專(zhuān)利名稱(chēng)：：甘草中g(shù)lycyrrhisoflavone的篩選方法﹑提取方法﹑含量測(cè)定方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥材有效成分的分析、提取技術(shù)，還涉及化工技術(shù)，特別是甘草中g(shù)lycyrrhisoflavone的確認(rèn)方法、提取方法、含量測(cè)定方法及用途。
背景技術(shù)：
：抑制a-葡萄糖苷酶可以顯著降低進(jìn)食碳水化合物后的血糖濃度，因此可以成為調(diào)節(jié)II型糖尿病人及高危人群餐后血糖濃度的重要方法，參見(jiàn)RammohanSubramanian.M.ZainiAsmawiandAmirinSadikun.2008.Invitroa—glucosidaseanda—amylaseenzymeinhibitoryeffectsofAndrogr即hispaniculataextractandandrographolide.ActaBiochemicapolonica55(2):391-398。同時(shí)，ct-葡萄糖苷酶抑制劑易與其他類(lèi)型糖尿病治療藥物并用等種種因素，都使a-葡萄糖苷酶抑制劑成為糖尿病治療中的重要藥物。目前臨床使用的a-葡萄糖苷酶抑制劑主要包括阿卡波糖(Acarbose)，伏格列波糖(Voglibose)和米格列醇(Miglitol)三種。然而，阿卡波糖和伏格列波糖具有強(qiáng)烈的腸道副作用，以及由于其分解產(chǎn)物在腸道內(nèi)吸收而引起的肝損傷副作用。而米格列醇雖然降低了腸道副作用，而且尚無(wú)肝損傷副作用報(bào)道，但其臨床用量的1/2以未變化體形式在小腸上部被吸收，對(duì)體內(nèi)的存在的a-葡萄糖苷酶的影響仍然需要關(guān)注。基于以上，作為糖尿病治療藥物的新型a-葡萄糖苷酶抑制劑的研制與開(kāi)發(fā)仍須進(jìn)一步研發(fā)和完善。甘草為豆科(Leguminosae)甘草屬(Glycyrrhiza)植物的根和根狀莖，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中作為上品收載，其主要功效是和中緩急、潤(rùn)肺、解毒、調(diào)和諸藥等，是臨床應(yīng)用最為廣泛的傳統(tǒng)中藥。甘草含有多種活性成分為皂苷類(lèi)、黃酮類(lèi)和異黃酮類(lèi)化合物。其黃酮類(lèi)成分有治療糖尿病的生物活性，參見(jiàn)KakuNakagawa，HideyukiKishida;NaokiArai，TozoNishiy咖a，andTats咖asaMae.2004.LicoriceflavonoidssuppressabdominalfataccumulationandincreaseinbloodglucoselevelinobesediabeticKK_AyMiceBiol.Pharm.Bull27(11)，1775-1778。Glycyrrhisoflavone—詞沒(méi)有規(guī)范的中文譯文，屬于黃酮類(lèi)物質(zhì)，Isoflavone是異黃酮的意思。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供一種甘草中g(shù)lycyrrhisoflavone的篩選方法；本發(fā)明的目的之二是提供兩種甘草中g(shù)lycyrrhisoflavone的提取方法；本發(fā)明的目的之三是提供一種glycyrrhisoflavone的用途；本發(fā)明的目的之四是提供一種甘草中g(shù)lycyrrhisoflavone含量的定量分析方法。本發(fā)明的目的按照下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)3甘草中g(shù)lycyrrhisoflavone的篩選方法，包括以下工藝過(guò)程1)甘草乙醇提取物(LF)用水懸濁后使用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯層LE。2)利用silica對(duì)LE進(jìn)行柱層析，依次使用氯仿，氯仿_甲醇和氯仿_甲醇_水系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)流出液依照硅膠薄層層析結(jié)果進(jìn)行合并，得到14個(gè)分離部位LEl-9，LEa-e;在Img/mL濃度下進(jìn)行a-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定，LE8對(duì)蔗糖酶和麥芽糖酶的抑制活性最高。