專利名稱：調(diào)節(jié)補體組分的分子和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗原結(jié)合分子，這些分子結(jié)合的新表位，以及使用這類分子的方法。背景
衰老相關(guān)性黃斑變性(AMD)是一種進(jìn)行性疾病，是65歲以上美國人視力喪失 和致盲的主要原因。AMD主要影響黃斑，黃斑是視網(wǎng)膜的一部分，負(fù)責(zé)閱讀或駕駛所需 的高視敏度。大部分AMD患者在疾病的早期階段的特征是出現(xiàn)視網(wǎng)膜胞外沉淀，稱為脈 絡(luò)膜小疣(Drusen)。脈絡(luò)膜小疣是細(xì)胞碎片、炎癥介體和胞外基質(zhì)組分的視網(wǎng)膜細(xì)胞 外沉淀。AMD后期表現(xiàn)為干形和濕形，都與視力喪失相關(guān)。干形AMD也稱為地圖狀萎縮 (geographicatrophy)，在檢眼鏡檢中表現(xiàn)出與視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)缺失相應(yīng)的界限分 明的區(qū)域。濕形AMD與脈絡(luò)膜新血管發(fā)生有關(guān)，導(dǎo)致布魯赫膜喪失完整性，以及視網(wǎng)膜內(nèi)的 血管生長，通常發(fā)生出血。上述血液泄露導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞永久性損傷而相繼死亡，并導(dǎo)致中 央視力中的盲點。先天性人系統(tǒng)包括補體通路。補體通路幫助抵抗化膿性細(xì)菌感染，連接了先天性 和適應(yīng)性免疫；以及處理免疫復(fù)合體產(chǎn)物和炎癥損傷。補體是有多于30種蛋白質(zhì)的系統(tǒng)， 涉及在血漿和細(xì)胞表面的級聯(lián)反應(yīng)。補體系統(tǒng)及其補體組分涉及多種免疫過程。例如，補 體C5b-9復(fù)合體，也稱為膜攻擊復(fù)合體(MAC)的終末復(fù)合物，在通過誘導(dǎo)膜滲透性破壞導(dǎo)致 細(xì)胞死亡中扮演了重要的角色。近期的工作證實，補體組分C3和C5是AMD患者的脈絡(luò)膜小疣的主要組分(Mull ing，R.F.等人，(2000)FASEB J 14,835-46) 上述因子以及膜攻擊復(fù)合體(MAC)C5b_9和 其他急性期反應(yīng)物蛋白在覆蓋RPE細(xì)胞的脈絡(luò)膜小疣中的存在，已被認(rèn)為涉及觸發(fā)MAC的 補體激活和形成(Johnson，L等人，(2001)Exp Eye Res 73,887-896) 因此，不斷增加的證 據(jù)證明，補體組分不僅僅只是先天性免疫介體。已經(jīng)處方營養(yǎng)干預(yù)來抑制干形AMD向濕形AMD的發(fā)展。目前，唯一 FDA批準(zhǔn)的濕 形AMD治療包括光動力學(xué)治療(PDT)、抗VEGF適體(adtamer)，例如培加尼布，和抗VEGF抗 體ranibizumab。通常向已經(jīng)承受嚴(yán)重視覺喪失的患者施用這些藥物或療法。仍然需要開發(fā)AMD的有效療法來取代或補充現(xiàn)有療法。特別的，需要可以提供早 期檢測、預(yù)防或恢復(fù)視覺喪失的治療。概述本發(fā)明涉及補體組分C3b的表位、C3b結(jié)合分子，以及生產(chǎn)和使用所述分子的方 法。發(fā)明還提供與C3b結(jié)合的分子(即，C3b結(jié)合分子)，特別是與人C3b表位結(jié)合的抗體 及其部分，以及調(diào)節(jié)至少一種補體蛋白，或調(diào)節(jié)補體旁路和/或經(jīng)典補體通路所調(diào)節(jié)的細(xì) 胞活性。在整個說明書中，“補體通路”或“補體”表示補體旁路或經(jīng)典補體通路。在一個方面，水平被調(diào)節(jié)的補體組分蛋白是過敏毒素(anaphylotoxin)、因子H、 因子P、因子B、C3或C5轉(zhuǎn)化酶；C3分解產(chǎn)物例如C3a、C3b、iC3b和C3d，C5分解產(chǎn)物C5a 和C5b ；MAC，和MAC依賴性產(chǎn)生的補體副產(chǎn)物。
