專利名稱：副雞禽桿菌抗體的檢測方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及副雞禽桿菌抗體的檢測方法和檢測試劑盒。具體來說，本發(fā)明涉及 副雞禽桿菌抗體的檢測方法，該方法包含通過ELISA法檢測由副雞禽桿菌(Avibacterium paragalliniirum，禾爾力 A. pg。(Hemphilus paragallinarum)) A 型菌和/或C型菌的菌體外膜蛋白(以下也稱為“HMT P210多肽”)誘導(dǎo)的抗體，其中，所 述ELISA法以含有該外膜蛋白的非同源區(qū)域或其一部分氨基酸序列的肽作為固相抗原；以 及該方法中使用的檢測試劑盒。根據(jù)構(gòu)成該肽的氨基酸殘基數(shù)，肽以二肽、三肽、寡肽、多肽 等名稱稱呼，本發(fā)明中不對它們進(jìn)行區(qū)別，均定義為肽。
背景技術(shù)：
由于感染A. pg而發(fā)病的雞傳染性鼻炎是雞的重要的呼吸系統(tǒng)疾病。雞傳染性鼻 炎發(fā)病雞的主要癥狀是鼻液流出、呈現(xiàn)顏面腫脹或者流淚。雞傳染性鼻炎導(dǎo)致雞的生長率 降低、產(chǎn)蛋開始的延遲、產(chǎn)蛋率降低或產(chǎn)蛋停止，其經(jīng)濟(jì)損失較大。Page等人將A. pg分類為A、B和C型三種型(非專利文獻(xiàn)1)，Sawata等人將其分 類為1型和2型兩種型(非專利文獻(xiàn)2)。之后，Kume等人報(bào)道Page等人的A型相當(dāng)于 Sawata等人的1型，Page等人的C型相當(dāng)于Sawata等人的2型(非專利文獻(xiàn)3和4)。目 前，A. pg的A型(1型)菌(以下也稱為“A. pg-A型菌”)和C型(2型)菌(以下也稱為 “A. pg-C型菌”)成為雞傳染性鼻炎的主要病因菌。關(guān)于雞傳染性鼻炎的預(yù)防，以往廣泛使用將A. pg-A型菌或A. pg-C型菌的菌體用 福爾馬林、硫柳汞(thimerosal)等滅活得到的疫苗。但是，在給予這些疫苗時(shí)，存在在接種 雞的局部形成壞死病灶(非專利文獻(xiàn)5)等的副作用的問題，人們強(qiáng)烈期望開發(fā)安全性高的疫苗。在上述狀況下，人們開發(fā)了以下的疫苗等組分疫苗(component vaccine)，只 從菌體或培養(yǎng)上清中取出保護(hù)性抗原(protective antigen，感染防御抗原)即有效成分 (component，組分)，制成疫苗；重組疫苗，通過基因重組技術(shù)克隆編碼保護(hù)性抗原的基因， 使該基因在細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等中表達(dá)，純化大量表達(dá)的表達(dá)產(chǎn) 物，將其作為疫苗；或者是載體疫苗，將編碼保護(hù)性抗原的基因插入到病毒載體等中。例如德永等人從A. pg-A型菌的培養(yǎng)液中誘導(dǎo)生成紅細(xì)胞凝集抑制抗體(HI抗 體)，成功地純化了可防御A. pg-A型菌引起的雞傳染性鼻炎的、來自該A型菌的分子量約 130kDa的多肽(專利文獻(xiàn)1)。并發(fā)現(xiàn)，克隆編碼該130kDa多肽的DNA片段并在大腸桿菌中 表達(dá)的該重組蛋白可以防御副雞禽桿菌A型菌引起的雞傳染性鼻炎的感染。進(jìn)一步以編碼 130kDa多肽的DNA片段作為探針，鑒定了 HMT p210基因，該基因編碼含有2，042個(gè)氨基酸 的A型HMT p210多肽(具有紅細(xì)胞凝集活性的菌體外膜蛋白)。還同樣地從C型菌中 克隆 了與該DNA片段雜交的DNA片段，獲得了來自C型菌的C型HMT p210基因(專利文獻(xiàn)2)。 還有報(bào)道稱，將A型菌和C型菌的HMT p210基因的開放閱讀框(0RF，open reading frame) 的核苷酸序列進(jìn)行比較，兩者的同源性占全體的80%，5’一側(cè)的約3. 4kbp的區(qū)域(以下稱為區(qū)域1)和3’ 一側(cè)的約1. 2kbp的區(qū)域(以下稱為區(qū)域3)具有非常高的同源性，由兩個(gè) 區(qū)域夾持的約1. 5kbp的區(qū)域(以下稱為區(qū)域2)則同源性低(專利文獻(xiàn)2)。據(jù)野呂等人的報(bào)道，德永等人發(fā)現(xiàn)的HMT p210基因作為型特異性的疫苗的靶區(qū)域 是很重要的。野呂等人還報(bào)道通過將編碼A. pg-A型HMT p210多肽的HMT p210基因的 一部分即由4，SOlbp 5，157bp的DNA片段所編碼的肽免疫雞，則該肽具有誘導(dǎo)對A. pg-A 型菌的HI抗體以及疫苗的效果(專利文獻(xiàn)3)。另外，野呂等人在第143回日本獸醫(yī)學(xué)會(huì) (2007年4月3 5日舉辦，日本)上報(bào)道通過將編碼C型HMT p210多肽的HMT p210基 因的一部分即由5. 5kbp的DNA片段HPC5. 5所編碼的肽免疫雞，同樣具有誘導(dǎo)對A. pg-C型 菌的HI抗體和疫苗的效果。感染了 A. pg的雞有急性的過程，并且在發(fā)病后也難以誘導(dǎo)抗體生成，因此以往并 未進(jìn)行雞傳染性鼻炎的血清診斷。而給予了疫苗的雞中，誘導(dǎo)出存在于A. pg菌體表面的對 紅 細(xì)胞凝集素(Hemagglutinin，以下稱為“HA”)的抗體，在體外評價(jià)疫苗效果時(shí)，可進(jìn)行利 用抗HA抗體的紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)(以下也稱為“HI試驗(yàn)”)。HI試驗(yàn)中使用了新鮮雞紅 細(xì)胞或戊二醛固定的雞紅細(xì)胞，但也被認(rèn)為有以下的缺點(diǎn)(1)在A. pg-A型菌的疫苗效果 的評價(jià)中必須采用新鮮的雞紅細(xì)胞，因此需要確保供血用雞(在與病原體隔離的狀態(tài)下的 飼養(yǎng)管理)、采血和血液處理等煩雜且較為費(fèi)事；(2)受到雞紅細(xì)胞批次的影響，并且抗體 效價(jià)的判定是根據(jù)測定者主觀進(jìn)行判定，難以獲得穩(wěn)定的成績等。另一方面，Sun等人報(bào)道了利用型特異性單克隆抗體的封閉ELISA(B-ELISA)，以 此作為代替HI試驗(yàn)的血清診斷法(非專利文獻(xiàn)6)。B-ELISA是以將A型菌或C型菌體超 聲波破碎所得的破碎物作為抗原，使用與各血清型反應(yīng)的單克隆抗體，競爭性檢測血清中 的抗體的ELISA法。本方法與HI試驗(yàn)相比，靈敏度高，具有可以對應(yīng)多檢體優(yōu)點(diǎn)。但是必 須進(jìn)行血清的添加、單克隆抗體的添加、抗小鼠IgG-HRP標(biāo)記抗體的添加和顯色底物的添 加這四個(gè)步驟，與常規(guī)的ELISA方式比較多一個(gè)步驟，操作煩雜。