專利名稱：重組生產(chǎn)多肽的改進方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過在升高的溫度下后溫育宿主細胞通過內(nèi)含體的形式在原核生物中重組生產(chǎn)多肽的改進方法。
背景技術(shù)：
在原核生物中，蛋白合成，也指翻譯，是在細胞質(zhì)中的核糖體上進行的。在原核宿主生物如大腸桿菌中表達重組DNA的過程中，得到的重組基因產(chǎn)物/蛋白質(zhì)在細胞質(zhì)中以不溶性“內(nèi)含體”的形式沉淀通常是理想的。在完成發(fā)酵和溶解細胞后，分離內(nèi)含體，任選地純化，并通過添加變性劑如尿素或鹽酸胍溶解其中包含的重組蛋白質(zhì)，通過還原變性條件完成所述蛋白質(zhì)的復(fù)性(naturation)。這類方法是眾所周知的，并且也已經(jīng)長期成功用于重組蛋白質(zhì)的工業(yè)化制備(參見，如Lee，S.Y.，Trends Biotechnol.14(1996)98-105；Panda，A.K.，等.，J.Biotechnol.75(1999)161-172；Mattes，R.，Semin.Thromb.Hemost.27(2001)325-336；Clark，E.D.，Curr.Opin.Biotechnol.12(2001)202-207；Misawa，S.，和Kumagai，I.，Biopolymers51(1999)297-307；和Lilie，H.，Current Opinion Biotechnol.9(1998)497-501)。
在細胞質(zhì)中表達的蛋白質(zhì)作為不溶性蛋白聚集體(內(nèi)含體)或以可溶性活性或無活性形式而獲得的程度基本上通過蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)確定。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)固有生物物理/生物化學(xué)性質(zhì)，所述性質(zhì)因此決定蛋白質(zhì)是否將在微生物的細胞質(zhì)環(huán)境中折疊以形成可溶性生物活性或無活性蛋白質(zhì)或是否將形成優(yōu)選高分子量蛋白聚集體。通過選擇發(fā)酵和表達條件可影響折疊平衡(相對于不溶性蛋白聚集體形成可溶性結(jié)構(gòu)的蛋白)。例如，通過在降低的培養(yǎng)溫度和/或非最佳誘導(dǎo)條件(有限的誘導(dǎo)物濃度)下培養(yǎng)原核細胞，可以降低重組質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)生物合成速率，從而防止或減少形成不溶性蛋白質(zhì)聚集體的蛋白質(zhì)積累(參見例如Kopetzki，E.，等.，Mol.Gen.Genet.216(1989)149-155；和EP 0 300425)。然而，在其它情況，通過內(nèi)含體的途徑制備重組蛋白質(zhì)是理想的。因此，這類方法的目的是獲得高產(chǎn)率的內(nèi)含體形式的重組蛋白質(zhì)。然而，關(guān)于這一點，應(yīng)緊記其它參數(shù)在原核細胞中重組基因表達過程中同樣高度重要，例如這類其它參數(shù)盡可能高的實現(xiàn)重組基因表達和防止不理想的翻譯后修飾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在重組表達后增加內(nèi)含體形式的不溶性多肽的產(chǎn)率。
令人驚訝地，發(fā)現(xiàn)不溶性變性的所需重組多肽的產(chǎn)率可通過在發(fā)酵后非生理升高的溫度下增加溫育步驟而顯著增加。
因此，本發(fā)明的目的是一種重組生產(chǎn)所需多肽的方法，所述重組生產(chǎn)所需多肽是通過在微生物宿主細胞，優(yōu)選原核宿主細胞中表達編碼所述多肽的核酸，在所述宿主細胞的細胞質(zhì)中形成包含所述多肽的內(nèi)含體，分離所述內(nèi)含體，溶解和復(fù)性(naturing)多肽來進行，所述方法特征在于在發(fā)酵后，在40℃或更高，優(yōu)選45℃或更高的溫度下溫育宿主細胞或宿主細胞內(nèi)容物至少10分鐘，優(yōu)選10-180分鐘，隨后從宿主細胞中分離不溶性多肽。
依照本發(fā)明的方法在水性介質(zhì)中實施，并且通常在40-60℃，優(yōu)選在45℃的溫度下實施。更高的溫度對依照本發(fā)明的效果僅有非常小的幫助，并且可能導(dǎo)致多肽的不可逆的變性。
