專利名稱：用改良K-N法組份A+Ⅰ上清制備富含α1-抗胰蛋白酶組份的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于血漿蛋白制備領(lǐng)域，具體涉及運(yùn)用改良K-N法組份A+I上清制備富含ar抗胰蛋白酶(AAT)組分的方法。
背景技術(shù)：
ar抗胰蛋白酶劑(Alpha-l antitrypsin AAT)。分子由394個(gè)氨基酸組成，分子量為52000的糖蛋白，以天然有活性及變性無(wú)活性兩種形式存在，由肝臟產(chǎn)生，主要功能為抑制胰蛋白酶和中性白細(xì)胞的彈性蛋白酶的活性，還可抑制糜蛋白酶，纖維蛋白溶酶等。為人體內(nèi)功能最強(qiáng)大的酶抑制劑之一。AAT先天性缺乏如基因突變或后天因素如長(zhǎng)期吸煙或細(xì)菌感染會(huì)造成AAT活性中心失活，都會(huì)導(dǎo)致AAT功能性不足進(jìn)而造成機(jī)體蛋白酶與抗蛋白酶系統(tǒng)失衡，肺組織抵抗彈性蛋白酶的能力下降，引起肺泡變形及末端小支氣管以及下肺空間擴(kuò)張等肺組織的慢性損害，會(huì)發(fā)生泡性肺氣腫，慢性阻塞性肺病，成人呼吸道窘迫癥，臨床上一直就存在著采用AAT制劑進(jìn)行替代治療的需求。另外AAT和其他血液制品聯(lián)用，如和抗凝血酶III用于彌散性血管內(nèi)凝血；AAT和蛋白C聯(lián)用可保護(hù)機(jī)體正常細(xì)胞和組織器官不受蛋白酶的破壞，抑制感染和炎癥，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。由于AAT的功能及潛在價(jià)值受到臨床醫(yī)生越來(lái)越多的關(guān)注，被認(rèn)為最有潛力的幾個(gè)血液蛋白制品之一。我國(guó)人口眾多，吸煙人數(shù)巨大，患肺部疾病的人不在少數(shù)，至今國(guó)內(nèi)沒(méi)有商品供應(yīng)臨床治療需要。開發(fā)AAT能有利于寶貴的血漿資源的綜合利用，極大地提升血漿蛋白生產(chǎn)的附加利潤(rùn)。因此開展AAT的研發(fā)不僅有很好的經(jīng)濟(jì)效益而且會(huì)有極佳的社會(huì)效益。
隨著國(guó)內(nèi)血漿蛋白分離技術(shù)的發(fā)展，Kistler與Nitschmann法及其改良法也廣泛地為國(guó)內(nèi)廠家所采用。
經(jīng)典Kistler和Nitschma皿法分離白蛋白流程如圖l所示。改良Ki st 1 er和Ni t schmann法分離白蛋白流程如圖2所示。
改良Kistler和Nitschma皿法(簡(jiǎn)稱改良K-N法)確實(shí)提升了主要血漿蛋白制品白蛋白的收率。但也造成了一些問(wèn)題， 一些重要的血漿蛋白制品如a廣抗胰蛋白酶等制備困難。國(guó)際上有一些廠家及研究者，如法國(guó)伯爾諾夫等Burnouf et al "Biochemical andBiological Properties of an ai- antitrypsin Concentrate" Vox Sang52:291-297(1987)應(yīng)用Kistler與Nitschmann法的組份八或組份八+I上清經(jīng)層析柱進(jìn)行分離純化a廣抗胰蛋白酶，該方法存在對(duì)設(shè)備要求較高，需要大規(guī)模的層析系統(tǒng)及配套設(shè)施，操作時(shí)間較長(zhǎng)等缺陷，這是20多年以來(lái)一直困擾本領(lǐng)域技術(shù)人員的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種用改良Kistler和附化(*1^皿法組份八+ I上清制備富含a廣抗胰蛋白酶組份的方法。
本發(fā)明方法的技術(shù)方案是通過(guò)調(diào)整改良1(-^去組份八+I上清的蛋白濃度、pH、乙醇濃度、電導(dǎo)、溫度等五項(xiàng)參數(shù)后制備所述富含a廣抗胰蛋白酶的組份；其中蛋白濃度1.6g/100ml、 pH: 5.00 5.20、乙醇濃度18% 25% (體積百分比，下同)、電導(dǎo)7. 0ms 8.5ms 、溫度-4.5°C -5.5°C。
進(jìn)一步的，使用以下具體步驟制備上述富含a i —抗胰蛋白酶的組份
a、 用pH 4. O醋酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)體積為Vo 、蛋白濃度為Po的改良K- ^去組份八+I上清至pH 5. 00 5. 20;