另外，為了采用本方法，還 必須確保型特異性單克隆抗體。在制備試劑盒方面，除抗原固相化板、參照血清之外還必須 制備單克隆抗體并附在試劑盒中。并且，該B-ELISA是在各血清中檢測僅與一個(gè)單克隆抗 體所識(shí)別的抗原表位相對的抗體的系統(tǒng)。在檢測與一個(gè)表位相對的抗體的系統(tǒng)中，由于菌 體的變異而失去該表位時(shí)，則無法檢測菌體感染或疫苗接種抗體的危險(xiǎn)性更高。專利文獻(xiàn)1 日本特開平10-84969專利文獻(xiàn)2 :W098/12331專利文獻(xiàn)3 日本特開2005-218414非專利文獻(xiàn)1 :Am. J. Vet. Res. ,23 85 95，1962非專利文獻(xiàn)2 Jpn. J. Vet. Sci. ,40 645 652，1978非專利文獻(xiàn)3 :Am. J. Vet. Res. ,41 757 760，1980非專利文獻(xiàn)4 :Am. J. Vet. Res. ,41 1901 1904,1980非專利文獻(xiàn)5 =Avian Dis.，15 109 117，1971非專利文獻(xiàn)6 :Int. Ass. Bio. (IABS) 35 :317 320，200
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題
本發(fā)明的課題在于提供可分別區(qū)別對A. pg的A型菌和C型菌的抗體的抗體檢測 方法。具體來說，提供一種抗體檢測方法，其特征在于該方法使用可分別區(qū)別對A. pg的A 型菌和C型菌的抗體的重組抗原肽。更具體地說，提供一種抗體檢測方法，其特征在于使 用含有在A. pg的A型菌和C型菌的外膜蛋白之間同源性低的區(qū)域內(nèi)的氨基酸序列的重組 抗原肽。解決課題的方法
本發(fā)明人等為了實(shí)現(xiàn)上述目的進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在作為疫苗抗原 很重要的HMT p210基因所編碼的p210多肽的偏離區(qū)域2的氨基酸序列的位置，含有在 A.pg-A型菌和A. pg-C型菌之間同源的氨基酸序列(SEQ ID NO :1所述的A. pg-Α型菌第 243 273號氨基酸序列和SEQ ID NO :2所述的A. pg_C型菌第38 68號氨基酸序列的 31個(gè)氨基酸中，29個(gè)氨基酸一致，參照圖3)，并且發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列形成表位。并且本發(fā) 明人等還發(fā)現(xiàn)在由德永等人定義的區(qū)域2的C末端區(qū)域的一部分含有在A. pg-A型菌和 A. pg-C型菌之間同源性高的氨基酸序列。因此，在A. pg-A型菌和A. pg-C型菌的各HMT p210 多肽中，制備不含有上述兩個(gè)同源的氨基酸序列的肽，使用所得肽，通過在微量板上固相化 的ELISA法進(jìn)行抗體測定。結(jié)果確認(rèn)可分別特異性識(shí)別由來自A. pg-A型菌的疫苗和來自 A. pg-C型菌的疫苗所誘導(dǎo)的抗體，從而完成了本發(fā)明。因此，本申請發(fā)明如下所述。(1)副雞禽桿菌抗體的檢測方法，其特征在于，該方法包含使下述肽A或B的至少 一種抗原與檢體反應(yīng)的抗體測定方法肽A 為SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的一部分，含有6個(gè)氨基酸以上的肽鏈且不含 有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列第243 273號氨基酸序列的肽；肽B 為SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的一部分，含有6個(gè)氨基酸以上的肽鏈且不含 有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列第38 68號氨基酸序列的肽。(2)上述(1)所述的檢測方法，其特征在于肽A或B是10個(gè)氨基酸以上的肽鏈。(3)上述(1)所述的檢測方法，其特征在于肽A或B是20個(gè)氨基酸以上的肽鏈。(4)上述⑴所述的檢測方法，其特征在于，肽A或B是下述的肽鏈肽A:為SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO=I所示的氨基酸序 列第8 236號氨基酸序列且不含有SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列第243 273號氨基 酸序列的肽；肽B 為SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序 列第69 452號氨基酸序列且不含有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列第38 68號氨基 酸序列的肽。(5)上述⑴所述的檢測方法，其特征在于，肽A或B是下述的肽鏈肽A 為含有SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列第8 236號氨基酸序列的肽；肽B
為含有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列第69 452號氨基酸序列的肽。(6)上述(4)所述的檢測方法，其特征在于，肽A是下述的肽鏈肽A:為SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO=I所示的氨基酸序 列第274 445號氨基酸序列且不含有SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列第243 273號氨 基酸序列的肽。(7)上述(5)所述的檢測方法，其特征在于，肽A是下述的肽鏈肽A 為含有SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列第274 445號氨基酸序列的肽。(8)上述1 7中任一項(xiàng)所述的檢測方法，其特征在于肽A或B是具有1或多個(gè) 氨基酸殘基缺失、添加、或取代的氨基酸序列的肽。(9)上述1 8中任一項(xiàng)所述的檢測方法，其特征在于抗體測定方法選自ELISA 法、蛋白質(zhì)印跡法和斑點(diǎn)雜交法。(10)上述1 9中任一項(xiàng)所述的檢測方法，其特征在于檢體是感染了副雞禽桿 菌的雞血清或給予了副雞禽桿菌疫苗的雞血清。