專利名稱：抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本 發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，特別的涉及一種抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 (deoxynivalenol, DON)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在我國農(nóng)產(chǎn)品的諸多污染因素中，真菌毒素是一類重要的天然污染物，由其引起 的食源性疾病和食品貿(mào)易爭端一直是全球關(guān)注的熱點。其中毒性大、與人類健康關(guān)系最 密切、對農(nóng)作物污染最重、分布最廣的真菌毒素是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol， DON)。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)不僅是赤霉病小麥污染的主要毒素，而且還可以污染玉 米、大麥、高粱等谷物，人畜進(jìn)食被該毒素污染的糧食和飼料后可以引起中毒，產(chǎn)生DON的 鐮刀菌還是導(dǎo)致水稻惡苗病、蔬菜(如節(jié)瓜節(jié)瓜枯萎病)等農(nóng)作物的主要病原菌，因此DON 污染不僅是一個重要的食品安全問題，而且在農(nóng)業(yè)上是一個導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)、品質(zhì)下降的 一個重要因素。因此以研制的抗DON單克隆抗體為基礎(chǔ)，創(chuàng)建快速、靈敏、準(zhǔn)確的DON的檢 測方法，不僅對保障食品安全，促進(jìn)人類健康具有重要意義，而且在優(yōu)質(zhì)、抗惡苗病水稻和 蔬菜品種的篩選，提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和保障質(zhì)量方面具有重要作用。DON污染控制的關(guān)鍵在于現(xiàn)場快速、動態(tài)監(jiān)控毒素水平，摸清毒素在各類農(nóng)產(chǎn)品 中污染的“家底”，而目前我國檢測上述毒素方法存在靈敏度低、操作繁瑣、接觸劇毒標(biāo)準(zhǔn) 品、檢測方法不適用于批量樣品處理、難以滿足現(xiàn)場檢測要求等缺憾，并已成為制約我國食 品工業(yè)快速發(fā)展和農(nóng)產(chǎn)品出口貿(mào)易的“瓶頸”，迫切需要建立快速、靈敏、適于企業(yè)自檢和 基層現(xiàn)場使用的DON免疫檢測技術(shù)方法。目前檢測DON的免疫方法有酶聯(lián)免疫吸附實驗 (ELISA)、免疫膠體金方法和化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法(CLIA)。這幾種方法的關(guān)鍵是制備特 異性強的針對DON的單克隆抗體，并以此為基礎(chǔ)利用高親和力的抗體與抗原之間的特異識 另IJ，篩選出最佳免疫檢測方法并標(biāo)準(zhǔn)化，從而研制出方便、經(jīng)濟(jì)、靈敏、快速、適于基層和現(xiàn) 場使用的免疫檢測試劑盒。由于DON為半抗原，因此只有免疫反應(yīng)性(與特異性抗體反應(yīng))而無免疫原性(不 能刺激機體產(chǎn)生抗體)，必須與大分子載體偶聯(lián)后方可刺激機體產(chǎn)生抗體。目前國內(nèi)外報道 在制備DON單克隆抗體時用于免疫動物的完全抗原是DON-卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)物，檢測用 的包被抗原為DON-牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)物。而本研究免疫動物和單克隆抗體檢測時 均用同一種蛋白和DON的偶聯(lián)物(DON-BSA)、采用載體排除法制備抗DON單克隆抗體的方法 國內(nèi)外未見報道。由于只需合成一種完全抗原，因此該方法雖具有經(jīng)濟(jì)、簡單、省時的特點， 但在技術(shù)上較免疫和檢測用不同完全抗原的方法要求高、難度大。本研究通過細(xì)胞融合，免疫抗原和檢測抗原均采用D0N-BSA，獲得了高效分泌抗 DON單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，該抗體靈敏度高，特異性強，與DON親和力高，與其他毒素 交叉反應(yīng)低，為DON檢測試劑的研制奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