b、 將冷卻至-4. 5°C -5. 5卩的^(]1/乙醇混合液加入改良改良1(- ^去組份八+I上清，所使用的NaCl/乙醇混合液的體積記為VB; VB = VT-V0;
c、 確認(rèn)體系的pH5. 00 5. 20、溫度-4.5。C -5. 5"C及電導(dǎo)7. 0ms 8. 5ms，最終蛋白濃度Pl為1.6 g/100ml，此時(shí)體系的總體積記為VT ;
d、 將體系于溫度-4. 5°C -5. 5"C攪拌1小時(shí)，-4. 5°C -5. 5"C靜置過(guò)夜后離心，過(guò)濾收集沉淀，即得富含a工一抗胰蛋白酶的組份；
其中上述VO為待處理的改良K- N法組份A+I上清初始體積，單位L;Po為待處理的改良K- N法組份A+I上清蛋白濃度，單位g/100ml;Pl為最終蛋白濃度，單位g/100ml;
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一 本發(fā)明方法的確立本發(fā)明經(jīng)多次試驗(yàn)摸索和預(yù)實(shí)驗(yàn)，重點(diǎn)對(duì)pH、乙醇濃度并增加了以電導(dǎo)值測(cè)定來(lái)確定沉淀時(shí)離子強(qiáng)度這幾個(gè)參數(shù)來(lái)進(jìn)行篩選、優(yōu)化。
表l使用改良K-N法組份A+ I上情制備富含C^-抗胰蛋白酶的組份
批號(hào)溫度 cc )蛋白 濃度 W)電導(dǎo) (mS/C M)pH乙醇 濃度 (%)沉淀 (g)04含量W活性備注
20040401_51. 67. 045. 131858. 526. 110. 0沉淀量 少
20040402_51. 68. 725. 151874. 339. 225. 2
20040503_51. 67. 995. 1718肌836. 622. 3
20041104-51. 67. 255. 121887. 018. 616. 3
20041105_51. 68. 505. 101875. 036. 233. 0
20050106_51. 67. 505. 1025345. 07. 54. 2純度低
20050207-51. 68. 205. 0420149. 012. 614. 9純度低
20050308_51. 68. 295. 101912219. 017. 0
20050409_51. 67. 85. 05189216. 511. 8
20050510_51. 67. 925. 071877. 322. 217. 1
20050511_51. 67. 885. 101879. 523. 716. 0
20050612_51. 68. 205. 101873. 036. 328. 8
20050613_51. 67. 995. 001870. 834. 826. 0
在充分考慮沉淀量和a r抗胰蛋白酶的含量及活性的平衡后，優(yōu)選后確定蛋白濃度:
5VB為補(bǔ)加入改良K- N法組份A+I上清的NaCl/乙醇混合液體積，單位L;VT為步驟c處理后體系的總體積，單位L。其中，上述方法步驟b中所述的NaCl/乙醇混合液中的乙醇濃度系以滿足最終體系的乙醇濃度18% 25%為準(zhǔn)。
優(yōu)選的，上述方法步驟b中所述的NaC 1 /乙醇混合液中的乙醇濃度系以滿足最終體系的乙醇濃度18%為準(zhǔn)。
上述方法步驟b中所述的NaCl/乙醇混合液是先將乙醇溶液預(yù)冷至-7。C以下，然后將NaCl用少量注射用水溶解后，加入乙醇中充分?jǐn)嚢?，用注射用水補(bǔ)足體積至VB即得。NaCl使用量二VbXO. 6%+VTX0. 2%(公式中0. 6%、 0. 2%為質(zhì)量百分比g/100ml，即O. 6%=0. 6g/100ml， 0.2%=0.2 g/100ml，下同)，以使最終體系VT的電導(dǎo)控制在7. 0 8. 5ms為準(zhǔn)，優(yōu)選7. 5 8. 5ms。
