專利名稱：高產(chǎn)重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法以及新型重組蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及高產(chǎn)重組蛋白的植物的貯藏器官的生產(chǎn)方法、以及肽酶抗性人胰高血 糖素樣肽-1 (GLP-I)的新型衍生物及其利用。本發(fā)明中，“重組蛋白”包含“重組肽和重組 蛋白”(以下表示為“重組蛋白”)。
背景技術：
利用基因工程技術的藥物、臨床檢查藥物、工業(yè)原料的生產(chǎn)已經(jīng)在實際的產(chǎn)業(yè)方 面成就了很大的貢獻，其中，以微生物或哺乳類培養(yǎng)細胞為宿主的物質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)得到特別 廣泛應用。但是，培養(yǎng)這些細胞時，必須有無菌環(huán)境完善的培養(yǎng)設備或培養(yǎng)基等，并且，不可 避免地要消耗石油能源，因此成本高。另外，使用哺乳類細胞作為宿主，則不可避免會有對 人體有害的病毒混入的風險。因此，作為價廉、安全的物質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)，人們開發(fā)了使用轉基因植物的物質(zhì)生產(chǎn)系 統(tǒng)，以此代替通過微生物或哺乳類細胞的培養(yǎng)進行的物質(zhì)生產(chǎn)。例如，迄今為止已報道的 有生產(chǎn)生物降解性聚酯等高分子化合物(例如日本特開2002-262886號公報)、疫苗(例 如 G. Jaeger 等.，Eur. J. Biochem. 259，426，1999)或乳鐵蛋白(D. Chong 等.，Transgenic. Res. 9,71,2000)等蛋白、腦啡肽(日本特開2000-106890號公報)等肽的轉基因植物的制 備。作為轉基因植物，如果可以在該植物的可食用部分例如大豆或水稻的種子、蔬菜 的葉等生產(chǎn)對人體有益的功能性物質(zhì)，則無須經(jīng)過目標物質(zhì)的提取步驟，即可直接經(jīng)口攝 入人體。并且如果是種子，還無需用冷藏裝置完備的設備進行保存或運輸，可在室溫下穩(wěn)定 地長期保存。另外，提取目標物質(zhì)時，種子與葉不同，幾乎沒有酚性物質(zhì)的混入，因此容易純 化。因此可以認為種子是理想的生產(chǎn)目標基因產(chǎn)物的器官，目前為止，已有例如制備生產(chǎn)大 豆球蛋白(T. Katsube 等·，Plant. Physiol. 120，1063，1999)等蛋白、(1, 3-1，4) - β -葡聚 糖酶(H. Horvath 等.,Proc. Nathl. Acad. Sci. USA.，97，1914，2000)等酶、腦啡肽(D. Chong 等·，Transgenic. Res. 9，71，2000)等肽的種子的報告。但是，通過轉基因植物的物質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)與目前作為主流的微生物或哺乳類細胞 培養(yǎng)系統(tǒng)比較，在具有上述優(yōu)異特性的另一面，也有產(chǎn)率低、特別是由植物貯藏器官進行的 生產(chǎn)效率差的問題。為解決該問題，人們考慮了各種增強轉基因植物中物質(zhì)生產(chǎn)能力的方 案。例如，為了改善貯藏其器官之一的種子的物質(zhì)生產(chǎn)能力，從提高導入的目標基因的表 達或基因產(chǎn)物的蓄積的觀點考慮，人們將精力集中于以下的研究利用在種子中強烈表達 的種子貯藏蛋白的啟動子(例如T.Katsube等·，Plant. Physiol. 120，1063，1999)、將該啟動子同與之作用并使表達增強的轉錄因子結合使用(例如D. Yang等.，Proc. Nathl. Acad. Sci. USA.，98，11438，2001)、插入5，非翻譯區(qū)(例如日本特開2002-58492號公報)、使基因 中的 C+G 含量最佳(H. Horvath 等.，Proc. Nathl. Acad. Sci. USA.，97，1914，2000)、向內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)附加核輸送信號(例如日本特開2000-504567號公報)等。還有報告指出使用缺失種 子貯藏蛋白的突變體作為導入外源基因的植物體，則外源基因產(chǎn)物在種子中的生產(chǎn)量提高 (日本特開2002-58492號公報)。但僅憑這些改良，不足以顯示種子中的物質(zhì)生產(chǎn)能力得 到了增強，人們希望開發(fā)出新的方法。另一方面，已知GLP-I (胰高血糖素樣肽-1)是因攝取食物而由消化管分泌、在胰 臟中發(fā)揮功效，刺激糖依賴性胰島素的分泌的激素。II型糖尿病患者中，雖然可以保持對 該GLP-I的應答性，但量不足。GLP-I制劑的開發(fā)作為補充GLP-I的不足部分的胰島素分泌 促進劑，有望應用于糖尿病治療藥。但是，GLP-I的活性本體是GLP-I (7-36)的酰胺化物或 GLP-I (7-37)的多肽，如果口服攝取GLP-1，則在消化管內(nèi)被消化酶消化、分解，不能充分吸 收。因此，目前臨床上嘗試通過輸液進行靜脈內(nèi)注射或皮下注射。并且有報道指出，GLP-I 也可被存在于血液中或組織中的二肽酰肽酶IV(DPP-IV)分解，活性半衰期只有1-2分鐘， 非常短，容易由腎臟排出，在血液中的半衰期在5分鐘以內(nèi)，這些成為臨床應用的瓶頸。因此人們研究開發(fā)難以被分解、半衰期長的GLP-I衍生物。例如有第8位氨基 酸置換衍生物(Diabetologia41，271-278，1998、Biochem40, 2860-2869, 2001)、N 末端和 C末端氨基酸的修飾產(chǎn)物(W09808871等)、將第34位置換為Arg并向第26位Lys導入 親油性基團的衍生物(W00007617)、以及整個序列都有氨基酸置換的衍生物(W09943705、 W09111457)等。另外還進行了皮下吸收緩慢的緩釋型注射劑，或者具有類GLP-I激動活 性、在血液中的半衰期長、來自蜥蜴的合成Exendin-4的注射劑。但是這些都是注射劑，考 慮到患者的負擔，人們希望開發(fā)由注射以外的途徑給藥的新型GLP-I衍生物。本發(fā)明的課題在于提供高產(chǎn)重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法、通過該方法 生產(chǎn)的高產(chǎn)重組蛋白的植物貯藏器官、以及肽酶抗性人胰高血糖素樣肽-I(GLP-I)的新型 衍生物及其利用。S卩，為了增強轉基因植物的貯藏器官中的物質(zhì)生產(chǎn)，進行了上述的各種嘗試。但 是，為了將生產(chǎn)可用作藥物等的重組蛋白的植物貯藏器官作為食物攝取，使其在體內(nèi)發(fā)揮 充分的功能，有必要開發(fā)更高產(chǎn)重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，同時，由植物中提取 重組蛋白并加工成藥物或功能性食品時，可以在這些貯藏器官中高產(chǎn)重組蛋白，這在成本 方面是很重要的。因此，本發(fā)明的目的之一在于提供在轉基因植物中高產(chǎn)重組蛋白的貯藏 器官的新型生產(chǎn)方法。如果選擇GLP-I作為通過上述方法在植物貯藏器官中高產(chǎn)的重組蛋白，則只是象 平常飲食那樣攝取果實或米等，就有望獲得糖尿病的治療效果。但是，如上所述，該天然型 GLP-I在消化管內(nèi)被消化酶消化、分解，因此無法以口服的方式穩(wěn)定給藥，因此目前的現(xiàn)狀 是尚未有除注射以外的有效的給藥方式。因此，人們考慮如果通過一些方法使GLP-I不被 消化而通過胃，就可以在小腸被吸收了。不過，吸收時，GLP-I必須以單體的形式存在。此 時，天然型GLP-I也會被胰蛋白酶等酶分解而失活。并且，天然型GLP-I即使被吸收了，其后也會被二肽酰肽酶IV分解，作用無法持 續(xù)。因此，為了通過口服GLP-I來獲得藥理效果，必須設計一種通過氨基酸置換使其難以被胰蛋白酶或二肽酰肽酶IV分解、具有持續(xù)性活性的GLP-I衍生物。因此，本發(fā)明的另一目的在于提供對胰蛋白酶等消化酶具有抗性的可口服的新 型GLP-I衍生物，進一步優(yōu)選同時對二肽酰肽酶IV具有抗性的新型GLP-I衍生物。由此即 可獲得在作為食物攝取時可被吸收、顯示藥理效果的GLP-I衍生物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人對于轉基因植物中高產(chǎn)重組蛋白的貯藏器官的生產(chǎn)方法進行了深入地 研究，結果發(fā)現(xiàn)通過構建一種載體，將該載體導入細胞中，由該導入有基因的植物的細胞 再分化成轉化體，由該再分化的轉化體獲得貯藏器官，由此可以在轉基因植物中生產(chǎn)高產(chǎn) 重組蛋白的貯藏器官，從而完成了本發(fā)明，其中所述載體含有在植物的貯藏器官中表達的 重組蛋白的基因、細胞分裂素相關基因、抗藥性基因和具有脫離能力的DNA因子，且細胞分 裂素相關基因和抗藥性基因存在于可與具有脫離能力的DNA因子聯(lián)動的位置，在植物的貯 藏器官中表達的重組蛋白的基因存在于與具有脫離能力的DNA因子不聯(lián)動的位置。