(一)抗DON單克隆抗體的制備1.動物免疫將BSA，DON分別與1，3 二環(huán)基二亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)偶聯(lián)，通 過戊二酸將二者連接形成DON-BSA偶聯(lián)物，采用小劑量長周期的免疫方案。2.細(xì)胞融合將Sp2/0細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞按1 10混合于50mL無菌離心管中，1000r/min離 心lOmin，棄上清，輕彈管底使細(xì)胞充分散開，將離心管置37°C水浴中，緩慢加入37°C預(yù)溫 的50% PEGO. 7mL, Imin內(nèi)加完，于37°C靜置90s，緩慢加入20mL 1640培養(yǎng)液終止PEG的作 用。800r/min離心lOmin，棄上清液，用含20%小牛血清的HAT選擇培養(yǎng)基(Gibco公司產(chǎn) 品)懸浮沉淀的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X 106/mL，然后分別接種于加有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培 養(yǎng)板中，置37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在融合7 14d后改用HT培養(yǎng)液(Gibco公司產(chǎn) 品)，逐日觀察細(xì)胞生長情況，待長至1/3 1/2視野，ELISA法檢測上清液中抗體。3.雜交瘤篩選及抗體檢測本研究采用與傳統(tǒng)方法不同的載體排除法進(jìn)行。即以0. 5 μ g/ml DON-BSA.BSA分 別為包被抗原，用間接ELISA法篩選融合細(xì)胞上清中抗DON單克隆抗體，用DON毒素間接 競爭抑制性ELISA法確證單克隆抗體的特異性。以免疫小鼠的血清為陽性對照，以Sp2/0 細(xì)胞培養(yǎng)的上清液為空白對照。4.雜交瘤細(xì)胞的克隆化ELISA及DON毒素間接競爭抑制性ELISA法檢測上清陽性的孔，有限稀釋法進(jìn) 行克隆化，至所有單克隆孔上清抗體陽性率為100%，將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并建株，將雜交瘤 細(xì)胞凍存于液氮罐中。同時送國家知識產(chǎn)權(quán)局指定專利微生物保藏中心保藏，保藏號為 CGMCCN0. 4107。5.單克隆抗體的生產(chǎn)采用動物體內(nèi)腹水誘生法。6.單克隆抗體的純化采用飽和硫酸銨法對腹水進(jìn)行純化。(二)抗DON單克隆抗體的鑒定1.抗體的免疫球蛋白類別及亞類鑒定采用抗體亞類測定試劑盒進(jìn)行測定。2.抗體IgG含量的測定采用BCA蛋白測定試劑盒對辛酸-硫酸銨法純化后的腹 水進(jìn)行IgG含量測定。3.抗體分子量的測定采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法。4.抗體滴度測定以0. 5 μ g/ml DON-BSA為包被抗原，將抗體進(jìn)行倍比稀釋，以 Sp2/0細(xì)胞腹水純化液為陰性對照，PBS為空白對照，用間接ELISA方法測定純化腹水中抗 體滴度，以(A3^-AseV(Aratt-Ase)彡2. 1的最大稀釋倍數(shù)為抗體的滴定終點。A值約為 1時抗體的稀釋度為參考工作稀釋度。5.抗體親和力的測定采用間接ELISA法，即測定抗體的親和常數(shù)。6.抗體的特異性測定用間接競爭抑制性ELISA法進(jìn)行測定，參試毒素為OTV、 DAS、T-2毒素、F-X等毒素。采用本發(fā)明取得了以下技術(shù)效果 用DON-BSA免疫Balb/c小鼠獲得了較好的免疫應(yīng)答。細(xì)胞融合后，經(jīng)間接非競爭ELISA方法篩選，并用間接競爭ELISA方法確證，從中選擇出對抗DON毒素有抑制的細(xì)胞 株，經(jīng)3 4次亞克隆，達(dá)到3次100%陽性，建立了 1株能穩(wěn)定分泌DON單克隆抗體的雜交 瘤細(xì)胞株，命名為3G5。用間接競爭抑制ELISA測得線性范圍9. 8 μ g/L-10000 μ g/L，線性方程Y =-0. 2726X+0. 2259 (r = 0. 9309)，對DON的最低檢出濃度是9. 2 μ g/L (見說明書附圖1)， 遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國標(biāo)中對于食品中< 750μ g/L，飼料中< 1000 μ g/L的檢測靈敏度的要求。由此 可見，該研究將BSA，DON分別與DCC和NHS偶聯(lián)，通過戊二酸將二者連接形成DON-BSA偶 聯(lián)物，該方法偶聯(lián)效率高，偶聯(lián)抗原穩(wěn)定，溶解性好，免疫原性強。同時該研究中BSA-DON 偶聯(lián)物既為免疫抗原又做檢測抗原，用細(xì)胞融合的方法制備了分泌抗DON的單克隆抗體的 雜交瘤細(xì)胞株，與其它半抗原單克隆抗體制備方法相比，該方法簡單，經(jīng)濟(jì)可行，抗體篩選 難度大。所得單克隆抗體效價高，抗體含量高，DON最低檢出濃度是9. 2 μ g/L，靈敏度高， 與DON具有高度親和力，與其它真菌毒素交叉反應(yīng)低，特異性強，可用于制備高質(zhì)量國產(chǎn) D0N-ELISA檢測試劑盒。


說明書附圖1為DON間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線