本發(fā)明的有益效果在于為了解決現(xiàn)有技術(shù)對(duì)設(shè)備要求高，需要大規(guī)模的層析系統(tǒng)及配套設(shè)施，操作時(shí)間較長(zhǎng)等缺陷，本發(fā)明創(chuàng)造性地提出使用改良Kistler和Nitschma皿法組份A+ I上清進(jìn)行一步沉淀，制備富含a r抗胰蛋白酶的組份，以便進(jìn)一步將制備得到的富含a廣抗胰蛋白酶劑的組份進(jìn)行純化提取a廣抗胰蛋白酶的思路。本發(fā)明方法操作較簡(jiǎn)單，能大幅度降低制備a r抗胰蛋白酶的設(shè)備投資，極大的縮小操作體積，能很好的克服現(xiàn)有技術(shù)對(duì)設(shè)備要求高，需要大規(guī)模的層析系統(tǒng)及配套設(shè)施，操作時(shí)間較長(zhǎng)等缺陷，純化效率也得到了提高。解決了本領(lǐng)域長(zhǎng)期以來(lái)希望解決的技術(shù)難題。另外本發(fā)明方法中開發(fā)的制備上述富含a廣抗胰蛋白酶的組份的工藝步驟簡(jiǎn)便，a廣抗胰蛋白酶含量高，活性強(qiáng)，使改良K-N法組份A— I上清得到了充分的應(yīng)用，具有很好的應(yīng)用前景。


圖1是經(jīng)典Ki st 1 er和Ni t schma皿法分離白蛋白流程示意圖。圖2是改良Kistler和Nitschma皿法分離白蛋白流程示意圖。1.6 g/100ml; pH: 5.00 5.20，優(yōu)選5. 05 5. 17;乙醇體積百分濃度18% 25%，優(yōu)選18%;電導(dǎo)7. 0ms 8. 5ms，優(yōu)選7. 5 8. 5ms;溫度-5"C等參數(shù)進(jìn)行操作。優(yōu)化后的具體操作方式應(yīng)為
1. 取改良K-N法組份A+I上清Vo (L)。測(cè)定蛋白濃度。
2. pH 4. 0醋酸鹽緩沖液，調(diào)改良K-^去組份八+I上清至pH 5. 00 5. 20。
3. 將25。/。乙醇溶液預(yù)冷至-7。C以下，按下式計(jì)算25。/。乙醇需要量二(VtX18—VoX20)/25;(NaCl/乙醇混合液中的乙醇濃度系為了滿足最終體系的乙醇濃度(18% 25%)為準(zhǔn)
。如為了滿足最終體系為25%的乙醇濃度，可使用32%乙醇，用量的計(jì)算公式可相應(yīng)地調(diào)整為32。/。乙醇需要量二(VTX18—VoX20)/ 32)。VT= (V0XP0)/P1，最終蛋白濃度為Pi。
4. NaCl需要量^VB+VA) XO. 6%+VTX0. 2%，最終電導(dǎo)控制在7. 0 8. 5ms。將NaCl用少量注射用水溶解后，混入乙醇，用注射用水樸足至Vb ， VB = VT-Vo，VB體積的NaC1/乙醇混合液需冷卻至-5。C 。
5. 將-5。CNaCl/乙醇混合液加入制品。
6. 復(fù)測(cè)pH、溫度及電導(dǎo)。溫度-4. 5°C —5. 5"C，攪拌1小時(shí)。-5"C靜置過(guò)夜，約20小時(shí)。
7. 次日晨離心或過(guò)濾收集沉淀，上清液進(jìn)行改良K-N法的后繼操作。其中
Vo為改良K-N法組份A+I上清體積，單位L。Po為改良K-N法組份A+I上清蛋白濃度，單位g/100ml。Pi為最終蛋白濃度，單位g/100ml。
VB為補(bǔ)加入改良K-N法組份A+I上清的NaCl/乙醇混合液體積，單位L。VT為制備體系的總體積，單位L。實(shí)施例二使用本發(fā)明方法制備a廣抗胰蛋白酶
1、 實(shí)驗(yàn)批次20050510:取Vo 6L改良K-^去組份八+I上清，蛋白濃度PO 。制品降溫至-5°C (HC2050低溫循環(huán)儀，重慶恒達(dá)儀器廠)?？傮w積最終應(yīng)為VT = (VoXP0)/1.6為10.72L 。
2、 使用pH 4.0醋酸鹽緩沖液調(diào)改良1(^法組份八+I上清pH為5.14，用量為65ml 。
3、 按下式計(jì)算25。/。乙醇需要量二(VtX18—VoX20)/ 25為2. 918L，按下式計(jì)算NaCl需要量二VBXO. 6%+VTX0. 2%，為49. 75g。
4、 將NaCl用注射用水溶解后，混入上述預(yù)冷至-7'C的25。/。乙醇溶液，用注射用水補(bǔ)足至VB 4. 72L， NaCl/乙醇混合液溫度冷卻至-5。C。
5、 將NaCl/乙醇混合液加入體系，總體積VT為IO. 72L，混合液溫度-5"C。
6、 復(fù)測(cè)pH5.07，電導(dǎo)7.92ms.溫度攪拌l小時(shí)，靜置過(guò)夜。
7、 次日離心(轉(zhuǎn)速10000rpm)收集沉淀77. 3g富含a廣抗胰蛋白酶組份的沉淀(AvantiJ-25 BECKMANCOULTER )，經(jīng)檢測(cè)，每g沉淀a廣抗胰蛋白酶含量22. 2mg/g，具有生物活性的a廣抗胰蛋白酶17.09mg/g。
按照實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算，6L改良K-N法組份A+I上清，相當(dāng)于5L血漿，故l噸血漿照本發(fā)明能夠制備富含a i-抗胰蛋白酶組份15kg。每g沉淀a i-抗胰蛋白酶含量22. 2mg， 15kg組份含有a廣抗胰蛋白酶340g。
