一種水產(chǎn)魚皮膠原蛋白納吸棉及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種水產(chǎn)魚皮膠原蛋白納吸棉及其制備方法。水產(chǎn)魚皮膠原蛋白納吸棉由羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白自聚集獲得，其表觀形態(tài)為松散的細(xì)絲狀，其微觀結(jié)構(gòu)呈粗細(xì)均勻縱橫交錯(cuò)的纖維狀，并且在纖維絲交錯(cuò)之間存在均勻的細(xì)小網(wǎng)格。本發(fā)明制備過(guò)程簡(jiǎn)單、廉價(jià)易得，產(chǎn)品用途廣泛。
【專利說(shuō)明】一種水產(chǎn)魚皮膠原蛋白納吸棉及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種水產(chǎn)魚皮膠原蛋白納吸棉及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]膠原蛋白是動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富、分布最廣泛的蛋白質(zhì)。膠原蛋白具有獨(dú)特的三螺旋結(jié)構(gòu)、低抗原性、無(wú)毒性、良好的生物相容性和生物可降解性等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于組織工程支架材料、止血海綿、藥物控緩釋系統(tǒng)、基因傳遞載體、美容外科等生物醫(yī)用領(lǐng)域。目前，國(guó)內(nèi)使用的膠原蛋白主要來(lái)自豬和牛的皮膚和跟腱，但隨著瘋牛病和口蹄疫等疾病的發(fā)生，使人們對(duì)它們的安全性產(chǎn)生了質(zhì)疑；另外，由于宗教和習(xí)俗等原因，豬來(lái)源的膠原蛋白在某些地區(qū)的應(yīng)用受到了限制。因此，迫切需要尋求質(zhì)量和安全性更好的膠原蛋白來(lái)源。
[0003]我國(guó)每年魚鱗，魚皮等水產(chǎn)品廢棄物約有40多萬(wàn)噸，這些水產(chǎn)品廢棄物均含有豐富的膠原蛋白，其氨基酸組成與陸生哺乳動(dòng)物膠原蛋白無(wú)明顯差異，且其不存在人畜共患的傳染性疾病，具有極大的開發(fā)和利用價(jià)值，但這些廢棄物除小部分被用于生產(chǎn)飼料外，大部分卻被丟棄。因此，開發(fā)魚皮等水產(chǎn)品廢棄物的利用新途徑，不僅可提高水產(chǎn)品加工的附加值，而且能減少環(huán)境污染，具有良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
[0004]然而，作為生物醫(yī) 用材料，不同的形態(tài)可以有不同的用處，本發(fā)明所開發(fā)的納吸棉產(chǎn)品，其特點(diǎn)是纖維絲狀，易于根據(jù)需要撕取，用于止血和填充等，而且體內(nèi)可降解，這樣就可以擴(kuò)大膠原蛋白醫(yī)用材料的使用范圍，前景可觀。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在于提供一種水產(chǎn)魚皮膠原蛋白納吸棉及其制備方法。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為:
[0007]一種水產(chǎn)魚皮膠原蛋白納吸棉，水產(chǎn)魚皮膠原蛋白納吸棉由羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白自聚集獲得，這種膠原蛋白的分子量在300kDa左右，并且保持了三螺旋結(jié)構(gòu)；制備得到的納吸棉，其表觀形態(tài)為松散的細(xì)絲狀，其微觀結(jié)構(gòu)呈粗細(xì)均勻縱橫交錯(cuò)的纖維狀，并且在纖維絲交錯(cuò)之間存在均勻的細(xì)小網(wǎng)格。
[0008]水產(chǎn)魚皮膠原蛋白納吸棉的制備方法:
[0009]I)將水產(chǎn)魚皮膠原蛋白充分溶于濃度為0.5mol/L的醋酸溶液中，得濃度為2-6mg/mL的膠原液，而后離心收集膠原上清液，待用；
[0010]2)將磷酸鹽緩沖液按體積比1:1緩慢加入到膠原上清液中，期間不斷攪拌混合液體系，并加入10-15mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)混合液體的pH至7.0-7.8 ；
[0011]3)將調(diào)節(jié)pH后的混合液置于25-35°C水浴鍋中，水浴12 — 24h，使其充分自聚集；
[0012]4)用紗布過(guò)濾膠原自聚集纖維絲，然后用少量超純水將其從紗布上洗下；洗下后將膠原自聚集纖維絲溶液裝于3.5kDa透析袋中，透析24h，透析液為純水；透析后的膠原自聚集纖維絲溶液于-80°C快速遇冷，然后-60°C冷凍干燥48h，即得水產(chǎn)膠原納吸棉。
[0013]所述步驟I)將水產(chǎn)魚皮膠原蛋白在溫度為4°C及磁力攪拌器不斷攪拌的條件下充分溶于醋酸溶液中，溶解后的膠原液于4°C、20000g的條件下離心30min，除去不溶性的雜質(zhì)，用移液槍小心吸出上清液，待用。
[0014]所述磷酸鹽緩沖液為用氯化鈉配制40mM含氯化鈉520-1040mMpH為7.4的磷酸鹽緩沖液，濾紙過(guò)濾，待用；所述氫氧化鈉溶液為濃度在10 — 15mol/L濾紙過(guò)濾的氫氧化鈉溶液。
[0015]所述水產(chǎn)魚皮膠原蛋白為羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白。
[0016]所述羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白的提取步驟為:
[0017]I)將清洗并吸干表面水分的原料羅非魚皮在磁力攪拌下用10%正丁醇對(duì)魚皮進(jìn)行脫脂24h，期間每8h更換一次正丁醇溶液；而后清洗待用；
[0018]2)于4°C條件下，用0.lmol/L的氫氧化鈉對(duì)上述處理后魚皮進(jìn)行脫雜蛋白24h，期間每8h更換一次氫氧化鈉溶液,而后清洗待用；
[0019]3)將上述脫雜蛋白后的魚皮粉碎，粉碎后魚皮粉與0.5mol/L醋酸溶液混合，混合后再加入原料魚皮質(zhì)量0.5%-1%的胃蛋白酶(750U/mg，Sigma)，而后于4°C下攪拌提取48h ；
[0020]4)將上述提取后魚皮提取液離心收集上清液，并在冰水浴及攪拌的條件下向上清液中緩緩加入研磨細(xì)碎的氯化鈉至終濃度為0.9mol/L，而后將液體置于4°C冰箱中過(guò)夜鹽析；
[0021]5)將上述鹽析液離心，收集沉淀，而后將沉淀復(fù)溶于0.5mol/L的醋酸溶液中；所得復(fù)溶液裝于3.5kDa透析袋中，透析24h，透析液0.02mol/L的磷酸氫二鈉溶液(pH8.6)；
[0022]6)上述所得透析液再用0.lmol/L的醋酸溶液透析24h，透析后再用純水透析48h ；透析后的膠原液于_80°C快速遇冷，然后_60°C冷凍干燥48h，即得羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白(PSC)。
[0023]本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn):
[0024]1.本發(fā)明制備過(guò)程簡(jiǎn)單、原料廉價(jià)、制得的納吸棉未加任何化學(xué)交聯(lián)劑完全依靠膠原蛋白自身自聚集的性質(zhì)制備，且易于撕取使用，用途廣泛，前景可觀。同時(shí)本發(fā)明所得納吸棉微觀結(jié)構(gòu)呈粗細(xì)均勻的纖維狀，易于撕取，可用于填充和止血等，用途廣泛，前景可觀，是一種較好的生物醫(yī)用材料。
[0025]2.本發(fā)明所用原料為水產(chǎn)加工的下腳料羅非魚皮，原料來(lái)源安全，本發(fā)明充分利用羅非魚水產(chǎn)加工過(guò)程中產(chǎn)生的魚皮廢料，變廢為寶，提高經(jīng)濟(jì)效益。