具體實施例方式(一)抗DON單克隆抗體的制備1.動物免疫將BSA，DON分別與1，3 二環(huán)基二亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)偶聯(lián)，通 過戊二酸將二者連接形成DON-BSA偶聯(lián)物，DON與BSA摩爾比為50 1。該方法偶聯(lián)效率 高，偶聯(lián)抗原穩(wěn)定，溶解性好，免疫原性強。 將DON-BSA偶聯(lián)物配制成lmg/ml溶液，采用小劑量長周期的免疫方案，對6 8周 齡的雌性Balb/c小鼠(體重18 20g)，首次免疫用100 μ g D0N-BSA，加入等量完全福氏 佐劑(Sigma公司產(chǎn)品)，腹腔注射。2周后，用IOOyg D0N-BSA，加入等量不完全福氏佐劑 (Sigma公司產(chǎn)品)，腹腔注射。再2周后，用IOOyg D0N-BSA，加入等量不完全福氏佐劑，腹 腔注射。2周后，強化免疫，50 μ g DON-BSA溶液脾內(nèi)免疫，4d后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。2.細(xì)胞融合將Sp2/0細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞按1 10混合于50mL無菌離心管中，1000r/min離 心lOmin，棄上清，輕彈管底使細(xì)胞充分散開，將離心管置37°C水浴中，緩慢加入37°C預(yù)溫 的50% PEG0. 7mL, Imin內(nèi)加完，于37°C靜置90s，緩慢加入20mL 1640培養(yǎng)液終止PEG的作 用。800r/min離心lOmin，棄上清液，用含20%小牛血清的HAT選擇培養(yǎng)基(Gibco公司產(chǎn) 品)懸浮沉淀的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X 106/mL，然后分別接種于加有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培 養(yǎng)板中，置37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在融合7 14d后改用HT培養(yǎng)液(Gibco公司產(chǎn) 品)，逐日觀察細(xì)胞生長情況，待長至1/3 1/2視野，ELISA法檢測上清液中抗體。3.雜交瘤篩選及抗體檢測本研究采用與傳統(tǒng)方法不同的載體排除法進(jìn)行。即以0. 5 μ g/ml D0N_BSA、BSA分 別為包被抗原，用間接ELISA法篩選融合細(xì)胞上清中抗DON單克隆抗體，用DON毒素間接競爭抑制性ELISA法確證單克隆抗體的特異性。以免疫小鼠的血清為陽性對照，以Sp2/0 細(xì)胞培養(yǎng)的上清液為空白對照，以融合細(xì)胞培養(yǎng)板中未長出克隆的細(xì)胞培養(yǎng)上清為陰性對 照，陽性細(xì)胞孔判定標(biāo)準(zhǔn)為(A試驗-A ) / (A _對照-A 對照)彡2. 1。本研究中采用的免疫抗原與檢測抗原為同一載體BSA，使得半抗原單克隆抗體的 制備更簡單，更經(jīng)濟(jì)，更省時。4.雜交瘤細(xì)胞的克隆化ELISA及DON毒素間接競爭抑制性ELISA法檢測上清陽性的孔，有限稀釋法進(jìn)行克 隆化，至所有單克隆孔上清抗體陽性率為100%，將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并建株，將雜交瘤細(xì)胞凍 存于液氮罐中。同時送國家知識產(chǎn)權(quán)局指定專利微生物保藏中心包藏。5.單克隆抗體的生產(chǎn)采用動物體內(nèi)腹水誘生法。6.單克隆抗體的純化采用飽和硫酸銨法對腹水進(jìn)行純化。(二)抗DON單克隆抗體的鑒定

1.抗體的免疫球蛋白類別及亞類鑒定采用抗體亞類測定試劑盒進(jìn)行測定。2.抗體IgG含量的測定采用BCA蛋白測定試劑盒對辛酸-硫酸銨法純化后的腹 水進(jìn)行IgG含量測定。3.抗體分子量的測定采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法。4.抗體滴度測定以0. 5 μ g/ml DON-BSA為包被抗原，將抗體進(jìn)行倍比稀釋，以 Sp2/0細(xì)胞腹水純化液為陰性對照，PBS為空白對照，用間接ELISA方法測定純化腹水中抗 體滴度，以(A3^-AseV(Aratt-Ase)彡2. 1的最大稀釋倍數(shù)為抗體的滴定終點。A值約為 1時抗體的稀釋度為參考工作稀釋度。5.抗體親和力的測定采用間接ELISA法，即測定抗體的親和常數(shù)。取三種倍比 稀釋度(0. 25 μ g/mL, 0. 50 μ g/mL, 1. 00 μ g/mL)的DON-BSA包被聚苯乙烯微板，加入系列稀 釋的已知濃度的純化腹水，采用間接ELISA法，測定各抗體的親和常數(shù)。以A值對純化腹水 濃度繪制出3條測定曲線，以各曲線上部趨于平坦段的A值為100%，查出其A值為50%時 點的蛋白濃度[Ab]t，這樣可得[Ab]t、[Ab，]t和[Ab”]t三個值，然后按下式計算K值當(dāng) 包被抗原濃度比為 2 時，K1 = 1/2 (2 [Ab' ]{-仏13]0，或1(2 = l/2(2[Ab”]t-[Ab，]t)；當(dāng)包 被抗原濃度比為4時，K3 = 3/2(4[Ab”]t-[Ab]t)。即可得3個K值，取平均值即為其親和 力常數(shù)6.抗體的特異性測定用間接競爭抑制性ELISA法進(jìn)行測定，參試毒素為OTV、 DAS、T-2毒素、F-X等毒素?？贵w的亞類、相對分子量、抗體滴度、親和力常數(shù)等見表1。用間接競爭性ELISA法 測得抗DON單克隆抗體與NIV、DAS、T-2毒素、F-X等毒素的交叉反應(yīng)率，見表2。表1抗DON單克隆抗體特性
權(quán)利要求
1.一種抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇單克隆的雜交瘤細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞的保藏號 為 CGMCC NO. 4107。