相比于實(shí)例中改良K-N法組份A+I上清6L，本發(fā)明制備的富含ai-抗胰蛋白酶的組份77.3g，經(jīng)15 20倍體積溶解(1.16 1.54L)后按"Biochemical and BiologicalProperties of an a i- antitrypsin Concentrate" Vox Sang 52 :291-297 (1987)中記載方法的或其他的現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步層析純化，也減小了操作體積75%以上，故層析系統(tǒng)的規(guī)模及投資也有大幅度的降低，純化效率也更高。由此可見本發(fā)明提供了一種從Kistler和Nitschma皿組份制備富含a i-抗胰蛋白酶組分的新方法，為a i-抗胰蛋白酶的制備提供了新的思路和途徑。
權(quán)利要求
1.一種從改良K-N法A+I上清中提取富含α1-抗胰蛋白酶組份的方法。
2 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于通過(guò)調(diào)整改良K-N法組份A+I上清的蛋白濃度、pH、乙醇濃度、電導(dǎo)、溫度，制備富含G l-抗胰蛋白酶的組份；其中蛋白濃度1.6 g/100ml 、 pH: 5. 00 5. 20、乙醇濃度18% 25%、電導(dǎo)7. 0ms 8.5ms 、溫度-4.5 -5.5。C。
3 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于使用以下步驟制備富含Q i-抗胰蛋白酶的組份a、 用pH4.0醋酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)體積為Vo、蛋白濃度為Po的改良K- ^去組份八+I上清至pH 5. 00 5. 20;b、 將冷卻至-4. 5°C -5. 51:的^(]1/乙醇混合液加入改良1(- ^去組份八+I上清，所使用的NaCl/乙醇混合液的體積記為vb; vb = vt—v0;c、 確認(rèn)體系的pH5. 00 5. 20、溫度-5"C及電導(dǎo)7. 0ms 8. 5ms，最終蛋白濃度^為1.6g/100ml，此時(shí)體系的總體積記為vt;d、 將體系于溫度-4. 5°C -5. 5"C攪拌1小時(shí)，-4. 5°C -5. 5"C靜置過(guò)夜后離心收集沉淀，即得富含。i-抗胰蛋白酶的組份；其中上述Vo為待處理的改良K- N法組份A+I上清初始體積，單位L;Po為待處理的改良K- N法組份A+I上清蛋白濃度，單位g/100ml;^為最終蛋白濃度，單位g/100ml;vb為補(bǔ)加入改良K- N法組份A+I上清的NaCl/乙醇混合液體積，單位L;vt為步驟c處理后體系的總體積，單位L。
4 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟b中所述的NaCl/乙醇混合液中的乙醇濃度系以滿足最終體系的乙醇濃度18 % 25 %為準(zhǔn)。
全文摘要
本發(fā)明屬于血漿蛋白制備領(lǐng)域，具體涉及運(yùn)用改良K-N法組份A+I上清制備α₁-抗胰蛋白酶的方法。本發(fā)明方法的技術(shù)方案是通過(guò)調(diào)整改良K-N法組份A+I上清的蛋白濃度、pH、乙醇濃度、電導(dǎo)、溫度等五項(xiàng)參數(shù)，制備富含α₁-抗胰蛋白酶的組份。本發(fā)明方法操作較簡(jiǎn)單，能大幅度降低制備α₁-抗胰蛋白酶的設(shè)備投資，極大的縮小操作體積，克服現(xiàn)有技術(shù)對(duì)設(shè)備要求高，需要大規(guī)模的層析系統(tǒng)及配套設(shè)施，操作時(shí)間較長(zhǎng)等缺陷，純化效率也得到了提高，具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07K14/81GK101602804SQ200910302098
公開日2009年12月16日 申請(qǐng)日期2009年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月5日
發(fā)明者波 劉, 強(qiáng) 吳, 李澤林, 駿 蔡 申請(qǐng)人:成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司