專(zhuān)利名稱：蛋白質(zhì)氧化復(fù)性新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及變性蛋白的復(fù)性技術(shù)，主要是氧化復(fù)性技術(shù)。
背景技術(shù)：
重組DNA技術(shù)使在細(xì)菌或其它宿主細(xì)胞中大量表達(dá)多肽和蛋白分子成為可能。重組表達(dá)的蛋白類(lèi)產(chǎn)品已獲得了許多成功。然而，異源宿主表達(dá)技術(shù)經(jīng)常遇到蛋白產(chǎn)物在宿主細(xì)胞內(nèi)沉淀的情況。沉淀的蛋白以包涵體形式存在，它們不具有天然的三維結(jié)構(gòu)，處于變性狀態(tài)，通常沒(méi)有生物活性。變性蛋白需要在體外進(jìn)行處理，使其獲得具有生物活性的空間結(jié)構(gòu)。該過(guò)程稱為復(fù)性或蛋白折疊(重折疊)。體外復(fù)性常常是多肽和蛋白類(lèi)產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程成功的關(guān)鍵因素。Anfinsen理論認(rèn)為，多肽分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)，即其序列是蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)以及活性的決定因素[Anfinsen CB, Haber E, Sela M, et al. The kinetics of formation ofnative ribonuclease during oxidation of the reduced polypeptide chain. Proc NatlAcad Sci USA，1961,47 :1309-1314]。該理論是現(xiàn)代蛋白質(zhì)化學(xué)的重要理論基礎(chǔ)。然而，近來(lái)更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，一級(jí)結(jié)構(gòu)本身并不足以確定蛋白產(chǎn)物精確的三級(jí)結(jié)構(gòu)。已經(jīng)知道， 細(xì)胞合成蛋白分子的同時(shí)，有多種其他蛋白和酶參與和輔助了該蛋白分子的正確折疊，這些蛋白和酶包括伴侶分子、蛋白氧化還原酶以及一些蛋白異構(gòu)酶等[Ruddon Rff, Bedows E.Assisted protein folding. J BiolChem. 1997；272 :3125-3128]。在蛋白復(fù)性和折疊過(guò)程中，會(huì)形成具有一定結(jié)構(gòu)的部分折疊的分子形態(tài)，稱為中間體。早期中間體可能與折疊過(guò)程中的蛋白聚集現(xiàn)象有關(guān)。部分折疊的中間體含有相鄰的大片表面疏水區(qū)，使得這些中間體有很強(qiáng)的聚集傾向。中間體分子的特定疏水表面結(jié)構(gòu)元素與相鄰分子的配合疏水表面結(jié)構(gòu)元素相互作用，導(dǎo)致其分子間聚集。最初的聚集物可能是二聚體或四聚體，為可溶性；當(dāng)聚集體尺寸超過(guò)溶解性極限時(shí)，就形成沉淀[Fink AL. Protein aggregation :foldingaggregates，inclusion bodies and amyloid. Fold Design, 1998, 3 :R9-R23]0 一旦不溶性的聚集物形成，自然狀態(tài)下，這一過(guò)程是不可逆的。多種蛋白分子，特別是由細(xì)胞分泌的具有重要功能活性的蛋白分子，內(nèi)部通常含有天然二硫鍵；二硫鍵對(duì)于這些蛋白分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和活性，有重要作用[Betz SF. Disulfide bonds and the stability of globular proteins.Protein Sci. 1993 ；2 1551-8]。在真核細(xì)胞中，蛋白分子合成后，借助二硫鍵氧化酶和二硫鍵異構(gòu)酶的作用，數(shù)分鐘甚至數(shù)秒內(nèi)即可形成正確完整的二硫鍵連接。但在體外折疊復(fù)性時(shí)，二硫鍵的形成過(guò)程非常緩慢，并需要有合適的氧化性小分子和還原性小分子的適當(dāng)配合，使錯(cuò)誤配對(duì)的二硫鍵連接轉(zhuǎn)換成正確二硫鍵，以促進(jìn)復(fù)性。這些氧化性小分子和還原性小分子的配合，稱為氧化還原對(duì)(redox)，如還原型/氧化型谷胱苷肽(GSH/GSSG)、還原型/氧化型二硫蘇糖醇 (DlTed/DTT°x)、半胱氨酸/胱氨酸(cysteine/cysteamine)等。該復(fù)性過(guò)程稱為氧化復(fù)性或氧化折疊。在蛋白變性、復(fù)性過(guò)程的折疊機(jī)制研究中，牛胰核糖核酸酶RNase A是最常使用的一個(gè)典型的模式蛋白，它全長(zhǎng)1 個(gè)氨基酸殘基中含有8個(gè)半胱氨酸，天然狀態(tài)下形成4對(duì)二硫鍵(Cys^-Cys84，Cys58-Cysll0，Cys40-Cys95，Cys65-Cys72)。大量研究已經(jīng)確定了其折疊中間體的存在禾口結(jié)構(gòu)[Narayan M, Welker E, Wedemeyer WJ, Scheraga HA. Oxidative Folding of Proteins. Acc ChemRes. 2000 ；33 :805-12]。