本發(fā)明還將該高產(chǎn)重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法應用于已知的刺激糖依 賴性胰島素分泌的激素，GLP-I，制備該GLP-I的衍生物，由此提供不會被消化酶等消化、分 解，并且在血漿中穩(wěn)定的GLP-I衍生物。即，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在含有GLP-I (7-36)或者在其 氨基酸序列的基礎上有1個或多個氨基酸缺失、置換和/或附加的序列、且具有GLP-I活性 的肽中、第26位被置換為谷胺酰胺、第34位被置換為天冬酰胺或天冬氨酸的GLP-I衍生物 可保持與天然型GLP-I同等程度的活性，對胰蛋白酶等消化酶具有抗性，可由小腸吸收。還 發(fā)現(xiàn)再通過將第8位的丙氨酸變更為絲氨酸或甘氨酸，還可獲得對二肽酰肽酶IV的抗性， 在血漿中穩(wěn)定，從而完成了本發(fā)明。另外，以往講肽口服給藥時，在胃中會被胰蛋白酶分解， 因此肽是不可以口服的。但是，本發(fā)明由植物貯藏器官生產(chǎn)，因此可獲得胰蛋白酶抗性，可 以口服給藥。附圖簡述

圖1是表示本發(fā)明的實施例中，在制備pGlbGLP130Hm的方案中，由pTL7到 PGlbGLP的制備過程的圖。圖2是表示本發(fā)明的實施例中，在制備pGlbGLP130Hm的方案中，由pUC18和 PNPI130到pNPI130PUC的制備過程的圖。圖3是表示本發(fā)明的實施例中，在制備pGlbGLP130Hm的方案中，由pNPI140和 PNPI130PUC到pNPI130Hm的制備過程的圖。圖4是本發(fā)明的實施例中，表示由pGlbGLP和pNPI 130Hm到pGlbGLP130Hm的制備， 同時表示pGlbGLP130Hm的限制酶切圖譜的圖。圖5是表示本發(fā)明的實施例中，由實施例1和比較例1得到的水稻成熟種子中 GLP-I衍生物融合蛋白的蓄積水平的圖。圖6是表示本發(fā)明的實施例中，以往的載體pGlbGLP-Hm的限制酶切圖譜的圖。圖7是表示本發(fā)明的實施例中，根據(jù)實施例2所示的方法，測定比較制備例1的 GLP-I (7-36酰胺)(天然型GLP-1)、比較制備例2的[Ser8J-GLP-I (7-36酰胺)、比較制備 例 3 的[Gly8] -GLP-I (7-36 酰胺)、和制備例 1 的[Gln26jAsn34] -GLP-I (7-36 酰胺)的環(huán) AMP 產(chǎn)生活性的結果的圖。
圖8是本發(fā)明的實施例中，根據(jù)實施例3所示的方法，將[Gln26， Asn34J-GLP-I (7-36酰胺)進行胰蛋白酶處理，對經(jīng)胰蛋白酶處理的和未經(jīng)處理的情況下比 較環(huán)AMP產(chǎn)生活性的濃度依賴性的圖。圖9是本發(fā)明的實施例中，根據(jù)實施例4所示的方法，使用來自由實施例1得 到的水稻成熟種子的白米及其粉末的GLP-I衍生物、比較制備例1的GLP-I (7-36酰胺) (天然型 GLP-1)、制備例 2 的[Ser8，Gln26, Asp34]-GLP-I (7-36)、制備例 3 的[Ser8，Gln26, Asn34J-GLP-I (7_36)，進行對胰蛋白酶的穩(wěn)定性比較的圖。圖10是表示本發(fā)明的實施例中，根據(jù)實施例5所示的方法，由水稻成熟種子提取 融合蛋白[Ser8，Gln26，Asp34]-GLP-I (7_36)，該提取組分的胰蛋白酶處理時間與環(huán)AMP產(chǎn)生 活性的關系的圖。圖11是本發(fā)明的實施例中，根據(jù)實施例6所示的方法，使用比較制備例1的 GLP-I (7-36 酰胺)(天然型 GLP-1)、制備例 2 的[Ser8，Gln26, Asp34]-GLP-I (7-36)、制備例 3的[Ser8，Gln26，Asn34]-GLP-I (7-36)進行胰蛋白酶抗性的比較的圖。圖12是本發(fā)明的實施例中，根據(jù)實施例7所示的方法，使用比較制備例1的 GLP-I (7-36 酰胺)(天然型 GLP-1)、制備例 2 的[Ser8，Gln26, Asp34]-GLP-I (7-36)、制備例 3 的[Ser8, Gln26, Asn34J-GLP-I (7-36)進行 DPP-IV 抗性的比較的圖。圖13是本發(fā)明的實施例中，根據(jù)實施例8所示的方法，使用比較制備例1的 GLP-I (7-36 酰胺)(天然型 GLP-1)、制備例 2 的[Ser8，Gln26, Asp34]-GLP-I (7-36)、制備例 3的[Ser8，Gln26，Asn34]-GLP-I (7-36)進行胰島素分泌促進活性比較的圖。圖14是本發(fā)明的實施例中，根據(jù)實施例9所示的方法，在使用比較制備例1的 GLP-I (7-36 酰胺)(天然型 GLP-1)、制備例 2 的[Ser8，Gln26, Asp34]-GLP-I (7-36)、制備例 3的[Ser8，Gln26，Asn34]-GLP-I (7-36)進行小鼠經(jīng)口糖負荷試驗中降血糖效果比較的圖中， 以圖15中0至120分鐘血糖值變動圖表曲線下面積表示血糖值變化量。圖15是本發(fā)明的實施例中，根據(jù)實施例9所示的方法，在使用比較制備例1的 GLP-I (7-36 酰胺)(天然型 GLP-1)、制備例 2 的[Ser8，Gln26, Asp34]-GLP-I (7-36)、制備例 3的[Ser8，Gln26，Asn34]-GLP-I (7-36)進行小鼠經(jīng)口糖負荷試驗中降血糖效果比較的圖中， 表示0至120分鐘血糖值隨時間的變化。天然型=GLPl (7-36酰胺)；34N:[Ser8, Gln26, Asn34]-GLP-1 (7-36) ；34D :[Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1 (7-36) ；5 5yg/kg 皮下施用； 20 ZOyg/kg皮下施用。實施發(fā)明的最佳方式[高產(chǎn)重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)]本發(fā)明是高產(chǎn)重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，包含以下步驟(A)構建一 種載體，將該載體導入細胞中的步驟，其中所述載體含有在植物的貯藏器官中表達的重組 蛋白的基因、細胞分裂素相關基因、抗藥性基因和具有脫離能力的DNA因子，且細胞分裂素 相關基因和抗藥性基因存在于與具有脫離機能的DNA因子聯(lián)動的位置，在植物貯藏器官中 表達的重組蛋白的基因存在于與具有脫離機能的DNA因子不聯(lián)動的位置；(B)將通過上述 (A)導入了載體的植物細胞在添加藥物的培養(yǎng)基和不添加藥物的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，由此 再分化為轉化體的步驟；(C)從通過上述(B)再分化的轉化體中獲得植物貯藏器官的步驟。 以下對本發(fā)明進行詳細說明。
(對象植物)本發(fā)明中用于植物貯藏器官的生產(chǎn)的對象植物只要可形成貯藏器官即可，并沒有 特別限定，雙子葉植物的代表性例子有煙草、菜籽、大豆等，單子葉植物的代表性例子有 水稻、玉米、大麥、小麥等谷類或蘆筍等。另外，本發(fā)明中對高產(chǎn)重組蛋白的植物貯藏器官并 沒有特別限定，代表性的有果實、塊根、塊莖、種子等。(所使用的基因)本發(fā)明所使用的基因可通過cDNA或基因組DNA的克隆獲得。另外，如果預先知道 該DNA序列，則也可以化學合成。即使不清楚DNA序列，如果知道氨基酸序列，也可以化學 合成由氨基酸序列推定的DNA序列。本發(fā)明中，基因可以根據(jù)需要將表達所必需的啟動子和/或終止子的序列、還有 使基因產(chǎn)物高效輸送到貯藏器官的信號序列連接使用。這些啟動子、終止子和信號序列只 要可在植物中發(fā)揮功能即可，可以沒有特別限制地使用。例如，可以使用花椰菜花葉病毒的 35S啟動子(J.T. Odell等.，Nature (London)，313，810，1985)、胭脂氨酸合成酶的啟動子 (W. H. R. Langridge 等.，Plant Cell Rep. ,4,355,1985)等作為所述啟動子。并且，如果使 用誘導型啟動子，還可以控制基因表達。所述誘導型啟動子目前有很多是已知的。例如與化學物質(zhì)反應而誘導的啟動 子有谷胱甘肽-S-轉移酶I系基因的啟動子(日本特開平5-268965號公報)、谷胱甘 肽-S-轉移酶II系基因的啟動子(國際公開W093/01294號公報),Tet阻抑物融合型花椰 菜花葉病毒35S啟動子(C. Gatz等.，Mol. Gen. Genet.，227，229，1991)、Lac操縱子/阻抑物 系啟動子(R. J.Wilde 等.