在另一個方面，發(fā)明的結(jié)合分子調(diào)節(jié)補體蛋白的酶活性。在一些方法中，被調(diào)節(jié)的酶活性是C3和/或C5轉(zhuǎn)化酶活性，C3向C3a和C3b的轉(zhuǎn)化，C5向C5a和C5b的轉(zhuǎn)化，以及 C5b-9的形成。在另一個方面，發(fā)明的特征是調(diào)節(jié)受試者中的補體蛋白的產(chǎn)生水平。方法包括，向 受試者施用C3b結(jié)合分子，所述分子調(diào)節(jié)一種或多種下列生物活性(a)抑制因子P結(jié)合C3 轉(zhuǎn)化酶；(b)抑制因子B結(jié)合C3b ； (c)競爭性或非競爭性抑制C3或C5轉(zhuǎn)化酶的蛋白水解 活性；(d)抑制C3b與C3轉(zhuǎn)化酶的結(jié)合，從而抑制C5轉(zhuǎn)化酶的形成；(e)抑制C3分解產(chǎn)物 C3a、C3b、iC3b和C3d的形成；(f)抑制C5分解產(chǎn)物C5a和C5b的形成；(g)抑制MAC形成， 和(h)抑制MAC依賴性的補體副產(chǎn)物的產(chǎn)生，包括C6、凝聚素(clus terin)、結(jié)合珠蛋白、 IgK鏈、Ig λ鏈或IgY鏈。一些方法還包括檢測來自受試者的尿、血漿、血清、全血或眼液 體的補體蛋白的水平。因此，在一方面，發(fā)明提供了 C3b結(jié)合分子，包括它的與C3b新表位結(jié)合的抗原結(jié) 合部分，其中抗原結(jié)合部分結(jié)合的新表位選自下表1列舉的氨基酸。在另一個方面，C3b結(jié)合分子與效應(yīng)子配體的親和力改變。本發(fā)明的抗C3b抗體 優(yōu)選的具有234和235位亮氨酸向丙氨酸的突變，從而消除了 FcR γ結(jié)合，并消弱了效應(yīng)子 功能。特別地，發(fā)明提供了分離的C3b結(jié)合分子，其包括與C3b新表位結(jié)合(例如，特 異性結(jié)合)的抗體的抗原結(jié)合部分，其中抗原結(jié)合部分結(jié)合人C3b的新表位，其位于下 列C3b新表位之一中或與之重疊(a)GEDTVQSLTQG(氨基酸393-403，Seq ID No 1) ； (b) DEDIIAEENIVSRSEF(氨基酸 752-767，Seq ID No 2) ； (c) IRMNKTVAVRT (氨基酸936-946，Seq ID No. 3) ； (d)SDQVPDTESET(氨基酸 968-978，Seq ID No 4) ； (e) VAQMTED (氨基酸 987-993， Seq ID NO:5) ； (f) FVKRAP (氨基酸 IO69-IO74, Seq IDNo:6) ； (g) KDKNRWEDPGKQLYN (氨基 酸 1215-1229，Seq ID No 7) ； (h) CTRYRGDQDATMS (氨基酸 1389-1401，Seq ID No 8)；⑴ GFAPDTDDLKQLANGV (氨基酸 1410-1425，Seq ID No 9)。在另一個方面，發(fā)明提供了分離的C3b結(jié)合分子，其包括與連接了第二或第三分 子的C3b新表位結(jié)合(例如，特異性結(jié)合)的結(jié)合分子的抗原結(jié)合部分。第二或第三分子可 以是游離的或附著在復(fù)合物中，例如雙鏈體或三鏈體。此類第二或第三分子可以選自C3b、 C3bBb、C4b、C4b2a、因子P、因子H、因子B或其部分。在多種方面，抗原結(jié)合部分特異性的結(jié)合人C3b的新表位，所述新表位位于下表1 列舉的一種或多種氨基酸之中，或與之重疊。在多個方面，結(jié)合分子是抗體或以抗體方式發(fā) 揮作用的分子，其可以結(jié)合線性或非線性的表位。在一個方面，在C3b分子結(jié)合非線性表位 (包括本文表1的一個或多個新表位)的情況下，所述新表位的構(gòu)象排列應(yīng)該使結(jié)合分子與 新表位的一個或多個抗原部分相互作用，而明顯產(chǎn)生期望的生物學(xué)功能。線性和非線性新 表位包括各下列線性表位的至少一部分(a) SEQ ID NO :4的氨基酸968-978，;和(b) SEQ ID NO 2的氨基酸752-762。在另一個實施里中，抗原結(jié)合部分與非線性的新表位結(jié)合，包括各 下列線性新表位的至少一部分，或由所述部分組成(a) SEQ ID NO :3的氨基酸936-946，；和 (b)SEQ ID NO :8的氨基酸1389-1401。此類結(jié)合分子可以結(jié)合非線性新表位的任意組合， 來調(diào)節(jié)通過補體通路介導(dǎo)的至少一種補體蛋白或細(xì)胞活性。