺和谷氨酰胺殘基，傳統(tǒng)方法制備膠原蛋白過程中這些含酰胺的氨基酸殘基發(fā)生脫酰胺現(xiàn)象。膠原蛋白性質(zhì)與其動物來源密切，哺乳動物來源的膠原蛋白具有較好的熱穩(wěn)定性，而魚類的膠原蛋白熱穩(wěn)定性低于哺乳動物來源的膠原蛋白，使用傳統(tǒng)的提取方法從魚皮中提取的膠原蛋白由于降解嚴(yán)重而導(dǎo)致其平均分子量不高，因此，以魚皮為原料提取高分子量和高純度膠原蛋白更加困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種以魚皮為原料制備高分子量和高純度膠原蛋白的方法。因此，本發(fā)明提供一種以魚皮為原料制備高純度膠原蛋白的方法，其特征在于，該方法依次包括以下步驟⑴魚皮粉碎；⑵脫脂；(3)非膠原類蛋白質(zhì)溶出；⑷清洗；(5)膠原蛋白溶出；(6)膠原蛋白溶液濃縮；(7)膠原蛋白干燥。魚皮中非膠原類蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性低于膠原蛋白的熱穩(wěn)定性，在低于膠原蛋白變性溫度條件下，加入酸性溶液可使魚皮中非膠原類的蛋白質(zhì)首先溶出；將提取過程中溶液的溫度控制在膠原蛋白發(fā)生可變性的溫度，可使魚皮中膠原蛋白溶出，從而可以制備出具有較高分子量范圍的膠原蛋白，同時，在提取膠原蛋白之前將非膠原類的蛋白質(zhì)溶出，提供了最終制備出的膠原蛋白的純度。
圖I是以魚皮為原料提取高純膠原蛋白的工藝流程圖。
具體實施方式
本發(fā)明提供一種以魚皮為原料制備高純度膠原蛋白的方法，其特征在于，該方法依次包括以下步驟(I)魚皮粉碎；(2)脫脂；(3)非膠原類蛋白質(zhì)溶出；(4)清洗；(5)膠原蛋白溶出；(6)膠原蛋白溶液濃縮；(7)膠原蛋白干燥。在本發(fā)明中，所述魚皮可以為未經(jīng)過處理的干魚皮或者濕魚皮，或者粉碎后的干魚皮或者濕魚皮；也可以為經(jīng)過脫脂和/或脫灰處理的魚皮。在本發(fā)明中，所述步驟(3)、(4)和(5)可以在任何可以連續(xù)分離固液的容器中進行，但在一種優(yōu)選的實施方式中，所述步驟(3)、(4)和(5)均在提取罐中進行，所述提取罐具有截留魚皮的過濾裝置。步驟(I)魚皮粉碎和(2)脫脂均可按照現(xiàn)有技術(shù)進行。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述脫脂是向提取罐內(nèi)連續(xù)注入脫脂劑，脫脂劑與魚皮接觸后從提取罐內(nèi)流出，脫脂劑加入量為濕態(tài)魚皮重量的10-20倍，注入時間控制在18-32小時，溫度控制在18°C以下。脫脂劑可以是5 30體積％的異丙醇水溶液或5 30體積％的正丁醇水溶液。在所述步驟(3)中，非膠原類蛋白的溶出主要是通過控制該步驟的溫度，通常控制該步驟進行的溫度低于魚皮膠原蛋白發(fā)生變性的臨界溫度，使非膠原類蛋白從魚皮中溶出，而膠原蛋白仍然保留在魚皮中，借此將膠原蛋白與非膠原類蛋白進行分離從而除去非膠原類蛋白，用于溶解非膠原類蛋白的介質(zhì)可以為水或酸的水溶液。在一種優(yōu)選的實施方式中，在所述步驟(3)中將魚皮與酸性水溶液接觸，并控制所述接觸溫度低于所述魚皮膠原蛋白發(fā)生變性的臨界溫度，使非膠原蛋白溶出到所述酸性水溶液中。在另一種優(yōu)選的實施方式中，在所述步驟(3)中，所述非膠原蛋白溶出步驟為連續(xù)的方式，所述酸性水溶液的注入可以連續(xù)注入，溶有非膠原蛋白的水溶液連續(xù)流出。