，The EMBO Journal，11，1251，1992)、alcR/alcA 系啟動子(國際 公開W094/03619號公報)、糖皮質(zhì)激素系啟動子(青山卓史、蛋白核酸酶、41 =2559,1996), par 系啟動子(T. Sakai 等.，Plant CellPhysiol.，37，906，1996)等，在光條件下反應而 誘導的有二磷酸核酮糖羧化酶小亞基基因(rbcS)的啟動子(R.Fluhr等.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，83，2358，1986)、果糖-1,6- 二磷酸酶基因的啟動子(日本特表平7-501921 號公報)、捕光性葉綠素a/b結合蛋白基因的啟動子(日本特開平5-89號公報)等，其它在 傷害、溫度等各種外部環(huán)境等下反應而誘導的啟動子。如上所述，本發(fā)明的重組蛋白基因的啟動子可以使用35S啟動子等組成型表達的 啟動子或誘導型啟動子，特別優(yōu)選可保證在生產(chǎn)重組蛋白基因的植物貯藏器官中表達的該 植物貯藏器官特異性啟動子。這樣的在植物的特定組織或器官中促進特異性表達的啟動子 也是本領域技術人員廣泛已知的。例如，本發(fā)明中，所述啟動子可以使用在水稻種子中使外 源基因表達的種子貯藏蛋白基因的啟動子——球蛋白基因的啟動子(M. Nakase等.，Plant Mol. Biol. ,33,513,1997)、谷蛋白基因的啟動子(F. Takaiwa 等·，Plant Mol. Biol.，17， 875，1991)等。還可以使用在菜豆、蠶豆、豌豆等豆科作物，花生、芝麻、菜籽、棉籽、葵花籽、 紅花籽等糧油種子作物的種子中使外源基因表達的啟動子——大豆球蛋白基因的啟動子、 夕7 工'J > 基因的啟動子(J.Rodin 等.，Plant Mol. Biol.，20，559，1992)等各作物的 主要種子貯藏蛋白基因的啟動子。另一方面，本發(fā)明中，終止子可以以胭脂氨酸合成酶的終止子(A. D印icker等.、 J. Mol. Appl. Gen.，1，561，1982)、章魚氨酸合成酶的終止子(J. Gielen 等·，EMBO J.，3， 835，1984)為代表，從DNA數(shù)據(jù)庫中登錄的植物基因的終止子等中選擇使用。
本發(fā)明中，可導入植物的重組蛋白基因不僅是編碼對人或家畜等動物的健康有 作用的功能性肽、藥物肽等的基因，也可以是編碼功能未知的任意的肽或蛋白的基因。例 如，本發(fā)明的實施例中就是將編碼GLP-I衍生物的基因?qū)胫参镏?，在植物的種子中生產(chǎn) GLP-I衍生物，可根據(jù)本發(fā)明的方法在植物的貯藏器官中生產(chǎn)的重組蛋白不僅限于GLP-I 或其衍生物，包括已經(jīng)作為藥物使用或開發(fā)的各種肽或蛋白(S. Jowphson and R. Bishop， TIBTECH，6，218，1988)在內(nèi)，近年來發(fā)現(xiàn)的低膽固醇肽(例如日本特開2001-114800號公 報)、螨塵或花粉抗原的T細胞表位肽(例如美國專利6268491號、日本特開平10-7700號 公報、日本特開平10-259198號公報、日本特開平10-506877號公報、日本特開平11-9M97 號公報、日本特開2000-327699號公報)等各種肽或蛋白都可通過本發(fā)明的方法在植物貯 藏器官生產(chǎn)。可以根據(jù)其性質(zhì)和目的生產(chǎn)經(jīng)適當修飾的上述肽。即，以GLP-I為例，除GLP-I 之外，本發(fā)明還可適用于含有GLP-I (7-36)或在其氨基酸序列的基礎上有1或多個氨基酸 缺失、置換和/或附加的序列、且具有GLP-I活性的肽，或者具有該肽的第沈位被谷氨酰 胺、第34位被天冬酰胺或天冬氨酸置換的氨基酸序列的GLP-I衍生物。本發(fā)明中，含有 GLP-I (7-36)或者在其氨基酸序列的基礎上有1或多個氨基酸缺失、置換和/或附加的序 列、且具有GLP-I活性的肽也適合為GLP-I (7-36)、GLP-I (7-37)或它們的C末端為酰胺化 物的GLP-I衍生物。本發(fā)明也適合將這些GLP-衍生物的第8位置換為絲氨酸或甘氨酸的 GLP-I衍生物和SEQ ID NO. 2的GLP-I衍生物。(導入的重組蛋白基因的構建)本發(fā)明中，可以使用一種融合基因，該融合基因是通過將編碼這些重組蛋白的基 因(DNA序列)插入或置換到編碼原本在植物貯藏器官中表達的蛋白，例如種子貯藏蛋白， 的基因中編碼可變區(qū)的基因序列內(nèi)，其中所述植物貯藏器官是要通過本發(fā)明的方法高產(chǎn)重 組蛋白的貯藏器官，所述編碼區(qū)不會對原本在植物貯藏器官中表達的蛋白的蓄積量等不 會因此受到不良影響。例如實施例中，將編碼上述GLP-I衍生物的基因插入球蛋白基因中 編碼蛋白可變區(qū)的位置，形成融合基因使用。另外，此時，通過在重組蛋白基因和插入或置 換了該基因的、原本在植物貯藏器官中表達的貯藏蛋白基因的交界處設置酶切序列，可以 在提取所述融合基因的表達產(chǎn)物后，通過酶處理，切取目標重組蛋白并純化。如果將要用胰 蛋白酶等消化酶處理的酶切序列設置于此，則在通過飲食攝取要由本發(fā)明的方法高產(chǎn)重組 蛋白的種子等植物貯藏器官后，目標肽或蛋白在小腸中被切取，被體內(nèi)吸收，發(fā)揮各種生理 機能。種子貯藏蛋白是主要貯藏在種子中的蛋白，作為發(fā)芽所必需的營養(yǎng)元素而發(fā)揮著 重要的作用(稻學大成第3卷、農(nóng)山漁村文化協(xié)會)?？稍诒景l(fā)明中使用的種子貯藏蛋白基 因的種類沒有特別限定，例如可以使用水稻球蛋白、谷蛋白、谷醇溶蛋白、擬南芥的2S白蛋 白(日本特開2000-106890號公報)等基因。重組蛋白基因的插入位置只要是不使原本種 子貯藏蛋白基因所編碼的蛋白的特性發(fā)生變化的可變區(qū)即可，并沒有特別限定。例如，本發(fā) 明的實施例中，是將編碼GLP-I衍生物的基因插入編碼水稻球蛋白第109號氨基酸部位的 位置。(導入載體的構建)本發(fā)明中，通過構建一種載體，對植物進行基因?qū)搿Ｋ鲚d體中細胞分裂素相關基因和抗藥基因存在于與具有脫離能力的DNA因子聯(lián)動的位置，并且上述重組蛋白基因存 在于與它們的不聯(lián)動的位置上。這里，細胞分裂素相關基因是指具有促進植物中細胞分裂或引起由植物的組織分 化定芽或不定芽等的功能、與細胞分裂素的生成等相關的基因。關于所述細胞分裂素相關基因，本發(fā)明中例如可以使用來自根癌農(nóng)桿菌的ipt基 因(A. C. Smigocki、L. D. Owens，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85，5131，1988)、來自紅球菌的 ipt基因、來自擬南芥的細胞分裂素合成酶基因、來自假單胞菌的ptz基因等的細胞分裂素 合成基因，除此之外，還有使惰性細胞分裂素活化的基因——來自大腸桿菌的葡糖醛 酸糖苷酶基因(Morten Joersbo and Finn Τ. Okkels, Plant Cell Reports 16,219-221, 1996)、被認為是細胞分裂素受體基因的來自擬南芥的CKIl基因(Kakimoto T. Science 274,982-985,1996)等細胞分裂素相關基因的任意一種。本發(fā)明中，抗藥性基因是指使導入該基因的植物細胞具有抗生素抗性和農(nóng)藥抗性 的基因。所述抗生素抗性基因例如可以使用潮霉素抗性基因(HPT 潮霉素磷酸化酶基因)、 卡那霉素抗性基因(NPTII 新霉素磷酸化酶基因)等，農(nóng)藥抗性基因可以使用磺酰脲系抗 性基因(ALS 乙酰乳酸合成酶基因)等。具有脫離能力的DNA因子是指本身具有可從它們所存在并發(fā)揮功能的染色體DNA 等中脫離的能力的DNA序列。植物中，這樣的因子已知有存在于染色體DNA中的被稱為轉 座子的因子，其結構和功能以及其動態(tài)已基本研究清楚。即，原則上轉座子發(fā)揮功能必須具 備兩個構成要素，即由位于其內(nèi)部的基因表達、催化其本身的脫離或轉移的酶(轉移酶)， 以及也是存在于其內(nèi)部的末端區(qū)、該轉移酶與之結合并作用的DNA序列。通過這些功能，轉 座子由其所存在的染色體DNA上脫離，然后通常轉移至DNA上新的位置，但也有一定的概率 是不轉移而直接失去功能、消失等，因此，本發(fā)明就是利用這樣的轉座子的轉移錯誤。轉座子有所述自主性轉座子、即保持轉移酶和DNA結合序列兩個要素，由轉座子 內(nèi)部表達的轉移酶與存在于末端區(qū)的DNA序列結合并作用，由此可自主地從其存在的染色 體上脫離并轉移的轉座子，除此之外，也有被稱為非自主性轉座子的形式。該非自主性轉 座子是指雖然保持有轉移酶與之結合并作用的末端DNA序列，但內(nèi)部的轉移酶基因發(fā)生突 變，轉移酶不表達，因此不能自主地從染色體上脫離的轉座子。不過，如果由自主性轉座子 或者獨立存在的轉移酶基因提供轉移酶，則非自主性轉座子與自主性轉座子顯示同樣的動 態(tài)。自主性轉座子有由玉米分離出的Ac和Spm等(A. Gieri and H. Saedler, Plant Mol. Biol.，19，39，1992)。尤其Ac，可用限制酶Sau3A從玉米染色體中切取wx_m7基因座 而獲得(U. Behrens等·，Mol. Gen. Genet. 