在其他方面，C3b結(jié)合分子與非人靈長類(例如，食蟹猴(cynomolgusmonkey)或恒河猴(rhesus monkey))的C3b交叉反應(yīng)。在多個方面，抗原結(jié)合部分與嚙齒類物種的 C3b (例如，小鼠C3b、大鼠C3b、兔C3b)交叉反應(yīng)。在一個方面，本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合C3b，具有解離常數(shù)(Kd)等于或小于InM(例 如，0. 01ηΜ、0· 1ηΜ、0· 25ηΜ、0· 5ηΜ)。在另一個方面，C3b結(jié)合分子結(jié)合非人靈長類(例如，食蟹猴或恒河猴)的C3b新 表位，具有Kd是結(jié)合人C3b的Kd的5-10倍。在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合小鼠C3b新表位，具有Kd等于或小于 5nM,或在結(jié)合人C3b的Kd的100倍以內(nèi)。在一個方面，結(jié)合分子是嵌合的(例如，人源化的)抗體或人抗體。在另一個方面，結(jié)合分子是單克隆抗體或多克隆抗體。 C3b結(jié)合分子包括例如，抗體的Fab片段，F(xiàn)ab，片段，F(xiàn)(ab，)2，或Fv片段。在一個方面，C3b結(jié)合分子是人抗體。在一個方面，C3b結(jié)合分子包括單鏈Fv。在一個方面，C3b結(jié)合分子包括雙價抗體(例如，單鏈雙價抗體，或具有兩條多肽 鏈的雙價抗體)。在其他方面，抗體的抗原結(jié)合部分源自下列一種同種型的抗體IgGl、 IgG2、IgG3或IgG4。在另一個方面，抗體的抗原結(jié)合部分源自抗體IgA或IgE同種型。在另一個方面，方面提供了組合物，當(dāng)向動物施用所述組合物時，所述組合物引發(fā) 特異性結(jié)合C3b新表位的抗體。組合物包括，例如一種或多種本文表1列舉的肽；其具有少 于5個氨基酸改變的肽；或其部分(例如，包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個氨基酸的 片段)?？梢孕揎椊M合物，來增加抗原性，例如通過將C3b新表位或其片段偶聯(lián)至載體蛋白。在另一個方面，本發(fā)明涉及降低細(xì)胞內(nèi)MAC產(chǎn)生的方法。在一個實施方案中，可以 通過使用CH50和AH50溶血測定，來測量MAC產(chǎn)生或抑制，例如抑制雞、兔或人的紅血細(xì)胞 的溶血。如本文進(jìn)一步提供的，測定方法包括將紅血細(xì)胞與C3b結(jié)合分子接觸，從而抑制紅 血細(xì)胞上MAC的形成。在本發(fā)明的一些方法中，結(jié)合分子調(diào)節(jié)響應(yīng)活化的補體系統(tǒng)或受其調(diào)節(jié)的細(xì)胞活 性。在一些方法中，受調(diào)節(jié)的細(xì)胞活性是細(xì)胞裂解。一些方法還包括通過例如溶血測定來 檢測細(xì)胞活性。在一些方法中，檢測來自受試者的尿、血漿、血清、全血或眼液體中的細(xì)胞活 性。本發(fā)明還提供了藥物組合物，其包括本文描述的一種或多種C3b結(jié)合分子。在一 個實施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包括與人C3b表位結(jié)合的C3b結(jié)合分子(例 如，抗體或其抗原結(jié)合片段)和可藥用的載體，所述人C3b表位落入選自以下之一的C3b 新表位中，或與選自以下之一的C3b新表位重疊(a) GEDTVQSLTQG (氨基酸393-403，Seq ID No 1) ； (b)DEDIIAEENIVSRSEF(氨基酸 752-767，Seq ID No 2) ； (c) IRMNKTVAVRT (氨 基酸 936-946，Seq ID No. 3) ； (d) SDQVPDTESET (氨基酸 968-978，Seq ID No 4) ； (e) VAQMTED(氨基酸 987-993，Seq ID NO :5) ； (f) FVKRAP (氨基酸 1069-1074，Seq ID No: 6) ； (g)KDKNRWEDPGKQLYN(氨基酸 1215-1229，Seq ID No 7) ； (h) CTRYRGDQDATMS (氨基酸 1389-1401，Seq ID No 8) ； (i) GFAPDTDDLKQLANGV (氨基酸 1410-1425，Seq ID No :9)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包括與人C3b新表位結(jié)合的 C3b結(jié)合分子(例如，抗體或其抗原結(jié)合片段)和可藥用的載體，所述C3b新表位包括下列線性表位之一的至少一部分(a) SEQ ID NO 4的氨基酸968-978 ；和(b) SEQ ID NO 2的氨 基酸752-762。