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述非膠原類蛋白質(zhì)溶出步驟為連續(xù)的，所采用的條件包括向提取罐內(nèi)連續(xù)注入酸性水溶液，所述酸性水溶液與濕態(tài)魚皮接觸后從提取罐流出，流出速率與所述酸性水溶液的注入速率相等，提取罐內(nèi)溫度控制在15 40°C，所述酸性水溶液的酸濃度為O. 01 O. 05mol/L，所述酸性水溶液與所述濕態(tài)魚皮的重量之比為10 : I 20 : 1，連續(xù)注入酸性水溶液的時間控制在6 12小時范圍內(nèi)。在另一種優(yōu)選的實施方式中，所述酸性水溶液為醋酸、檸檬酸或鹽酸的水溶液。
在所述步驟(3)中，當(dāng)在連續(xù)注入所述酸性水溶液時，連續(xù)注入所述酸性水溶液的速度與溶有非膠原蛋白的水溶液連續(xù)流出的速度可以相同或不同，但為了使溶有非膠原蛋白的水溶液能夠連續(xù)流出，連續(xù)注入所述酸性水溶液的速度應(yīng)當(dāng)大于或等于溶有非膠原蛋白的水溶液連續(xù)流出的速度。但在一種優(yōu)選的實施方式中，連續(xù)注入所述酸性水溶液的速度與溶有非膠原蛋白的水溶液連續(xù)流出的速度相等，以使非膠原蛋白一溶出，就立刻流出而與含有膠原蛋白的魚皮分離。 在本發(fā)明中所述清洗步驟(4)為連續(xù)方式，所采用的條件包括連續(xù)注入水，使所述水與經(jīng)過步驟(3)處理后的魚皮接觸后流出，流出速率與連續(xù)注入所述水的速率可以相同或不同，但為了使清洗液能夠連續(xù)流出，連續(xù)注入所述水的速度應(yīng)當(dāng)大于或等于流出速率。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述清洗步驟為連續(xù)的，所述方法采用的條件包括向所述提取罐內(nèi)連續(xù)注入清水，所述清水與濕態(tài)魚皮接觸后從所述提取罐流出，流出速率與所述清水的注入速率相等，所述提取罐內(nèi)溫度控制在10 30°C，所述清水與所述濕態(tài)魚皮的重量之比為6 : I 8 : 1，連續(xù)注入所述清水的時間控制在I小時以內(nèi)。在本發(fā)明所述的步驟(5)中，膠原蛋白的提取主要是通過控制該步驟的溫度以及清水的加入速率和流出速率。通常該步驟的溫度控制在魚皮膠原蛋白發(fā)生熱變性的臨界溫度，使膠原蛋白在熱變性條件下從魚皮中溶出，溶出的膠原蛋白溶液流出后溫度降低，變性的膠原蛋白逐漸恢復(fù)其天然狀態(tài)。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述膠原蛋白質(zhì)溶出步驟為連續(xù)的，所采用的條件包括向所述提取罐內(nèi)連續(xù)注入溫度為55 95°C的清水，所述清水與所述濕態(tài)魚皮接觸后，膠原蛋白從所述濕態(tài)魚皮中溶出至清水并從所述提取罐內(nèi)流出，流出速率與所述清水的注入速率相等，收集流出液，所述提取罐內(nèi)溫度控制在55 95°C，所述清水與所述濕態(tài)的所述魚皮的重量之比為10 I 30 1，連續(xù)注入所述55 95°C清水的時間控制在3 10小時。在本發(fā)明所述的步驟(5)中，連續(xù)注入清水的速度與溶有膠原蛋白的水溶液連續(xù)流出的速度可以相同或不同，但為了使溶有膠原蛋白的水溶液能夠連續(xù)流出，連續(xù)注入所述清水的速度應(yīng)當(dāng)大于或等于溶有膠原蛋白的水溶液連續(xù)流出的速度。在一種優(yōu)選的實施方式中，連續(xù)注入所述清水的速度與溶有膠原蛋白的水溶液連續(xù)流出的速度相等，以使膠原蛋白溶出后立刻流出而避免溶出的膠原蛋白進一步熱變性。