194，346，1984)，是植物轉座子中對其的分析最有 進展的自主性轉座子，其DNA序列也得到闡明(M. Muller-Neumann等·，Mol. Gen. Genet.， 198，19，1984)，因此本領域技術人員可容易地獲得，適合作為本發(fā)明所使用的DNA因子。 另外，非自主性轉座子分別是Ac、Spm的內(nèi)部區(qū)域有缺失的因子，以Ds、dSpm為代表(H. -P. Doring and P. Starlinger, Ann. Rev. Genet. 20，175，1986)，除玉米之外，還已知從金魚草、 牽牛等很多植物中分離得到(例如Y. Inagaki等.，Plant Cell，6，375，1994).由很多例子得知，這些轉座子在被導入到與其來源植物不同的種類植物的染色體 中時，可以發(fā)揮其能力進行脫離、轉移(例如B. Baker等.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83,4844,1986)。本發(fā)明中，使用自主性、非自主性轉座子均可。使用非自主性轉座子時，還需 要將由自主性轉座子等中獲得或合成的轉移酶基因?qū)肫渲?，這種情況下，可以將其與該 非自主性轉座子一起共同整合導入到本發(fā)明的載體中，也可以完全分別地導入。已知存在于植物以外的具有脫離能力的DNA因子有來自位點特異性重組體系的 因子。該位點特異性重組體系包含以下兩個要素具有特征性DNA序列的重組位點(相當 于本發(fā)明的具有脫離能力的DNA因子)，以及與該DNA序列特異性結合、當存在2個或以上 該序列時催化其序列間重組的酶；該DNA序列在同一 DNA分子上朝同一方向以一定的間隔 存在于兩處位置時，夾在它們之間的區(qū)從該DNA分子(質(zhì)粒、染色體)上脫離；該序列朝相 對的方向存在于兩處位置時，該區(qū)域顯示反轉的動態(tài)。本發(fā)明是利用該前者的脫離作用。 已知編碼重組酶的基因無需存在于與重組位點相同的DNA分子上，只要存在于與其相同的 細胞中并表達，即可發(fā)生該DNA序列間的脫離、反轉(N. L. Craig, Annu. Rev. Genet.，22，77， 1988)。目前，位點特異性重組體系已知有從噬菌體、細菌(例如大腸桿菌)、酵母等微生 Cre/lox R/RS FLP eer fim % (N. L. Craig, Annu. Rev. Genet. ,22,
17,1988中有概述)，但在高等生物中尚未知其存在。不過正如國際公開W093/01283號公 報中的來自Pl噬菌體的Cre/lox系用作導入植物的基因?qū)胼d體那樣，由上述微生物分離 的位點特異性重組體系在導入植物等與其來源生物種類不同的生物種類時，也可獲得與其 原本的生物體內(nèi)的舉動相同的舉動。本發(fā)明的一個實施例中，將重組酶插入酵母(接合酵 母)的位點特異性重組體系 R/RS 系(H. Matsuzaki 等.，J. Bacteriology, 172，610，1990) 的重組位點之間來應用，已有報告指出該R/RS系在高等植物中也可保持其本來的功能 (H. Onouchi 等·，Nucleic Acid Res.，19，6373，1991)。本發(fā)明中，插入細胞分裂素相關基因和抗藥基因的位置只要是與具有脫離能力的 DNA因子一起，使其可脫離的位置即可。例如使用自主性轉座子作為具有脫離能力的DNA因 子時，可以將其插入到轉移酶基因的啟動子區(qū)上游、該轉移酶基因所結合的末端區(qū)的下游 的不影響轉座子脫離的位置。使用R/RS系時，任何在被重組位點夾持的區(qū)域內(nèi)，且不阻礙 重組酶的表達的位置均可插入。(構建的載體向植物細胞的導入)本發(fā)明中，將這樣構建的載體導入植物細胞。如上述(對象植物)項所述，導入該 載體的植物只要是形成貯藏器官的植物即可，沒有特別限定，例如如果是單子葉植物，則有 以水稻、玉米、大麥、小麥等谷類或蘆筍等為代表的植物，如果是雙子葉植物，則有以煙草、 菜籽、大豆等為代表的植物。構建的載體向植物細胞的導入也可以使用公知的方法進行。例 如除經(jīng)由農(nóng)桿菌屬細菌的方法之外，還可以使用電穿孔法、聚乙二醇法、基因槍法等公知的 任意方法，但并不限于此。例如，使用本發(fā)明的方法向水稻中導入重組蛋白基因時，可以優(yōu)選使用日本特許 第3141084號公報所記載的方法。此時，播種水稻種子并使其發(fā)芽的播種培養(yǎng)基例如可使 用 N6C12 培養(yǎng)基(N6 無機鹽類以及維生素類(Chu C. C.，1978，Proc. Symp.，Plant Tissue Culture, SiencePress Peking, pp. 43-50)、30g/L 蔗糖、2. 8g/L 脯氨酸、0. 3g/L 酪蛋白氨基 酸、lmg/L 2，4-D、4g/L脫乙酰吉蘭糖膠)等。但是，對上述培養(yǎng)基組成并沒有特別限定，可 以通過改變其組成物的種類、濃度來實施本發(fā)明。
(轉化體的再分化)由導入了重組蛋白基因的植物細胞或組織進行轉化體的再分化時，可以將基因?qū)?入處理后的細胞或組織在添加藥物的培養(yǎng)基和不添加藥物的培養(yǎng)基中，采用公知的方法進 行培養(yǎng)。本發(fā)明中，轉化體是指定芽、不定芽、不定根等植物組織或小植株。例如，根據(jù)本發(fā)明，將重組蛋白基因?qū)胨静@得轉化體時，如上所述，使用構 建的載體，根據(jù)日本特許第3141084號公報記載的方法進行基因?qū)胩幚恚商幚砗蟀l(fā)芽 的種子切取水稻盾片組織，將該盾片組織例如在添加藥物的培養(yǎng)基N6C12TCH25培養(yǎng)基 (N6無機鹽類和維生素類、30g/L蔗糖、2. 8g/L脯氨酸、0. 3g/L酪蛋白氨基酸、2mg/L2，4-D、 500mg/L羧芐青霉素、25mg/L潮霉素、4g/L脫乙酰吉蘭糖膠)培養(yǎng)1周，再在添加藥物的培 養(yǎng)基N6C14TCH25培養(yǎng)基(N6無機鹽類和維生素類、30g/L蔗糖、2. 8g/L脯氨酸、0. 3g/L酪 蛋白氨基酸、細g/L2，4-D、500mg/L羧芐青霉素、25mg/L潮霉素、4g/L脫乙酰吉蘭糖膠)培 養(yǎng)1周，再用未添加藥物的培養(yǎng)基MSRC培養(yǎng)基(MS無機鹽類和維生素類(MurashigeJ. and Skoog，F(xiàn).，1962,Physiol. Plant.，15,473)、30g/L 蔗糖、30g/L 山梨醇、2g/L 酪蛋白氨基酸、 500mg/L羧芐青霉素、4g/L脫乙酰吉蘭糖膠)中培養(yǎng)，可得到作為芽或小植株的轉化體。當 然，上述例舉的培養(yǎng)條件不是絕對的，可以根據(jù)需要改變培養(yǎng)基的組成、濃度，或者添加各 種植物激素或藥物，改變培養(yǎng)時間。含藥物的培養(yǎng)基使用添加與抗藥性基因?qū)乃幬锏呐囵B(yǎng)基，其中所述抗藥性基 因整合到如上構建的用于基因?qū)氲妮d體中。例如將潮霉素抗性基因整合到該載體中時， 可以使用添加有潮霉素的培養(yǎng)基，將磺酰脲系抗性基因整合到該載體中時，可以使用添加 有磺酰脲系農(nóng)藥的培養(yǎng)基。(植物貯藏器官的獲得)本發(fā)明中，植物貯藏器官可以如下獲得如上述，由導入了重組蛋白基因的植物細 胞或組織再分化為轉化體，然后采用公知的方法培育該轉化體。例如，該轉化體為不定芽 時，可通過公知的方法進行生根處理，再生植株，培育該植株，使其結籽，即可收獲高產(chǎn)重組 蛋白的植物成熟種子等貯藏器官。不定芽的生根可以采用在MS瓊脂培養(yǎng)基上插植不定芽 等方法進行。另外，轉化體以小植株的形式獲得時，即使不進行生根處理也可以得到轉基因 植物。并且利用塊根或塊莖等作為植物貯藏器官時，可以通過公知的方法，無須經(jīng)過植株的 再生過程，使這些組織分化，即可由所得轉化體獲得。(GLP-1 類的生產(chǎn))本發(fā)明中，采用高產(chǎn)重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法提供GLP-I類。已知 GLP-I是刺激糖依賴性胰島素分泌的激素，因此GLP-I (7-36)是具有His-Ala-Glu-Gly-Thr -Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly- Arg所示序列的肽。本發(fā)明中，將編碼該GLP-1 (7-36)氨基酸序列 的基因，或者編碼含有在GLP-I (7-36)氨基酸序列的基礎上有1個或多個氨基酸缺失、置換 和/或附加的序列、且具有GLP-I活性的肽的基因作為上述重組蛋白，整合到本發(fā)明中所構 建的載體中，使該基因表達，生產(chǎn)GLP-I類。(GLP-1 衍生物)如上所述，本發(fā)明提供GLP-I類的生產(chǎn)方法，同時制備該GLP-I的衍生物，提供不 被消化酶等消化、分解，并且在血漿中穩(wěn)定的GLP-I的衍生物。本發(fā)明的衍生物是在含有GLP-I (7-36)或者在其氨基酸序列的基礎上有1個或多個氨基酸缺失、置換和/或附加的序 列、且具有GLP-I活性的肽中，第沈位被谷氨酰胺置換，第34位被天冬酰胺或天冬氨酸置 換，該GLP-I衍生物可保持與天然型GLP-I同等程度的胰島素分泌促進活性，且對胰蛋白酶 等消化酶具有抗性，由此變?yōu)榭捎尚∧c吸收。