在一個實施方案中，C3b結(jié)合分子結(jié)合線性的C3b新表位。在另一個實施方 案中，C3b結(jié)合分子結(jié)合非線性的C3b新表位。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包括與人的非線性C3b新表位結(jié)合的C3b結(jié)合分子(例如，抗體或其抗原結(jié)合片段)和可藥用的載體，所述非線性C3b 新表位包括各下列線性表位的至少一部分，或由所述部分組成(a) SEQ ID NO :3的氨基酸 936-946，；禾口 (b)SEQ IDNO 8 的氨基酸 1389-1401。在另一個方面，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防受試者視力喪失的方法。如本文中使用的， 術(shù)語“治療”或“療法”指受試者的病癥或疾病的任何治療，包括但不限于，防止受試者發(fā)生 病癥或疾病，所述受試者對病癥或疾病是易感的，但尚未診斷患有病癥或疾??；抑制病癥或 疾病，例如阻止病癥或疾病的發(fā)展；緩解病癥或疾病，例如導(dǎo)致病癥或疾病的減退；或病癥 或疾病由病癥或疾病導(dǎo)致的病情，例如終止或減輕病癥或疾病的癥狀。如本文中使用的，當(dāng) 涉及受試者的病癥或疾病時，術(shù)語“預(yù)防”或“防止”當(dāng)關(guān)于受試者中的病癥或疾病時意指如 果尚未出現(xiàn)，則不會發(fā)展出病癥或疾病，或者如果已經(jīng)發(fā)展出病癥或疾病，則病癥或疾病不 會進(jìn)一步發(fā)展。方法包括向受試者施用包括本文描述的C3b結(jié)合分子的藥物組合物，所述 組合物的量足以調(diào)節(jié)至少一種補體蛋白的活性或水平，或者受補體通路介導(dǎo)的細(xì)胞活性。 在一些方法中，受試者具有與黃斑退化相關(guān)的病情或病癥。在其他方法中，受試者有風(fēng)險發(fā) 展出與黃斑退化相關(guān)的病癥。在一些方法中，受試者除黃斑退化相關(guān)的病癥以外，沒有其它 的補體相關(guān)疾病。特別地，受調(diào)節(jié)的補體蛋白是受試者中的C3轉(zhuǎn)化酶或C5轉(zhuǎn)化酶酶活性。可以向受試者施用的量是有效抑制MAC、C5a產(chǎn)生，或C3分解產(chǎn)物形成(例如， C3a、C3b、iC3b)的量。特別地，與施用藥物組合物之前的基線水平相比，受試者血液中的補 體活化產(chǎn)物(包括但不限于C3a和/或C5a)的濃度可以降低至少5 %、10 %、15 %、20 %、 30%、40%、50%、60% 或 75%。可以用本發(fā)明方法治療的其他疾病或病癥包括但不限于，衰老相關(guān)性黃斑退化、 北卡羅來納黃斑營養(yǎng)不良、Sorsby眼底營養(yǎng)不良、斯塔加特病、模式營養(yǎng)不良(pattern dystrophy)、貝斯特病、顯性脈絡(luò)膜小疣和malattia leventinese、視網(wǎng)膜脫落、脈絡(luò)視 網(wǎng)膜變性、視網(wǎng)膜變性、光感受器變性、RPE變性、粘多糖貯積病、視桿-視錐營養(yǎng)不良、視 錐_視桿營養(yǎng)不良、視錐變性、腎小球腎炎、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(PNH)，降低與體外循 環(huán)相關(guān)的免疫和凝血系統(tǒng)功能障礙、神經(jīng)性障礙、多發(fā)性硬化、中風(fēng)、格-巴二氏綜合征、夕卜 傷性腦損傷、帕金森氏病、不當(dāng)或不期望的補體激活的病癥、血液透析并發(fā)癥、超急性同種 異體移植排斥、異種移植排斥、在IL-2療法中白介素-2誘導(dǎo)的毒性、炎性疾病、自體免疫病 的炎癥、克隆病、成人呼吸窘迫綜合癥、熱傷包括燒傷或凍傷、缺血后再灌注病、心肌梗阻、 球囊血管成形術(shù)、心肺轉(zhuǎn)流或腎轉(zhuǎn)流中的泵后綜合癥、血液透析、腎缺血、無脈重建后的腸 系膜動脈再灌注、感染性疾病或膿毒癥、免疫復(fù)合體病和自體免疫病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系 統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、SLE腎炎、增殖性腎炎、溶血性貧血和重癥肌無力。