(11)副雞禽桿菌抗體測定試劑盒，其特征在于，該試劑盒使用下述肽A或B的至少 一種作為抗原肽A 為SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的一部分，含有6個(gè)氨基酸以上的肽鏈且不含 有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列第243 273號氨基酸序列的肽；肽B 為SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的一部分、含有6個(gè)氨基酸以上的肽鏈且不含 有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列第38 68號氨基酸序列的肽。(12)上述(11)所述的抗體測定試劑盒，其特征在于，肽A或B是10個(gè)氨基酸以上 的肽鏈。(13)上述(11)所述的抗體測定試劑盒，其特征在于肽A或B是20個(gè)氨基酸以 上的肽鏈。(14)上述(11)所述的抗體測定試劑盒，其特征在于，肽A或B是下述的肽鏈肽A 為SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO=I所示的氨基酸序 列第8 236號氨基酸序列且不含有SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列第243 273號氨基 酸序列的肽；肽B 為SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序 列第69 452號氨基酸序列且不含有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列第38 68號氨基 酸序列的肽。(15)上述(11)所述的抗體測定試 劑盒，其特征在于，肽A或B是下述的肽鏈肽A 為含有SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列第8 236號氨基酸序列的肽；
肽B 為含有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列第69 452號氨基酸序列的肽。(16)上述(14)所述的抗體測定試劑盒，其特征在于，肽A是下述的肽鏈肽A 為SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序 列第274 445號氨基酸序列且不含有SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列第243 273號氨 基酸序列的肽。(17)上述(15)所述的抗體測定試劑盒，其特征在于，肽A是下述的肽鏈肽A 為含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列第274 445號氨基酸序列的肽。(18)上述11 17中任一項(xiàng)所述的抗體測定試劑盒，其特征在于肽A或B是具 有1或多個(gè)氨基酸殘基缺失、添加、或取代的氨基酸序列的肽。(19)上述11 18中任一項(xiàng)所述的抗體測定試劑盒，其特征在于抗體測定方法 選自ELISA法、蛋白質(zhì)印跡法和斑點(diǎn)雜交法。(20)上述11 19中任一項(xiàng)所述的抗體測定試劑盒，其特征在于檢體是感染了 副雞禽桿菌的雞血清或給予了副雞禽桿菌疫苗的雞血清。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，可以提供副雞禽桿菌抗體的檢測方法和試劑盒。本發(fā)明中使用的來 自A. pg-A型菌和A. pg-C型菌的肽互相不含有同源的氨基酸序列，因此與由來自A. pg-A型 菌的疫苗和A. pg-C型菌的疫苗所誘導(dǎo)的抗體分別特異性結(jié)合。因此，本發(fā)明的檢測方法和 試劑盒不僅是在單獨(dú)將各疫苗給予雞時(shí)，在給予將兩者混合的疫苗時(shí)也可以分別識(shí)別并測 定存在于雞血清中的各個(gè)菌體的抗體效價(jià)。另外，根據(jù)本發(fā)明，使用純化重組抗原的結(jié)果，與使用A. pg菌體破碎物的以往的 技術(shù)相比，可以使更高濃度的抗原固相化，因此可以構(gòu)建抗體的檢測靈敏度更高的抗體測 定系統(tǒng)。另外，本申請發(fā)明的抗體的檢測方法對于抗原肽具有識(shí)別A. pg的血清型的能力， 因此與使用型特異性單克隆抗體的B-ELISA相比更為簡便，且從菌體的抗原變異的角度考 慮，可以更確實(shí)地檢測出對A. pg的抗體。并且，通過本發(fā)明的檢測方法，不僅可以識(shí)別給予疫苗后的雞血清，也可以識(shí)別 A. pg感染雞血清中的抗體。


圖1是表示HMT p210多肽及其片段以及各片段的位置關(guān)系的圖。涂黑部分表示 區(qū)域2內(nèi)的同源序列，網(wǎng)格部分表示區(qū)域2的C末端同源區(qū)域。圖中所述的氨基酸SEQ ID NO相當(dāng)于專利文獻(xiàn)2的序列表SEQ ID N0:1(A型菌)和序列表SEQ ID NO :5 (C型菌)中 公開的氨基酸SEQ ID NO。圖2是表示由大腸桿菌純化的各多肽的SDS-PAGE結(jié)果的圖。M 標(biāo)志物，泳道1 P-A Δ 6b-lb,泳道 2 :P_C Δ 6b_lb圖3是表示由HMT p210基因編碼的氨基酸序列的非同源區(qū)域中同源的氨基酸序 列及其位置的圖。圖中所述的氨基酸SEQ ID NO相當(dāng)于專利文獻(xiàn)2序列表SEQ ID N0:1(A型菌)和序列表SEQ ID NO :5 (C型菌)中公開的氨基酸SEQ ID NO。圖4是觀察以A型菌攻擊前血清的多肽Ρ-ΑΔ 6b_2#作為抗原的ELISA值與A型 菌攻擊后的防御發(fā)病的相關(guān)性的圖。圖中的“· ”表示未發(fā)病的雞，“〇”表示發(fā)病的雞。圖5是觀察以C型菌攻擊前血清的多肽P-CA 6b_lb作為抗原的ELISA值與C型 菌攻擊后的防御發(fā)病的相關(guān)性的圖。圖中的“· ”表示未發(fā)病的雞，“〇”表示發(fā)病的雞。
具體實(shí)施例方式本申請發(fā)明的特征在于通過以下述的肽作為抗原的抗體測定方法的副雞禽桿菌 抗體的檢測方法和試劑盒，所述肽是將由來自A. pg的HMT p210基因所編碼的氨基酸序列 中的少許存在于非同源區(qū)域中的A. pg-A型菌和A. pg-C型菌之間的同源的氨基酸序列除去 而得到的肽。本申請發(fā)明的副雞禽桿菌抗體的檢測方法中，使用由來自A. pg-A型菌和/或 A. pg-C型菌的HMT p210基因所編碼的氨基酸序列的非同源區(qū)域或其一部分作為抗原。這 里，非同源區(qū)域定義為從夾持在5’ 一側(cè)的約3. 4kbp的DNA區(qū)域所編碼的氨基酸序列(區(qū) 域1)和3’ 一側(cè)的約1. 2kbp的DNA區(qū)域所編碼的氨基酸序列(區(qū)域3)的兩個(gè)區(qū)域的、約 1. 5kbp的DNA區(qū)域(區(qū)域2)所編碼的氨基酸序列中除去C末端一側(cè)的同源序列而得到的 約1.3kbp的區(qū)域(SEQ ID N0:1(A型菌)和SEQ ID NO :2 (C型菌))(參照圖1)。