一種兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性啟動子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新發(fā)現(xiàn)的DNA序列，它可以作為啟動子以光誘導(dǎo)的形式調(diào)控目的基因特異性地表達(dá)在植物地上部分的組織器官中。本發(fā)明從模式植物擬南芥中克隆了AtcpSecY2基因的啟動子序列，隨后在轉(zhuǎn)基因擬南芥中證實，該啟動子能夠驅(qū)動GUS報告基因以光誘導(dǎo)的形式在植物地上部分的組織器官中特異性表達(dá)。應(yīng)用本發(fā)明的啟動子，構(gòu)建獲得“啟動子-待表達(dá)的目的基因”融合基因，將其轉(zhuǎn)化植物可獲得兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因植物。這不僅有助于研究植物基因在光照條件下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)模式，并應(yīng)用于植物基因工程中使外源基因在光照條件下伴隨著植物生理狀態(tài)適度表達(dá)，同時準(zhǔn)確有效地改變植物地上部分的光合特性和農(nóng)藝性狀，實現(xiàn)農(nóng)作物的品系改良，具有廣泛的應(yīng)用價值。
【專利說明】一種兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性啟動子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體說是利用分子生物學(xué)技術(shù)獲得一種兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性的啟動子及其在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因上游、對RNA聚合酶進(jìn)行識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，啟動子就像“開關(guān)”一樣，能夠控制其下游結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的起始時間和強度。高等植物基因的表達(dá)調(diào)控是植物基因工程研究的中心內(nèi)容之一，作為轉(zhuǎn)錄水平上一種重要的分子調(diào)控元件，對啟動子的研究成為分子生物學(xué)的熱點(王穎等，2003 ;李杰等，2006)。
[0003]根據(jù)植物中啟動子啟動轉(zhuǎn)錄的模式和功能可將其分為三類:組成型啟動子、組織器官特異性啟動子和誘導(dǎo)型啟動子(王穎等，2003)。組成型啟動子在所有組織中都能啟動基因的表達(dá)，具有持續(xù)性，不表現(xiàn)時空特異性；組織器官特異性啟動子調(diào)控下的基因轉(zhuǎn)錄一般只發(fā)生在某些特定器官或組織中；誘導(dǎo)型啟動子是在某些物理或化學(xué)信號的誘導(dǎo)下，可以促進(jìn)目的基因強烈表達(dá)(王穎等，2003 ;路靜等，2004)。
[0004]在組成型啟動子中，目前使用最廣泛的是花椰菜花葉病毒的dK 啟動子、來自根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒T-DNA區(qū)域的胭脂堿合成酶基因Mxs啟動子和章魚堿合成酶基因6^5.啟動子等(王穎等,2003 ;李杰等，2006)。如在單子葉植物中，Tsuchiya等(1996)發(fā)現(xiàn)CaMV 啟動子和水稻啟動子在百合的基因轉(zhuǎn)化中都有高效的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。在雙子葉植物中，Sunilkumar等(2002)以CMfV 啟動子驅(qū)動綠色熒光蛋白(GFP)基因在轉(zhuǎn)基因棉花中表達(dá)。雖然利用組成型啟動子驅(qū)動目的基因的表達(dá)對于基因的功能研究取得了一定的進(jìn)展，但是由于組成型啟動子會導(dǎo)致目的基因在植物所有組織中大量表達(dá)，過度消耗細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)和能量，因此在應(yīng)用中存在很多的弊端(Gittins et al.，2000)。如使用組成型啟動子會導(dǎo)致目的基因在整體植株中表達(dá)，產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，阻礙了植物的正常生長發(fā)育，不利于產(chǎn)量和品質(zhì)的提高；有些表達(dá)產(chǎn)物甚至有毒，導(dǎo)致植株的死亡(Robinson, 1996; Gilmour et al., 2004; Qin et al., 2004; Savitch et al., 2005;Thomashow, 2010)。另外，重復(fù)使用組成型啟動子驅(qū)動多個外源基因的表達(dá)可能引起基因沉默(Kumpatla et al.，1998)。因此，亟待需要尋找更為有效的組織器官特異性或誘導(dǎo)型啟動子代替組成型啟動子，以更好地調(diào)控植物基因的表達(dá)。