2.一種抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇單克隆抗體，其特征在于由保藏號為CGMCC NO. 4107 的雜交瘤的細(xì)胞所分泌，DON最低檢出濃度是9. 2 μ g/L。
3.一種抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇單克隆的制備方法，其特征在于包括以下依次步驟1)偶聯(lián)物制備BSA，D0N分別與1，3 二環(huán)基二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺偶聯(lián)，通過戊二酸將二者連接 形成DON-BSA偶聯(lián)物，DON與BSA摩爾比為50 1 ；將DON-BSA偶聯(lián)物配制成lmg/ml溶液， 采用小劑量長周期的免疫方案，對6 8周齡的雌性小鼠；首次免疫用IOOyg D0N-BSA，加 入等量完全福氏佐劑；2周后，用IOOyg D0N-BSA，加入等量不完全福氏佐劑；再2周后，用 IOOyg D0N-BSA，加入等量不完全福氏佐劑；2周后，強化免疫，50μ g DON-BSA溶液脾內(nèi)免 疫，4d后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合；2)細(xì)胞融合將Sp2/0細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞按1 10混合于50mL無菌離心管中，lOOOr/min離心 lOmin，棄上清，輕彈管底使細(xì)胞充分散開；將離心管置37°C水浴中，緩慢加入37°C預(yù)溫的 50% PEG 0. 7mL, Imin內(nèi)加完；于37°C靜置90s,緩慢加入20mL 1640培養(yǎng)液終止PEG的作 用；800r/min離心lOmin，棄上清液，用含20%小牛血清的HAT選擇培養(yǎng)基懸浮沉淀的細(xì) 胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X106/mL，然后分別接種于加有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，置37°C， 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在融合7 14d后改用HT培養(yǎng)液；逐日觀察細(xì)胞生長情況，待長至 1/3 1/2視野，ELISA法檢測上清液中抗體；3)雜交瘤篩選及抗體檢測以0. 5 μ g/ml D0N-BSA、BSA分別為包被抗原，用間接ELISA法篩選融合細(xì)胞上清中抗 DON單克隆抗體，用DON毒素間接競爭抑制性ELISA法確證單克隆抗體的特異性；以免疫小 鼠的血清為陽性對照，以Sp2/0細(xì)胞培養(yǎng)的上清液為空白對照，以融合細(xì)胞培養(yǎng)板中未長 出克隆的細(xì)胞培養(yǎng)上清為陰性對照；4)雜交瘤細(xì)胞的克隆化ELISA及DON毒素間接競爭抑制性ELISA法檢測上清陽性的孔，有限稀釋法進(jìn)行克隆 化，經(jīng)3 4次亞克隆，達(dá)到3次100%陽性，建立了 1株能穩(wěn)定分泌DON單克隆抗體的雜交 瘤細(xì)胞株，保藏號為CGMCCN0. 4107，該雜交瘤細(xì)胞所分泌的單克隆抗體DON最低檢出濃度 是 9. 2 μ g/L。
4.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于在檢測水稻惡苗病或節(jié)瓜枯萎病中 的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求2所述的雜交瘤細(xì)胞，其特征在于在檢測水稻惡苗病或節(jié)瓜枯萎病中 的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于在檢測農(nóng)作物食品中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求2所述的雜交瘤細(xì)胞，其特征在于在檢測農(nóng)作物食品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，特別的涉及一種抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。通過細(xì)胞融合，免疫抗原和檢測抗原均采用DON-BSA，獲得了高效分泌抗DON單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株并保藏，該抗體靈敏度高，特異性強，與DON親和力高，與其他毒素交叉反應(yīng)低，為DON檢測試劑的研制奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C07K16/14GK102071169SQ201010277020
公開日2011年5月25日 申請日期2010年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月9日
發(fā)明者李鳳琴, 王偉, 趙麗 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所, 山東大學(xué)