[0026]3.本發(fā)明所用提取方法為酶促提取法，可以使魚皮膠原蛋白提取的更加徹底，而且在提取過(guò)程中，酶可以切除膠原蛋白的末端段肽，這樣可以降低人體對(duì)其的免疫抗性。同時(shí)本發(fā)明還可以應(yīng)用于哺乳動(dòng)物(豬和牛)以外來(lái)源的水產(chǎn)膠原蛋白醫(yī)用材料，其安全系數(shù)更高、產(chǎn)量更大，而且更加廉價(jià)。
[0027]4.本發(fā)明開發(fā)的水產(chǎn)魚皮膠原蛋白納吸棉，是在模擬生理?xiàng)l件的環(huán)境下完全依靠膠原蛋白自聚集的性質(zhì)制備的，未加任何交聯(lián)劑，所以其在體內(nèi)的安全性、穩(wěn)定性和相容性會(huì)更好?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1為本發(fā)明是實(shí)例提供的膠原蛋白(PSC)終濃度為lmg/mL，氯化鈉終濃度為260mM制得樣品的表觀形態(tài)圖；
[0029]圖2為本發(fā)明是實(shí)例提供的膠原蛋白(PSC)終濃度為2mg/mL，氯化鈉終濃度為520mM制得樣品的表觀形態(tài)圖；
[0030]圖3為本發(fā)明是實(shí)例提供的膠原蛋白(PSC)終濃度為lmg/mL，氯化鈉終濃度為390mM制得樣品的表觀形態(tài)圖；
[0031]圖4為本發(fā)明是實(shí)例提供的膠原蛋白(PSC)終濃度為lmg/mL，氯化鈉終濃度為260mM制得樣品的掃描電鏡圖；
[0032]圖5為本發(fā)明是實(shí)例提供的膠原蛋白(PSC)終濃度為2mg/mL，氯化鈉終濃度為520mM制得樣品的掃描電鏡圖；
[0033]圖6為本發(fā)明是實(shí)例提供的膠原蛋白(PSC)終濃度為lmg/mL，氯化鈉終濃度為390mM制得樣品的掃描電鏡圖。
【具體實(shí)施方式】:
[0034]下面用具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
[0035]實(shí)施例1水產(chǎn)魚皮膠原蛋白納吸棉的制備:
[0036]1.1酶促溶性羅非魚皮膠原蛋白的提取:
[0037]1.1.1清洗魚皮:取出一定量的保存于_20°C的羅非魚皮，用大量自來(lái)水浸泡并沖洗，去除魚皮表面殘留的魚肉、魚鱗等其他組織，用超純水浸泡清洗3次，用吸水紙吸干魚皮表面的水分，
[0038]1.1.2脫脂:準(zhǔn)確稱取1g魚皮，將魚皮剪成I X 2cm大小，于4°C冰柜中，在磁力攪拌器不斷攪拌的條件下，用200mL的10%正丁醇水溶液脫脂8h，重復(fù)上述脫脂過(guò)程3次，然后用自來(lái)水沖洗30min，再用超純水清洗3次；
[0039]1.1.3脫雜蛋白:在4°C冰柜中，將上述脫脂后的魚皮浸泡于200mL的0.lmol/L氫氧化鈉溶液中脫雜蛋白8h，期間適時(shí)用玻璃棒攪拌，重復(fù)上述脫脂過(guò)程3次，然后用自來(lái)水沖洗至中性，再用超純水清洗3次；
[0040]1.1.4酶解提取:用組織粉碎機(jī)將上述處理后的魚皮粉碎，粉碎后魚皮粉中加入500mL的0.5mol/L醋酸溶液，再加入0.05g(原料魚皮質(zhì)量0.5% )胃蛋白酶(750U/mgSigma)，于4°C冰柜中，用磁力攪拌器攪拌提取48h，然后于4°C，10000r/min條件下離心30min,收集上清液；
[0041]1.1.5鹽析及透析:準(zhǔn)確稱取5.2596g研磨細(xì)碎的氯化鈉，緩緩加入到酶提上清液中(最后濃度為0.9mol/L)，整個(gè)過(guò)程均在冰水浴和磁力攪拌器不斷攪拌的條件下進(jìn)行，然后將其置于4°C冰箱中過(guò)夜鹽析，于4°C，10000r/min條件下離心30min，收集沉淀，將沉淀復(fù)溶于0.5mol/L的醋酸溶液中，復(fù)溶液裝于3.5kDa的透析袋中，依次在0.02mol/L磷酸氫二鈉(pH8.6)溶液中透析24h、0.lmol/L醋酸溶液中透析24h和純水中透析48h，整個(gè)透析過(guò)程均在4 °C冰柜中進(jìn)行，