在經(jīng)典的復(fù)性研究中，完全還原變性的RNase A在偏堿性溶液和適當(dāng)氧化還原對(duì)存在下復(fù)性，形成含有不同二硫鍵數(shù)目的結(jié)構(gòu)性或非結(jié)構(gòu)性中間體(按二硫鍵數(shù)目分別稱為IS, 2S，3S，4S)，3S是主要的穩(wěn)定中間體； 在1S，2S中間體甚至完全還原(R)的分子中，蛋白骨架的拓?fù)錁?gòu)象已趨近于天然蛋白，導(dǎo)致二硫鍵的形成更趨向于正確的連接，而錯(cuò)誤連接的二硫鍵也通過(guò)改組(reshuffle)轉(zhuǎn)換為正確類(lèi)型。最終形成的3S中間體具有基本正確的二硫鍵連接和極近天然的高級(jí)結(jié)構(gòu)，并具明 的 Blfi舌個(gè)生[ffedemeyer WJ, Welker E, Narayan Μ, Scheraga HA. Disulfide Bonds and Protein Folding. Biochemistry, 2000 ；39,4207-4216] 不同的含二硫鍵的蛋白類(lèi)型，其氧化折疊機(jī)制有很大差別，需要用不同的折疊模型描述[Arolas JL，Aviles FX，Chang JY，Ventura S. Folding of smalldisulfide-rich proteins :clarifying the puzzle. Trends Biochem Sci 2006，31 :292-301]。一些蛋白的氧化折疊，起始于隨機(jī)配對(duì)的二硫鍵的形成，并由此導(dǎo)致蛋白分子的疏水塌縮，這種雜亂 (scrambled)種類(lèi)分子隨后形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，并在二硫鍵還原和改組(reshuffle)過(guò)程中，恢復(fù)正確的高級(jí)結(jié)構(gòu)和正確二硫鍵連接。一些蛋白的氧化折疊，起始于近天然空間結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，由此導(dǎo)致正確二硫鍵的形成，同時(shí)促進(jìn)錯(cuò)配二硫鍵的改組、巰基序貫氧化，最終形成天然結(jié)構(gòu)和天然二硫鍵連接。無(wú)論在何種模型下，二硫鍵改組(reshuffle)都是折疊復(fù)性的必須環(huán)節(jié)。不同的復(fù)性條件如pH、離子強(qiáng)度、氧化還原對(duì)等，可能影響復(fù)性的效率和動(dòng)力學(xué)。 對(duì)于許多天然狀態(tài)下含有二硫鍵的蛋白，在偏堿性溶液和加入適當(dāng)氧化還原對(duì)，是促進(jìn)其氧化復(fù)性的必要條件。英特網(wǎng)“折疊數(shù)據(jù)庫(kù)”(http://clims. med. monash. edu. au/) [Chow MK, Amin AA, Fulton KF, et al. TheREFOLD database :a tool for the optimization of protein expression and refolding. Nucleic Acids Res. 2006 ;34 :D207_12.]儲(chǔ)存有數(shù)千種已知的蛋白復(fù)性條件和方法，其中包括一些氧化折疊的方法。一些添加劑如精氨酸、去污劑、變性劑、伴侶分子、蛋白氧化還原酶以及蛋白異構(gòu)酶等，可能輔助氧化折疊過(guò)程，并減少該過(guò)程中由于蛋白聚集引起的收率降低問(wèn)題。體外復(fù)性時(shí)，即使加入二硫鍵異構(gòu)酶，仍然需要有合適比例的氧化還原對(duì)，才能使其發(fā)揮催化的作用。[LylesMM，Gilbert HF. Catalysis of the oxidative folding of ribonuclease A by proteindisulfide isomerase :dependence of the rate on the composition of the redox buffer. Biochemistry. 1991 ；30 :613-9.]Creighton早期曾在pH 8. 7溶液中單獨(dú)用氧化型谷胱苷肽GSSG觀察還原變性 Rnase A 的復(fù)性[Creighton TE. A three-disulphide intermediate in refolding ofreduced ribonuclease A with a folded conformation. FEBS Lett. 1980 ；118 283-8. ]ο Scheraga 等[Rothwarf DM，Scheraga HA. Regeneration and reduction of nativebovine pancreatic ribonuclease A with oxidized and reduced dithiothreitol. J AmChem Soc. 1991 ；113，6293-6294.]首次單獨(dú)使用氧化型 DTT (DTT°X)， 證實(shí)用DTTed/DTT°x作為氧化還原對(duì)的可行性。盡管他們?cè)趐H 8. 0溶液中單獨(dú)用DTT°X獲得了還原變性Rnase A的復(fù)性，但作者在該文及其后的文獻(xiàn)[Iwaoka M, Juminaga D5Scheraga HA. Regeneration of three-disulfide mutants of bovinepancreatic ribonuclease A missing the 65-72 disulfide bond characterization of aminor folding pathway of ribonuclease A and kinetic roles of Cys65 and Cys72Biochemistry. 