此外，其他已知的 補體相關(guān)疾病是肺病和病癥，例如呼吸困難、咯血、ARDS、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、 肺氣腫、肺栓塞和梗塞、肺炎、致纖維化粉塵病、惰性粉塵和礦物(例如，硅、煤塵、鈹和石 棉)、肺纖維化、有機粉塵病、化學(xué)損傷(由于刺激性氣體和化學(xué)物質(zhì)，例如，氯、光氣、二氧 化硫、硫化氫、二氧化氮、氨和鹽酸)、煙損傷、熱傷(例如，燒傷、凍傷)、哮喘、過敏、支氣管縮窄、過敏性肺炎、寄生蟲病、古德帕斯徹氏綜合征、肺血管炎、免疫復(fù)合體-相關(guān)性炎癥、 自體免疫性心臟病、多發(fā)性硬化、炎性腸病、缺血-再灌注損傷、巴-西二氏綜合征、血液透 析、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、紅斑狼瘡、牛皮癬、多發(fā)性硬化、移植、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病例如阿爾茨 海默病和其他神經(jīng)變性病、aHUS、大皰性類天皰瘡或MPGN II?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的途徑施用本發(fā)明的藥物組合物，例如，皮下、靜脈或眼內(nèi)， 包括玻璃體內(nèi)。在附圖
和下文說明書中提出了本發(fā)明的一個或多個特征的細(xì)節(jié)。根據(jù)說明書和附 圖以及權(quán)利要求書，本發(fā)明的其他特征、目標(biāo)和優(yōu)點是顯而易見的。
發(fā)明詳述在經(jīng)典補體通路和補體旁路中，本發(fā)明人都發(fā)現(xiàn)識別和結(jié)合C3b新表位的結(jié)合分 子，調(diào)節(jié)C3和/或C5轉(zhuǎn)化酶的生物活性，以及MAC的產(chǎn)生。此類結(jié)合分子可用于預(yù)防和/ 或治療與經(jīng)典補體通路和/或補體旁路的異?；钚韵嚓P(guān)的的疾病，例如眼病、與黃斑變性 相關(guān)的病情，和本文描述的非眼病。因此，本發(fā)明提供了結(jié)合C3b新表位的分子，例如人抗體或其片段，其調(diào)節(jié)補體蛋 白和/或受補體通路介導(dǎo)的細(xì)胞活性。本文也提供了 C3b的新表位，以及制造和使用這些 新表位的方法。如本文中使用的，“新表位”或“新抗原”可互換的使用，是存在于C3蛋白水解切割 后的C3b上的、蛋白質(zhì)的抗原部分。在未切割時，這些C3上的新表位是不可接近的。術(shù)語“與黃斑變性相關(guān)的病情或病癥”指任意種病，其中視網(wǎng)膜黃斑變性或出現(xiàn)功 能障礙，例如，由于視網(wǎng)膜黃斑的細(xì)胞生長減少、視網(wǎng)膜黃斑的細(xì)胞(例如，RPE細(xì)胞)死亡 增加或重排，喪失正常的生物學(xué)功能，或上述事件的組合產(chǎn)生的結(jié)果。黃斑變性導(dǎo)致喪失正 常黃斑的細(xì)胞和/或胞外基質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)，和/或喪失黃斑細(xì)胞的功能。黃斑變性相關(guān)病 癥的實例包括AMD、北卡羅來納黃斑營養(yǎng)不良、Sorsby眼底營養(yǎng)不良、斯塔加特病、模式營 養(yǎng)不良、貝斯特病、顯性脈絡(luò)膜小撫(dominant drusen)禾口 malattialeventinese。術(shù)語還 涵蓋了在黃斑功能障礙和/或變性之前或之后發(fā)生的黃斑外改變。因此，術(shù)語“黃斑變性相 關(guān)性病癥”還寬泛的包括任何改變或破壞黃斑完整性或功能的病情(例如，對RPE或布魯赫 膜的破壞)。例如，術(shù)語涵蓋了視網(wǎng)膜脫落、脈絡(luò)視網(wǎng)膜變性、視網(wǎng)膜變性、光感受器變性、 RPE變性、粘多糖貯積病、視桿-視錐營養(yǎng)不良、視錐_視桿營養(yǎng)不良和視錐變性。