專利名稱：模擬折疊酶功能的小分子化合物n-烷基酰胱胺、制備方法及用于輔助蛋白質(zhì)氧化復(fù)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種模擬折疊酶功能的小分子化合物和其合成方法，及其在輔助蛋白 質(zhì)氧化復(fù)性中的使用方法，屬于生物技術(shù)中的蛋白質(zhì)復(fù)性技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)折疊復(fù)性不僅與人類的一些疾病相關(guān)，而且也是應(yīng)用基因重組技術(shù)生產(chǎn)貴 重醫(yī)藥蛋白質(zhì)的瓶頸。因此，蛋白質(zhì)折疊復(fù)性技術(shù)是目前研究的熱點。很多重要的醫(yī)藥蛋 白質(zhì)都是含有二硫鍵的，例如人生長激素、人干擾素、腫瘤壞死因子、胰島素、白細(xì)胞介素、 組織型纖溶酶原激活劑等。這些含二硫鍵蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性則是蛋白質(zhì)復(fù)性中的一個巨大 挑戰(zhàn)。這種含有二硫鍵的蛋白質(zhì)的折疊過程被稱作氧化復(fù)性，在此過程中蛋白質(zhì)不但要形 成正確的三級結(jié)構(gòu)，而且多個半胱氨酸殘基要準(zhǔn)確配對形成正確的二硫鍵。在體內(nèi)，此過程 是受到氧化還原酶催化的。在真核細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)以及原核菌體細(xì)胞 周質(zhì)中的DsbA可以有效地輔助蛋白質(zhì)折疊過程中二硫鍵的形成。這些酶不但具有特殊的 共同序列CXXC (C，半胱氨酸；X，任何氨基酸殘基)、較低的PKa值和合適的氧化還原勢，而且 與變性蛋白質(zhì)具有特異的相互作用。但是，直接將PDI和DsbA作為氧化劑應(yīng)用于蛋白質(zhì)的 氧化復(fù)性則存在價格比較昂貴、不穩(wěn)定、難于分離的問題，不適宜于應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。所 以針對實際生產(chǎn)，有必要開發(fā)此類折疊酶的小分子模擬物。目前，人們基于PDI物理性質(zhì)如CXXC序列、較低的pKa值和合適的氧化還原勢而 設(shè)計了一些巰基小分子模擬物來輔助復(fù)性，如芳香巰醇、(士)_反-1，2-二(2-乙酰巰基) 環(huán)己烷(BMC)、CXXC 類似多肽序列(Small-molecule catalysts of oxidative protein folding. Current Opinion in Chemical Biology，2008，12，740-745.)。這些模擬PDI 功能 的小分子化合物能夠在一定程度上提高蛋白質(zhì)氧化復(fù)性的速率和收率。但是，得到的小分 子模擬物的催化效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于實際折疊酶的作用，達(dá)到輔助復(fù)性的效果需要很高的濃度。 另外，這些小分子不能夠有效地模擬PDI和DsbA對變性蛋白質(zhì)的特異性相互作用。由于這 些小分子模擬物以及最為常用的氧化還原劑，氧化型谷胱甘肽(GSSG)和還原型谷胱甘肽 (GSH)都不具有蛋白質(zhì)氧化特異性，很容易被強(qiáng)還原劑二硫蘇糖醇(DTT)還原，所以，應(yīng)用 這些小分子輔助蛋白質(zhì)復(fù)性時都需要將還原變性蛋白質(zhì)中殘留的還原劑二硫蘇糖醇先通 過凝膠過濾色譜或透析的操作除去，這樣就使得復(fù)性過程操作復(fù)雜。為了克服常用氧化劑輔助復(fù)性的不足，本發(fā)明提出了一種新型的模擬折疊酶功能 的小分子化合物及其輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的方法，氧化劑用量大大減少，而且操作簡單，不需要 將變性劑分離的操作步驟，節(jié)省復(fù)性時間和成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種模擬折疊酶功能的小分子化合物N-烷基酰胱胺，并 建立其輔助含有二硫鍵蛋白質(zhì)的高效氧化復(fù)性的技術(shù)方法。本方法無需對變性蛋白質(zhì)進(jìn)行