在微生物宿主細胞中重組表達多肽的過程中形成不溶性內(nèi)含體。內(nèi)含體是蛋白酶抗性的錯折疊所需蛋白質(zhì)的折射聚集體，其剛過表達編碼基因時產(chǎn)生(Misawa，S.，和Kumagai，I.，Biopolymers 51(1999)297-307)。
令人驚訝地，通過在這類非生理升高的溫度下溫育含所需重組多肽的宿主細胞，所需的多肽以不溶性內(nèi)含體的形式聚集。因此，可提高在發(fā)酵批次的不溶部分中所需多肽的產(chǎn)率。溫育的持續(xù)時間和溫育溫度本質(zhì)上不是關(guān)鍵的。隨著溫育時間增加和在較高的溫育溫度下，首先形成更大量的內(nèi)含體。然而，非常長的溫育時間和非常高的溫育溫度導(dǎo)致例如通過加熱產(chǎn)生的不可逆變性而不可逆地改變多肽。目前本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通過進行簡單的實驗可容易地發(fā)現(xiàn)重組生產(chǎn)目的多肽的最佳條件。在這類實驗中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)例如通過在45℃后溫育1小時可實現(xiàn)含重組多肽的內(nèi)含體的產(chǎn)率的相當大的增加。
適用于重組基因表達的原核宿主細胞是，例如，革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。合適的大腸桿菌菌株是，例如大腸桿菌K12菌株如UT5600，HB101，XL1，X1776和W3110。然而，其它腸細菌科(enterobacteriacea)以及微生物如克雷伯氏菌屬(Klesiella)，沙門氏菌屬(Salmonella)或枯草芽孢桿菌，假單胞菌屬(Pseudomonas)或鏈霉菌屬(Streptomyces)也是適于作為宿主細胞。同樣適于作為宿主細胞的是酵母菌株，如酵母菌屬(Saccharomyces)，畢赤酵母屬(Pichia)，漢遜酵母屬(Hansenula)，克魯維酵母屬(Kluyveromyces)和裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)。
通常將編碼多肽的核酸插入到表達載體中。合適的載體對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是熟知的，是例如質(zhì)?；蚴删w。
依照本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的方法同樣完成宿主細胞的發(fā)酵。通常，首先在發(fā)酵溫度或高達37℃下溫育細胞。在已經(jīng)獲得預(yù)定量的細胞后(通過發(fā)酵肉湯/細胞懸液的光密度測定)，誘導(dǎo)重組多肽的表達，并進行培養(yǎng)直至到達穩(wěn)定期(在分批培養(yǎng)的情況下)。完成細胞培養(yǎng)后，收獲細胞，通過依照已知方法的溶解和復(fù)性分離和處理內(nèi)含體。將依照本發(fā)明的附加的溫育步驟適當?shù)夭迦氲皆撨^程中。這意味著，例如，在完成發(fā)酵后，簡單地增加發(fā)酵批次的溫度，隨后收獲細胞。另外，當然，在溶解前或裂解后，也可依照本發(fā)明在懸浮液中收獲和溫育細胞。因此，如果收獲細胞懸浮液并從發(fā)酵罐中去除，細胞生長受抑制，另外或者如果依照本發(fā)明將細胞懸浮液的溫度升高至同樣抑制宿主細胞進一步生長的40℃和更高，則完成發(fā)酵。
發(fā)酵溫度可以在用于在微生物宿主細胞中重組生產(chǎn)多肽的通常范圍內(nèi)。優(yōu)選發(fā)酵溫度為30℃或更低，尤其是如果需要N-末端加工的情況(例如所需多肽的甲硫氨酸的N-末端切割)。在發(fā)酵過程中通過宿主細胞的內(nèi)源性酶酶促進行這種N-末端加工。特別優(yōu)選地，溫度的范圍是在18-28℃間，最優(yōu)選在22-26℃間。
提供下述實施例，參考文獻，序列表和附圖
以助于理解本發(fā)明，本發(fā)明的真正范圍在后附的權(quán)利要求書中闡明?？梢岳斫庠谖疵撾x本發(fā)明的精神的條件下可對闡述的程序進行修改。
具體實施例方式
原材料依照本發(fā)明用于表達基因/多肽的大腸桿菌宿主/載體系統(tǒng)(大腸桿菌宿主菌株和基本載體)在美國專利號6,291,245中描述。