1998 ；37 (13) 4490-501.]中強(qiáng)調(diào)，在該pH條件下，加入的高濃度氧化劑與其在復(fù)性反應(yīng)中還原生成的還原型產(chǎn)物，形成了氧化還原對(duì)，因而促進(jìn)了 toase A的復(fù)性。而該實(shí)驗(yàn)室的氧化復(fù)性研究工作主要都是以DTTraVDTT 二者共同加入復(fù)性溶液，觀察復(fù)性過(guò)程[Rottwarf DM, Scheraga HA. Regenerationof bovine pancreatic ribonuclease Α. 2. Kinetics of regeneration. Biochemistry. 1993 ；32 :2680-9.Rothwarf DM, Li YJ, Scheraga HA.Regeneration of bovinepancreatic ribonuclease A :detailed kinetic analysis of two independent foldingpathways. Biochemistry. 1998 ；37 :3767-76.]。還原型小分子，被認(rèn)為是消除錯(cuò)配二硫鍵，促進(jìn)二硫鍵改組的關(guān)鍵因素。只有在偏堿性溶液中，氧化還原對(duì)才能促進(jìn)氧化復(fù)性。研究者很早就觀察到， 在PH低于7. 5時(shí)，即使含有合適比例的氧化還原對(duì)，還原變性foiase A的復(fù)性產(chǎn)物與在 PH 高于 8 時(shí)相比，僅有極低的活性[Ahmed AK, Schaffer Sff, Wetlaufer DB. Nonenzymic reactivation of reduced bovine pancreatic ribonucleaseby air oxidation and by glutathione oxidoreduction buffers. J Biol Chem. 1975 ;250 :8477-82.]。只有在偏堿性溶液中，還原型小分子才具有充分的離子化形態(tài)和還原能力，從而促進(jìn)錯(cuò)配二硫鍵的斷裂和二硫鍵改組。除采用經(jīng)典的稀釋法和透析法對(duì)變性蛋白進(jìn)行復(fù)性外，近年來(lái)色譜復(fù)性在實(shí)驗(yàn)研究和工業(yè)生產(chǎn)上的可行性也得到更多的重視[Li M，Su ZG, Janson JC. Invitro protein refolding by chromatographic procedures. Protein Expression andPurification 2004;33:1-10]。色譜復(fù)性，或稱基質(zhì)輔助復(fù)性，可以在多種色譜基質(zhì)上實(shí)現(xiàn)。但各種色譜基質(zhì)是否有直接的促進(jìn)蛋白復(fù)性作用，還沒(méi)有相關(guān)的直接證據(jù)[Jimgbauer A，Kaar W, Schlegl R. Folding and refolding of proteins inchromatographic beds. Curr Opin Biotechnol. 2004 ；15 :487-94.]。研究顯示，在凝膠過(guò)濾色譜輔助的變性蛋白復(fù)性中，變性劑與蛋白的分離過(guò)程，以及加入的復(fù)性添加劑才是其復(fù)性的主要因素，而凝膠基質(zhì)本身對(duì) SS^^i/fftMft^Wfiniii] [Lanckriet H,Middelberg ΑΡ. Continuous chromatographic protein refolding. JChromatogr A. 2004 ；1022 :103-13.]。在模式蛋白 RNase A 復(fù)性研究 [黃亞渝，童衛(wèi)，郭立安.RNase等10種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在高效疏水作用色譜上的復(fù)性.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)2005，26 :682-4 ；黃亞渝，童衛(wèi)，郭立安，耿信篤.還原變性核糖核酸酶的高效液相色譜復(fù)性.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)2005，26 =1423-6]中，色譜復(fù)性對(duì)變性和還原變性的RNase A具有極高的復(fù)性效率，而復(fù)性前于變性液中加入氧化還原對(duì)的比例，對(duì)其色譜復(fù)性效率影響很大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了將活性狀態(tài)下含二硫鍵的蛋白，由變性狀態(tài)轉(zhuǎn)化為活性狀態(tài)，從而獲得生物活性蛋白產(chǎn)品的方法。該方法中，含有變性蛋白、或/和其結(jié)構(gòu)中間體的蛋白樣品溶液，在適當(dāng)?shù)臈l件下流經(jīng)過(guò)或吸附于色譜基質(zhì)上，使溶液中的變性劑和其它雜質(zhì)與蛋白分子分離。在基質(zhì)的輔助下，變性蛋白、或/和其結(jié)構(gòu)中間體可以迅速形成近天然結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定中間體形態(tài)。該穩(wěn)定中間體只需要單獨(dú)采用氧化劑處理，在廣泛的反應(yīng)條件下，促進(jìn)蛋白分子內(nèi)正確二硫鍵的形成。