進一步通過將第8位的丙氨酸變更為絲氨酸 或甘氨酸，還可獲得對二肽酰肽酶IV的抗性，可變?yōu)樵谘獫{中也穩(wěn)定。S卩，本發(fā)明的GLP-I衍生物是在含有GLP-I (7-36)或者在其氨基酸序列的基礎上 有1個或多個氨基酸缺失、置換和/或附加的序列、且具有GLP-I活性的肽中、第沈位被 谷氨酰胺置換，第34位被天冬酰胺或天冬氨酸置換的產(chǎn)物，這里，含有GLP-I (7-36)或者 在其氨基酸序列的基礎上有1個或多個氨基酸缺失、置換和/或附加的序列、且具有GLP-I 活性的肽也包含GLP-I前體、類似物、以及它們的C末端酰胺化物，優(yōu)選GLP-I (7-36)、 GLP-I (7-37)或它們的末端酰胺化物。特別優(yōu)選本發(fā)明的GLP-I衍生物將第8位置換成絲 氨酸或甘氨酸。二肽酰肽酶IV是識別多肽鏈由N末端開始的第2個脯氨酸或丙氨酸，并水 解其羧基一側的酶。這里，優(yōu)選本發(fā)明的GLP-I衍生物將第8位的丙氨酸變更為絲氨酸或 甘氨酸。該第8位置換物可保持與天然型GLP-I同等程度的活性，在血漿中也穩(wěn)定。如上所述，本發(fā)明所使用的GLP-I (7-36)是具有以下的氨基酸序列的肽=His-Ala -Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg,第 8 位改變?yōu)榻z氨酸的[Ser8]表示第 2 個(相 當于第8位)的Ala變換為義！·。本發(fā)明的GLP-I衍生物可以通過化學合成或基因重組技 術制備。即，多肽的化學合成原理是本領域所周知的，可將以下的本領域的常規(guī)教材作為 參考Dugas H.禾口 Penney C, Bioorganic Chemistry, 1981, Springer-Verlag, New York, pp. 54-92、Merrifields JM, Chem. Soc，85，2149，1962、Stewart 禾口 Young， Solid Phase Peptide Synthesis, pp. 24-66，F(xiàn)reeman (San Francisco, 1969)。例如可使用 430A 肽合成 儀(PE-Applied Biosystems Inc，850 Lincoln Center Drive, Foster City CA94404)禾口 由PE-Applied Biosystems提供的循環(huán)合成儀，通過固相方法合成本發(fā)明的肽。Boc氨基酸 及其它試劑可由PE-Applied Biosystems以及其它試劑供應商購買。通過基因重組技術進行的本發(fā)明的GLP-I衍生物的生產(chǎn)可以全合成GLP-I衍生物 的DNA、或使用編碼更大的天然胰高血糖素的DNA經(jīng)修飾得到的基因進行。合成基因的構建 方法是本領域所周知的，可參照Brown等著的Methods in Enzymology, Academic Press, NY,第 68 卷 109-151 頁。對于本發(fā)明的GLP-I衍生物的生產(chǎn)所使用的DNA，除上述之外，還可以在提高表達 量、使產(chǎn)物在宿主內(nèi)穩(wěn)定蓄積方面，在生產(chǎn)后容易純化方面，或者在生產(chǎn)融合蛋白并容易地 切取GLP-I衍生物等方面多加考慮。例如，與β-半乳糖苷酶、β-內(nèi)酰胺酶、A蛋白、TrpE 等蛋白的基因連接，生產(chǎn)融合蛋白的方法就是其中之一。這些情況下，例如生產(chǎn)后為了以單 體的形式獲得GLP-I衍生物，可以在各基因之間加入與氨基酸的甲硫氨酸對應的基因，進 行溴化氰處理。此時，C末端為Hse (高絲氨酸)。本發(fā)明中有的GLP-I衍生物中，只在C末 端具有精氨酸，通過精氨酰內(nèi)肽酶的酶處理，可得到GLP-I衍生物的單體。編碼上述GLP-I衍生物的基因可以通過公知的基因工程技術導入植物以外的細 胞中表達，由此可生產(chǎn)GLP-I衍生物。這種情況下，使用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶，將編碼GLP-I衍生物的基因插入適當?shù)闹亟MDNA表達載體。構建了 GLP-I衍生物的表達載體 后，使用該載體轉化適當?shù)乃拗骷毎?。宿主細胞可以使用真核細胞或原核細胞的任意?胞。載體的構建和轉化細胞的技術是本領域所周知的，通常可參照Molecular Cloning ； A Laboratory Manual, Cold Springs HarborLaboratory Press, NY, Vol. 1-3,1989。此 時，為實現(xiàn)目標基因的有效的轉錄，可以將其與啟動子-操縱子區(qū)功能性結合?？稍谠?細胞和真核細胞的轉化中使用的各種表達載體是周知的，可參照！"he PromegaBiological Research Products Catalogue禾口The Stratagene CloningSystems Catalogue。本發(fā)明的 GLP-I衍生物的生產(chǎn)可以利用以廣泛采用的微生物和哺乳類培養(yǎng)細胞為宿主的物質(zhì)生產(chǎn)系 統(tǒng)。另外，也可以利用采用上述的轉基因植物的物質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)作為價廉、安全的物質(zhì)生產(chǎn)系 統(tǒng)。[本發(fā)明的GLP-I衍生物的利用]本發(fā)明所生產(chǎn)的GLP-I衍生物可以以植物種子等貯藏器官的形式，或者純化、分 離制成制劑的形式，或者以添加該成分的飲料食品的形式攝取并利用。以制劑的形式利用 時，可以將含有GLP-I衍生物的成分與制劑可接受的載體、稀釋劑、賦型劑或吸收促進劑組 合，制成制劑，用作藥物組合物。本發(fā)明的GLP-I衍生物對于與GLP-I有關的各種疾病有效， 例如，可用于胰島素非依賴性慢性糖尿病的處置、胰島素依賴性慢性糖尿病的處置、肥胖的 處置或者抑制食欲。
(實施例)以下給出實施例具體說明本發(fā)明。但本發(fā)明并不受下述事實例的限定。以下的 實施例中，如無特別說明，更詳細的實驗操作均根據(jù)分子生物學的方法，按照Molecular Cloning (Sambrook等.，1989)或制造商的操作說明書進行。[實施例1]I.質(zhì)粒 pGlbGLP130Hm 的制備將用限制酶EcoRI和ke 83871切取的水稻球蛋白啟動子、SEQ IDN0. 1所示 的編碼[Ser8、Gin26、Asp34]-GLP-I (7-36酰胺)的基因插入到可變區(qū)(第109號氨基酸 部位)得到的水稻球蛋白基因、以及胭脂氨酸合成酶聚腺苷酸化信號所連接的基因片段 插入至Ij pTL7 (H. Ebinuma 等· ，Molecular Methods of Plant Analysis, 22 :95,2002)的 EcoRI-Sse8387I限制酶切位點之間，得到質(zhì)粒pGlbGLP。如SEQ ID N0. 2所示，[Ser8Xln26, Asp34I-GLP-I (7-36)是含有GLP-I的7_36號的氨基酸，其中第8位被絲氨酸置換，第沈位 被谷氨酰胺置換，第34位被天冬酰胺置換的衍生物，插入到水稻球蛋白基因中時，其N末端 一側附加有賴氨酸殘基(AAG)。另一方面，用限制酶KpnI酶切質(zhì)粒pUC18的KpnI限制酶切位點，通過T4聚合酶 形成平滑末端，然后再結合，得到質(zhì)粒PUC18 Δ kpnl。用限制酶ke8387I從質(zhì)粒pNPI 130 (日 本特開平9-154580號公報)酶切酵母的位點特異性重組體系的重組序列Rs所夾持的區(qū) 域，將其插入上述pUC18AkpnI的ke8387I限制酶切位點，得到質(zhì)粒pNPI130PUC。用限制酶ΚρηΙ，從質(zhì)粒pNPI140(日本特開平9-154580號公報)中酶切CaMV35S 啟動子、Hm(潮霉素抗性)基因和胭脂氨酸合成酶聚腺苷酸化信號所連接的基因片段，插入 PNPI130PUC的KpnI限制酶切位點，得到質(zhì)粒pNPI130Hm。
