專利名稱：凍干蛋白質(zhì)復(fù)性法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)復(fù)性方法，應(yīng)用于生物蛋白質(zhì)工程，尤其是細(xì)菌包 涵體蛋白工程，分子生物學(xué)下游研究，基岡工程和蛋白質(zhì)技術(shù)研究，生物制藥 等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
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蛋白質(zhì)復(fù)性是生物領(lǐng)域居于核心的中心法則中由無活性肽鏈一級(jí)結(jié)構(gòu)向有 活性的蛋白質(zhì)三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)演變的質(zhì)變過程，無論理論和實(shí)踐意義均極其重 大。隨著分子生物學(xué)和基因工程蛋白質(zhì)技術(shù)的迅猛發(fā)展，越來越多地通過蛋白 質(zhì)的異源表達(dá)為臨床，科研和工業(yè)生產(chǎn)提供一些蛋白質(zhì)多肽產(chǎn)品。迄今為止， 細(xì)菌以其易于操作、遺傳背景清楚、發(fā)酵成本低和蛋白表達(dá)水平高等優(yōu)點(diǎn)，成 為牛產(chǎn)重組蛋白的首選表達(dá)系統(tǒng)，尤其適合表達(dá)不經(jīng)過蛋白質(zhì)翻譯后修飾(如 糖基化)就具有生物活性的基因工程蛋白。但是80%以上細(xì)菌中表達(dá)的蛋白質(zhì) 通常以包涵體的形式沉積于細(xì)胞內(nèi)，表現(xiàn)為無活性的不溶性聚集物，如何高效 成功地復(fù)性蛋白是基因工程蛋白質(zhì)生產(chǎn)過程中最關(guān)鍵和最困難的一步，己成為 科研和生物制藥產(chǎn)業(yè)化工作的瓶頸步驟。
目前的蛋白復(fù)性，主要有三種方式稀釋，層析，透析。這三種的從本質(zhì) 角度講都是一樣的，即利用蛋白質(zhì)的活性狀態(tài)是蛋白結(jié)構(gòu)分子能級(jí)最低這個(gè)原 理，平緩的降低變性鹽的濃度，進(jìn)而引起肽鏈自身內(nèi)部的結(jié)構(gòu)自動(dòng)重排，達(dá)到 復(fù)性的目的。但是由于分子熱運(yùn)動(dòng)，肽鏈的聚集幾乎無法避免，而一旦聚集沉 淀，復(fù)性即宣告失敗。層析法的要求高，柱料相對(duì)昂貴，通量低，條件較為苛 刻，還有柱料選擇也是較復(fù)雜的問題。透析的方法雖然可以獲得較高的產(chǎn)物濃
度，但是容易產(chǎn)生沉淀。稀釋法是目前科研應(yīng)用最多的，就是用復(fù)性液逐漸稀 釋的方法。現(xiàn)在的優(yōu)化多半是改變兌進(jìn)去的復(fù)性液的配方，來提高復(fù)性率，但 是無法避免的是樣品的過度稀釋。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是提供一種簡(jiǎn)單易行，低成本，無污染，高效率的蛋白質(zhì)復(fù) 性方法。解決生物中心法則的瓶頸問題。
凍干蛋白復(fù)性法是基于溶液凍結(jié)過程中，溶質(zhì)自然與溶劑分離的自然現(xiàn)象。溶液中溶質(zhì)鹽的溶解度會(huì)受到溫度的影響，由于變性鹽(尿素，鹽酸胍等)在 低溫下溶解度下降逐漸結(jié)晶析出脫離溶液，同時(shí)做到了減低分子熱運(yùn)動(dòng)和減低 溶液變性鹽濃度這兩個(gè)至關(guān)重要的變性因素。結(jié)晶的速度可以通過溫度的下降 速度來進(jìn)行控制，從而營(yíng)造了一個(gè)蛋白復(fù)性的絕好的條件一即低溫，和平滑的
變性鹽濃度下降梯度。同時(shí)也可在復(fù)性液中輔助以一定濃度的防凍劑(DMSO, 海藻糖，葡萄糖等)和復(fù)性促迸劑(環(huán)糊精，甘氨酸，分子伴侶等)，氧化還原 劑，緩沖鹽等，用于防止凍結(jié)對(duì)蛋白質(zhì)活性的損傷，提高復(fù)性率。當(dāng)凍結(jié)完成 后經(jīng)冷凍干燥機(jī)干燥，獲得的固體顆粒。顆粒物利用變性鹽結(jié)晶比重、結(jié)晶形 態(tài)與蛋白質(zhì)干粉不同的區(qū)別適度振碎后采用風(fēng)選、過篩、靜電吸附等方法分離 獲得目的蛋白。