[0042]1.1.6冷凍干燥:將透析完成的膠原蛋白，在_80°C快速預(yù)冷，再在_60°C下冷凍干燥48h，即得羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白。
[0043]1.2羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白自聚集制備納吸棉:
[0044]1.2.1不同濃度膠原蛋白自聚集制備納吸棉:
[0045]準(zhǔn)確稱取20、40及60mg的膠原蛋白分別加入到1mL0.5mol/L醋酸溶液中，在4°C冰柜中、磁力攪拌器攪拌條件下充分溶解48h，然后于4°C、20000g條件下離心30min，用移液槍取出上清液，即得濃度分別為2、4及6mg/mL的膠原液；向各膠原液中緩慢加入10mL40mM含氯化鈉790mM pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(體積比1:1即膠原的終濃度為1、2和3mg/mL，磷酸鹽和氯化鈉終濃度分別為20mM和390mM)，期間不斷攪拌，然后用1mol/L氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)混合液pH至7.4，將混合液置于30°C水浴中自聚集24h，用紗布過(guò)濾膠原蛋白自聚集纖維絲，然后用少量超純水將其從紗布上洗下；將膠原自聚集纖維絲溶液裝于3.5kDa透析袋中，于室溫透析24h，透析液為純水；將透析后的膠原自聚集纖維絲溶液-80°C快速遇冷，然后-60°C冷凍干燥48h，即得羅非魚皮水產(chǎn)膠原蛋白不同濃度自聚集納吸棉。
[0046]1.2.2不同氯化鈉濃度對(duì)膠原蛋白自聚集納吸棉制備的影響:
[0047]準(zhǔn)確稱取3份20mg的膠原蛋白分別加入到3份1mL0.5mol/L醋酸溶液中，在4°C冰柜中、磁力攪拌器攪拌條件下充分溶解48h，然后于4°C、20000g條件下離心30min，用移液槍取出上清液，即得濃度分別為2mg/mL的膠原液；向各膠原液中緩慢加入10mL40mM分別含氯化鈉520、790和1040mM pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(體積比1:1即膠原的終濃度為lmg/mL、磷酸鹽終濃度分別為20mM、氯化鈉的終濃度分別為260、390及520mM)，期間不斷攪拌，然后用lOmol/L氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)混合液pH至7.4，將混合液置于30°C水浴中自聚集24h，用紗布過(guò)濾膠原蛋白 自聚集纖維絲，然后用少量超純水將其從紗布上洗下；將膠原自聚集纖維絲溶液裝于3.5kDa透析袋中，于室溫透析24h，透析液為純水；將透析后的膠原自聚集纖維絲溶液-80°C快速遇冷，然后-60°C冷凍干燥48h，即得不同氯化鈉濃度下羅非魚皮水產(chǎn)膠原蛋白自聚集納吸棉(參見(jiàn)圖1-6)。
[0048]用甲醛固定在玻璃片上，用叔丁醇干燥后，進(jìn)行掃描電鏡測(cè)定其微觀結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示本發(fā)明制得的納吸棉微觀成粗細(xì)均勻的纖維絲狀，性質(zhì)優(yōu)良，分子量在300kDa左右，并且保持了三螺旋結(jié)構(gòu)。
[0049]制備得到的納吸棉其表觀形態(tài)為松散的細(xì)絲狀，其微觀結(jié)構(gòu)呈粗細(xì)均勻縱橫交錯(cuò)的纖維狀，并且在纖維絲交錯(cuò)之間存在均勻的細(xì)小網(wǎng)格將各自聚集得到的纖維絲。
【權(quán)利要求】
1.一種水產(chǎn)魚皮膠原蛋白納吸棉，其特征在于:水產(chǎn)魚皮膠原蛋白納吸棉由羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白自聚集獲得，這種膠原蛋白的分子量在300kDa左右，并保持三螺旋結(jié)構(gòu)。