在一種最優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的方法包括(I)魚皮粉碎將魚皮經(jīng)水浸泡，濾去水溶液，采用粉碎機將魚皮粉碎成塊狀，裝填到提取罐內(nèi)，提取罐具有截留魚皮的過濾裝置。(2)脫脂向提取罐內(nèi)連續(xù)注入脫脂劑，脫脂劑與魚皮接觸后從提取罐內(nèi)流出，脫脂劑加入量為濕態(tài)魚皮重量的10-20倍，注入時間控制在18-32小時，溫度控制在18°C以下。脫脂劑可以是5 30體積％的異丙醇水溶液或5 30體積％的正丁醇水溶液。(3)非膠原類蛋白質(zhì)溶出向提取罐內(nèi)連續(xù)注入酸性水溶液，酸性水溶液與濕態(tài)魚皮接觸后從提取罐流出，控制流出速率和酸性水溶液的注入速率相等。提取罐內(nèi)溫度控制在15 40°C。所述酸性水溶液的酸濃度為O. 01 O. 05mol/L，所述酸性水溶液與濕態(tài)的所述魚皮的重量之比為10 : I 20 : 1，連續(xù)注入酸性水溶液的時間控制在6 12小時范圍內(nèi)。(4)清洗向提取罐內(nèi)連續(xù)注入清水，清水與魚皮接觸后從提取罐流出，控制流出速率和清水的注入速率相等；提取罐內(nèi)溫度控制在15 30°C，清水與濕態(tài)所述魚皮的重量之比為6 : I 8 : 1，連續(xù)注入清水的時間控制在I小時以內(nèi)。(5)膠原蛋白連續(xù)溶出向提取罐內(nèi)連續(xù)注入溫度為55 95°C的清水，清水與魚皮接觸后膠原蛋白從濕態(tài)魚皮中溶出至清水并從提取罐內(nèi)流出，流出控制和清水的注入速率相等；流出液為含有膠原蛋白的溶液。提取罐內(nèi)溫度控制在55 95°C，所述清水與濕態(tài)所述魚皮的重量之比為10 I 30 1，連續(xù)注入55 95°C清水的時間控制在3 10小時。(6)濃縮將步驟(5)獲得的膠原蛋白溶液使用三效法進行濃縮或超濾法進行濃縮，將膠原蛋白溶液的固含量提高至30%以上。(7)干燥將步驟(6)獲得的膠原蛋白濃縮液使用冷凍干燥或噴霧干燥法制備成膠原蛋白粉末。本發(fā)明由于將非膠原類的蛋白質(zhì)與膠原蛋白分步溶出，只收集含膠原蛋白的蛋白浸出液，因此提高了膠原蛋白的純度；由于控制提取溫度在膠原蛋白發(fā)生不可逆的熱變性臨界溫度，且提取時間低于魚皮膠原蛋白在變性臨界溫度發(fā)生不可逆變性所需的時間，因此提取出的膠原蛋白發(fā)生的隨機降解率低或不發(fā)生隨機降解，因此，利用本發(fā)明目所述的方法制備出的膠原蛋白具有純度高和分子量高等特點。實施例I(I)魚皮粉碎稱取魚皮10kg，使用5kg清水在30°C條件下浸泡4小時，過濾去除水溶液，采用粉碎機將魚皮粉碎成約IcmX Icm塊狀，裝填到體積為200升的提取罐內(nèi)，提取罐出口裝有孔徑為Imm的過濾網(wǎng)。(2)脫脂向提取罐內(nèi)連續(xù)注入5體積％的異丙醇水溶液，異丙醇水溶液與魚皮接觸后從提取罐內(nèi)流出，異丙醇水溶液加入量為200L，注入時間控制在32小時，溫度控制在18°C以下。(3)非膠原類蛋白質(zhì)溶出向提取罐內(nèi)連續(xù)注入O.Olmol/L的醋酸水溶液，醋酸水溶液與魚皮接觸后從提取罐流出，提取罐內(nèi)溫度控制在15°C，醋酸水溶液注入量為200kg，連續(xù)注入時間12小時。(4)清洗向提取罐內(nèi)連續(xù)注入清水60kg的清水，清水與魚皮接觸后從提取罐流出，提取罐內(nèi)溫度控制在15°C，連續(xù)注入清水的時間控制在I小時以內(nèi)。