3去除還原劑的操作，直接應(yīng)用所設(shè)計的N-烷基酰胱胺作為氧化劑與殘留的還原劑耦合形 成氧化還原對，在強(qiáng)還原性的溶液中高效地輔助蛋白質(zhì)的復(fù)性。本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案加以實現(xiàn)的?！N模擬折疊酶功能的小分子化合物N-烷基酰胱胺，其特征在于，N-烷基酰胱胺 是胱胺分子中一端的氨基，通過酰胺化反應(yīng)與脂肪酸的羧基偶聯(lián)而形成，N-烷基酰胱胺結(jié) 構(gòu)形式表達(dá)如下 其中R為含有4 7個碳原子的烷基鏈；上述的脂肪酸選自戊酸、己酸、庚酸和辛酸。本發(fā)明的一種N-烷基酰胱胺的制備方法，步驟如下1)將胱胺二鹽酸鹽用去離子水溶解，得到0.05-lmol/L胱胺溶液后，加入含有5-8 個碳原子的脂肪酸，脂肪酸的摩爾濃度為胱胺摩爾濃度的0. 02-0. 5倍，混合后，用NaOH將 其 pH 調(diào)至 5. 5-6. 5 ；2)向上述制得的液體中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽固體 粉末，使固體粉末摩爾濃度為脂肪酸摩爾濃度的5-100倍；3)將上述反應(yīng)體系置于15-30°C恒溫水浴搖床，反應(yīng)3-6小時，得到N-烷基酰胱 胺粗產(chǎn)物；4)將粗產(chǎn)物首先用0. 45 μ m的水系微孔濾膜過濾，然后用C18反相色譜柱進(jìn)行分 離，收集的組分經(jīng)冷凍干燥得到N-烷基酰胱胺。用N-烷基酰胱胺輔助蛋白質(zhì)氧化復(fù)性的方法，經(jīng)含DTT的變性液還原變性的蛋白 質(zhì)或包含體溶液，用不含DTT的變性液稀釋5-25倍后稀釋于或直接稀釋于由20-100mmol/ L三羥甲基氨基甲烷(Tris)、0-3.0mmol/L乙二胺四乙酸四鈉(EDTA)、0_2mol/L尿素或 Ο-lmol/L鹽酸胍及N-烷基酰胱胺組成的pH為7. 5-9. 0的復(fù)性液中，使得稀釋后溶液中 N-烷基酰胱胺濃度為DTT摩爾濃度的0. 25-1. 3倍。所述的N-烷基酰胱胺，當(dāng)其為N-辛基酰胱胺時，其摩爾濃度為體系中變性還原蛋 白質(zhì)摩爾濃度的40倍及以下。本發(fā)明的N-烷基酰胱胺輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的方法應(yīng)用于變性還原蛋白質(zhì)復(fù)性中， 變性失活并且含有二硫鍵被斷開的蛋白質(zhì)樣品使用本發(fā)明的方法進(jìn)行復(fù)性可以保證較高 的復(fù)性收率。含有二硫鍵的蛋白質(zhì)均可使用本專利的復(fù)性方法進(jìn)行復(fù)性。本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)有五點首先，模擬折疊酶功能的小分子化合物結(jié)構(gòu)的設(shè)計，在 活性位點二硫鍵周圍修飾疏水性基團(tuán)從而增強(qiáng)小分子和變性蛋白質(zhì)之間的親和性，同時保 證了小分子的水溶性，分子只是一端修飾的N-烷基酰胱胺而不是N，N’ -雙烷基酰胱胺，因 為N，N’ _雙烷基酰胱胺的水溶性較差；其次是合成過程中胱胺較容易兩端均修飾脂肪酸， 得到N，N’ -雙烷基酰胱胺副產(chǎn)物，本發(fā)明的反應(yīng)體系中采用的脂肪酸量遠(yuǎn)低于胱胺的量，從而保證了主產(chǎn)物為N-烷基酰胱胺；關(guān)鍵之三合成反應(yīng)條件的選擇，適當(dāng)?shù)臏囟燃胺磻?yīng)時 間可有效地降低副產(chǎn)物含量，提高主產(chǎn)物的合成量；關(guān)鍵之四需要根據(jù)N-烷基酰胱胺分子 中酰基含有的碳鏈長度確定復(fù)性液中需要加入的N-烷基酰胱胺的量，主要是控制?；?有的碳鏈與蛋白質(zhì)之間的疏水相互作用的強(qiáng)度，因為過強(qiáng)的疏水相互作用會抑制蛋白質(zhì)的 折疊；最后是變性蛋白質(zhì)溶液中殘留的DTT的處理，應(yīng)用其它的小分子氧化劑輔助復(fù)性時 需要將其中的DTT通過凝膠過濾色譜或24h透析的方法除去，而本發(fā)明的復(fù)性方法不需要 進(jìn)行此操作，直接將DTT作為還原劑來輔助復(fù)性。