本發(fā)明中，“變性狀態(tài)”或“變性蛋白”，是指目標(biāo)蛋白處于無(wú)生物活性的狀態(tài)，通常是來(lái)源于重組表達(dá)的蛋白產(chǎn)物，經(jīng)溶解包涵體等步驟獲得。該蛋白特指活性狀態(tài)下含二硫鍵的蛋白，其二硫鍵數(shù)目為1個(gè)或以上。這種變性蛋白通常經(jīng)過(guò)還原劑處理，以解除蛋白分子內(nèi)或分子間的非正常二硫鍵連接；蛋白分子內(nèi)正確的二硫鍵通常也被完全破壞?！爸虚g體狀態(tài)”或“中間體”，是指目標(biāo)蛋白經(jīng)由變性狀態(tài)，達(dá)到具有完全生物活性的天然狀態(tài)的過(guò)程中，形成的一些中間結(jié)構(gòu)狀態(tài)，它們可能沒(méi)有生物活性或只具有部分生物活性，容易聚集形成沉淀形式。從重組表達(dá)的蛋白產(chǎn)物或其它來(lái)源的目的蛋白，溶解制備成還原變性的蛋白樣品，是一個(gè)本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所公知的技術(shù)。盡管蛋白還原變性過(guò)程通常需要高濃度變性劑和還原劑，其它可獲得還原變性而能促進(jìn)復(fù)性的溫和變性方法[Singh SM, Panda AK. Solubilization and refolding of bacterial inclusion bodyproteins. J Biosci Bioeng. 2005 ；99 :303-10]也可以采用。其它裂解二硫鍵的方法(如氧化裂解法)處理的樣品，經(jīng)過(guò)適當(dāng)轉(zhuǎn)化，也可以應(yīng)用于本發(fā)明中。將變性蛋白、或/和其結(jié)構(gòu)中間體蛋白樣品，流經(jīng)過(guò)或吸附于色譜基質(zhì)的方法很多，并常規(guī)應(yīng)用于蛋白色譜純化中，也是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所公知的技術(shù)。本發(fā)明不限定所采用的基質(zhì)類(lèi)型，如凝膠過(guò)濾色譜基質(zhì)，離子交換基質(zhì)，其它吸附性色譜基質(zhì)或親和色譜基質(zhì)等。該過(guò)程可以通過(guò)傳統(tǒng)的色譜柱上樣方式實(shí)現(xiàn)，也可以通過(guò)色譜基質(zhì)的批次操作來(lái)實(shí)現(xiàn)， 或通過(guò)其它可能的方式實(shí)現(xiàn)。變性劑和其它雜質(zhì)與目的蛋白分子分離的過(guò)程，依據(jù)采用的色譜基質(zhì)類(lèi)型不同， 可以經(jīng)由普通緩沖液驅(qū)動(dòng)的基質(zhì)內(nèi)自然分離實(shí)現(xiàn)，或緩沖液的反復(fù)清洗實(shí)現(xiàn)。該緩沖液的成分和條件沒(méi)有具體限定，僅需不影響色譜基質(zhì)對(duì)目的蛋白的吸附和分離為指標(biāo)，這可根據(jù)蛋白本身的特征和基質(zhì)所屬類(lèi)型的特征而定。流經(jīng)過(guò)或吸附于色譜基質(zhì)上的目的蛋白，在去除變性劑和其它雜質(zhì)后，在普通緩沖液中迅速轉(zhuǎn)化成具有接近天然結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定中間體形態(tài)。通?？梢栽谕耆コ冃詣┖推渌s質(zhì)后進(jìn)行氧化折疊反應(yīng)；如果殘留的部分變性劑和其它雜質(zhì)對(duì)變性蛋白向穩(wěn)定中間體的轉(zhuǎn)化影響不大，也可在殘留有部分變性劑和其它雜質(zhì)的情況下進(jìn)行氧化折疊反應(yīng)。氧化折疊反應(yīng)通常是在目的蛋白吸附于色譜基質(zhì)上時(shí)，加入含有小分子氧化劑的折疊緩沖液來(lái)實(shí)現(xiàn)的。該緩沖液可以是前述的普通緩沖液，或是含有其它額外成分的普通緩沖液。 所述的小分子氧化劑，包括但不限于氧化型谷胱苷肽GSSG、氧化型DTT(DTTm)和胱氨酸 cysteamine.這些小分子氧化劑的濃度，主要依賴于氧化劑本身的特性而定，如對(duì)于氧化型谷胱苷肽，濃度可選為(不限于)0. 01 10mM，或優(yōu)選為0. 1 3mM，或再優(yōu)選為0. 5 ImM ；對(duì)于氧化型DTT，濃度可選為(不限于)1 200mM，或優(yōu)選為10 IOOmM,或再優(yōu)選為 20 50mM。這些小分子氧化劑的濃度，也與目的蛋白的濃度、所含游離巰基含量等有關(guān)，可進(jìn)一步優(yōu)化。在折疊緩沖液中加入的其它額外成分，可以是阻止聚集的化學(xué)成分如精氨酸、 低濃度變性劑、聚乙二醇等，或是促進(jìn)折疊的伴侶分子、蛋白氧化還原酶以及一些蛋白異構(gòu)酶等。折疊緩沖液中加入還原劑，如果不明顯影響小分子氧化劑的氧化折疊效果，也涵蓋在本發(fā)明所包含的范圍內(nèi)。折疊緩沖液的PH，可以是中性或偏酸性，而不僅是偏堿性。氧化折疊反應(yīng)進(jìn)行的時(shí)間，依賴于不同蛋白使用不同小分子氧化劑獲得復(fù)性的程度，可以是數(shù)分鐘、數(shù)小數(shù)甚至數(shù)天。氧化折疊反應(yīng)結(jié)束后可按標(biāo)準(zhǔn)的色譜層析方法洗脫活性蛋白，進(jìn)行后續(xù)處理。氧化折疊反應(yīng)除可按上述色譜基質(zhì)吸附狀態(tài)進(jìn)行外，也可在從基質(zhì)上洗脫下來(lái)的溶液中進(jìn)行。