3)利用反相ODS硅膠柱對(duì)LE8進(jìn)行層析，使用甲醇_水和甲醇系統(tǒng)進(jìn)行洗脫，得到2個(gè)分離部位LE81，LE82，分離部位LE81在Img/mL濃度下對(duì)蔗糖酶和麥芽糖酶的抑制活性最高。4)LE81上高效液相色譜，使用甲醇_水_含三氟乙酸進(jìn)行洗脫，得到9個(gè)分離部位LE811-819;分離部位LE818在Img/mL濃度對(duì)蔗糖酶和麥芽糖酶的抑制活性最高。5)通過(guò)核磁共振法確定了LE818的結(jié)構(gòu)，為化合物glycyrrhisoflavone，其分子式為(:2。111806，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為甘草中g(shù)lycyrrhisoflavone的一種提取方法，其工藝過(guò)程為將甘草乙醇提取物用水混懸后加入乙酸乙酯提取，乙酸乙酯層上silica柱層析進(jìn)一步分離，氯仿_甲醇洗脫，根據(jù)硅膠薄層層析結(jié)果將含有g(shù)lycyrrhisoflavone的部分進(jìn)行合并，上高效液相色譜，使用甲醇-水-三氟乙酸進(jìn)行洗脫，得到含有g(shù)lycyrrhisoflavone的部分，再利用HP-20大孔樹(shù)脂柱除去三氟乙酸，得到glycyrrhisoflavone。甘草中g(shù)lycyrrhisoflavone的另一種提取方法，將甘草乙醇提取物上HP-20大孔樹(shù)脂，依次用甲醇_水、甲醇洗脫，含有g(shù)lycyrrhisoflavone部分上silica柱層析進(jìn)一步分離，氯仿-甲醇洗脫，根據(jù)硅膠薄層層析結(jié)果將含有g(shù)lycyrrhisoflavone的部分進(jìn)行合并，上高效液相色譜，流動(dòng)相甲醇_水_三氟乙酸，根據(jù)高效液相色譜儀檢查結(jié)果，得到含有g(shù)lycyrrhisoflavone的部分，再利用HP-20大孔樹(shù)脂柱除去三氟乙酸，得到glycyrrhisoflavone。glycyrrhisoflavone作為a-葡萄糖苷酶抑制劑在制備治療或預(yù)防II型糖尿病藥物與保健食品上的應(yīng)用。甘草中g(shù)lycyrrhisoflavone含量的定量分析方法，采用高效液相色譜法，色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相乙腈-水-三氟乙酸；流速1.2mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)260nm;柱溫40。C;進(jìn)樣量lOiiL;以標(biāo)準(zhǔn)glycyrrhisoflavone為對(duì)照品，用甲醇溶解制成對(duì)照品溶液，分濃度上柱進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)所測(cè)數(shù)據(jù)回歸線(xiàn)性方程式；供試品的準(zhǔn)備定量甘草樣品用甲醇溶液超聲提取，提取液減壓蒸干，加甲醇使溶解，過(guò)濾，濾液置于25mL量瓶中，加甲醇至刻度，供試品進(jìn)柱測(cè)定，根據(jù)測(cè)定值通過(guò)線(xiàn)性方程式得出含量值。本發(fā)明采用多種儀器分析方式，結(jié)合a-葡萄糖苷酶抑制活性篩選方法，確認(rèn)了4甘草提取物中的glycyrrhisoflavone，并提供了從甘草中提取glycyrrhisoflavone的方法，該方法可最大限度的富集甘草中的glycyrrhisoflavone，該提取物可以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成為作為治療與預(yù)防II型糖尿病的新型藥物及保健食品上應(yīng)用，本發(fā)明還提供了一種a-葡萄糖苷酶抑制劑的新的高效液相色譜定量方法，該方法快速、簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，為控制甘草及其產(chǎn)品的質(zhì)量提供了可行的方案。