本發(fā)明所介紹的N-烷基酰胱胺輔助蛋白質(zhì)氧化復(fù)性的方法與其它的氧化劑輔助 蛋白質(zhì)氧化復(fù)性方法相比有如下優(yōu)點第一，本發(fā)明所采用氧化劑即使在強(qiáng)還原的環(huán)境下 也能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)二硫鍵的形成，所以可以省去將強(qiáng)還原劑DTT從還原變性的蛋白質(zhì)溶液 中除去的操作步驟，從而節(jié)省復(fù)性時間和成本；第二，本發(fā)明所采用的模擬折疊酶功能的小 分子化合物N-烷基酰胱胺可以大大提高蛋白質(zhì)氧化復(fù)性的速度，同樣條件下，是氧化型谷 胱甘肽輔助復(fù)性速度的7至10倍；第三，本發(fā)明介紹的N-烷基酰胱胺，較低濃度下就可有 效地輔助蛋白質(zhì)氧化復(fù)性，可以大大降低氧化劑的用量；第四，本發(fā)明采用的N-烷基酰胱 胺可以和變性還原蛋白質(zhì)所攜帶的強(qiáng)還原劑耦合形成氧化還原對，從而不需要在復(fù)性液中 加入還原劑，操作簡單，并降低了復(fù)性成本。


圖1 實施例1中所制備的N-辛基酰胱胺(0. lmmol/L)輔助還原變性溶菌酶的復(fù)性。圖2 實施例1中所制備的N-辛基酰胱胺(0. 2mmol/L)輔助還原變性溶菌酶的復(fù) 性圖3 實施例3中所制備的N-庚基酰胱胺輔助還原變性的核糖核酸酶A的復(fù)性。圖4 實施例4中所制備的N-戊基酰胱胺輔助還原變性的溶菌酶的復(fù)性。圖5 實施例5中所制備的N-己基酰胱胺輔助還原變性溶菌酶的復(fù)性，其中(·) 表示復(fù)性體系中加入0. 2mmol/LN-己基酰胱胺；(▲)表示復(fù)性體系中加入0. 2mmol/L胱胺。圖6 實施例5中所制備的N-己基酰胱胺輔助14μ mol/L還原變性溶菌酶的復(fù) 性，其中(·)表示復(fù)性體系中加入0. 9mmol/L胱胺；(▼)表示復(fù)性體系中加入0. 6mmol/ L N-己基酰胱胺。圖7 實施例5中所制備的N-己基酰胱胺輔助14 μ mol/L還原變性溶菌酶的復(fù)性， 復(fù)性體系中含有1. 53mmol/L N-己基酰胱胺。圖8 實施例5中所制備的N-己基酰胱胺輔助還原變性的核糖核酸酶A樣品復(fù) 性，其中(·)表示復(fù)性體系中加入0. 4mmol/L N-己基酰胱胺；(〇)表示復(fù)性體系中加 入 0. 4mmol/L 胱胺。
具體實施例方式下面的實例將對本發(fā)明提供的方法予以進(jìn)一步的說明。實施例1 :N-辛基酰胱胺的合成及應(yīng)用于輔助還原變性溶菌酶的復(fù)性
稱0. 225g胱胺二鹽酸鹽用IOmL去離子水溶解，得到0. lmol/L胱胺溶液，然后滴 入3. 18 μ L正辛酸，使其濃度為0. 002mol/L,混合均勻，用2mol/L NaOH將溶液的pH調(diào)至 6.3，而后向其中加入0.3848 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽使其終濃度 為0. 2mol/L，迅速混合均勻。將反應(yīng)體系置于25°C恒溫水浴搖床，反應(yīng)4小時，得到粗產(chǎn) 物。粗產(chǎn)物經(jīng)過0. 45 μ m的水系微孔濾膜過濾，然后應(yīng)用C18反相柱高效液相色譜分離，流 動相A是含有0. 三氟乙酸(TFA)的水相，B是含有0. 1% TFA的乙腈。流速lmL/min。 洗脫梯度應(yīng)用在ISmin內(nèi)流動相B由10%升至到100%的線性梯度進(jìn)行洗脫分離。收集 8. 2min處產(chǎn)物峰，冷凍干燥得到N-辛基酰胱胺。將如上制備的N-辛基酰胱胺用于輔助還原變性溶菌酶的復(fù)性。14.3mg溶菌 酶溶于1. OmL含有8mol/L尿素，IOOmmol/L DTT, IOOmmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 (Tris-HCl)和lmmol/L EDTA, pH 8. 5的變性緩沖溶液中，混合均勻并于40°C還原變性3 小時；變性完成后通過C18反相色譜測定得到其中殘留的DTT含量為84mmol/L ；對得到的 變性溶菌酶用不含DTT的變性緩沖液進(jìn)行20倍稀釋得到變性蛋白質(zhì)樣品。復(fù)性緩沖液由 100mmol/L Tris-HCl、1. 