[0005]組織器官特異性或誘導(dǎo)型啟動子由于其驅(qū)動目的基因的表達(dá)發(fā)生在某些特定的器官組織部位或其表達(dá)受外界刺激信號的誘導(dǎo)，所以在很大程度上可以克服組成型啟動子在理論和應(yīng)用研究中突顯的種種缺陷。目前在許多植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了這兩類特異性啟動子。如毛自朝等(2002)將番茄果實特異性啟動子和目的基因構(gòu)成的融合基因轉(zhuǎn)入番茄，獲得了無籽番茄果實。Mariani等(1990; 1992)將煙草花藥絨氈層特異表達(dá)基因的啟動子TA29與Barnase基因融合后轉(zhuǎn)化植物核酸酶基因在花藥中特異表達(dá)，獲得了煙草和油菜的雄性不育材料，并進(jìn)行了商業(yè)化應(yīng)用。根據(jù)外源刺激或誘導(dǎo)物的不同，誘導(dǎo)型啟動子又分為光、熱、傷害、激素和病原菌等誘導(dǎo)型啟動子。目前在植物中已發(fā)現(xiàn)了多種誘導(dǎo)型啟動子，如向日葵熱激蛋白基因啟動子、馬鈴薯激素誘導(dǎo)型啟動子和P69B、P69C假單胞菌誘導(dǎo)型啟動子等(Xu et al., 1993; Coca et al., 1996; Jorda and Vera,2000)。
[0006]擬南芥屬于十字花科，由于其個體形態(tài)小、生長周期短、繁殖能力強、基因組小和生物信息資源豐富等特點，成為植物遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)研究的模式植物(張振楨等，2006)。植物的地上部分和地下部分處于不同的環(huán)境中，兩者之間由維管束連接，存在著營養(yǎng)物質(zhì)和信息的大量交換。地下部分根組織的活動依賴于地上部分所提供的光合產(chǎn)物、激素和維生素等；而地上部分葉片、枝條和花果等的生長活動則需要根系提供水分、礦質(zhì)、氮素、激素和氨基酸等。光是影響植物生長發(fā)育最重要的環(huán)境因子之一，尤其對植物地上部分組織器官的生理特性和功能狀態(tài)影響最大。植物的種子在土壤中萌發(fā)生長，伴隨著幼苗出土的過程，地上部分逐漸適應(yīng)光照，并且在光的誘導(dǎo)下，參與植物地上組織器官的生長發(fā)育，特別是參與綠色組織光合作用的基因強烈表達(dá)，通過光合作用為后續(xù)植物的生長、開花和結(jié)實提供最主要的物質(zhì)和能量來源。因此，植物地上部分組織器官的生命活動與光照存在著緊密的聯(lián)系。
[0007]目前還沒有一種兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性的啟動子，因此本領(lǐng)域迫切需要篩選和開發(fā)在光的誘導(dǎo)下植物地上組織器官特異性的啟動子。獲得并有效利用兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性的啟動子不僅有助于研究植物基因在光照條件下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)模式和調(diào)控機制，并應(yīng)用于植物基因工程中使外源基因在光照條件下伴隨著植物生理狀態(tài)適度表達(dá)，同時準(zhǔn)確有效地改變植物地上部分的光合特性和農(nóng)藝性狀，實現(xiàn)農(nóng)作物的品系改良，以更好地調(diào)控植物的生長發(fā)育，具有廣泛的應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明目的是解決現(xiàn)有植物基因工程技術(shù)技術(shù)中，因使用組成型啟動子，使外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中過量表達(dá)異源蛋白或代謝產(chǎn)物，使植物原有的代謝失衡，阻礙了植物的正常生長發(fā)育，甚至導(dǎo)致死亡，以及重復(fù)使用同一種組成型啟動子驅(qū)動多個外源基因的表達(dá)可能引起基因沉默的問題。同時為深入研究植物基因在光照條件下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)模式，并應(yīng)用于植物基因工程中使外源基因在光照條件下伴隨著植物生理狀態(tài)適度表達(dá)，同時準(zhǔn)確有效地改變植物地上部分的光合特性和農(nóng)藝性狀，實現(xiàn)農(nóng)作物的品系改良，以更好地調(diào)控植物的生長發(fā)育，提供一種兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性的啟動子及其在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明提供了一種新的、1851bp的兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性的啟動子，該啟動子核酸序列選自:
(a)如序列表1所示的核酸序列；
(b)在(a)限定的核酸序列中至少具有80%以上的同源性的核酸序列。
[0010]作為具體應(yīng)用的實例，本發(fā)明提供了一種兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性的啟動子的克隆方法，具體操作步驟如下:
第一、以擬南芥基因組DNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性啟動子；第二、回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