具體實(shí)施例方式—、Glycyrrhisoflavone的活性篩選(1)甘草95%乙醇提取物(LF)用水懸濁后使用乙酸乙酯及正丁醇萃取得到乙酸乙酯層(LE)，乙酸乙酯提取部(LE)利用silica柱層析，依次使用氯仿(5.5L)，氯仿-甲醇(97:3)(1.5L)，氯仿-甲醇(95:5)(4L)，氯仿-甲醇(93:7)(5L)，氯仿-甲醇(9:1)(5L)和氯仿-甲醇-水(60:20:3)(4L)，氯仿-甲醇-水(60:29:6)(4L)，氯仿-甲醇-水(6:4:1)(4.5L)系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)分離部位500mL共得到67個(gè)分離部位，依照硅膠薄層層析結(jié)果進(jìn)行合并，得到14個(gè)分離部位LE1-14;在lmg/mL濃度下進(jìn)行a-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定，LE8活性最強(qiáng)，對(duì)蔗糖酶和麥芽糖酶的抑制活性分別為20.7%和47.5%。(2)甘草黃酮分離部位LE8利用反相ODS硅膠柱層析，使用甲醇_水(70:30)(500mL)和甲醇(500mL)系統(tǒng)進(jìn)行洗脫，分別得到分離部位LE81和LE82;兩分離部位分別在lmg/mL濃度評(píng)價(jià)了其對(duì)a-葡萄糖苷酶的抑制活性，分離部位LE81抑制活性較強(qiáng)，對(duì)蔗糖酶和麥芽糖酶的抑制活性分別為56.8%和80.0%。甘草黃酮分離部位LE81利用JASCOPU-1580高效液相色譜儀，ShodexRI-71示差檢測(cè)器，WatersX-BridgeODS制備柱，流速為5mL/min，流動(dòng)相甲醇-0.06X三氟乙酸70:30(v/v)，使用甲醇-水(含0.06%三氟乙酸)進(jìn)行洗脫，得到9個(gè)分離部位LE811-819;各分離部位分別在lmg/mL濃度評(píng)價(jià)了其對(duì)a_葡萄糖苷酶的抑制活性；在各分離部位中，保留時(shí)間為35.4min的分離部位LE818抑制活性最強(qiáng)，在lmg/mL濃度時(shí)，對(duì)蔗糖酶和麥芽糖酶的抑制活性分別為117.8%和129.1%，完全抑制了蔗糖酶和麥芽糖酶的活性；(3)通過(guò)核磁共振法確定了LE818的結(jié)構(gòu)，為化合物glycyrrhisoflavone,該化合物具有下述光譜化學(xué)和物理特性。分子式C2。H1806ESI-MS(positive)m/z:377[M+Na]+力NMR(400MHz，CD30D)(S)1.73(6H，s)，3.34(2H，d，J=7.6Hz)，5.34(1H，brt)，6.22(1H，d，J=2.1Hz)，6.34(1H，d，J=2.1Hz)，6.72(1H，d，J=2.0Hz)，6.87(1H，d，J=2.3Hz)，7.99(1H，s).二、提取方法兩種甘草種化合物glycyrrhisoflavone的提取分離方法主要步驟如下(1)將50g寧夏烏拉爾甘草分別用95X乙醇8L，6.4L，4.8L在75。C回流提取三次，分別提取2小時(shí)，2小時(shí)，1小時(shí)，回流液過(guò)濾，減壓濃縮，得到的浸膏在7(TC下干燥，粉碎得固體10g。將所得固體用水混懸后加入乙酸乙酯提取，乙酸乙酯層上silica柱層析(填料高25cm，柱直徑3.4cm)進(jìn)一步分離，用氯仿_甲醇95:5洗脫，根據(jù)硅膠薄層層5析結(jié)果將含有g(shù)lycyrrhisoflavone的部分進(jìn)行合并，旋干后得固體0.301g。利用JASCOPU-1580高效液相色譜儀，ShodexRI-71示差檢測(cè)器，WatersX-BridgeODS柱制備柱，流速為5mL/min，流動(dòng)相甲醇-0.06X三氟乙酸70:30(v/v)使用甲醇-水(含0.06%三氟乙酸)進(jìn)行洗脫制備，根據(jù)高效液相色譜儀檢查結(jié)果，得到含有g(shù)lycyrrhisoflavone的部分，再利用HP-20大孔樹(shù)脂柱用30%甲醇洗脫至洗脫液呈中性除去三氟乙酸，旋干后得到glycyrrhisoflavonelO.05mg(2)將50g寧夏烏拉爾甘草分別用乙醇8L，6.4L，4.8L在75°C回流提取三次，分別提取2小時(shí)，2小時(shí)，1小時(shí)，回流液過(guò)濾，減壓濃縮，得到的浸膏在7(TC下干燥，粉碎得固體10g。將所得固體上HP-20大孔樹(shù)脂柱(填料高40cm，柱直徑3.4cm)，依次用甲醇-水70:30、甲醇-水90:10、甲醇各1000ml洗脫，根據(jù)高效液相色譜儀檢查結(jié)果90%甲醇部分含有g(shù)lycyrrhisoflavone,旋干的得固體1.446g。