以下，將 編碼該非同源區(qū)域的氨基酸序列的基因稱為“A. pg-1. 3基因”，在對A型菌和C型菌的兩者 進(jìn)行區(qū)別時(shí)，分別稱為“A. pg-Al. 3基因”、“A. pg-Cl. 3基因”。從A. pg感染雞中分離的3株A型菌(221株、053株和W株)的相當(dāng)于HMT p210 基因的非同源區(qū)域的核苷酸序列在053株和W株之間完全一致，在兩株和221株之間僅有 一個(gè)堿基發(fā)生變異。而3株C型菌(53-47株、Modest株和NK-I株)之間的同源區(qū)域的核 苷酸序列只是Modest株和NK-I株相對于53-47株有3個(gè)堿基(1個(gè)氨基酸)缺失。因此， 可以說同一血清型之間的非同源區(qū)域高度保守，本申請發(fā)明中，可以使用同一血清型內(nèi)的 任何菌株。A. pg-Al. 3基因以及含有該基因的DNA片段可通過以下方法獲得。A. pg 的增殖可 以使用適當(dāng)含有聚胨、葡萄糖、酪蛋白氨基酸、谷氨酸鈉、酵母提取物、氯化鈉、雞湯、β NAD、 雞血清等的培養(yǎng)基。本申請發(fā)明中，為了進(jìn)行小、中容量的菌體增殖，使用含雞血清的雞 肉湯培養(yǎng)基(IOOOmL培養(yǎng)基中含有5g聚胨S、Ig酪蛋白氨基酸、5g氯化鈉、5g L-谷氨酸 鈉、Ig葡萄糖、IOg酵母提取物、175mL雞湯、25mL雞血清、0. 025%煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (β-NAD))。培養(yǎng)條件通常在溫度37°C、時(shí)間16 24小時(shí)的范圍內(nèi)設(shè)定，這可根據(jù)使用目 的、培養(yǎng)形態(tài)、接種的菌量、培養(yǎng)基規(guī)模等適當(dāng)調(diào)節(jié)。培養(yǎng)液中的菌體通過離心(8，000rpm，20分鐘)回收在沉淀物中。HMT p210基 因可按照Sambrook等人敘述的常規(guī)的基因重組技術(shù)(Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y. ,1989),以由菌體 提取的總RNA、mRNA或基因組DNA作為起始材料來制備。實(shí)際中可使用市售的試劑盒。例 如RNA的提取可以使用TRIzol試劑(4 >匕’卜口夕工 >公司)、ISOGEN( 二 ,水。> 夕一 > 公司)、StrataPr印 Total RNA Purification Kit (StrataPr印總 RNA 純化試劑盒)(東洋 紡)等的試劑，染色體DNA的提取可以使用力〃 ”一 > 試劑盒(三光純藥)、IS0PLANT (和光純藥)，mRNA的純化可以使用mRNA Purification Kit(mRNA純化試劑盒)(了 m “ K < 才寸 < 工 > 7 公司)、Poly(A) Quick mRNA Isolation Kit (Poly (A) Quick mRNA 分離 試劑盒)(東洋紡)、mRNA Separator Kit (mRNA分離試劑盒)(々口 >〒？々公司)等的 試劑盒，轉(zhuǎn)換為 cDNA 可以使用 SuperScript plasmid system for cDNA synthesis and plasmid cloning ( 4 > 卜 口 夕工 > 公司)、cDNA Synthesis Kit (cDNA 合成試劑盒)(寶 酒造)、SMART PCR cDNA Synthesis & Library Construction Kits (SMART PCR cDNA合成 和文庫構(gòu)建試劑盒)(夕口 > 夕公司)、Directionary cDNA文庫構(gòu)建系統(tǒng)()^ ^工 乂公司)、GeneAmp PCR Gold( ” 八卜、K 4才〉7于Λ文公司)等。
更具體來說，使用七^ ”一 >試劑盒(三光純藥)等，從通過離心回收的菌體中提 取的染色體DNA，將其用適當(dāng)?shù)南拗泼?優(yōu)選使用EcoRI)切斷，插入到市售的克隆載體中 (例如，λ gtll ； 二-一 4 >夕‘，> 卜‘八4才，7" ^ (NEB)公司)，制備DNA文庫。以所得 DNA片段為模板，使用LA Taq(夕力，才株式會(huì)社)，按照所附的流程，通過PCR法擴(kuò)增 各種大小的DNA片段。PCR中使用的引物可根據(jù)德永等人公開的來自A. pg-A型菌和A. pg-C 型菌的HMT p210基因的核苷酸序列(專利文獻(xiàn)1)設(shè)計(jì)。PCR用引物如果委托DNA合成受 托機(jī)構(gòu)(例如，夕'” m卞” ^ ^ >公司)等，則可以容易地獲得。此時(shí)，在上游側(cè)引 物的5’末端和下游側(cè)引物的5’可以附加適當(dāng)?shù)南拗泼盖形稽c(diǎn)的核苷酸序列。PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物克隆到基因克隆載體、pCR-XL-T0P0( 4 > ii卜α 7 - >株式會(huì)社)中，可獲得插入了各 種DNA片段的質(zhì)粒pCRDNT。所得DNA片段的核苷酸序列先克隆到pBluescript II SK+( ^
卜，夕夕一 > 公司)或pCR2. 1-T0P0 ( 4 > '卜口夕工 > 公司)中，然后由DNA測序儀(ABI Prism 377 ” 八卜、K 4才〉7于Λ文公司)確定。如后所述，只要不會(huì)導(dǎo)致靈敏度降低或非特異性反應(yīng)的增大，一部分中導(dǎo)入了氨 基酸變異的肽也可以作為本申請發(fā)明的抗體測定方法中的抗原使用。在肽的特定的氨基 酸中導(dǎo)入變異時(shí)，通常是采用向編碼該肽的DNA片段的核苷酸序列中導(dǎo)入變異的位點(diǎn)定 向誘變法(site-directed mutagenesis)。實(shí)際中可以使用應(yīng)用了該技術(shù)的Takara公司 白勺位‘點(diǎn)定向誘變系統(tǒng)(Site-Directed Mutagenesis System) (Mutan-Super Express Km、 Mutan-Express Km>Mutan-K 等)>Stratagene &司的 QuickChange Multi 胃向式 劑盒、QuickChange XL位點(diǎn)定向誘變試劑盒、Invitrogen公司的GeneTailor位點(diǎn)定向誘變 系統(tǒng)等市售的試劑盒，按照所附的流程來進(jìn)行。在獲得編碼在A. pg-A型菌和A. pg-C型菌之間不含有同源氨基酸序列的各種肽的 氨基酸序列的DNA片段時(shí)，可以從非同源區(qū)域(分別為SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列(A 型菌)和SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列(C型菌))中設(shè)計(jì)引物，使其不含有上述同源序 列，以上述A. pg-1. 