2mol/L 尿素、lmmol/L EDTA 禾Π 0. 105mmol/L N-辛基酰胱胺、氧化 性谷胱甘肽或胱胺組成，溶液PH為8. 5。用復(fù)性液將變性蛋白質(zhì)樣品稀釋10倍，稀釋后溶 液中溶菌酶的濃度為5 μ mol/L,DTT為0. 42mmol/L。稀釋后的溶液置于28°C的恒溫水浴中 開始復(fù)性。溶菌酶的活性檢測以微球菌為底物，1. 30mL 0. 25mg/mL底物的pH 6. 2的磷酸鹽 緩沖液與0. IOmL稀釋后的蛋白質(zhì)復(fù)性液充分混合，測定反應(yīng)液在450nm下的吸光度變化。 活性測定溫度28°C。通過0-90s間吸光值降低速率與天然酶催化條件下的降低速率的比 值來計算溶菌酶活性收率。在復(fù)性60min取樣測定蛋白質(zhì)的活性。其它復(fù)性條件相同，不 同小分子氧化劑輔助復(fù)性效果對比如圖1所示。由圖可知，在DTT濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氧化劑濃 度的復(fù)性條件下，氧化型谷胱甘肽和胱胺都無法輔助蛋白質(zhì)復(fù)性，而N-辛基酰胱胺卻仍然 能夠輔助蛋白質(zhì)復(fù)性。實施例2 實施例1合成的N-辛基酰胱胺輔助還原變性溶菌酶的復(fù)性將實施例1所制備的N-辛基酰胱胺用于輔助還原變性溶菌酶的復(fù)性。14.3mg 溶菌酶溶于1. OmL含有8mol/L尿素，lOOmmol/L DTT, 1 OOmmo 1/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸 鹽(Tris-HCl)和lmmol/L EDTA, pH 8. 5的變性緩沖溶液中，混合均勻并于40°C還原變性 3小時；變性完成后通過C18反相色譜測定得到其中殘留的DTT含量為84mmol/L ；對得到 的變性溶菌酶用不含DTT的變性緩沖液進(jìn)行5倍稀釋得到變性蛋白質(zhì)樣品。復(fù)性緩沖液 由 100mmol/L Tris_HCl、2mol/L 尿素、lmmol/L EDTA 和 0. 2mmol/LN_ 辛基酰胱胺或胱胺組 成，溶液PH為8. 5。用復(fù)性液將變性蛋白質(zhì)樣品稀釋40倍，稀釋后溶液中溶菌酶的濃度為 5umol/L, DTT為0. 42mmol/L。稀釋后的溶液置于28°C的恒溫水浴中開始復(fù)性。溶菌酶 的活性檢測以微球菌為底物，1. 30mL 0. 25mg/mL底物的pH 6. 2的磷酸鹽緩沖液與0. IOmL 稀釋后的蛋白質(zhì)復(fù)性液充分混合，測定反應(yīng)液在450nm下的吸光度變化?；钚詼y定溫度 28°C。通過0-90s間吸光值降低速率與天然酶催化條件下的降低速率的比值來計算溶菌酶 活性收率。在復(fù)性36min取樣測定蛋白質(zhì)的活性。其它復(fù)性條件相同，N-辛基酰胱胺和 胱胺輔助復(fù)性效果對比如圖2所示。由圖可知，在DTT濃度高于氧化劑濃度的復(fù)性條件下， 0. 2mM的胱胺幾乎無法輔助蛋白質(zhì)復(fù)性，而0. 2mM N-辛基酰胱胺卻能夠輔助蛋白質(zhì)復(fù)性。實施例3 =N-庚基酰胱胺的合成及用于輔助還原變性核糖核酸酶A的復(fù)性
稱2. 25g胱胺二鹽酸鹽用IOmL去離子水溶解，得到lmol/L胱胺溶液，然后滴入 28. 6 μ L正庚酸，使其濃度為0. 02mol/L,混合均勻，用5mol/LNa0H將溶液的pH調(diào)至6. 5， 而后向其中加入0. 192g 1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽使其終濃度為 0. lmol/L，迅速混合均勻。將反應(yīng)體系置于15°C恒溫水浴搖床，反應(yīng)6小時，得到粗產(chǎn)物。 粗產(chǎn)物經(jīng)過0. 45 μ m的水系微孔濾膜過濾，然后應(yīng)用C18反相柱高效液相色譜分離，流動相 A是含有0. 三氟乙酸(TFA)的水相，B是含有0. 1% TFA的乙腈。流速lmL/min。洗脫 梯度應(yīng)用在ISmin內(nèi)流動相B由10%升至到100%的線性梯度進(jìn)行洗脫分離。收集7. 6min處產(chǎn)物峰，冷凍干燥得到N-庚基酰胱胺。將如上制備的N-庚基酰胱胺用于輔助還原變性核糖核酸酶A的復(fù)性。