將HP-20大孔樹(shù)脂柱所得樣品上silica柱層析(填料高25cm，柱直徑3.4cm)進(jìn)一步分離，用氯仿_甲醇95:5洗脫，根據(jù)硅膠薄層層析結(jié)果將含有g(shù)lycyrrhisoflavone的部分進(jìn)行合并，旋干后得固體0.262g。利用JASC0PU-1580高效液相色譜儀，ShodexRI-71示差檢測(cè)器，WatersX-BridgeODS柱制備柱，流速為5mL/min，流動(dòng)相甲醇-0.06X三氟乙酸70:30(v/v)使用甲醇-水(含0.06%三氟乙酸)進(jìn)行洗脫制備，根據(jù)高效液相色譜儀檢查結(jié)果，得到含有g(shù)lycyrrhisoflavone的部分，再利用HP-20大孔樹(shù)脂柱用30%甲醇洗脫至洗脫液呈中性除去三氟乙酸，旋干后得至Llglycyrrhisoflavone10.83mg。將上述a-葡萄糖苷酶的抑制活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)敘述如下(1)基質(zhì)的配置將蔗糖、麥芽糖分別配制成20mg/mL的溶液，作為活性測(cè)定的基質(zhì)。56iim馬來(lái)酸溶液的配置取馬來(lái)酸0.56g，加蒸餾水100mL，溶解后，用水酸化的Na0H溶液調(diào)pH值到6.0。(2)粗酵素液的配置大鼠腸管粉末100mg，用56i!m馬來(lái)酸溶液900iiL超聲提取20分鐘，離心分離(4°C，3000rpm，10min)，取上清液，冷凍保存。(3)測(cè)定用酵素溶液的配置取粗酵素液，用56iim馬來(lái)酸溶液按1:1(蔗糖)和1:40(麥芽糖)的比例稀釋(使測(cè)定的吸光度<1.3)(4)樣品溶液的配置將GU818用甲醇配置成0.05mg/mL，0.lmg/mL，0.5mg/mL以及l(fā)mg/mL的一系列濃度的溶液。樣品溶液的混合如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>精密量取含GU818對(duì)照品溶液(50yg/mL)20yL，重復(fù)進(jìn)樣5次測(cè)定峰面積，RSD為0.3%(n=5)。(5)線(xiàn)性關(guān)系的測(cè)定將GU818對(duì)照品用甲醇配置成每lmL含5，10，50，100，200和500yg的溶液，各取20iiL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，測(cè)定結(jié)果GU818在濃度(5500)yg/mL之間線(xiàn)性關(guān)系良好，回歸方程:Y=0.0272X-0.0472(Y為峰面積X10-6)R2>0.999。(6)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的測(cè)定取寧夏鹽池縣甘草樣品，取4份，每份2g，按含量測(cè)定的方法測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)定3次，RSD=2%。(7)回收率實(shí)驗(yàn)的測(cè)定取寧夏鹽池縣甘草樣品，取4份，每份lg，分別加入不同量的GU818對(duì)照品按含量測(cè)定的方法測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)定3次，回收率為98.2%-102.0%.RSD=1.8%。權(quán)利要求甘草中g(shù)lycyrrhisoflavone的篩選方法，包括以下工藝過(guò)程1)甘草乙醇提取物(LF)用水懸濁后使用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯層LE。2)利用silica對(duì)LE進(jìn)行柱層析，依次使用氯仿，氯仿-甲醇和氯仿-甲醇-水系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)流出液依照硅膠薄層層析結(jié)果進(jìn)行合并，得到14個(gè)分離部位LE1-14；在1mg/mL濃度下進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定，LE8對(duì)蔗糖酶和麥芽糖酶的抑制活性最高。3)利用反相ODS硅膠柱對(duì)LE8進(jìn)行層析，使用甲醇-水和甲醇系統(tǒng)進(jìn)行洗脫，得到2個(gè)分離部位LE81，LE82，分離部位LE81對(duì)蔗糖酶和麥芽糖酶的抑制活性最高。