一般方法重組DNA技術(shù)如Sambrook，J.，等.，Molecular cloningA laboratory manual；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，紐約，1989中所述使用標準方法操縱DNA。依照制造商的說明書使用分子生物學(xué)試劑。
多肽測定通過測定在280nm的光密度(OD)，使用在氨基酸序列的基礎(chǔ)上計算的摩爾消光系數(shù)評估多聚T-重復(fù)融合多肽和干擾素-α-2a的多肽濃度[T-重復(fù)ε＝148680cm2/mol；IFN-α-2aε＝18020cm2/mol]。
實施例1T-重復(fù)融合基因的合成1.1 T-重復(fù)融合基因的基因設(shè)計人工T-重復(fù)融合基因編碼217個氨基酸的、分子量為27,242D的融合多肽。融合多肽由人干擾素-α-2a的N-末端13個氨基酸(MCDLPQTHSLGSR(SEQ ID NO1)；載體肽)和5個拷貝的抑制HIV肽T-1357(WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO2)，靶肽)組成，其通過胰蛋白酶可切割的肽接頭(GR)連接。
為了將T-重復(fù)結(jié)構(gòu)基因插入到大腸桿菌表達質(zhì)粒pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel(生產(chǎn)和描述參見實施例2)，將合成的核糖體RBSII結(jié)合位點和單一EcoRI切割位點插入到5’末端的上游，將單一CelII限制性內(nèi)切核酸酶切割位點插入到3’末端的上游。
1.2 T-重復(fù)融合基因的基因合成通過化學(xué)合成從寡核苷酸制備長約690bp，并且側(cè)接單一EcoRI和CelII限制性內(nèi)切核酸酶切割位點的RBSII T-重復(fù)基因。通過退火和連接寡核苷酸裝配雙鏈RBSII T-重復(fù)基因，隨后作為長691bp的EcoRI/CelII片段克隆到大腸桿菌質(zhì)粒中。將所需的質(zhì)粒表示為pT-重復(fù)。通過DNA測序證實克隆的RBSII T-重復(fù)基因的預(yù)定的DNA序列。
實施例2構(gòu)建大腸桿菌表達質(zhì)粒2.1構(gòu)建起始質(zhì)粒pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel質(zhì)粒pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel是用于在大腸桿菌中表達干擾素-α-2a(IFN-α-2a)的載體。它是基于IFN-α-2b表達質(zhì)粒OripBR-URA3-EK-IFN(美國專利號6,291,245)。由于另外存在lacI阻抑物基因和IFN-α-2a基因代替IFN-α-2b基因，pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel不同于OripBR-URA3-EK-IFN。IFN-α-2a和IFN-α-2b僅在第21位的一個氨基酸存在差異(Lys21Arg交換)。lacI阻抑物基因來自質(zhì)粒pUHA1(Stüber，D.，等.，System for high-level production in Escherichia coli and rapidapplication to epitope mapping，preparation of antibodies，andstructure-function analysis；InImmunological Methods IV(1990)121-152)。依照Mullis，K.B.，和Faloona，F(xiàn).A.，InMethods Enzymol.155(1987)335-350所述方法，使用引物N1(SEQ ID NO3)和N2(SEQ ID NO4)，通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增lacI阻抑物基因，隨后作為長約1210bp的NotI片段連接到OripBR-URA3-EK-IFN的單一NotI切割位點。