14. Omg核 糖核酸酶 A 溶于 1. OmL 含有 8mol/L 尿素，IOOmmol/L DTT，IOOmmol/L Tris-HCl 禾口 lmmol/ LEDTA，pH 8. 5的變性緩沖溶液中于40°C還原變性1小時。變性完成后通過C18反相色譜 測定得到其中殘留的DTT含量為94mmol/L。復(fù)性緩沖液由100mmol/L Tris_HCl、0. 35mmol/ L N-庚基酰胱胺、氧化型谷胱甘肽或胱胺和lmmol/L EDTA組成，溶液pH為7. 5。用復(fù)性 液將變性蛋白質(zhì)樣品稀釋72. 4倍，稀釋后溶液中核糖核酸酶A的濃度為14ymol/L，DTT 為1.3mm0l/L。稀釋后的溶液置于25°C的恒溫水浴中開始復(fù)性。核糖核酸酶A的活性檢測 以胞苷-2' ,3'-環(huán)磷酸(cCMP)為底物，1. OOmL 0. 25mg/mL 底物的 pH 6. 0 的 100mmol/L Tris-HCl緩沖液與0. IOmL蛋白質(zhì)復(fù)性樣品充分混合，測定反應(yīng)液在284nm下的吸光度變 化?；钚詼y定溫度25°C。通過0-90s間吸光值降低速率與天然酶催化條件下的降低速率 的比值來計算活性收率。采用本專利所述方法復(fù)性，不除掉變性還原蛋白質(zhì)中的DTT，而直 接稀釋復(fù)性。在復(fù)性5小時后取樣測定蛋白質(zhì)的活性。其它復(fù)性條件相同，N-庚基酰胱胺、 氧化性谷胱甘肽和胱胺輔助溶菌酶復(fù)性效果對比如圖3所示。由圖可知，N-庚基酰胱胺能 夠加快變性還原的核糖核酸酶A復(fù)性的速度并提高復(fù)性收率。同樣的復(fù)性條件下，較低的 N-庚基酰胱胺能起到很好的復(fù)性效果，用0. 35mmol/L N-庚基酰胱胺作為氧化劑，復(fù)性5小 時之后收率可達(dá)85%，而此時在胱胺或氧化型谷胱甘肽的輔助下復(fù)性收率接近于0。實施例4 =N-戊基酰胱胺的合成及用于輔助還原變性溶菌酶的復(fù)性稱0. 113g胱胺二鹽酸鹽用IOmL去離子水溶解，得到0. 05mol/L胱胺溶液，然后滴 入27. 25 μ L正戊酸，使其濃度為0. 025mol/L,混合均勻，用0. 5mol/L NaOH將溶液的pH調(diào) 至5.5，而后向其中加入0.3848 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽使其終濃 度為0. 2mol/L，迅速混合均勻。將反應(yīng)體系置于30°C恒溫水浴搖床，反應(yīng)3小時，得到粗產(chǎn) 物。粗產(chǎn)物經(jīng)過0. 45 μ m的水系微孔濾膜過濾，然后應(yīng)用C18反相柱高效液相色譜分離，流 動相A是含有0. 三氟乙酸(TFA)的水相，B是含有0. 1% TFA的乙腈。流速lmL/min。 洗脫梯度應(yīng)用在ISmin內(nèi)流動相B由10%升至到100%的線性梯度進(jìn)行洗脫分離。收集 5min處產(chǎn)物峰，冷凍干燥得到N-戊基酰胱胺。將如上制備的N-戊基酰胱胺用于輔助14μ mol/L還原變性溶菌酶的復(fù)性。14. 3mg 溶菌酶溶于 1. OmL 含有 6mol/L 鹽酸胍，100mmol/L DTT,20mmol/L Tris-HCl 和 lmmol/ LEDTA, pH 7. 5的變性緩沖溶液中于40°C還原變性4小時。變性完成后通過C18反相色譜 測定得到其中殘留的DTT含量為84mmol/L ；對得到的變性溶菌酶用不含DTT的變性緩沖液 進(jìn)行5倍稀釋得到變性蛋白質(zhì)樣品。復(fù)性緩沖液由20mmol/L Tris-HCl、lmol/L鹽酸胍、 0. 8mmol/L N-戊基酰胱胺或胱胺和3mmol/L EDTA組成，溶液pH為8. 5。用復(fù)性液將變性蛋白質(zhì)樣品稀釋14. 3倍，稀釋后溶液中溶菌酶的濃度為14ymol/L，DTT*l. 18mmol/L。稀 釋后的溶液置于28°C的恒溫水浴中開始復(fù)性。溶菌酶的活性檢測以微球菌為底物，1. 30mL 0. 25mg/mL底物的pH 6. 2的磷酸鹽緩沖液與0. IOmL稀釋后的蛋白質(zhì)復(fù)性液充分混合，測定 反應(yīng)液在450nm下的吸光度變化?；钚詼y定溫度28°C。通過0_90s間吸光值降低速率與 天然酶催化條件下的降低速率的比值來計算溶菌酶活性收率。在復(fù)性45min后取樣測定活 性。其它復(fù)性條件相同，N-戊基酰胱胺和胱胺輔助溶菌酶復(fù)性效果對比如圖4所示。