目標質(zhì)粒如下獲得用限制酶ke8387I從該pNPI130Hm中酶切酵母的位點特異 性重組體系的重組序列Rs所夾持的區(qū)域，將其插入pGlbGLP的ke8387I限制酶切位點之 間。將所得質(zhì)粒命名為pGlbGLP130Hm，于2003年3月25日保藏在國際專利生物保藏機構， 獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所特許生物寄托中心(TsukiAa Central 6,1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan), H ^1 ^ FERM BP—8343。 i亥 pGlbGLP130Hm中，作為在植物的貯藏器官中表達的重組蛋白基因，編碼[Ser8、Gin26、 Asp34]-GLP-I (7-36)的基因以插入到水稻球蛋白基因的可變區(qū)(第109號氨基酸部位)的 形式存在，還具有細胞分裂素相關基因ipt基因、抗藥性基因——潮霉素抗性基因，并使用 酵母的位點特異性重組系R/RS系作為具有脫離能力的DNA因子。pGlbGLP130Hm的制備方案如圖1_4所示，該pGlbGLP130Hm中要整合到植物染色體 中的區(qū)(T-DNA區(qū))的限制酶切圖譜如圖4所示。圖1-4中，Glb-P表示水稻球蛋白基因的 啟動子，GLP表示編碼[Ser8、Gin26、Asp34]-GLP-I (7-36)的基因，球蛋白表示水稻球蛋白基 因，T表示胭脂氨酸合成酶基因的聚腺苷酸化信號，Ia表示lacZ’基因的片段，35S-P表示 花椰菜花葉病毒的35S啟動子，ipt表示ipt基因，圈T表示ipt基因本身的聚腺苷酸化信 號，Hm表示潮霉素抗性基因，R表示重組酶基因，方框圈起的三角形表示重組序列Rs及其序 列方向，RB和LB表示T-DNA區(qū)的邊界序列。II. pGlbGLP130Hm向農(nóng)桿菌的導入將根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株接種于IOmL YEB液體培養(yǎng)基(5g/L牛肉膏、lg/L酵母 膏、5g/L蛋白胨、5g/L蔗糖、2mM MgS04、22°C的pH為7. 2 (以下如無特別說明，均為22°C下 的pH))，在培養(yǎng)，使0D630在0. 4-0. 6的范圍。以6900Xg、在4°C下將培養(yǎng)液離心10 分鐘，收集菌體，將菌體懸浮于20mlIOmM HEPES (pH 8.0)中，再次以6900 X g、在4°C離心 10分鐘，收集菌體，接著將該菌體懸浮于200 μ 1的YEB液體培養(yǎng)基中，將其作為質(zhì)粒導入菌 液。使用該質(zhì)粒導入菌液，如下進行pGlbGLP130Hm向農(nóng)桿菌的導入。S卩，使用Gene Pulser II系統(tǒng)[BI0RAD制造]，在0. 5ml管中對將50 μ 1上述質(zhì)粒導入菌液和3μ 1 pGlbGLP130Hm混合的混合液進行電穿孔，向經(jīng)電穿孔處理后的混合液中加入200 μ 1 YEB 液體培養(yǎng)基，在25°C振蕩1小時進行培養(yǎng)，然后將菌體接種于添加有50mg/L卡那霉素的 YEB瓊脂培養(yǎng)基(1. 5w/V%瓊脂，其它組成與上述相同)，在培養(yǎng)2天。再將所得菌落 轉移至YEB液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，接著，通過堿法從該菌體中提取質(zhì)粒，可確認這些菌是導 入有 pGlbGLP130Hm 的 EHA105 菌株，將其稱為 EHA105 (pGlbGLP130Hm)。III.感染材料的制備使用水稻品種“日本晴”作為基因?qū)氲膶ο?，按照細胞工學別冊植物細胞工學系 列4模型植物的試驗方案(93-98頁)進行該成熟種子的滅菌。將滅菌的成熟種子播種于 N6C12培養(yǎng)基(N6無機鹽類以及維生素類、30g/L蔗糖、2. 8g/L脯氨酸、0. 3g/L酪蛋白氨基 酸、lmg/L2，4-D、4g/L脫乙酰吉蘭糖膠、pH = 5. 8)，用外科膠帶封住，在亮處培養(yǎng)，使其 發(fā)芽，制成通過農(nóng)桿菌EHA105 (pGlbGLP130Hm)進行感染的材料。IV.通過農(nóng)桿菌EHA105(pGlbGLP130Hm)進行水稻的轉化以及轉化水稻的制備將在YEB瓊脂培養(yǎng)基(5g/L牛肉膏、lg/L酵母膏、5g/L蛋白胨、5g/L蔗糖、2mM MgS04、15g/L Bacto-agar)中培養(yǎng)的農(nóng)桿菌EHA105 (pGlbGLP130Hm)轉移到YEB液體培養(yǎng)基中，在25°C以ISOrpm培養(yǎng)過夜，然后以3000rpm離心20分鐘，收集菌體，懸浮于含有乙酰 丁香酮(10mg/L)的N6培養(yǎng)基(N6無機鹽類以及維生素類、30g/L蔗糖、2mg/L 2，4_D、pH = 5. 8)，使OD63tl = 0.15,制成感染用農(nóng)桿菌懸浮液。將III中制備的發(fā)芽種子裝入50ml管中，向其中注入上述感染用農(nóng)桿菌懸浮液， 浸泡種子。浸泡1. 5分鐘后，倒去農(nóng)桿菌懸浮液，將發(fā)芽的種子置于無菌濾紙上，吸去多余 的水分，然后播種于N6C12培養(yǎng)基(N6無機鹽類以及維生素類、30g/L蔗糖、2. 8g/L脯氨酸、 0.3g/L酪蛋白氨基酸、lmg/L 2，4-0、48/1脫乙酰吉蘭糖膠、？!1=5.2)，用外科膠帶封住， 在暗處共培養(yǎng)3天，再轉移到N6C12CH25培養(yǎng)基(N6無機鹽類以及維生素類、30g/L蔗 糖、2. 8g/L脯氨酸、0. 3g/L酪蛋白氨基酸、2mg/L 2，4_D、500mg/L羧芐青霉素、25mg/L潮霉 素、4g/L脫乙酰吉蘭糖膠)，培養(yǎng)1周，然后從發(fā)芽種子的盾片組織中切取所發(fā)的芽。接著，將該盾片組織在N6C14TCH25培養(yǎng)基(N6無機鹽類以及維生素類、30g/L蔗 糖、2. 8g/L脯氨酸、0. 3g/L酪蛋白氨基酸、％ig/L2，4-D、500mg/L羧芐青霉素、25mg/L潮霉 素、4g/L脫乙酰吉蘭糖膠)上培養(yǎng)1周，再在MSRC培養(yǎng)基(MS無機鹽類以及維生素類、30g/ L蔗糖、30g/L山梨醇、2g/L酪蛋白氨基酸、500mg/L羧芐青霉素、4g/L脫乙酰吉蘭糖膠)上 培養(yǎng)，在與EHA105(pGlbGLP130Hm)共培養(yǎng)后，在1個月至2個月之間再分化為芽或小植株。 再分化的芽或小植株移植到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到高約20cm的幼苗。使用Dneasy 96 PlantKit (QIAGEN制備)，從該幼苗中提取染色體DNA，通過PCR法確認編碼[Ser8、Gin26、 Asp34]-GLP-I (7-36)的基因的存在。此時，為了檢測插入到球蛋白基因的可變區(qū)的、編碼[Ser8、Gin26、 Asp34]-GLP-I (7-36)的基因，PCR 引物使用 3-1 :5，-GGATCCATGGCTAGCAAGGTCGTC-3，(SE Q ID NO. 3)和 3-3:5，-GATCACTATCTCGTTGCATGCAACAC-3，(SEQ ID NO. 4)。使用瓊脂糖凝 膠電泳對所得PCR反應產(chǎn)物(約700bp)進行分析，確認了染色體DNA中編碼[Ser8、Gin26、 Asp34]-GLP-I (7-36)的基因的存在。結果表明，約3%的用于農(nóng)桿菌感染處理的水稻種子中導入了上述編碼[Ser8、 Gin26、Asp34]-GLP-I (7-36)的基因。這樣得到的、已確認導入了編碼[Ser8、Gln26、ASp34]-GLP-I (7-36)的基因的水稻幼 苗的轉化體在土壤中馴化，在溫室中栽培、生長，收獲成熟種子。V.蛋白分析用250μ1 含有 10% (ν/ν)甘油、0. 25% (w/v) SDS、5 % 2_ 巰基乙醇的 62. 5mM Tris-HCl (ρΗ6· 8)提取緩沖液，在100°C，將IV.中得到的IOmg成熟種子處理5分鐘，提取 這些種子的全部蛋白，將該提取液進行SDS-PAGE。SDS-PAGE使用15% (w/v)聚丙烯酰胺 (丙烯酰胺N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺=30 0. 8)凝膠進行。用分析軟件Image Gauge (富士寫真膠片制造)對所得凝膠圖像進行分析，對編碼 [Ser8、Gin26、Asp34]-GLP-I (7-36)的基因插入到球蛋白的可變區(qū)得到的融合蛋白的蓄積水 平進行調(diào)查。結果如圖5所示。[比較例1]使用含有水稻球蛋白啟動子、SEQ ID NO. 1所示的編碼[Ser8、Gin26、 Asp34]-GLP-I (7-36)的基因插入到可變區(qū)的球蛋白基因、以及胭脂氨酸合成酶的聚腺苷酸 化信號所連接的基因片段的圖6記載的現(xiàn)有載體pGlbGLP-Hm，進行對水稻成熟種子的基因?qū)?，除此之外，與實施例1同樣地進行基因?qū)?，再分化芽或小植株，由該芽或小植株?生植株，得到轉化水稻，收獲成熟種子，對該成熟種子進行蛋白分析。結果如圖5所示。由圖5可知，編碼[Ser8、Gln26、ASp34]-GLP-I (7-36)的基因插入到球蛋白的可變區(qū) 形成的融合蛋白在實施例1中所生產(chǎn)的水稻成熟種子中高蓄積，與比較例1相比較，最高顯 示約6倍的水平(圖5)。[實施例2]I. GLP-I衍生物的合成通過43(^型月太合成儀(PE-Applied Biosystems, Foster City，CA)進行固相合 成，合成以下所示的GLP-I衍生物，通過HPLC純化，然后通過質(zhì)譜確認合成品。使用純度為 95%或以上的合成品，用于體外和體內(nèi)試驗。