NotIN15′-AAAAAAGCGGCCGCGACAATTCGCGCGCGAAGGCG-3′NotIN25′-AAAAAAGCGGCCGCTCACTGcCCGCTTTCCAGTCGG-3′2.2構(gòu)建表達載體pBRori-URA3-LacI-T-重復(fù)從質(zhì)粒pT-重復(fù)分離作為長約690bp的EcoRI/CelII片段的T-重復(fù)基因(參見實施例1.2)，隨后連接到用EcoRI和CelII消化的長約3.1kbp的pBRori-URA3-LacI-RFN載體片段中。通過限制酶圖譜鑒定所需的質(zhì)粒pBRori-URA3-LacI-T-重復(fù)，并通過DNA測序再次證實亞克隆的T-重復(fù)基因。
實施例33.1在大腸桿菌中表達T-重復(fù)基因為了表達依照本發(fā)明的融合基因，使用大腸桿菌宿主/載體系統(tǒng)，其通過大腸桿菌營養(yǎng)缺陷體(PyrF)的互補進行無抗生素的質(zhì)粒選擇(美國專利號6,291,245)。
3.2通過在選擇性培養(yǎng)基中pyrF營養(yǎng)缺陷體的互補進行轉(zhuǎn)化和細胞生產(chǎn)為了生產(chǎn)用于表達T-重復(fù)基因的細胞，用實施例2.2描述的表達質(zhì)粒pBRori-URA3-LacI-T-重復(fù)轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12菌株[表示為UT5600(ΔpyrF)。首先在瓊脂平板上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的UT5600(ΔpyrF)/pBRori-URA3-LacI-T-重復(fù)細胞，隨后在含0.5％酪蛋白氨基酸(Difco)的M9基本培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)直至在550nm的光密度(OD550)為0.6-0.9，隨后用IPTG(1-5mmol/l終濃度)誘導(dǎo)。在22-37℃進行4-16小時的誘導(dǎo)期后，通過離心收獲細胞，用50mmol/l磷酸鉀緩沖液，pH6.5洗滌，并保存在-20℃直至進一步處理。
實施例4用于表達IFN-α-2a的轉(zhuǎn)化和細胞生產(chǎn)為了表達IFN-α-2a基因，使用大腸桿菌宿主/載體系統(tǒng)，其通過大腸桿菌營養(yǎng)缺陷體(PyrF)的互補進行無抗生素的質(zhì)粒選擇(美國專利號6,291,245)。
為了生產(chǎn)表達IFN-α-2a的細胞，用實施例2.1描述的表達質(zhì)粒pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12菌株UT5600(ΔpyrF)。首先在瓊脂平板上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的UT5600(ΔpyrF)/pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel細胞，隨后在22-37℃，在含0.5％酪蛋白氨基酸(Difco)的M9基本培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)直至在550nm的光密度(OD550)為0.6-0.9，隨后用IPTG(1-5mmol/l終濃度)誘導(dǎo)。在22-37℃進行4-16小時的誘導(dǎo)期后，通過離心收獲細胞，用10mmol/l磷酸鉀緩沖液，pH6.8洗滌。
實施例5表達分析通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，用考馬斯亮藍R染料染色和光密度分析，分析在細胞裂解物中在完成細胞培養(yǎng)、發(fā)酵和后發(fā)酵以后存在的可溶性和不溶性IFN-α-2a和T-重復(fù)融合多肽的部分。通過離心實現(xiàn)將細胞裂解物分離成可溶性(上清)和不溶性級分(IB’s和不溶性細胞組分)。
為了這個目的，將來自每個離心的培養(yǎng)基的3個OD550單位(1個OD550＝OD550為1的1ml細胞懸浮液)的細胞沉淀重懸浮在0.25ml10mmol/l磷酸鉀緩沖液，pH6.8中，并通過超聲處理(在50％強度下2個脈沖30秒)裂解細胞。沉淀(14,000rpm，5分鐘)不溶性細胞組分，將上清與1/5體積(vol)5×SDS樣品緩沖液(1×SDS樣品緩沖液50mmol/lTris-HCl，pH6.8，1％SDS，50mmol/l DTT，10％甘油，0.001％溴酚藍)混合。將不溶性細胞碎片級分(沉淀)重懸浮在0.3ml 1×SDS樣品緩沖液中，并將樣品在95℃溫育5分鐘，并再次離心。隨后，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)(Laemmli，U.K.，Nature 227(1970)680-685)分離多肽，用考馬斯亮藍R染料染色，隨后通過光密度分析相關(guān)凝膠條帶。