由圖 可知，在輔助還原變性溶菌酶的復(fù)性時，N-戊基酰胱胺能夠提高復(fù)性收率。同樣的復(fù)性條 件下，0. 8mmol/L N-戊基酰胱胺能使得復(fù)性收率達(dá)到92%，而用同濃度的胱胺作為氧化劑 則收率只有15%。實施例5 =N-己基酰胱胺的合成及輔助還原變性溶菌酶的復(fù)性稱0. 225g胱胺二鹽酸鹽用IOmL去離子水溶解，得到0. lmol/L胱胺溶液，然后滴 入25 μ L正己酸，使其濃度為0. 02mol/L,混合均勻，用Imol/LNaOH將溶液的pH調(diào)至6. 0， 而后向其中加入0.384g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽使其終濃度為0. 2 mol/L，迅速混合均勻。將反應(yīng)體系置于25°C恒溫水浴搖床，反應(yīng)4小時，得到粗產(chǎn)物。粗 產(chǎn)物經(jīng)過0. 45 μ m的水系微孔濾膜過濾，然后應(yīng)用C18反相柱高效液相色譜分離，流動相A 是含有0. 三氟乙酸(TFA)的水相，B是含有0. 1% TFA的乙腈。流速lmL/min。洗脫梯 度應(yīng)用在ISmin內(nèi)流動相B由10%升至到100%的線性梯度進(jìn)行洗脫分離。收集6. 4min 處產(chǎn)物峰，冷凍干燥得到N-己基酰胱胺。將如上合成的N-己酰胱胺用于輔助5 μ mol/L還原變性溶菌酶的復(fù)性。14. 3mg溶 菌酶溶于 LOmL 含有 8mol/L 尿素，100mmol/L DT T,50mmol/L Tris-HCl 和 lmmol/L EDTA, PH 9. 0的變性緩沖溶液中于40°C還原變性2. 6小時；變性完成后通過C18反相色譜測定 得到其中殘留的DTT含量為80mmol/L ；對得到的變性溶菌酶用不含DTT的變性緩沖液進(jìn) 行25倍稀釋得到變性蛋白質(zhì)樣品。復(fù)性緩沖液由50mmol/L Tris-HCl、1. Omol/L尿素和 0. 2mmol/L N-己基酰胱胺或胱胺組成，溶液pH為9. 0。用復(fù)性液將變性蛋白質(zhì)樣品稀釋8 倍，稀釋后溶液中溶菌酶的濃度為5 μ mol/L，DTT為0. 40mmol/L。稀釋后的溶液置于28°C 的恒溫水浴中開始復(fù)性。溶菌酶的活性檢測以微球菌為底物，1. 30mL 0. 25mg/mL底物的pH 6. 2的磷酸鹽緩沖液與0. IOmL稀釋后的蛋白質(zhì)復(fù)性液充分混合，測定反應(yīng)液在450nm下的 吸光度變化?；钚詼y定溫度28°C。通過0-90s間吸光值降低速率與天然酶催化條件下的 降低速率的比值來計算溶菌酶活性收率。在復(fù)性不同時間取樣測定蛋白質(zhì)的活性隨時間的 變化。其它復(fù)性條件相同，N-己基酰胱胺和胱胺輔助溶菌酶復(fù)性效果對比如圖5所示。由 圖可知，N-己基酰胱胺作為氧化劑能夠加快蛋白質(zhì)復(fù)性的速度提高復(fù)性收率，在30min就 能夠使復(fù)性收率達(dá)到80%以上，而此時胱胺的輔助復(fù)性收率才只有5%。實施例6 實施例5合成的N-己基酰胱胺輔助14 μ mol/L還原變性溶菌酶的復(fù)性N-己基酰胱胺的合成如實施例5所示。14. 3mg溶菌酶溶于1. OmL含有8mol/L 尿素，100mmol/L DTT，IOOmmo 1/L Tris-HCl 禾Π lmmol/L EDTA, pH 8. 5 的變性緩沖溶液中 于40°C還原變性3小時。變性完成后通過C18反相色譜測定得到其中殘留的DTT含量為 84mmol/L ；對得到的變性溶菌酶用不含DTT的變性緩沖液進(jìn)行7倍稀釋得到變性蛋白質(zhì)樣 品。復(fù)性緩沖液由lOOmmol/L Tris-HCl、0. 8mol/L鹽酸胍、0. 6mmol/L N-己基酰胱胺或 0. 9mmol/L胱胺和lmmol/L EDTA組成，溶液pH為8. 5。用復(fù)性液將變性蛋白質(zhì)樣品稀釋10. 2倍，稀釋后溶液中溶菌酶的濃度為14ymol/L，DTT為1. 18mmol/L。稀釋后的溶液置于 28°C的恒溫水浴中開始復(fù)性。溶菌酶的活性檢測以微球菌為底物，1. 30mL 0. 25mg/mL底物 WpH 6. 2的磷酸鹽緩沖液與0. IOmL稀釋后的蛋白質(zhì)復(fù)性液充分混合，測定反應(yīng)液在450nm 下的吸光度變化。