(5)膠原蛋白連續(xù)溶出向提取罐內(nèi)連續(xù)注入溫度為55°C的清水，清水與魚皮接觸后膠原蛋白從魚皮中溶出至清水并從提取罐內(nèi)流出，清水注入量為100L，注入時間為3小時，提取罐內(nèi)溫度控制在55°C。(6)濃縮將步驟(5)獲得的膠原蛋白溶液使用三效法進行濃縮和超濾法進行濃縮，將膠原蛋白溶液的固含量提高至20%以上。(7)干燥將步驟(6)獲得的膠原蛋白濃縮液使用冷凍干燥法制成干態(tài)膠原蛋白。實施例2(I)魚皮粉碎稱取魚皮10kg，使用5kg清水在30°C條件下浸泡4小時，過濾去除水溶液，采用粉碎機將魚皮粉碎成約IcmX Icm塊狀，裝填到體積為200升的提取罐內(nèi)，提取罐出口裝有孔徑為Imm的過濾網(wǎng)。(2)脫脂向提取罐內(nèi)連續(xù)注入18體積％的異丙醇水溶液，異丙醇水溶液與魚皮接觸后從提取罐內(nèi)流出，異丙醇水溶液加入量為150L，注入時間控制在24小時，溫度控制在18°C以下。(3)非膠原類蛋白質(zhì)溶出向提取罐內(nèi)連續(xù)注入O. 03mol/L的鹽酸水溶液，鹽酸水溶液與魚皮接觸后從提取罐流出，提取罐內(nèi)溫度控制在28°C，鹽酸水溶液注入量為150kg，連續(xù)注入時間8小時。(4)清洗向提取罐內(nèi)連續(xù)注入清水70kg的清水，清水與魚皮接觸后從提取罐流出，提取罐內(nèi)溫度控制在20°C，連續(xù)注入清水的時間控制在I小時以內(nèi)。(5)膠原蛋白連續(xù)溶出向提取罐內(nèi)連續(xù)注入溫度為80°C的清水，清水與魚皮接觸后膠原蛋白從魚皮中溶出至清水并從提取罐內(nèi)流出，清水注入量為200L，注入時間為7小時，提取罐內(nèi)溫度控制在80°C。(6)濃縮將步驟(5)獲得的膠原蛋白溶液使用三效法進行濃縮和超濾法進行濃縮，將膠原蛋白溶液的固含量提高至20%以上。(7)干燥將步驟(6)獲得的膠原蛋白濃縮液使用冷凍干燥制成干態(tài)膠原蛋白。實施例3(I)魚皮粉碎稱取魚皮10kg，使用5kg清水在30°C條件下浸泡4小時，過濾去除水溶液，采用粉碎機將魚皮粉碎成約IcmX Icm塊狀，裝填到體積為200升的提取罐內(nèi)，提取罐出口裝有孔徑為Imm的過濾網(wǎng)。(2)脫脂向提取罐內(nèi)連續(xù)注入30%體積的正丁醇水溶液，正丁醇水溶液與魚皮接觸后從提取罐內(nèi)流出，異丙醇水溶液加入量為100L，注入時間控制在18小時，溫度控制在18°C以下。(3)非膠原類蛋白質(zhì)溶出向提取罐內(nèi)連續(xù)注入O. 05mol/L的檸檬酸水溶液，檸檬酸水溶液與魚皮接觸后從提取罐流出，提取罐內(nèi)溫度控制在40°C，檸檬酸水溶液注入量為100kg，連續(xù)注入時間6小時。(4)清洗向提取罐內(nèi)連續(xù)注入清水80kg的清水，清水與魚皮接觸后從提取罐流出，提取罐內(nèi)溫度控制在30°C，連續(xù)注入清水的時間控制在I小時以內(nèi)。(5)膠原蛋白連續(xù)溶出向提取罐內(nèi)連續(xù)注入溫度為95°C的清水，清水與魚皮接觸后膠原蛋白從魚皮中溶出至清水并從提取罐內(nèi)流出，清水注入量為300L，注入時間為10小時，提取罐內(nèi)溫度控制在95°C。(6)濃縮將步驟(5)獲得的膠原蛋白溶液使用三效法進行濃縮和超濾法進行濃縮，將膠原蛋白溶液的固含量提高至20%以上。(7)干燥將步驟(6)獲得的膠原蛋白濃縮液使用冷凍干燥制成干態(tài)膠原蛋白。檢測檢測實施例1-3所制備的產(chǎn)品膠原蛋白的純度以及分子量分布，采用的方法分別為氨基酸組成分析法和凝膠過濾法，檢測的結(jié)果如表I所示表I施例1-3所制備的膠原蛋白的純度、分子量范圍及平均分子量
膠原蛋白純度分子量分布平均分子量