第三、將上述第二步回收的擴(kuò)增產(chǎn)物，與pMD-18載體(購自TaKaRa公司)在連接酶催化下進(jìn)行連接反應(yīng)；
第四、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞；
第五、通過氨芐霉素抗性篩選，獲得該啟動子的陽性TA克隆。
[0011]本發(fā)明同時提供了兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性的啟動子的應(yīng)用，即:利用獲得的兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性的啟動子，構(gòu)建“啟動子-目的基因”的融合基因，進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化，從而獲得基因組中含有以上所述啟動子核酸序列的、可以光誘導(dǎo)的形式在植物地上組織器官特異表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因植物。其中所述的融合基因中的目的基因可以是任何針對基礎(chǔ)研究、轉(zhuǎn)化技術(shù)、植物地上部分的光合特性和農(nóng)藝性狀改良需要的目的基因。
[0012]作為具體應(yīng)用的實例，本發(fā)明提供了一種“啟動子-GUS報告基因”融合基因的構(gòu)建及其在轉(zhuǎn)基因擬南芥中以光誘導(dǎo)的形式在地上部分特異性表達(dá)。具體操作過程如下:
第一、用Z如I /Nco I雙酶切含有兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性的啟動子的TA克隆質(zhì)粒，回收該特異性啟動子片段；
第二、用I /Nco I雙酶切pCAMBIA 1301 (購自CAMBIA公司)質(zhì)粒，回收大的載體片段(其中含有報告基因的編碼序列)；
第三、混合上述第一步得到的兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性的啟動子片段和第二步得到的pCAMBIA 1301載體大片段，在連接酶催化下進(jìn)行連接反應(yīng)，完成在pCAMBIA1301載體上的“兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性的啟動子-GUS,,融合基因的構(gòu)建。
[0013]其中所設(shè)計的兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性啟動子的PCR擴(kuò)增引物如下，其中上游引物引入了油a I酶切位點，下游引物引入了 Afc0 I酶切位點:
上游引物:5 ’ -TCTAGACTTGTCGACAACTACTGATCCG-3，
下游引物:5’ -CCATGGCGAGAGGATGAGGAGAGAAA-3，
所述應(yīng)用中的“啟動子_^浴報告基因”在轉(zhuǎn)基因擬南芥中以光誘導(dǎo)的形式在地上部分特異表達(dá)，操作過程如下:
擬南芥轉(zhuǎn)化的具體方法，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Floral dip的方法(Clough and Bent,1998)，獲得的種子經(jīng)過50 mg .L-1潮霉素抗性篩選，生長正常的抗性植株轉(zhuǎn)土培養(yǎng)，利用組織化學(xué)染色的方法(Blume and Grierson, 1997),檢測轉(zhuǎn)基因擬南芥光誘導(dǎo)條件下和整個生長發(fā)育過程中各個組織器官中報告基因表達(dá)的特異性。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果: 本發(fā)明利用有效的兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性的啟動子代替組成型啟動子，可以用于構(gòu)建在植物的地上組織器官中以光誘導(dǎo)的形式特異性表達(dá)目的基因的融合基因。利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將其轉(zhuǎn)入植物的基因組中，可以實現(xiàn)對目的基因的定向操作，獲得兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因植物。這不僅有助于研究植物基因在光照條件下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)模式和調(diào)控機制，并應(yīng)用于植物基因工程中使外源基因在光照條件下伴隨著植物生理狀態(tài)適度表達(dá)，同時準(zhǔn)確有效地改變植物地上部分的光合特性和農(nóng)藝性狀，實現(xiàn)農(nóng)作物的品系改良，以更好地調(diào)控植物的生長發(fā)育，具有廣泛的應(yīng)用價值?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0015]圖1是兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性啟動子克隆的電泳檢測圖。
[0016]圖2是擬南芥“兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性啟動子”轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的PCR鑒定。