變性蛋白在基質(zhì)輔助下形成的穩(wěn)定中間體，經(jīng)洗脫后，在溶液中更不穩(wěn)定，但仍能維持近天然的空間結(jié)構(gòu)，有時(shí)更易被小分子氧化劑氧化生成正確的分子內(nèi)二硫鍵連接。溶液中進(jìn)行氧化折疊反應(yīng)的條件與上述色譜基質(zhì)吸附狀態(tài)進(jìn)行反應(yīng)相似，即僅需要小分子氧化劑，在折疊緩沖液的PH是中性或偏酸性，而不僅是偏堿性的條件下完成。對(duì)于一些氧化折疊難度較大的蛋白，也可以采用色譜基質(zhì)吸附下氧化折疊，和洗脫后溶液中氧化折疊聯(lián)合的方法，促進(jìn)活性蛋白的生成。數(shù)輪的色譜基質(zhì)吸附下氧化折疊和洗脫后溶液中氧化折疊過(guò)程，也是促進(jìn)蛋白復(fù)性的一個(gè)選項(xiàng)。對(duì)一些氧化折疊后可能產(chǎn)生分子內(nèi)二硫鍵錯(cuò)配的不穩(wěn)定蛋白，可以在氧化劑處理后，繼以低濃度還原劑短時(shí)還原的處理，選擇性地?cái)嗔彦e(cuò)配二硫鍵；再進(jìn)入下一輪氧化折疊。總的來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供的方法有以下一些優(yōu)點(diǎn)能夠使目的蛋白在高濃度狀態(tài)下獲得復(fù)性；獲得目的蛋白復(fù)性的同時(shí)可能獲得蛋白的純化；在更廣泛的復(fù)性條件如PH下復(fù)性，便于生產(chǎn)操作；復(fù)性添加物成分簡(jiǎn)單，僅需小分子氧化劑作用即可產(chǎn)生明顯的復(fù)性效果，可顯著降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明提供的方法，可以在小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室操作，也可以在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用。 目的蛋白的處理能力可以從數(shù)毫克直到公斤級(jí)水平。


圖l.RNase A (a)與R3R5 (b)的質(zhì)譜測(cè)定(1)及其與還原變性蛋白經(jīng)AEMTS烷化后質(zhì)譜測(cè)定O)的比較。還原變性RNase A烷化產(chǎn)物除有含8個(gè)巰基標(biāo)記產(chǎn)物外，還存在含7個(gè)巰基標(biāo)記和6個(gè)巰基標(biāo)記的產(chǎn)物。還原變性R3R5烷化產(chǎn)物僅有含6個(gè)標(biāo)記巰基的
唯一產(chǎn)物。圖2.還原變性RNase A吸附于S^hadex-SP基質(zhì)，去除變性還原劑，在基質(zhì)上 (1)，及在洗脫液中(2)經(jīng)AEMTS烷化，與天然RNase A質(zhì)譜圖(3)的比較?；|(zhì)上RNase A的游離巰基不能烷化，而洗脫液中RNase A的游離巰基能充分烷化。圖3.還原變性R3R5 吸附于S^hadex-SP基質(zhì)，去除變性還原劑，在基質(zhì)上(1)，及在洗脫液中(2)經(jīng)AEMTS烷化，與未烷化R3R5質(zhì)譜圖C3)的比較?；|(zhì)上和洗脫液中R3R5的游離巰基均能充分烷化。圖4.還原變性RNase A吸附于kphadex-SP基質(zhì)，去除變性還原劑，在基質(zhì)上 (左)，及在洗脫液中(右)經(jīng)空氣氧化(a)、氧化型GSSG (b)或氧化型DTT(C)氧化，于不同時(shí)間(小時(shí))洗脫后烷化，質(zhì)譜測(cè)定分子內(nèi)二硫鍵形成時(shí)程的變化。在PH 7.0時(shí)，ImM氧化型GSSG可使二硫鍵快速形成，洗脫溶液中RNase A的氧化速度快于基質(zhì)吸附RNase A ；50mM 氧化型DTT可使二硫鍵快速形成，基質(zhì)吸附RNase A的氧化速度快于洗脫溶液中RNase A。圖5.還原變性RNase A經(jīng)圖4所示的氧化處理，復(fù)性樣品在各時(shí)間點(diǎn)的活性測(cè)定。在pH 7.0情況下，50mM氧化型DTT可使基質(zhì)吸附RNase A氧化產(chǎn)物的活性快速恢復(fù)， ImM氧化型GSSG也使基質(zhì)吸附RNase A氧化產(chǎn)物的活性較快恢復(fù)。
圖6.去除變性還原劑的還原變性RNase A在基質(zhì)上(a，b)，及在洗脫液中(c， d)經(jīng)氧化型DTT完全(a，c)或部分(b，d)氧化，蛋白在洗脫液中經(jīng)5mM還原型DTT作用 5min(l)，或不經(jīng)還原型DTT作用O)，再用AEMTS烷化。質(zhì)譜測(cè)定二硫鍵的還原狀態(tài)?；|(zhì)上及在洗脫液中的氧化復(fù)性蛋白經(jīng)脈沖還原未生成更多的還原產(chǎn)物。圖7.去除變性還原劑的還原變性RNase A在基質(zhì)上經(jīng)氧化型DTT處理(a)或氧化型DTT合并AEMTS處理(b)，在不同時(shí)間將蛋白在洗脫液中用AEMTS烷化，質(zhì)譜測(cè)定分子內(nèi)二硫鍵形成時(shí)程的變化。在AEMTS并存時(shí)，氧化型DTT促進(jìn)二硫鍵形成的作用進(jìn)一步加強(qiáng)。圖8.去除變性還原劑的還原變性RNase A在基質(zhì)上經(jīng)氧化型DTT合并AEMTS處理后，蛋白在洗脫液中經(jīng)5mM還原型DTT作用5min(l)，或不經(jīng)還原型DTT作用(2)，再用 AEMTS烷化。質(zhì)譜測(cè)定二硫鍵的還原狀態(tài)。基質(zhì)上由氧化型DTT合并AEMTS處理的氧化復(fù)性蛋白經(jīng)脈沖還原未生成更多的還原產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例的陳述是為更好地理解本發(fā)明的原理和應(yīng)用，而不限定本發(fā)明的使用范圍。