術(shù)語“補體組分”、“補體蛋白”或“補體組分蛋白”指涉及補體系統(tǒng)激活的分子。經(jīng) 典通路的組分包括例如，Clq、Clr、Cls、C4、C2、C3、C5、C6、C7、C8、C9和C5b_9復(fù)合體(膜 攻擊復(fù)合體；MAC)。旁路組分包括，例如因子B、因子D、備解素(properdin)、H和I。術(shù)語“調(diào)節(jié)”或“調(diào)節(jié)作用”在本文中可互換的使用，指上調(diào)(即，激活或刺激(例 如，通過激動或增強))和下調(diào)(即，抑制或阻遏(例如，通過拮抗、降低或抑制))活性或生 物學(xué)過程(例如，補體過程)?！罢{(diào)節(jié)”意在描述過程的上調(diào)或下調(diào)。被某些刺激劑上調(diào)的 過程可以被該刺激劑的拮抗劑抑制。相反地，被某些調(diào)節(jié)物下調(diào)的過程可以被該調(diào)節(jié)物的 激動劑抑制。術(shù)語“補體通路相關(guān)分子”、“補體通路分子”和“補體通路相關(guān)蛋白”可互換的使 用，指在補體激活和下游細(xì)胞活性中發(fā)揮作用的各種分子，所述下游細(xì)胞活性應(yīng)答活化的 補體系統(tǒng)，或受活化的補體系統(tǒng)介導(dǎo)或觸發(fā)。包括補體通路的起始劑(initiator)(即，直接或間接觸發(fā)補體系統(tǒng)活化的分子)、在補體活化過程中產(chǎn)生或發(fā)揮作用的分子(例如，補體蛋白/酶，如C3、C5、C5b-9、因子B、因子D、MASP-1和MASP-2)，補體受體或抑制劑(例如， 凝聚素、玻連蛋白(vitronectin) XRl或⑶59)，以及受活化的補體系統(tǒng)調(diào)控或觸發(fā)的分子 (例如，膜攻擊復(fù)合體抑制因子，MACIF ；參見例如，Sugita等人，J Biochem, 106 =589-92, 1989)。因此，除本文提及的補體蛋白以外，補體通路相關(guān)分子還包括例如C3/C5轉(zhuǎn)化酶調(diào) 節(jié)子(RCA)如1型補體受體(也稱為CRl或⑶35)、2型補體受體(也稱為CR2或⑶21)、膜 輔因子蛋白(MCP或⑶46)和C4bBP ；MAC調(diào)節(jié)子如玻連蛋白、凝聚素(也稱為“SP40、40”)、 CRP、⑶59和同源限制性因子(HRF)；免疫球蛋白鏈如IgK、IgX或Ig γ ；Cl抑制子；和其 他蛋白如 CR3、CR4 (CD 11 b/18)，和 DAF(CD55)。術(shù)語“受補體通路調(diào)控的細(xì)胞活性”包括C5b_9攻擊復(fù)合體導(dǎo)致的細(xì)胞破壞、血管 通透性改變、平滑肌細(xì)胞的收縮和移動、T細(xì)胞增殖、免疫粘連、樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞 和血小板的聚集、吞噬作用、嗜中性白細(xì)胞(PMN)和巨噬細(xì)胞的遷移和活化。此外，補體通路活化導(dǎo)致由補體通路中的副產(chǎn)物參與的促炎(proinflammatory) 應(yīng)答的增加。與補體通路活化相關(guān)的病癥包括腎炎、哮喘、再灌注損傷、血液透析、類風(fēng)濕 關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、牛皮癬、多發(fā)性硬化、移植、阿爾茨海默病、aHUS、MPGN II或任 何其他的補體介導(dǎo)的疾病。與黃斑變性相關(guān)的病癥包括AMD、北卡羅來納黃斑營養(yǎng)不良、 Sorsby眼底營養(yǎng)不良、斯塔加特病、模式營養(yǎng)不良、貝斯特病、顯性脈絡(luò)膜小疣和malattia leventinese (放射狀脈絡(luò)膜小疣)、在黃斑功能障礙和/或變性之前或之后的黃斑外改 變、視網(wǎng)膜脫離、脈絡(luò)視網(wǎng)膜變性、視網(wǎng)膜變性、光感受器變性、RPE變性、粘多糖貯積病、視 桿_視錐營養(yǎng)不良、視錐_視桿營養(yǎng)不良和視錐變性。如本文中使用的，術(shù)語“受試者”包括任何人或非人動物。術(shù)語“非人動物”包括所有的非人脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，例如非 人靈長類、嚙齒類、兔、綿羊、狗、貓、馬、牛、鳥、兩棲動物、爬行動物等。