3基因以及含有該基因的DNA片段作為模板，通過常規(guī)的PCR法進(jìn)行。如 果是較短的氨基酸序列，則也可以通過人工合成制備該DNA片段。本申請發(fā)明中，表1顯示 了制備的DNA片段和引物。將這樣得到的DNA片段插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，將其導(dǎo)入宿主，由此可以進(jìn)行各 DNA片段的表達(dá)。表達(dá)載體例如可以使用pQE30(、7 V >公司)或pET22b ()“ ”工> 公司或夕才株式會(huì)社制備)等，也可以適當(dāng)選擇。外源蛋白或肽的表達(dá)常用細(xì)菌、 酵母、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞等，可以結(jié)合使用目的進(jìn)行選擇。在轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞時(shí) 可以利用公知的方法。例如可以利用磷酸鈣法、DEAE葡聚糖法、使用脂轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的脂質(zhì)體的方法、原生質(zhì)體的聚乙二醇融合法、電穿孔法等，可根據(jù)所使用的宿主細(xì)胞選擇適當(dāng)?shù)姆?法。在表達(dá)本申請發(fā)明的各DNA片段時(shí)，可以使用可大量表達(dá)的大腸桿菌。關(guān)于大腸桿菌表 達(dá)用，已經(jīng)開發(fā)并銷售具有trp啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子、cspA啟動(dòng)子等的各種表達(dá)載體，因此可 以從中適當(dāng)選擇使用。根據(jù)表達(dá)載體，可選擇適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌、例如BL21、HMS174、DH5 α、 HBlOU JM109等作為宿主。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化可以使用市售的感受態(tài)細(xì)胞，按照所附的方法 進(jìn)行。這樣，可以獲得生產(chǎn)目標(biāo)多肽的重組大腸桿菌。在大腸桿菌的培養(yǎng)中所使用的培養(yǎng) 基(例如，LB、SOC、SOB等)、轉(zhuǎn)化體的選擇所使用的試劑(例如氨芐青霉素等)以及誘導(dǎo) 表達(dá)所使用的試劑(例如，吲哚乙酸(IAA)、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG))通?？梢?使用市售商品。培養(yǎng)基的PH在適合大腸桿菌增殖的范圍(ρΗ 6 8)內(nèi)使用。表達(dá)目標(biāo)肽(目標(biāo)產(chǎn)物)的重組大腸桿菌的篩選如下進(jìn)行。在表達(dá)誘導(dǎo)劑(本 發(fā)明中使用的表達(dá)系統(tǒng)中使用IPTG)存在下、通過離心(10，000rpm，5分鐘)回收培養(yǎng)、 增殖的菌體，向其中加入一定量的蒸餾水，使其懸浮，然后通過超聲波處理或者弗氏壓碎 器(French Press)、7 >卜> 丨」> (Manton Golin)等的勻漿器破碎菌體，通過離心 (15，OOOrpm，15分鐘)分離、回收在沉淀或上清中。蒸餾水中可以添加適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣?(例如，Triton X100)、螯合劑(例如，EDTA)、溶菌酶等。對一定量的回收到上清和沉淀中 的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，用考馬斯亮藍(lán)染色，然后確認(rèn)分子大小以及由 染色圖像確認(rèn)目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)。關(guān)于目標(biāo)產(chǎn)物的確認(rèn)(或檢測)除基于上述的分子大小的 方法之外，還可以采取基于ELISA法、蛋白質(zhì)印跡法、斑點(diǎn)雜交法等抗原抗體反應(yīng)的方法。 這均是檢測在任何大腸桿菌中表達(dá)的外源蛋白或多肽時(shí)的常規(guī)方法，可以根據(jù)目標(biāo)適當(dāng)選 擇。由重組大腸桿菌純化目標(biāo)產(chǎn)物時(shí)，通常采用將蛋白質(zhì)化學(xué)中使用的純化方法、例 如離心、鹽析法、超濾法、等電點(diǎn)沉淀法、電泳法、離子交換層析法、凝膠過濾層析法、親和層 析法、疏水層析法、羥基磷灰石法等方法組合的方法。所得蛋白質(zhì)或多肽的量可使用BCA蛋 白質(zhì)測定試劑盒(Pierce Biotechnology，Inc)、蛋白質(zhì)測定試劑盒(BI0-RAD，Inc)等蛋白 測定試劑進(jìn)行測定。為了使目標(biāo)物的純化容易進(jìn)行，還可以以與其它多肽或肽融合的形式表達(dá)。表達(dá) 上述融合蛋白的載體可以例舉可附加寡組氨酸的His-tag表達(dá)系統(tǒng)()>公司)、 可表達(dá)附加了 FLAG標(biāo)志的融合蛋白的系統(tǒng)(〉V 7公司)、可制備與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶 (GST)的融合蛋白的GST融合蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)(π * 乂 Λ 7 7 > * 7公司)、MagneHis 蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)(7 π J if公司)等。例如如在本發(fā)明的實(shí)施例中進(jìn)行的，以與寡組胺酸 的融合蛋白的形式表達(dá)后，使用鎳親和柱(GE > ^ > 7 /W ^ > ^公司)可以特 異性純化目標(biāo)多肽。如此得到的不含有A. pg-A型菌和A. pg-C型菌之間的同源氨基酸序列的區(qū)域的各 種肽可用于雞傳染性鼻炎疫苗抗體的檢測或用于進(jìn)行A. pg感染雞的血清學(xué)診斷的抗體測 定。具體來說可以適用ELISA法、蛋白質(zhì)印跡法、斑點(diǎn)雜交法等的抗體測定方 法。需要應(yīng)對 多個(gè)檢體時(shí)，優(yōu)選采用使肽固相化的微量板法的ELISA法。微量板中固相化的肽可以使用含有由A. pg-1. 3基因所編碼的氨基酸序列中的非 同源區(qū)域的肽及其一部分。