材料與方法1.蛋白樣品牛胰RNase A購(gòu)自北京沁源惠幟生物技術(shù)有限公司；電泳和質(zhì)譜分析符合其理論分子量(13689. 33)。編碼人胰RNase I的cDNA通過(guò)PCR反應(yīng)，從人胰腺癌細(xì)胞PANC-I的總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中擴(kuò)增獲得。該基因編碼1 個(gè)氨基酸殘基的成熟人胰 RNase I蛋白。以該基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增編碼S肽(1_15氨基酸序列)和S蛋白 (21-1 氨基酸序列)的基因片斷。通過(guò)酶切連接生成編碼S蛋白C-末端融合S肽的變異基因。將該基因克隆入原核表達(dá)載體pQE80L(Qiagen公司產(chǎn)品)中，經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)，可生成帶有組氨酸標(biāo)簽的S蛋白C-末端融合S肽、具有重排結(jié)構(gòu)(circular permutation)的人RNase I。該重組蛋白，命名為R3R5，以包涵體形式存在，電泳和質(zhì)譜分析符合其理論分子量(172 . 3 。重排結(jié)構(gòu)的核糖核酸酶的活性極低[Plainkum P, FuchsSM, Wiyakrutta S, Raines RT. Creation of a zymogen. Nat Struct Biol. 2003 ；10 (2) :115-9.];結(jié)構(gòu)重排也常常導(dǎo)致蛋白的穩(wěn)定性下降甚至高級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞[Beernink PT, Yang YR, Graf R, King DS, Shah SS, Schachman HK. Randomcircular permutation leading to chain disruption within and near alpha helices in thecatalytic chains of aspartate transcarbamoylase :effects on assembly,stability,andfunction. Protein Sci.2001 ； 10(3) :528-37.]2.蛋白的還原變性RNase A或R3R5，在含有8M尿素和40mM DTT的磷酸緩沖液 (20mM, pH 6. 5)中室溫處理過(guò)夜。3.蛋白的烷化烷化劑甲基硫代磺酸-2-氨基乙酯氫溴酸鹽(MethylAminoet hanethiolsulfonate Hydrobromide, AEMTS)按文獻(xiàn)[Bruice Tff and KenyonGL. Novel alkyl alkanethiolsulfonate sulfhydryl reagents. Modification of derivativesof L-cysteine. J Protein Chem. 1982 ； 1,47-58]方法合成。蛋白處理完成后，AEMTS加入反應(yīng)緩沖液，室溫反應(yīng)lOmin，加入醋酸使反應(yīng)液pH小于5以終止反應(yīng)。
4.質(zhì)譜分析取5uL蛋白樣品經(jīng)過(guò)kphadex G_10離心柱脫鹽，得到的樣品與質(zhì)譜基質(zhì)CHCA 1 1混合點(diǎn)樣。經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS) (MALDI-T0F/T0F Analyzer 4800 plus, Applied Biosystem)對(duì)樣品蛋白進(jìn)行定性和定量分析。5.蛋白的脈沖還原含二硫鍵的蛋白待測(cè)樣品中加入還原型DTT至終濃度5mM作用5min ；加入烷化劑烷化后質(zhì)譜檢測(cè)。低濃度還原劑的短時(shí)作用，只能還原不被穩(wěn)定立體結(jié)構(gòu)保護(hù)的二硫鍵，即含有錯(cuò)配二硫鍵的不穩(wěn)定中間體，而不對(duì)天然或近天然結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定中間體產(chǎn)生影響。[Narayan M, Welker E, Zhai H, Han X，Xu G, McLafferty Fff, Scheraga HA. Detecting native folds in mixtures ofproteins that contain disulfide bonds. Nat Biotechnol. 2008 ；26 (4) :427-9.]6.核糖核酸酶活性測(cè)定核糖核酸酶的活性測(cè)定參考文獻(xiàn)[Umansky SR, Piker EG, Adler W. Ribonuclease activity of rat thymus chromatin proteins. Experientia. 1974 Jul 15 ；30 (7) :734-6.]的 TCA沉淀法，以 25mM Tris-HCl (pH 8. 0), ImM EDTA，0. 01% BSA為緩沖液，適量的核糖核酸酶以及8 μ g酵母rRNA，37°C室溫反應(yīng)15min， 放置冰上，加入等體積預(yù)冷的10% TCA，冰上放置15min。4°C 12000rpm離心lOmin，取上清，0D280檢測(cè)光密度值。