實施例 I96%5000-260000200000
權(quán)利要求
1.一種以魚皮為原料制備高純度膠原蛋白的方法，其特征在于，該方法依次包括以下步驟⑴魚皮粉碎；⑵脫脂；⑶非膠原類蛋白質(zhì)溶出；⑷清洗；(5)膠原蛋白溶出；(6)膠原蛋白溶液濃縮；(7)膠原蛋白干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述步驟(3)、(4)和(5)均在提取罐中進行，所述提取罐具有截留魚皮的過濾裝置。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述非膠原類蛋白質(zhì)溶出步驟為連續(xù)的，所采用的條件包括向所述提取罐內(nèi)連續(xù)注入酸性水溶液，所述酸性水溶液與濕態(tài)魚皮接觸后從所述提取罐流出，流出速率與所述酸性水溶液的注入速率相等，所述提取罐內(nèi)溫度控制在15 40°C，所述酸性水溶液的酸濃度為O. Ol O. 05mol/L，所述酸性水溶液與所述濕態(tài)魚皮的重量之比為10 : I 20 : 1，連續(xù)注入所述酸性水溶液的時間控制在6 12小時范圍內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述酸性水溶液為醋酸、檸檬酸或鹽酸的水溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述清洗步驟為連續(xù)的，所采用的條件包括向所述提取罐內(nèi)連續(xù)注入清水，所述清水與濕態(tài)魚皮接觸后從所述提取罐流出，流出速率與所述清水的注入速率相等，所述提取罐內(nèi)溫度控制在10 30°C，所述清水與所述濕態(tài)魚皮的重量之比為6 : I 8 : 1，連續(xù)注入所述清水的時間控制在I小時以內(nèi)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述膠原蛋白質(zhì)溶出步驟為連續(xù)的，所采用的條件包括向所述提取罐內(nèi)連續(xù)注入溫度為55 95°C的清水，所述清水與所述濕態(tài)魚皮接觸后，膠原蛋白從所述濕態(tài)魚皮中溶出至所述清水中并從所述提取罐內(nèi)流出，流出速率與所述清水的注入速率相等，收集流出液，所述提取罐內(nèi)溫度控制在55 95°C，所述清水與所述濕態(tài)的魚皮的重量之比為10 I 30 1，連續(xù)注入所述55 95°C清水的時間控制在3 10小時。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種以魚皮為原料制備高純度膠原蛋白的方法，該方法依次包括以下步驟(1)魚皮粉碎；(2)脫脂；(3)非膠原類蛋白質(zhì)溶出；(4)清洗；(5)膠原蛋白溶出；(6)膠原蛋白溶液濃縮；(7)膠原蛋白干燥。在低于膠原蛋白變性溫度條件下使魚皮中非膠原類蛋白首先溶出，將溫度控制在膠原蛋白發(fā)生變性溫度范圍內(nèi)且控制溶解時間短于膠原蛋白變性所需的時間，可以獲得水解程度很低或沒有水解的膠原蛋白，該膠原蛋白具有天然結(jié)構(gòu)，獲得的膠原蛋白具有分子量高和純度高等優(yōu)點。
文檔編號C07K14/78GK102952188SQ201110240719
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月22日
發(fā)明者劉晶琦, 張貴鋒, 王海燕, 劉愛青, 孔英俊, 蘇志國 申請人:北京盛美諾生物技術(shù)有限公司, 中國科學(xué)院過程工程研究所, 海南盛美諾生物技術(shù)有限公司