活性測定溫度28°C。通過0-90s間吸光值降低速率與天然酶催化條件 下的降低速率的比值來計算溶菌酶活性收率。在復(fù)性不同時間取樣測定蛋白質(zhì)的活性隨時 間的變化。其它復(fù)性條件相同，N-己基酰胱胺和胱胺輔助溶菌酶復(fù)性效果對比如圖6所示。 由圖可知，即使在輔助相對較高還原變性溶菌酶的復(fù)性時，N-己基酰胱胺也能夠加快蛋白 質(zhì)復(fù)性的速度并提高復(fù)性收率。同樣的復(fù)性條件下，較低濃度的N-己基酰胱胺能起到很好 的復(fù)性效果，用0. 9mmol/L胱胺作為氧化劑20min收率只有不到40%，而此時0. 6mmol/L的 N-己基酰胱胺可以使得收率達(dá)到90%?？梢?，用N-己基酰胱胺輔助復(fù)性可以大大降低氧 化劑的加入量。實施例7 實施例5合成的N-己基酰胱胺輔助14 μ mol/L還原變性溶菌酶的復(fù)性N-己基酰胱胺的合成如實施例5所示。14. 3mg溶菌酶溶于1. OmL含有8mol/L 尿素，100mmol/L DTT，IOOmmo 1/L Tris-HCl 禾Π lmmol/L EDTA, ρΗ 8. 5 的變性緩沖溶液中 于40°C還原變性3小時。變性完成后通過C18反相色譜測定得到其中殘留的DTT含量為 84mmol/L ；對得到的變性溶菌酶用不含DTT的變性緩沖液進(jìn)行7倍稀釋得到變性蛋白質(zhì) 樣品。復(fù)性緩沖液由100mmol/L Tris-HCl、1. 2mol/L尿素、1. 53mmol/L N-己基酰胱胺和 lmmol/L EDTA組成，溶液ρΗ為8. 5。用復(fù)性液將變性蛋白質(zhì)樣品稀釋10.2倍，稀釋后溶液 中溶菌酶的濃度為Hymol/L，DTT為1. 18mmol/L。稀釋后的溶液置于28°C的恒溫水浴中 開始復(fù)性。溶菌酶的活性檢測以微球菌為底物，1. 30mL 0. 25mg/mL底物的ρΗ 6. 2的磷酸鹽 緩沖液與0. IOmL稀釋后的蛋白質(zhì)復(fù)性液充分混合，測定反應(yīng)液在450nm下的吸光度變化。 活性測定溫度28°C。通過0-90s間吸光值降低速率與天然酶催化條件下的降低速率的比 值來計算溶菌酶活性收率。在復(fù)性不同時間取樣測定蛋白質(zhì)的活性隨時間的變化。復(fù)性結(jié) 果如圖7所示。由圖可知，當(dāng)N-己基酰胱胺的濃度為DTT濃度的1. 3倍時，N-己基酰胱胺 能很好的輔助復(fù)性，在20min之內(nèi)就可以使得收率達(dá)到90%以上。實施例8 實施例5合成的N-己酰胱胺輔助還原變性的核糖核酸酶A樣品復(fù)性N-己基酰胱胺的合成如實施例5所示。14. Omg核糖核酸酶A溶于LOmL含有 8mol/L尿素，100mmol/L DTT, IOOmmo 1/L Tris-HCl 和 lmmol/L EDTA，pH 8. 5 的變性緩沖溶 液中于40°C還原變性1小時。變性完成后通過C18反相色譜測定得到其中殘留的DTT含 量為94mmol/L。復(fù)性緩沖液由lOOmmol/L Tris-HCl、0. 4mmol/L N-己基酰胱胺或胱胺和 lmmol/L EDTA組成，溶液ρΗ為8. 0。用復(fù)性液將變性蛋白質(zhì)樣品稀釋72. 4倍，稀釋后溶液 中核糖核酸酶A的濃度為14μ mol/L，DTT為1. 3mmol/L。稀釋后的溶液置于25°C的恒溫水 浴中開始復(fù)性。核糖核酸酶A的活性檢測以胞苷-2' ,3'-環(huán)磷酸(cCMP)為底物，LOOmL 0. 25mg/mL底物的ρΗ 6. 0的100mmol/L Tris-HCl緩沖液與0. IOmL蛋白質(zhì)復(fù)性樣品充分混 合，測定反應(yīng)液在284nm下的吸光度變化。活性測定溫度25°C。通過0_90s間吸光值降低 速率與天然酶催化條件下的降低速率的比值來計算活性收率。采用本專利所述方法復(fù)性， 不除掉變性還原蛋白質(zhì)中的DTT，而直接稀釋復(fù)性。在復(fù)性不同時間取樣測定蛋白質(zhì)的活 性隨時間的變化。其它復(fù)性條件相同，N-己基酰胱胺和胱胺輔助溶菌酶復(fù)性效果對比如圖 8所示。由圖可知，N-己基酰胱胺也能夠加快變性還原的核糖核酸酶A復(fù)性的速度并提高