結(jié)果1. AEMTS烷化是含游離巰基蛋白空間結(jié)構(gòu)測(cè)定的有效技術(shù)蛋白分子中游離巰基的烷化反應(yīng)性，可反映游離巰基在蛋白分子空間結(jié)構(gòu)的包埋狀態(tài)，是蛋白空間結(jié)構(gòu)及其變化的客觀指標(biāo)[Apuy幾，Park ZY, Swartz PD, Dangott LJ, Russell DH, Baldwin TO. Pulsed-alkylation mass spectrometry for thestudy of protein folding and dynamics !development and application to the study of afolding/unfolding intermediate of bacterial luciferase. Biochemistry. 2001 ；40 15153-63.]。AEMTS是比常用的烷化劑活性更高的巰基特異性烷化劑，能夠與蛋白分子中的游離巰基迅速反應(yīng)。蛋白分子被AEMTS烷化后，其分子量會(huì)增加；每標(biāo)記一個(gè)巰基，分子量增加76;因此，由蛋白分子量增加數(shù)目，可以準(zhǔn)確計(jì)算出被標(biāo)記的巰基數(shù)目。這是研究蛋白氧化折疊的最常用方法之一 [Iwaoka M, JuminagaD, Scheraga HA. Regeneration of three-disulfide mutants of bovine pancreaticribonuclease A missing the 65-72 disulfide bondcharacterization of a minor foldingpathway of ribonuclease A and kinetic roles of Cys65 and Cys72. Biochemistry. 1998 ；37 :4490-501.]。RNase A用8M尿素和5mM DTT充分還原變性后，在尿素中直接用100倍(巰基)過(guò)量的AEMTS烷化，質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，烷化產(chǎn)物除有含8個(gè)巰基標(biāo)記產(chǎn)物外，還存在含 7個(gè)巰基標(biāo)記和6個(gè)巰基標(biāo)記的產(chǎn)物。而R3R5還原變性后，在尿素中用過(guò)量的AEMTS烷化，僅有含6個(gè)標(biāo)記巰基的唯一產(chǎn)物(圖1)。改變還原變性條件和烷化條件，產(chǎn)物的質(zhì)譜分析結(jié)果沒(méi)有改變。該結(jié)果說(shuō)明，即使在還原變性的條件下，RNase A和R3R5仍然存在一定的空間結(jié)構(gòu)，使個(gè)別游離巰基在蛋白分子空間結(jié)構(gòu)中處于包埋狀態(tài)，不易被烷化標(biāo)記，與文獻(xiàn)[ffedemeyer WJ, Welker E, Narayan Μ, Scheraga HA. Disulfide Bonds and ProteinFolding. Biochemistry, 2000 ；39,4207-4216]結(jié)論一致。而 RNase A 標(biāo)記產(chǎn)物的差異應(yīng)該不是由于變性還原不充分，或質(zhì)譜檢測(cè)中AEMTS從蛋白分子上脫落所致。該結(jié)果也提示，AEMTS烷化方法可能象其它常用的烷化劑一樣，用于測(cè)定含游離巰基蛋白的空間結(jié)構(gòu)。結(jié)果也說(shuō)明，具有重排結(jié)構(gòu)的R3R5，盡管其含有二硫鍵連接結(jié)構(gòu)的S蛋白序列與RNaseA 高度一致，但還原變性后的空間結(jié)構(gòu)有巨大差異。2.基質(zhì)吸附促進(jìn)蛋白中間體的穩(wěn)定性4mg/mL RNase A經(jīng)8M尿素和40mM DTT (20mM pH 6.5磷酸緩沖液)中還原變性過(guò)夜，與經(jīng)pH 6. 5的8M尿素平衡的S^hadex-SP離子交換色譜基質(zhì)結(jié)合。20mM pH 6. 5磷酸緩沖液洗去尿素及未結(jié)合蛋白，重懸基質(zhì)于20mMpH 7.0磷酸緩沖液中或用加入NaCl至 IOOmM洗脫蛋白。基質(zhì)溶液或洗脫溶液中加入AEMTS至終濃度40mM進(jìn)行烷化lOmin。終止反應(yīng)后，質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，吸附于基質(zhì)的還原型RNase A完全不被AEMTS烷化，而洗脫溶液中的RNase A可被AEMTS烷化(圖2)。R3R5按相同方法處理和烷化，質(zhì)譜分析顯示，吸附于基質(zhì)的還原型R3R5與洗脫溶液中的R3R5均可被AEMTS同等烷化(圖幻。該結(jié)果說(shuō)明，還原變性的RNase A吸附于色譜基質(zhì)上，在普通緩沖液中形成的空間結(jié)構(gòu)，使全部游離巰基在蛋白分子空間結(jié)構(gòu)中處于包埋狀態(tài)，不易被烷化標(biāo)記；而具有該結(jié)構(gòu)的蛋白分子脫離色譜基質(zhì)后，其空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性明顯下降，游離巰基易于暴露而被烷化標(biāo)記；實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明， 這種基質(zhì)輔助的蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性是由蛋白分子自身的特性決定的。