實施例6
6.1重組生產(chǎn)T-重復(fù)的大腸桿菌的101細胞高密度發(fā)酵預(yù)培養(yǎng)為了制備預(yù)培養(yǎng)物，在1000ml錐形瓶中，用1ml大腸桿菌UT5600ΔpyrF/pBRori-URA3-lacI-T-重復(fù)的甘油原液接種300ml M9+培養(yǎng)基(補充以0.5％酪蛋白氨基酸和每個0.9g/l Trp，Pro和Leu的M9培養(yǎng)基)。將培養(yǎng)物在37℃下，在150rpm的偏心振蕩器上溫育約6小時，直至達到OD578nm為3.0。
101補料分批主發(fā)酵在發(fā)酵起始階段，將預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到10升發(fā)酵罐中。在25℃，在含1.4％代替葡萄糖的甘油，2％酪蛋白氨基酸和每個0.1％的氨基酸Trp，Leu和Pro的已知成分M9鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)主培養(yǎng)物，直至OD578nm為20。隨后，開始進料甘油酵母劑量(原液30％酵母提取物和33％甘油)培養(yǎng)物，取決于培養(yǎng)物pH值變化，其流速在0.8和3.5ml/分鐘間變化，從而避免任何另外添加校正酸(H3PO4，KOH)。將pH維持在pH7.0，通過控制rpm，pO2值保持在50％。
在OD578nm為70時，加入1.5mmol/l IPTG，并誘導(dǎo)基因/多肽表達。在OD578nm為160-180時終止發(fā)酵。
6.2重組生產(chǎn)干擾素-α-2a的大腸桿菌的101細胞高密度發(fā)酵預(yù)培養(yǎng)為了制備預(yù)培養(yǎng)物，在2 l錐形瓶中，用約1.5ml大腸桿菌UT5600ΔpyrF/pBRori-URA3-lacI-RFN的甘油原液接種500ml補充以0.5％酪蛋白氨基酸和每個0.9g/l的Trp，Pro和Leu的M9培養(yǎng)基。在37℃和130rpm(振蕩器)將培養(yǎng)物溫育約10小時，直至達到OD546nm＞2。
發(fā)酵為了發(fā)酵，使用在酵母-甘油基礎(chǔ)上的復(fù)合培養(yǎng)基。在25℃和pH為7.0的條件下進行培養(yǎng)。當OD456nm達到10時，起始甘油酵母劑量，其另外包含氨基酸L-甲硫氨酸。在OD546nm為50時用0.5mM IPTG進行誘導(dǎo)。然后，將發(fā)酵溫度從25℃升至45℃2小時。作為高溫的結(jié)果，目前為止已經(jīng)幾乎完全以可溶性形式存在的表達產(chǎn)物轉(zhuǎn)換成內(nèi)含體。隨后，收獲生物量，并分離多肽。
實施例7發(fā)酵后溫育細胞完成發(fā)酵后，在通過離心收獲前，在發(fā)酵罐中于45℃溫育細胞1小時，同時攪拌。
如實施例5所述，關(guān)于表達的多肽(可溶性部分對不溶性部分)分析細胞。

在42℃/1.5小時，50℃/1小時或50℃/45分鐘的后溫育條件下獲得類似的結(jié)果。
參考文獻目錄Clark，E.D.，Curr.Opin.Bioteehnol.12(2001)202-207EP 0 300 425EP-A 0 368 342Kopetzki，E.，et al.，Mol.Gen.Genet.216(1989)149-155Laemmli，U.K.，Nature 227(1970)680-685Lee，S.Y.，Trends Bioteehnol.14(1996)98-105Lilie，H.，Current Opinion Biotechnol.9(1998)497-501Mattes，R.，Semin.Thromb.Hemost.27(2001)325-336Misawa，S.，and Kumagai，I.，Biopolymers 51(1999)297-307Mullis，K.B.，and Faloona，F(xiàn).A.，Methods Enzymol.155(1987)335-350Panda，A.K.