通常由6 10個(gè)左右的氨基酸可以形成被抗體識(shí)別的表位(在 線上(http://www. genosys. jp/products/spots/spots_faq. html)公開了被抗體識(shí)另lj 的表位有3 6個(gè)氨基酸即足夠)，因此本申請發(fā)明中可以使用非同源區(qū)域的一部分、含有連 續(xù)的6個(gè)氨基酸以上的氨基酸序列的肽。為了提高特異性，優(yōu)選由含有非同源區(qū)域中的連 續(xù)的10個(gè)氨基酸以上的肽，進(jìn)一步優(yōu)選由含有連續(xù)的20個(gè)氨基酸以上的肽形成表位。最優(yōu)選使用由A Δ 6b-2#編碼的多肽(Ρ_Α Δ 6b_2#)、由C Δ 6b_lb編碼的多 肽(P-C Δ 6b-lb)、以及由A Δ 7b-lb編碼的多肽(Ρ_Α Δ 7b_lb)、以及含有由包含它們的 A. pg-1. 3基因編碼的氨基酸序列中的非同源區(qū)域的肽的一部分。只要不會(huì)導(dǎo)致在抗體檢測 方面出現(xiàn)障礙的靈敏度降低或非特異性反應(yīng)增大，也可以使用這些肽的一部分中導(dǎo)入了氨 基酸變異的變異肽。這些肽可以根據(jù)目的將兩種以上的肽分別組合使用。例如確定雞傳染 性鼻炎的病因菌時(shí)，優(yōu)選單獨(dú)使用各肽，或者分別獨(dú)立使用將來自A. pg-A型菌的肽之間或 者來自A. pg-C型菌的肽之間混合得到的混合物。如果只是要調(diào)查雞傳染性鼻炎感染的流 行病學(xué)或雞傳染性鼻炎疫苗的效果，也可以進(jìn)一步將來自A. pg-A型菌和A. pg-C型菌的混 合物混合使用。給予疫苗后的免疫血清通?？梢砸? 3次、2 4周的間隔將上述的肽與佐劑 的混合物給予適當(dāng)?shù)膭?dòng)物皮下、皮內(nèi)、腹腔內(nèi)等，然后將采集的血液進(jìn)行離心(14，000rpm， 5分鐘)獲得。佐劑可以使用弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、氫氧化鋁(例如， ImjectAlum(匕°7 — 7公司))等。副雞禽桿菌感染動(dòng)物的血清也可以同樣地將血液離心獲得。更具體來說，可以進(jìn)行各種方法的ELISA，可以是任何方法。例如首先將檢體(免 疫血清或A. pg感染血清)添加到將肽固相化的微量板中，清洗后添加標(biāo)記的抗雞抗體作為 二次抗體。還可以通過與抗肽特異性抗體組合，通過競爭法的ELISA來實(shí)施，該競爭法的 ELISA是將檢體和標(biāo)記抗肽(固相抗原)抗體同時(shí)或分別添加到使肽固相化的微量板中，或 者，抗肽抗體未標(biāo)記時(shí)，添加對抗肽抗體的標(biāo)記二次抗體。肽在微量板上的固相化通常通過以抗原量1 10μ g/ml、在室溫(25°C左右)下 放置30分鐘 2小時(shí)，或在低溫(4°C左右)下放置12 24小時(shí)來進(jìn)行。用于抑制非特異 性反應(yīng)的封閉試劑例如有7 口 7々-一 ^ (雪印公司)、ELISA用封閉試劑(口 * ^ ·夕’ A >/ m A、” 7公司)、牛血清白蛋白溶液、脫脂乳溶液等，可以適當(dāng)選擇使用。各 反應(yīng)后的清洗可使用PBS、TBS或其中含有Polysorbate (Tween 20)或防腐劑(疊氮化鈉) 等的試劑，反應(yīng)終止可以使用2 3mol的硫酸進(jìn)行。作為二次抗體，用HRP、熒光標(biāo)記、RI、 生物素化標(biāo)記的抗雞IgG單克隆抗體，例如抗雞IgG-HRP(《”千 >公司)等市場有銷售， 因此可以使用上述抗體。例如HRP的底物有OPD (鄰苯二胺)和TMBZ (3，3’，5，5’ -四甲基 聯(lián)苯胺)，分別以492nm、450nm測定吸光度。首先，可以在微量板上固定肽的抗體，采用使上述肽與該抗體結(jié)合的雙抗體夾層 的ELISA法。這種情況下，肽的抗體可以使用多克隆抗體和單克隆抗體的任意一種。多克隆 抗體可通過與上述免疫血清同樣的方法獲得，免疫所使用的動(dòng)物例如有雞、大鼠、豚鼠、倉 鼠、狗、猴等。單克隆抗體可以是從用A. pg菌體或多肽免疫的動(dòng)物中采集脾細(xì)胞或淋巴細(xì) 胞等抗體生成細(xì)胞，按照Milstein等人的方法(Method Enzymo 1.，73，3 46，1981)，與骨 髓瘤細(xì)胞株等融合，通過制備生成本申請發(fā)明中使用的肽的抗體的雜交瘤來獲得。還可以 通過利用噬菌體展示技術(shù)的抗體制備技術(shù)(Phage Display of Peptides and Proteins =A Laboratory Manual Edited by Brian K. Kay 等人、Antibody Engineering :A PRACTICALAPPROACH Edited by J. McCAFFERTY等人、ANTIBODY ENGINEERING second edition edited by Carl A. K. BORREBAECK)可以制備與本申請發(fā)明中使用的肽結(jié)合的抗體。采用如此建立的ELISA法的抗A. pg抗體的測定方法可以用于疫苗抗體或由A. pg 感染誘導(dǎo)的抗體的檢測。以下按照實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但并不限于下述的實(shí)施 例。實(shí)施例1A. pr-13基因及其區(qū)域內(nèi)DNA片段的制備按照德永等人的方法(日本特開平10-84969)制備A. pg-Α型菌221菌株和A. pg-C 型菌53-47株的基因組DNA文庫。簡單來說，使用七〃夕一 >試劑盒(三光純藥)，從通過 離心(8，OOOrpm, 20分鐘)回收的菌體中提取染色體DNA，用限制酶Sau3AI消化，制備DNA 文庫。以該DNA文庫的DNA片段為模板，使用LA Taq(夕力，〃 4才株式會(huì)社)，按照所附 的流程，通過PCR法擴(kuò)增含有A.pg-1.3基因的一部分的片段。PCR反應(yīng)是使用LA PCR試劑 盒版本2 (寶酒造制備)，在96°C下反應(yīng)1分鐘，然后將96°C 40秒、56°C 60秒、72°C 120秒 的反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)行72°C 10分鐘的反應(yīng)。圖1表示各DNA片段的位置關(guān)系。 各DNA片段的擴(kuò)增以及其中使用的PCR引物如表1所示。各引物中附加了限制酶識(shí)別序列。[表 1]
DNA片段5，引物3，引物
AA6b-lb 5，A Δ 6b_lb_P (SEQ ID NO 5)3，A Δ 6b_lb_P (SEQ ID NO 6)
A Δ 3-05’ A Δ 3-0-P (SEQ ID NO 7)3’ A Δ 3-0-P (SEQ ID NO 8)