3.蛋白中間體直接氧化生成正確二硫鍵和蛋白復(fù)性吸附于基質(zhì)的還原型RNase A和洗脫溶液中的RNase A，可經(jīng)空氣自然氧化，隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸形成二硫鍵。通常吸附于基質(zhì)的還原型RNase A在空氣中的氧化速度較洗脫溶液中的RNase A快(圖4)?；|(zhì)吸附RNase A在空氣中的氧化產(chǎn)物的活性恢復(fù)也稍快(圖 5)，但活性的恢復(fù)速度低于完全二硫鍵形成的速度?；|(zhì)溶液或洗脫溶液中單純加入氧化型DTT，在pH 7. O情況下，50mM氧化型DTT可使二硫鍵快速形成(圖4)，氧化產(chǎn)物的活性也較快恢復(fù)，而基質(zhì)吸附RNase A的活性恢復(fù)明顯快于洗脫溶液中RNase A (圖5)。如單純加入氧化型GSSG，在pH 7. O情況下，ImM氧化型GSSG可使二硫鍵快速形成，洗脫溶液中RNase A的完全氧化速度快于基質(zhì)吸附RNase A (圖4)；但基質(zhì)吸附RNase A的活性恢復(fù)明顯快于洗脫溶液中RNase A(圖幻。形成完全二硫鍵的復(fù)性產(chǎn)物經(jīng)DTT脈沖還原，無(wú)明顯還原產(chǎn)物的增加(圖6)，說(shuō)明該產(chǎn)物是含有正確二硫鍵連接的天然或近天然結(jié)構(gòu)的蛋白分子。4.基質(zhì)吸附蛋白中間體的氧化復(fù)性不依賴于還原劑的存在還原型RNase A吸附于基質(zhì)的溶液中，同時(shí)加入氧化型DTT和烷化劑AEMTS。AEMTS 可迅速與蛋白氧化時(shí)生成的還原型DTT反應(yīng)，從而抑制所生成的還原型DTT對(duì)蛋白氧化復(fù)性過(guò)程的影響。在PH 7.0和50mM氧化型DTT的作用下，二硫鍵形成速度比只加入氧化型 DTT而不加入烷化劑AEMTS的復(fù)性蛋白更快(圖7)。該復(fù)性產(chǎn)物經(jīng)DTT脈沖還原，無(wú)明顯還原產(chǎn)物的增加(圖8)。說(shuō)明該產(chǎn)物是含有正確二硫鍵連接的天然結(jié)構(gòu)或近天然結(jié)構(gòu)的蛋白分子；而基質(zhì)輔助氧化復(fù)性時(shí)，由氧化型小分子生成的還原型小分子，對(duì)分子內(nèi)二硫鍵的正確形成至少?zèng)]有促進(jìn)作用。
權(quán)利要求
1.一個(gè)生產(chǎn)活性蛋白的工藝流程，包括將變性蛋白與色譜基質(zhì)接觸和/或吸附，完全或部分去除變性劑和/或其它雜質(zhì)，使變性蛋白迅速形成近天然結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定中間體形態(tài)， 采用氧化劑處理，促進(jìn)蛋白分子內(nèi)正確二硫鍵的形成，獲得活性產(chǎn)物。
2.權(quán)利要求1所述的活性蛋白，特征在于該蛋白在活性狀態(tài)下，含有1個(gè)或以上的分子內(nèi)二硫鍵。
3.權(quán)利要求1所述的變性蛋白，特征在于該蛋白可先經(jīng)還原處理，基本去除了分子內(nèi)二硫鍵的錯(cuò)誤連接。
4.權(quán)利要求1所述的色譜基質(zhì)，特征在于在合適的條件下，該基質(zhì)能夠與變性蛋白接觸和/或吸附；并在合適的條件下，能夠使目的蛋白與變性溶液中的變性劑和/或其它雜質(zhì)分離或部分分離；且在合適的條件下，能夠使復(fù)性的目的蛋白脫離該基質(zhì)。
5.權(quán)利要求1所述的氧化劑，特征在于能夠氧化蛋白分子的游離巰基，并促進(jìn)二硫鍵的形成。
6.權(quán)利要求5所述的氧化劑，是氧化型DTT(DTTox)。
7.權(quán)利要求5所述的氧化劑，是氧化型谷胱苷肽GSSG。
8.權(quán)利要求5所述的氧化劑，是胱氨酸cysteamine。
9.權(quán)利要求1所述的氧化劑處理，是在形成的穩(wěn)定中間體與基質(zhì)接觸和/或吸附狀態(tài)下進(jìn)行。
10.權(quán)利要求1所述的氧化劑處理，是在形成的穩(wěn)定中間體脫離基質(zhì)后的溶液內(nèi)進(jìn)行。
11.權(quán)利要求1所述的氧化劑處理，是在偏酸性、中性或偏堿性環(huán)境中進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了將活性狀態(tài)下含二硫鍵的蛋白，由還原變性狀態(tài)轉(zhuǎn)化為活性狀態(tài)，從而獲得生物活性蛋白產(chǎn)品的方法。該方法通過(guò)色譜基質(zhì)與變性蛋白的接觸和/或吸附，在變性劑和其它雜質(zhì)與蛋白分子分離后，使變性蛋白、或/和其結(jié)構(gòu)中間體迅速形成近天然結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定中間體形態(tài)；該穩(wěn)定中間體只需要單獨(dú)采用氧化劑處理，在廣泛的反應(yīng)條件下，促進(jìn)蛋白分子內(nèi)正確二硫鍵的形成，獲得活性產(chǎn)物。
文檔編號(hào)C07K1/00GK102199187SQ20101013207
公開(kāi)日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2010年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月25日
發(fā)明者呂春婉, 王楠, 蘆娜 申請(qǐng)人:威志蘭斯醫(yī)學(xué)科技(北京)有限公司