4)LE81上高效液相色譜，使用甲醇-水-含三氟乙酸進(jìn)行洗脫，得到9個(gè)分離部位LE811-819；分離部位LE818在1mg/mL濃度對(duì)蔗糖酶和麥芽糖酶的抑制活性最高。5)通過(guò)核磁共振法確定了LE818的結(jié)構(gòu)，為化合物glycyrrhisoflavone，其分子式為C20H18O6，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為2.甘草中g(shù)lycyrrhisoflavone的提取方法，其工藝過(guò)程為將甘草乙醇提取物用水混懸后加入乙酸乙酯提取，乙酸乙酯層上silica柱層析進(jìn)一步分離，氯仿-甲醇洗脫，根據(jù)硅膠薄層層析結(jié)果將含有g(shù)lycyrrhisoflavone的部分進(jìn)行合并，上高效液相色譜，使用甲醇_水_三氟乙酸進(jìn)行洗脫，得到含有g(shù)lycyrrhisoflavone的部分，再利用HP-20大孔樹(shù)脂柱除去三氟乙酸，得到glycyrrhisoflavone。3.甘草中g(shù)lycyrrhisoflavone的提取方法，將甘草乙醇提取物上HP-20大孔樹(shù)脂，依次用甲醇_水、甲醇洗脫，含有g(shù)lycyrrhisoflavone部分上silica柱層析進(jìn)一步分離，氯仿-甲醇洗脫，根據(jù)硅膠薄層層析結(jié)果將含有g(shù)lycyrrhisoflavone的部分進(jìn)行合并，上高效液相色譜，流動(dòng)相甲醇_水_三氟乙酸，根據(jù)高效液相色譜儀檢查結(jié)果，得到含有g(shù)lycyrrhisoflavone的部分，再利用HP-20大孔樹(shù)脂柱除去三氟乙酸，得到glycyrrhisoflavone。4.如權(quán)利要求1所述的glycyrrhisoflavone作為a-葡萄糖苷酶抑制劑在制備治療或預(yù)防II型糖尿病藥物與保健食品上的應(yīng)用。5.甘草中g(shù)lycyrrhisoflavone含量的定量分析方法，采用高效液相色譜法，色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相乙腈_水_三氟乙酸；流速1.2mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)260nm;柱溫40。C;進(jìn)樣量lOiiL;以標(biāo)準(zhǔn)glycyrrhisoflavone為對(duì)照品，用甲醇溶解制成對(duì)照品溶液，分濃度上柱進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)所測(cè)數(shù)據(jù)回歸線(xiàn)性方程式；供試品的準(zhǔn)備定量甘草樣品用甲醇溶液超聲提取，提取液減壓蒸干，加甲醇使溶解，過(guò)濾，濾液置于25mL量瓶中，加甲醇至刻度，供試品進(jìn)柱測(cè)定，根據(jù)測(cè)定值通過(guò)線(xiàn)性方程式得出含量值。全文摘要本發(fā)明涉及甘草中g(shù)lycyrrhisoflavone的篩選方法、提取方法、含量測(cè)定方法及用途。采用多種儀器分析方式，結(jié)合α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選方法，確認(rèn)了甘草提取物中的glycyrrhisoflavone，并提供了從甘草中提取glycyrrhisoflavone的方法，該方法可最大限度的富集甘草中的glycyrrhisoflavone，該提取物可以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成為作為治療與預(yù)防II型糖尿病的新型藥物及保健食品上應(yīng)用，本發(fā)明還提供了一種α-葡萄糖苷酶抑制劑的新的高效液相色譜定量方法，該方法快速、簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，為控制甘草及其產(chǎn)品的質(zhì)量提供了可行的方案。文檔編號(hào)C07D311/00GK101694487SQ20091011750公開(kāi)日2010年4月14日申請(qǐng)日期2009年10月13日優(yōu)先權(quán)日2009年10月13日發(fā)明者小池一男,李巍,李松沛,王英華,詹曉平申請(qǐng)人:寧夏回族自治區(qū)藥品檢驗(yàn)所;