如圖所示僅只是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)際應(yīng)用的過程示意。 步驟1是蛋白或包涵體等的變性溶解獲得原液的過程。
步驟2是步驟1所得原液按照優(yōu)化程序凍結(jié)的過程。
步驟3是凍結(jié)的原液在冷凍干燥機(jī)中凍干的過程。
步驟4是采用高壓靜電吸附分離蛋白質(zhì)干粉和變性鹽的過程。
具體實(shí)施例方式
結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。步驟1依照優(yōu)化的生物操作配方用 艦鹽酸胍或者8M尿素等試劑溶解目的蛋白。步驟2需要針對(duì)不同蛋白對(duì)溫度下 降速率，溶液劑量進(jìn)行相應(yīng)優(yōu)化，找到合適的凍結(jié)方式。步驟3在凍干真空干 燥機(jī)中升華掉水份等。歩驟4適度振碎凍干后獲得的固體顆粒成分，用高壓靜 電吸附方式分離出活性蛋白粉來。
權(quán)利要求
1、一種進(jìn)行蛋白質(zhì)或包涵體蛋白復(fù)性的方法，其特征是蛋白質(zhì)變性原液降溫凍結(jié)復(fù)性過程。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)或包涵體蛋白復(fù)性方法，其特征是需要凍結(jié) 的蛋白質(zhì)變性原液中可加有防凍保護(hù)劑、氧化還原劑、分子伴侶等輔助復(fù) 性成分。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1、 2所述的蛋白質(zhì)或包涵體蛋白復(fù)性方法，其特征是凍結(jié) 后的蛋白質(zhì)變性原液在冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥，脫除水份等物質(zhì)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l、 2、 3所述的蛋白質(zhì)或包涵體蛋白復(fù)性方法，其特征是凍 干后所得固型顆粒物適度振碎后經(jīng)風(fēng)選、過篩、高壓靜電吸附等方法分離 獲得目的蛋白質(zhì)干粉。
全文摘要
凍干蛋白復(fù)性法是基于溶液凍結(jié)過程中，溶質(zhì)自然與溶劑分離的自然現(xiàn)象。溶液中溶質(zhì)鹽的溶解度會(huì)受到溫度的影響，由于變性鹽(尿素，鹽酸胍等)在低溫下溶解度下降逐漸結(jié)晶析出脫離溶液，同時(shí)做到了減低分子熱運(yùn)動(dòng)和減低溶液變性鹽濃度這兩個(gè)至關(guān)重要的變性因素。結(jié)晶的速度可以通過溫度的下降速度來進(jìn)行控制，從而營(yíng)造了一個(gè)蛋白復(fù)性的絕好的條件-即低溫，和平滑的變性鹽濃度下降梯度。同時(shí)也可在復(fù)性液中輔助以一定濃度的防凍劑(DMSO，海藻糖，葡萄糖等)和復(fù)性促進(jìn)劑(環(huán)糊精，甘氨酸，分子伴侶等)，氧化還原劑，緩沖鹽等，用于防止凍結(jié)對(duì)蛋白質(zhì)活性的損傷，提高復(fù)性率。當(dāng)凍結(jié)完成后經(jīng)冷凍干燥機(jī)干燥，獲得的固體顆粒。顆粒物利用變性鹽結(jié)晶比重、結(jié)晶形態(tài)與蛋白質(zhì)干粉不同的區(qū)別適度振碎后采用風(fēng)選、過篩、靜電吸附等方法分離獲得目的蛋白。
文檔編號(hào)C07K1/00GK101565448SQ20081001580
公開日2009年10月28日 申請(qǐng)日期2008年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月21日
發(fā)明者鵬 張, 張志濱 申請(qǐng)人:鵬 張