比較制備例1. GLP-I (7-36酰胺)(天然型GLP-1)比較制備例2. [Ser8] -GLP-I (7-36 酰胺)比較制備例3. [Gly8] -GLP-I (7-36 酰胺)制備例1. [Gin26、Asn34]-GLP-I (7-36 酰胺)(制備例1的非酰胺化物的氨基酸序列如SEQID NO. 5表示)制備例2. [Ser8、Gin26、Asp34] -GLP-1 (7-36)制備例3. [Ser8、Gin26、Asn34] -GLP-1 (7-36)(制備例3的氨基酸序列如SEQID NO. 6表示)II. GLP-1衍生物的環(huán)AMP產(chǎn)生活性根據(jù)已公開的人GLP-I受體的 DNA序列(Graziano 等、Biochem Biophys Res Com, 196 :141-146,1993)構建表達載體。用該載體轉化中國倉鼠卵巢SH0-K1細胞，得到表達人 GLP-I受體的重組CH0-K1細胞。將該人GLP-I受體表達細胞以1 X IO4細胞/ml/孔植入M 孔板中，3天后用于測定。測定方法是在GLP-I衍生物存在下，將上述細胞在緩沖液(PBS、5.6mM葡萄糖、 ImM異丁基甲基黃嘌呤、20 μ M Ro20-1724、0. 5%BSA、pH7. 4)中、在37°C孵育30分鐘。加 入ΙΟμΙ 5Ν鹽酸，停止孵育。通過cAMP-Screen 系統(tǒng)(Applied Biosystems制造)的酶 聯(lián)免疫測定對通過各種GLP-I衍生物與GLP-I受體的反應在細胞內(nèi)形成的環(huán)化AMP進行測 定。圖7表示各種GLP-I衍生物的環(huán)AMP產(chǎn)生活性。該結果顯示[Ser8]-GLP-I (7-36 酰胺)、[Gly8] -GLP-I (7-36 酰胺)、[Gin26、 Asn34]-GLP-I (7-36酰胺)具有與天然型GLP-I同等的環(huán)AMP產(chǎn)生活性。[實施例3]對制備例1的Win26、Asn34]-GLP-I (7-36酰胺)進行胰蛋白酶處理，然后與實施 例2同樣地進行環(huán)AMP產(chǎn)生活性測定，調(diào)查胰蛋白酶抗性。即，將合成得到的上述GLP-I衍生物溶解于50mM碳酸氫銨溶液(pH 7. 8)，使?jié)舛?為500yg/ml。向100 μ 1該溶液中加入5 μ 1 500 μ g/ml胰蛋白酶溶液(Promega制備、 Cat.No. V5113)，在37°C反應1小時。加入1200 μ 1 71. 5%的乙醇(終濃度65% )，使反應 停止，在4°C、以15，OOOrpm離心5分鐘，回收上清，蒸發(fā)干燥。將干燥固化物溶解于蒸餾水 中，用于測定活性。
圖8表示胰蛋白酶處理前和處理后的Knn26、Asn34]-GLP-l (7-36酰胺)的活性與 濃度的相關性?？芍猍Gln26、ASn34]-GLP-l (7-36酰胺)在胰蛋白酶處理前和處理后活性沒 有差別，對胰蛋白酶具有抗性。[實施例4]研究水稻成熟種子中GLP-I衍生物對胰蛋白酶的穩(wěn)定性。使用實施例1中得到的水稻成熟種子制成的白米及其粉末，加入1. 9倍量的水，加 熱15分鐘，制成米飯。將米飯顆粒均勻壓碎，然后用蒸餾水稀釋5倍，制成樣品；將粉末直 接用蒸餾水稀釋5倍，制成樣品。另一方面，用2% BSA溶液將合成品GLP-I (7-36酰胺)、 [Ser8, Gin26、Asp34] -GLP-I (7-36)、[Ser8, Gin26、Asn34] -GLP-I (7-36)制成 10 μ g/ml 溶液， 制成樣品。以1/10的量向各樣品中加入含有7.6mg/ml胰蛋白酶的10倍濃度的人工胃液 (pHl. 2)，在 37°C 反應 1 小時，然后用 NaOH 中和。對于 GLP-I (7-36 酰胺)、[Ser8, Gin26、 Asp34] -GLP-I (7-36)、[Ser8, Gin26、Asn34] -GLP-I (7-36)、以及對于來自米的樣品提取蛋白， 通過胰蛋白酶處理得到GLP-I單體，然后測定它們的環(huán)AMP產(chǎn)生活性。結果可知，合成的 GLP-I衍生物經(jīng)胰蛋白酶處理后完全失活，但米中則殘留有31-65%的GLP-I活性(圖9)。由以上可以斷定水稻成熟種子中含有的GLP-I衍生物不會被胰蛋白酶消化，可 通過胃到達小腸。[實施例5]通過0. 025M氫氧化鈉溶液，從實施例1得到的水稻成熟種子中提取[Ser8、Gin26、 Asp34]-GLP-I (7-36)和球蛋白融合的蛋白，將其用50mM碳酸氫銨pH7. 8稀釋15倍。向該稀 釋液中加入6μ1 83 μ g/ml胰蛋白酶溶液(Promega制備、Cat.No. V5113)，在37°C反應1、 2、4、6或20小時，然后加入1200 μ 171. 5%的乙醇(終濃度65% )，使反應停止，在4°C、以 15，OOOrpm離心5分鐘，回收上清，蒸發(fā)干燥。將干燥固化物溶解于蒸餾水中，測定活性。圖10表示在水稻成熟種子中表達、作為融合蛋白得到的[Ser8、Gin26、 Asp34]-GLP-I (7-36)的胰蛋白酶處理時間與活性的關系。胰蛋白酶處理伊始即顯現(xiàn)環(huán) AMP產(chǎn)生活性，與胰蛋白酶處理時間沒有關系，一直保持了該活性。由以上可知[Ser8、 Gin26、Asp34]-GLP-I (7-36)在水稻成熟種子中以具有活性的形式表達，且為胰蛋白酶抗 性。因此，可以推斷通過GLP-I衍生物的表達，水稻成熟種子中含有的[Ser8、Gln26、 Asp34I-GLP-I (7-36)可以不被胰蛋白酶分解而在小腸中被吸收。[實施例6]對[Ser8,Gin26、Asn34J-GLP-I (7-36)和[Ser8, Gin26、Asp34]-GLP-I (7-36)實施胰 蛋白酶處理后，與實施例2同樣地測定環(huán)AMP產(chǎn)生活性，由此研究胰蛋白酶抗性。即，將上述合成GLP-I衍生物用0. 2 %牛血清白蛋白溶液稀釋為10 μ g/ml，取8 μ 1 上述稀釋溶液，加入112 μ 1 50mM碳酸氫銨溶液(pH7. 8)和6 μ 183 μ g/ml胰蛋白酶溶液 (Promega制備、Cat. No. V5113)，在37°C反應1小時，然后加入1200 μ 1 71. 5%的乙醇(終 濃度65% )，使反應停止，在4°C、以15，OOOrpm離心5分鐘，回收上清，蒸發(fā)干燥。將干燥固 化物溶解于蒸餾水中，用于測定活性。圖11 表示 GLP-I (7-36 酰胺)、[Ser8, Gin26、Asn34] -GLP-I (7-36)和[Ser8, Gin26、 Asp34]-GLP-I (7-36)的胰蛋白酶處理時間與活性的變化。與天然型GLP-I (7_36酰胺)比較，可知[Ser8、Gin26、Asn34]-GLP-I (7-36)和[Ser8、Gin26、Asp34]-GLP-1 (7-36)不會因胰蛋 白酶處理而顯示活性變化，為胰蛋白酶抗性。[實施例7]研究本發(fā)明的GLP-I衍生物與天然型GLP-I比較，是否顯示顯著的DPP-IV抗性。 使用 5000pM GLP-I (7-36 酰胺)(天然型 GLP-1)、500pM [Ser8,Gln26,Asn34] -GLP-I (7-36)、 5000口] [561~8、611126、八8口34]-61^-1(7-36)，分別與4(^~口 1 的 DPP-IV (Sigma、D7052)混合， 在37°C反應0、15、30、60分鐘，然后用2倍量的乙醇提取，用旋轉蒸發(fā)器干燥固化。將所得 干燥固化物溶解于含1 % BSA的蒸餾水中，與GLP-I受體表述細胞作用，測定環(huán)AMP產(chǎn)生量。 圖12中，以未經(jīng)DPP-IV處理時的為100%，進行環(huán)AMP產(chǎn)生活性比較。與GLP-I (7_36酰 胺)比較，[Ser8、Gin26、Asn34]-GLP-I (7-36)和[Ser8、Gin26、Asp34]-GLP-1 (7-36)可見明顯 的DPP-IV抗性。[實施例8]研究本發(fā)明的GLP-I衍生物的胰島素分泌促進性。通過膠原酶從ICR小鼠的胰臟中取得朗格漢斯氏島細胞，在M孔板上每孔裝入 2-3個朗格漢斯氏島細胞。培養(yǎng)過夜。然后，加入溶解于含16. 7mM葡萄糖、0.2% BSA和 IOmM Hepes的Krebs-Ringer緩沖液的本發(fā)明的GLP-1衍生物，在37°C放置30分鐘，通過 酶聯(lián)免疫測定試劑盒(〉〃 ^<制備)測定。在GLP-I (7-36 酰胺)、[Ser8、Gin26、Asp34]-GLP-1 (7-36)、[Ser8、Gin26、 Asn34]-GLP-I (7-36)的任意肽中，都可見用量相關性的胰島素分泌促進活性。特別是在 [Ser8、Gin26、Asn34]-GLP-I (7-36)中可以高濃度顯示胰島素分泌促進活性(圖13)。[實施例9]研究口服糖負荷試驗(OGTT)中通過皮下施用GLP-I衍生物產(chǎn)生的血糖降低效果。對一夜未進食的小鼠口服施用lg/kg葡萄糖，立即背部皮下施用(5、20yg/kg) GLP-I (7-36 酰胺)、[Ser8、Gin26、Asn34]-GLP-I (7-36)或[Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-I (7-36)。 對對照組施用生理鹽水。葡萄糖負荷前以及20、60、120分鐘后由眼下靜脈叢采血， 測定血糖值。