[0017]圖3是“兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性啟動子”轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在光誘導(dǎo)條件下的GUS染色結(jié)果。
[0018]圖4是“兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性啟動子”轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的各個器官個發(fā)育過程中GUS染色結(jié)果。
【具體實施方式】
[0019]實施例1:兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性啟動子的克隆
第一、以擬南芥基因組DNA為模板，利用PCR方法擴(kuò)增1851bp的兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性啟動子，回收擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行TA克隆。
[0020](I)PCR擴(kuò)增目的片段:
①根據(jù)已知的擬南芥基因啟動子區(qū)的序列設(shè)計特異引物，在上游引物中引KXba I酶切位點，在下游引物中引入Afco I酶切位點。
[0021]上游引物:5’-TC TAGACTTGTCGACAACTACTGATCCG-3> (引入油a I 酶切位點)
下游引物:5’ -CCATGGCGAGAGGATGAGGAGAGAAA-3，(引入AfcoI 酶切位點)
②按常規(guī)方法提取擬南芥基因組DNA，以基因組DNA為模板，利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制備兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性啟動子片段。
[0022]PCR反應(yīng)程序:
94 0C 3分鐘；
940C 30 秒，560C 30 秒，72°C 2 分，32 個循環(huán)；
72 V 10分鐘；
4 C保溫。
[0023]PCR反應(yīng)體系:
【權(quán)利要求】
1.一種兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性的啟動子，其核酸序列選自: (a)如序列表1所示的核酸序列； (b)在(a)限定的核酸序列中至少具有80%以上的同源性的核酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性的啟動子，其特征在于，所設(shè)計的擬南芥兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性啟動子的PCR擴(kuò)增引物如下，其中上游引物中引入了油a I酶切位點，下游引物中引入了 Afc0 I酶切位點:
上游引物:5 ’ -TCTAGACTTGTCGACAACTACTGATCCG-3，
下游引物:5’ -CCATGGCGAGAGGATGAGGAGAGAAA-3，。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性的啟動子，其特征在于，從擬南芥基因組DNA中克隆獲得兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性啟動子，具體操作步驟如下: (1)以擬南芥基因組DNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性啟動子； (2)回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； (3)將上述⑵步回收的擴(kuò)增產(chǎn)物，與PMD-18T在連接酶催化下進(jìn)行連接反應(yīng)； (4)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞； (5)通過抗性篩選，獲 得該啟動子的陽性TA克隆。
4.一種權(quán)利要求1所述的兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性啟動子的應(yīng)用，其特征在于，利用該啟動子構(gòu)建獲得啟動子-目的基因的融合基因，將其轉(zhuǎn)化擬南芥或其他植物，從而獲得基因組中含有權(quán)利要求1所述啟動子核酸序列的、可在植物的地上部分組織器官中以光誘導(dǎo)的形式特異性表達(dá)相應(yīng)目的基因的轉(zhuǎn)基因植物。
5.一種權(quán)利要求1所述的兼具植物地上組織器官和光誘導(dǎo)特異性啟動子的應(yīng)用，其特征在于，利用該啟動子構(gòu)建獲得啟動子融合基因，在植物地上組織器官中驅(qū)動報告基因以光誘導(dǎo)的形式特異性地表達(dá)相應(yīng)的目的基因。
【文檔編號】C12N15/10GK103589725SQ201310540693
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月5日
【發(fā)明者】劉棟, 李衛(wèi)春, 馬利霞, 程建峰, 候玲 申請人:江西農(nóng)業(yè)大學(xué)