9復(fù)性收率。同樣的復(fù)性條件下，較低的N-己基酰胱胺能起到很好的復(fù)性效果，用0. 4mmol/ L N-己基酰胱胺作為氧化劑4h時復(fù)性達(dá)到平衡，收率可達(dá)90%以上，而此時0. 4mmol/L的 胱胺的輔助下復(fù)性收率卻幾乎為0。 本發(fā)明提出的折疊酶小分子模擬物N-烷基酰胱胺，并將其用于變性蛋白質(zhì)樣品 的復(fù)性，已通過現(xiàn)場較佳實施例子進(jìn)行了描述，相關(guān)技術(shù)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、 精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)本發(fā)明技術(shù)。特別需 要指出的是，所有相類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，他們都被視 為包括在本發(fā)明精神、范圍和內(nèi)容中。
權(quán)利要求
一種模擬折疊酶功能的小分子化合物N 烷基酰胱胺，其特征在于，N 烷基酰胱胺是胱胺分子中一端的氨基，通過酰胺化反應(yīng)與脂肪酸的羧基偶聯(lián)而形成，N 烷基酰胱胺結(jié)構(gòu)形式表達(dá)如下其中R為含有4～7個碳原子的烷基鏈；上述的脂肪酸選自戊酸、己酸、庚酸和辛酸。FDA0000025878540000011.tif
2.一種N-烷基酰胱胺的制備方法，其特征在于1)將胱胺二鹽酸鹽用去離子水溶解，得到0.05-lmol/L胱胺溶液后，加入含有5-8個碳 原子的脂肪酸，脂肪酸的摩爾濃度為胱胺摩爾濃度的0. 02-0. 5倍，混合后，用NaOH將其pH 調(diào)至 5. 5-6. 5 ；2)向上述制得的液體中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽固體粉 末，使固體粉末摩爾濃度為脂肪酸摩爾濃度的5-100倍；3)將上述反應(yīng)體系置于15-30°C恒溫水浴搖床，反應(yīng)3-6小時，得到N-烷基酰胱胺粗 產(chǎn)物；4)將粗產(chǎn)物首先用0.45 μ m的水系微孔濾膜過濾，然后用C18反相色譜柱進(jìn)行分離，收 集的組分經(jīng)冷凍干燥得到N-烷基酰胱胺。
3.用N-烷基酰胱胺輔助蛋白質(zhì)氧化復(fù)性的方法，其特征在于經(jīng)含DTT的變性液還 原變性的蛋白質(zhì)或包含體溶液，用不含DTT的變性液稀釋5-25倍后稀釋于或直接稀釋于 由20-100mmol/L三羥甲基氨基甲烷、0_3. Ommol/L乙二胺四乙酸四鈉、0_2mol/L尿素或 Ο-lmol/L鹽酸胍及N-烷基酰胱胺組成的pH為7. 5-9. 0的復(fù)性液中，使得稀釋后溶液中 N-烷基酰胱胺濃度為DTT摩爾濃度的0. 25-1. 3倍。
4.如權(quán)利要求3所述的氧化復(fù)性的方法，其特征在于所述的N-烷基酰胱胺，當(dāng)其為 N-辛基酰胱胺時，其摩爾濃度為體系中變性還原蛋白質(zhì)摩爾濃度的40倍及以下。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種模擬折疊酶功能的小分子化合物N-烷基酰胱胺、制備方法及用于輔助蛋白質(zhì)氧化復(fù)性的方法；此小分子作為氧化劑使用則即使在強(qiáng)還原的環(huán)境下也能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)二硫鍵的形成，所以省去將強(qiáng)還原劑DTT從還原變性的蛋白質(zhì)溶液中除去的操作步驟，從而節(jié)省復(fù)性時間和成本；采用的模擬折疊酶功能的小分子化合物N-烷基酰胱胺可以大大提高蛋白質(zhì)氧化復(fù)性的速度，同樣條件下，是氧化型谷胱甘肽輔助復(fù)性速度的7至10倍；N-烷基酰胱胺，較低濃度下就可有效地輔助蛋白質(zhì)氧化復(fù)性，可以大大降低氧化劑的用量；采用的N-烷基酰胱胺可以和變性還原蛋白質(zhì)所攜帶的強(qiáng)還原劑耦合形成氧化還原對，從而不需要在復(fù)性液中加入還原劑，操作簡單，并降低了復(fù)性成本。
文檔編號C07C323/41GK101921216SQ20101027612
公開日2010年12月22日 申請日期2010年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月8日
發(fā)明者史清洪, 孫彥, 王國珍, 董曉燕 申請人:天津大學(xué)