GLP-I衍生物中，可見血糖上升的峰值有降低的趨勢，[Ser8、Gln26、 Asn34]-GLP-I (7-36)中則可見強烈的作用(圖14)。另外，該作用持續(xù)到施用后120分鐘 (圖15)。由此明確通過GLP-I肽的改變，在生物體內(nèi)血液中的穩(wěn)定性飛躍提高，可確保持 續(xù)性。產(chǎn)業(yè)實用性作為采用基因工程的價廉、安全且高效的物質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)，本發(fā)明可提供通過高產(chǎn) 重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法而得到的物質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以提 供顯著蓄積對增進健康有作用的成分的食品。本發(fā)明的方法還可以作為生產(chǎn)可用作藥物、 工業(yè)原料的物質(zhì)的高附加值植物制備的基礎技術。本發(fā)明還包含通過本發(fā)明的方法制備GLP-1。其中所述GLP-I已知為通過食物攝 取、由消化管分泌、在胰臟中發(fā)揮作用的刺激糖依賴性胰島素分泌的激素。本發(fā)明中所提供的新型GLP-I衍生物具有以下優(yōu)異特性在利用并攝取時，針對 胰蛋白酶等消化酶的分解問題，其具有對該酶的抗性；并且在攝取、吸收后，關于在血漿中 的穩(wěn)定性，針對二肽酰肽酶IV的分解問題，其具有對該酶的抗性，有望作為藥物應用。艮口，本發(fā)明的GLP-I衍生物在經(jīng)口攝取時可以表達藥效，例如根據(jù)本發(fā)明的方法，在植物的貯 藏器官中表達并經(jīng)口攝取時，不會被分解，可從小腸吸收，表達藥效。因此，本發(fā)明所提供的 GLP-I衍生物進一步提高了 GLP-I的臨床應用的可能性，對糖尿病患者和肥胖患者的QOL改 善發(fā)揮作用。
權利要求
1.高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中編碼含有 GLP-I (7-36)或者在其氨基酸序列的基礎上有1或多個氨基酸缺失、置換和/或附加的序 列、且具有GLP-I活性的肽中、第沈位置換為谷胺酰胺、第34位置換為天冬酰胺或天冬氨 酸的GLP-I衍生物的基因，用作在植物貯藏器官中表達的重組蛋白基因，該方法包含以下 步驟㈧、(B)和(C):(A)構建一種載體，將該載體導入細胞中的步驟，其中所述載體含有在植物的貯藏器官 中表達的重組蛋白的基因、細胞分裂素相關基因、抗藥性基因和具有脫離能力的DNA因子， 且細胞分裂素相關基因和抗藥性基因存在于與具有脫離能力的DNA因子聯(lián)動的位置，在植 物貯藏器官中表達的重組蛋白的基因存在于與具有脫離能力的DNA因子不聯(lián)動的位置；(B)將通過上述步驟(A)導入了載體的植物細胞在添加藥物的培養(yǎng)基和不添加藥物的 培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，由此再分化為轉化體的步驟；和(C)從通過上述步驟(B)再分化的轉化體中獲得植物貯藏器官的步驟。
2.權利要求1的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中編碼 GLP-I衍生物的基因是編碼氨基酸序列的第8位進一步置換為絲氨酸或甘氨酸的GLP-I衍 生物的基因。
3.權利要求2的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中編碼 GLP-I衍生物的基因是序列表SEQ ID NO. 1所示的基因。
4.權利要求1的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中GLP-I 衍生物由序列表SEQ ID NO :2、5或6中所示的氨基酸序列組成。
5.權利要求1的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其包括在 由導入了載體的植物細胞再分化轉化體的過程中，將導入了載體的植物細胞在添加植物激 素的培養(yǎng)基和添加藥物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后在不添加植物激素的培養(yǎng)基和不添加藥物的 培養(yǎng)基上培養(yǎng)ο
6.權利要求1的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中編碼 GLP-I衍生物的基因處于該植物貯藏器官特異性啟動子的控制下。
7.權利要求1的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中編碼 GLP-I衍生物的基因插入或置換到原本在該植物貯藏器官中表達的蛋白編碼基因中編碼蛋 白可變區(qū)的位置。
8.權利要求7的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中在編碼 GLP-I衍生物的基因和原本在植物貯藏器官中表達的蛋白編碼基因的交界處配置有編碼酶 切氨基酸序列的堿基序列，其中所述酶切氨基酸序列用于將該GLP-I衍生物從原本在植物 貯藏器官中表達的蛋白上切取分離。
9.權利要求1的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中植物貯 藏器官為種子。
10.權利要求9的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中其蛋白 的可變區(qū)待插入或待置換的原本在植物貯藏器官中表達的蛋白編碼基因是種子貯藏蛋白 基因。
11.權利要求1的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中細胞分 裂素相關基因是細胞分裂素合成基因。
12.權利要求11的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中細胞 分裂素合成基因是異戊烯轉移酶基因。
13.權利要求1的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中抗藥性 基因是潮霉素抗性基因。
14.權利要求1的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中具有脫 離能力的DNA因子來自位點特異性重組系統(tǒng)或轉座子。
15.權利要求1的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中所述植 物為單子葉植物。
16.權利要求15的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中所述 單子葉植物為水稻。
17.通過權利要求1的生產(chǎn)方法生產(chǎn)的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官、或 生產(chǎn)該植物貯藏器官的轉基因植物。
18.權利要求1的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法中使用的用 于將基因?qū)胫参锏闹亟M載體，其中編碼含有GLP-I (7-36)或者在其氨基酸序列的基礎上 有1或多個氨基酸缺失、置換和/或附加的序列、且具有GLP-I活性的肽中、第沈位置換為 谷胺酰胺、第34位置換為天冬酰胺或天冬氨酸的GLP-I衍生物的基因，用作在植物貯藏器 官中表達的重組蛋白基因；該重組載體含有編碼GLP-I衍生物的基因、細胞分裂素相關基 因、抗藥性基因和具有脫離能力的DNA因子，該基因已被導入載體中，其中細胞分裂素相關 基因和抗藥性基因存在于與具有脫離能力的DNA因子聯(lián)動的位置、而在植物貯藏器官中表 達的重組蛋白的基因存在于與具有脫離能力的DNA因子不聯(lián)動的位置。
19.權利要求18的用于將基因?qū)胫参锏妮d體，其中編碼GLP-I衍生物的基因是編碼 氨基酸序列的第8位進一步置換為絲氨酸或甘氨酸的肽的基因。
20.權利要求19的用于將基因?qū)胫参锏妮d體，其中編碼GLP-I衍生物的基因是序列 表SEQ ID NO. 1所示的基因。
全文摘要
本發(fā)明提供在植物貯藏器官中高產(chǎn)重組蛋白的方法以及GLP-1衍生物。使用一種載體，通過轉化得到高產(chǎn)重組蛋白的植物貯藏器官。其中所述載體含有重組蛋白的基因、細胞分裂素相關基因、抗藥性基因以及具有脫離能力的DNA因子，且細胞分裂素相關基因和抗藥性基因存在于與具有脫離能力的DNA因子的聯(lián)動的位置，在植物的貯藏器官中表達的重組蛋白存在于與具有脫離能力的DNA因子的不聯(lián)動的位置。通過上述方法生產(chǎn)GLP-1，并提供對酶的分解作用穩(wěn)定的衍生物。
文檔編號C07K14/605GK102134577SQ20101027747
公開日2011年7月27日 申請日期2004年3月26日 優(yōu)先權日2003年3月28日
發(fā)明者S·笠原, 杉田耕一, 海老沼宏安, 高巖文雄 申請人:日本制紙株式會社, 獨立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所