A Δ 5-05’ A Δ 5-0-P (SEQ ID NO 9)3’ A Δ 5-0-P (SEQ ID NO 10)
A Δ 5-15，AA5-1-P(SEQ ID NO 11)3’ AA5_1_P(SEQ ID NO 12)
AA6b-lb 5，C Δ 6b_lb_P (SEQ ID NO 13) 3，C Δ 6b_lb_P (SEQ ID NO 14) A Δ 5-15’ CA5-1-P(SEQ ID NO 15)3’ CA5_1_P(SEQ ID NO 16)
A Δ 6-05’ C Δ 6-0-P (SEQ ID NO 17)3，C Δ 6-0-P (SEQ ID NO 18)
AA6b-2# 5' A Δ 6b-2#-P (SEQ ID NO: 19) 3’ A Δ 6b-2#-P (SEQ ID NO 20) AA7b-lb 5' A Δ 7b-lb-P (SEQ ID NO 21) 3’ A Δ 7b_lb_P (SEQ ID NO 22)實(shí)施例2各DNA片段的表達(dá)將實(shí)施例1所得的各DNA片段用 適當(dāng)?shù)南拗泼赶?，通過0. 8%瓊脂糖電泳分離，使用 Quantum Prep Freeze N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Co試劑盒洗脫并回收擴(kuò) 增片段。將所得片段預(yù)先用相同的限制酶消化，將5’末端與去磷酸化的的質(zhì)粒pQE30(與r Y >公司制備，6個(gè)His-tag序列存在于緊鄰起始密碼子的下邊)或pET22b連接，使用該片 段轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株。進(jìn)一步將含有擴(kuò)增片段的大腸桿菌在含有氨芐青霉素的Circle Grow培養(yǎng)基(7 t 二〉株式會(huì)社)中培養(yǎng)一夜，第二天加入IPTG，使終濃度為ImM，進(jìn)一步 培養(yǎng)2. 5小時(shí)。離心(10，000rpm，5分鐘)后舍棄上清，將沉淀物懸浮于培養(yǎng)液的1/10量 的裂解緩沖液 A(Lysis buffer A) (8M 尿素、100mMNaH2P04、IOmM Tris、10mM 咪唑，pH 8.0) 中，溶解菌體。離心(15，OOOrpm，15分鐘)后回收細(xì)胞裂解物上清。將回收的細(xì)胞裂解物 上清與ImL M-NTA瓊脂糖凝膠混合，使其吸附在凝膠上，然后填充到帶有底栓的柱中。將 柱清洗后用洗脫液(8M尿素、IOOmM NaH2PO4UOmM Tris、IOmM咪唑，pH 8.0)回收洗脫組分， 進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。A型、C型、各片段中作為ELISA抗 原使用的AA6b_lb和CA6b_lb的表達(dá)產(chǎn)物的電泳圖譜如圖2所示。實(shí)施例3抗多肽雞血清的制備將實(shí)施例2所得的多肽P-A Δ 5-1用PBS稀釋，濃度為10 μ g/劑量，進(jìn)一步加入 氫氧化鋁凝膠，終濃度為20%，將其以3周的間隔對5周齡的SPF雞的頸部皮下進(jìn)行免疫， 共進(jìn)行2次。對于其它多肽P-A Δ 3-0、P-A Δ 5-0、P-C Δ 5-1和P-C Δ 6-0用PBS稀釋，濃度 為IOyg/劑量，然后制備與油佐劑乳化的乳化液(每1劑量(0.5mL)中含有0. Olg抗原、
0.OOlmL以下福爾馬林、0. OlmL Polysorbate 80、0. 04mL失水山梨醇倍半油酸酯、0. 36mL 輕質(zhì)液體石蠟、余量為磷酸緩沖液)，對5周齡的SPF雞的頸部皮下給予1次。在9 11周 齡時(shí)采血，得到各多肽的免疫血清。實(shí)施例4通過ELISA確認(rèn)與各多肽免疫血清的反應(yīng)性將實(shí)施例2 所得的多肽 P-AA6b-lb、P_AA6b_2#、P_AA7b_lb 和 P_CA6_lb 用 50mM碳酸氫鹽緩沖液稀釋，濃度為1. 0 2. 5 μ g/mL,分別向96孔板中加入100 μ L并使其 固相化。在室溫下吸附1小時(shí)，然后舍棄反應(yīng)液，用200μ L的PBS-T (8. ImM磷酸氫二鈉、
1.5mM磷酸二氫鉀、137mM氯化鈉、2. 7mM氯化鉀、0. 05% Tween 20)清洗，然后加入200 μ L 含5%脫脂乳的PBS-T進(jìn)行封閉。舍棄封閉液，將血清用含脫脂乳的PBS-T稀釋50 100倍，向各孔中分別添加100 μ L，在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。除去反應(yīng)液后用PBS-T清洗3 次，將抗雞IgG-HRP標(biāo)記抗體用含1 %脫脂乳的PBS-T稀釋10，000 20，000倍，分別添加 100 μ L0在暗處、室溫下反應(yīng)1小時(shí)。除去反應(yīng)液后用PBS-T清洗3次，分別添加100 μ L顯 色底物液(IOOmM檸檬酸、200mM磷酸氫二鈉、0.004%鄰苯二胺、過 氧化氫)，在室溫下反應(yīng) 30分鐘。分別添加IOOyL 3M硫酸，終止顯色。用96孔板讀數(shù)儀(96well plate reader) (日本* 二一，一^公司制備)測定492nm的波長，其結(jié)果如表2所示。[表 2]
權(quán)利要求
1.副雞禽桿菌抗體的檢測方法，其特征在于，該方法包含使下述的肽A或B的至少一種 抗原與檢體反應(yīng)的抗體測定方法肽A:為SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的一部分，含有6個(gè)氨基酸以上的肽鏈且不含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列第243 273號氨基酸序列的肽； 肽B:為SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的一部分，含有6個(gè)氨基酸以上的肽鏈且不含有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列第38 68號氨基酸序列的肽。
2.權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于肽A或B是10個(gè)氨基酸以上的肽鏈。
3.權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于肽A或B是20個(gè)氨基酸以上的肽鏈。