，et al.，J.Biotechnol.75(1999)161-172Sambrook，J.，et al.，Molecular cloningA laboratory manual；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989Stüber，D.，et al.，System for high-level production in Escherichia coli andrapid application to epitope mapping，preparation of antibodies，andstructure-function analysis；InImmunological Methods IV(1990)121-152US Patent No.6,291,245
IN041517-序列表序列表<110>霍夫曼-拉羅奇有限公司<120>重組生產(chǎn)蛋白質(zhì)的改進方法<130>21736 EP<140>
<141>
<150>EP03012295.6<151>2003-06-12<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述載體肽<400>1Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg1 5 10<210>2<211>39<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述靶肽<400>2Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln1 5 10 15Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp20 25 30Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe35<210>3<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物N1<400>3aaaaaagcgg ccgcgacaat tcgcgcgcga aggcg 35<210>4<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物N2<400>4aaaaaagcgg ccgctcactg cccgctttcc agtcgg 3權(quán)利要求
1.一種重組生產(chǎn)所需多肽的方法，所述重組生產(chǎn)所需多肽是通過在微生物宿主細胞中表達編碼所述多肽的核酸，在所述宿主細胞的細胞質(zhì)中形成包含所述多肽的內(nèi)含體，和分離，溶解和復(fù)性所述多肽來實現(xiàn)的，所述方法特征在于在發(fā)酵后，在40℃或更高溫度下溫育所述宿主細胞或所述宿主細胞內(nèi)容物至少10分鐘，隨后從所述宿主細胞中分離不溶性多肽。
2.依照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述發(fā)酵在30℃或更低的溫度下進行。
3.依照權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于實施所述溫育10-180分鐘。
4.依照權(quán)利要求1-3的方法，其特征在于在40℃-60℃的溫度下實施所述溫育。
全文摘要
一種重組生產(chǎn)所需多肽的方法，所述重組生產(chǎn)所需多肽是通過在微生物宿主細胞中表達核酸編碼的所述多肽，在所述宿主細胞的細胞質(zhì)中形成包含所述多肽的內(nèi)含體，和分離，溶解和復(fù)性所述多肽來實現(xiàn)的，其特征在于在發(fā)酵后，在40℃或更高溫度下溫育所述宿主細胞或所述宿主細胞內(nèi)容物至少10分鐘，隨后從所述宿主細胞中分離不溶性多肽，該方法提供包含所需多肽的內(nèi)含體的增加的產(chǎn)率。
文檔編號C12P21/02GK1572872SQ20041004937
公開日2005年2月2日 申請日期2004年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月12日
發(fā)明者賴納·格林貝克, 埃哈德·科佩茨基, 弗里德里?！げㄆ?申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司