2.按權(quán)利要求1所述的水產(chǎn)魚皮膠原蛋白納吸棉的制備方法，其特征在于: 1)將水產(chǎn)魚皮膠原蛋白充分溶于濃度為0.5mol/L的醋酸溶液中，得濃度為2-6mg/mL的膠原液，而后離心收集膠原上清液，待用； 2)將磷酸鹽緩沖液按體積比1:1緩緩加入到膠原上清液中，期間不斷攪拌混合液體系，并加入10-15mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)混合液體的pH至7.0-7.8 ； 3)將調(diào)節(jié)pH后的混合液置于25-35°C水浴鍋中，水浴12— 24h，使其充分自聚集； 4)用紗布過(guò)濾膠原自聚集纖維絲，然后用少量超純水將其從紗布上洗下；洗下后將膠原自聚集纖維絲溶液裝于3.5k Da透析袋中，透析24h，透析液為純水；透析后的膠原自聚集纖維絲溶液于-80°C快速遇冷，然后-60°C冷凍干燥48h，即得水產(chǎn)膠原納吸棉。
3.按權(quán)利要求2所述的水產(chǎn)魚皮膠原蛋白納吸棉的制備方法，其特征在于:所述步驟I)將水產(chǎn)魚皮膠原蛋白在溫度為4°C及磁力攪拌器不斷攪拌的條件下充分溶于醋酸溶液中，溶解后的膠原液于4°C、20000g的條件下離心30min，除去不溶性的雜質(zhì)，用移液槍小心吸出上清液，待用。
4.按權(quán)利要求2所述的水產(chǎn)魚皮膠原蛋白納吸棉的制備方法，其特征在于:所述磷酸鹽緩沖液為用氯化鈉配制40mM含氯化鈉520-1040mM pH為7.4的磷酸鹽緩沖液，濾紙過(guò)濾，待用；所述氫氧化鈉溶液為濃度在10 — 15mol/L濾紙過(guò)濾的氫氧化鈉溶液。
5.按權(quán)利要求2所述的水產(chǎn)魚皮膠原蛋白納吸棉的制備方法，其特征在于:所述水產(chǎn)魚皮膠原蛋白為羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白。
6.按權(quán)利要求5所述的水產(chǎn)魚皮膠原蛋白納吸棉的制備方法，其特征在于: 所述羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白的提取步驟為: 1)將清洗并吸干表面水分的羅非魚皮原料在磁力攪拌下用10%正丁醇對(duì)魚皮進(jìn)行脫脂24h，期間每8h更換一次正丁醇溶液；而后清洗待用； 2)于4°C條件下，用0.lmol/L的氫氧化鈉對(duì)上述處理后魚皮進(jìn)行脫雜蛋白24h，期間每8h更換一次氫氧化鈉溶液,而后清洗待用； 3)將上述脫雜蛋白后的魚皮粉碎，粉碎后魚皮粉與0.5mol/L醋酸溶液混合，混合后再加入原料魚皮質(zhì)量0.5% -1%的胃蛋白酶，而后于4°C下攪拌提取48h ； 4)將上述提取后魚皮提取液離心收集上清液，并在冰水浴及攪拌的條件下向上清液中緩緩加入研磨細(xì)碎的氯化鈉至終濃度為0.9mol/L，而后將液體置于4°C冰箱中過(guò)夜鹽析； 5)將上述鹽析液離心，收集沉淀，而后將沉淀復(fù)溶于0.5mol/L的醋酸溶液中；所得復(fù)溶液裝于3.5kDa透析袋中，透析24h，透析液0.02mol/L的磷酸氫二鈉溶液(pH8.6)； 6)上述所得透析液再用0.lmol/L的醋酸溶液透析24h，透析后再用純水透析48h ;透析后的膠原液于_80°C快速遇冷，然后_60°C冷凍干燥48h，即得羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白(PSC)。
【文檔編號(hào)】A61L15/32GK104027835SQ201410231873
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月28日
【發(fā)明者】閆鳴艷, 史文軍, 秦松, 張朝暉, 崔紅利 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所, 江蘇省海洋水產(chǎn)研究所