4.權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，肽A或B是下述的肽鏈 肽A:為SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列第 8 236號氨基酸序列且不含有SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列第243 273號氨基酸序 列的肽； 肽B:為SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列第 69 452號氨基酸序列且不含有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列第38 68號氨基酸序 列的肽。
5.權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，肽A或B是下述的肽鏈 肽A:為含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列第8 236號氨基酸序列的肽； 肽B 為含有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列第69 452號氨基酸序列的肽。
6.權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，肽A是下述的肽鏈 肽A:為SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列第 274 445號氨基酸序列且不含有SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列第243 273號氨基酸 序列的肽。
7.權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于，肽A是下述的肽鏈 肽A:為含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列第274 445號氨基酸序列的肽。
8.權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的檢測方法，其特征在于肽A或B是具有1或多個(gè) 氨基酸殘基缺失、添加、或取代的氨基酸序列的肽。
9.權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的檢測方法，其特征在于抗體測定方法選自ELISA 法、蛋白質(zhì)印跡法和斑點(diǎn)雜交法。
10.權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的檢測方法，其特征在于檢體是感染了副雞禽桿菌 的雞血清或給予了副雞禽桿菌疫苗的雞血清。
11.副雞禽桿菌抗體測定試劑盒，其特征在于，該試劑盒使用下述肽A或B的至少一種作為抗原 肽A:為SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的一部分，含有6個(gè)氨基酸以上的肽鏈且不含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列第243 273號氨基酸序列的肽； 肽B:為SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的一部分、含有6個(gè)氨基酸以上的肽鏈且不含有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列第38 68號氨基酸序列的肽。
12.權(quán)利要求11所述的抗體測定試劑盒，其特征在于，肽A或B是10個(gè)氨基酸以上的 肽鏈。
13.權(quán)利要求11所述的抗體測定試劑盒，其特征在于肽A或B是20個(gè)氨基酸以上的 肽鏈。
14.權(quán)利要求11所述的抗體測定試劑盒，其特征在于，肽A或B是下述的肽鏈 肽A:為SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列第 8 236號氨基酸序列且不含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列第243 273號氨基酸序 列的肽； 肽B:為SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列第 69 452號氨基酸序列且不含有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列第38 68號氨基酸序 列的肽。
15.權(quán)利要求11所述的抗體測定試劑盒，其特征在于，肽A或B是下述的肽鏈 肽A:為含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列第8 236號氨基酸序列的肽； 肽B 為含有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列第69 452號氨基酸序列的肽。
16.權(quán)利要求14所述的抗體測定試劑盒，其特征在于，肽A是下述的肽鏈 肽A:為SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的一部分，含有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列第 274 445號氨基酸序列且不含有SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列第243 273號氨基酸 序列的肽。
17.權(quán)利要求15所述的抗體測定試劑盒，其特征在于，肽A是下述的肽鏈 肽A:為含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列第274 445號氨基酸序列的肽。
18.權(quán)利要求11 17中任一項(xiàng)所述的抗體測定試劑盒，其特征在于肽A或B是具有 1或多個(gè)氨基酸殘基缺失、添加、或取代的氨基酸序列的肽。
19.權(quán)利要求11 18中任一項(xiàng)所述的抗體測定試劑盒，其特征在于抗體測定方法選 自ELISA法、蛋白質(zhì)印跡法和斑點(diǎn)雜交法。
20.權(quán)利要求11 19中任一項(xiàng)所述的抗體測定試劑盒，其特征在于檢體是感染了副 雞禽桿菌的雞血清或給予了副雞禽桿菌疫苗的雞血清。
全文摘要
本發(fā)明提供副雞禽桿菌抗體的檢測方法和試劑盒。具體而言，本發(fā)明提供副雞禽桿菌抗體的檢測方法，該方法包含通過ELISA法檢測由副雞禽桿菌A型菌或/和C型菌的菌體外膜蛋白誘導(dǎo)的抗體，其中，所述ELISA法是以含有該外膜蛋白的非同源區(qū)域或其一部分的氨基酸序列的肽作為抗原；以及該方法中使用的檢測試劑盒。
文檔編號C07K16/12GK102007414SQ200980113170
公開日2011年4月6日 申請日期2009年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月8日
發(fā)明者今村孝, 坂元隆一, 坂口正士, 牛島稔大 申請人:一般財(cái)團(tuán)法人化學(xué)及血清療法研究所