如本文中使用的，術(shù)語“抗體”指完整的抗體或其抗原結(jié)合片段(即，“抗原結(jié)合部 分”)或單鏈(即，輕鏈或重鏈)或模擬物。完整的抗體是包括由二硫鍵相互連接的至少兩 條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的糖蛋白。每條重鏈包括重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為Vh)和 重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包括三個結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包括輕鏈可變區(qū)(在 本文中縮寫為和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包括一個結(jié)構(gòu)域Q。V1^nt區(qū)還可以細(xì)分為 超變區(qū)，稱為互補決定區(qū)(CDR)，其中散布著更保守的區(qū)域，稱為框架區(qū)(FR)。每個Vh和八 都包括三個⑶R和四個FR，從氨基端向羧基端以下列順序排列FR1、⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、 CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可以介 導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，包括多種免疫系統(tǒng)的細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng) 典補體系統(tǒng)的第一組分(Clq)。如本文中使用的，術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”或“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”指完整抗體的一個 或多個片段，所述片段保留了特異性結(jié)合給定抗原(例如，C3b)的能力?？梢酝ㄟ^完整抗 體的片段來實施抗體的抗原結(jié)合功能。涵蓋在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”中的結(jié)合片段 的實例包括Fab片段、由Vh、八、Q和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；F(ab)2片段，包括通過鉸 鏈區(qū)的二硫鍵連接的兩個Fab片段的雙價片段(通常一個來自重鏈，一個來自輕鏈)；由Vh 和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；由抗體單臂的\和Vh結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；單結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)片段(Ward等人，1989 Nature 341 544-546)，其由Vh結(jié)構(gòu)域組成；和分離的互補決 定區(qū)(CDR)。此外，雖然Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域，八和Vh，是由分離的基因編碼，但可以使用重組 方法，通過人工的肽接頭將其連接，使其成為單個蛋白質(zhì)鏈，其中\(zhòng)和Vh區(qū)配對形成單價分 子(稱為單鏈 Fv(scFv)，參見例如，Bird 等人，1988 Science 242 :423_426 ；和 Huston 等 人，1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85 =5879-5883)。此類單鏈抗體包括抗體的一種或多種“抗 原結(jié)合部分”。這些抗體片段是使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得的，按篩選完整抗 體的相同方法依用途篩選片段?？乖Y(jié)合部分也可以整合到單結(jié)構(gòu)域抗體、大體(maxibodies)、小體 (minibodies)、內(nèi)體(intrabodies)、二價抗體、三價抗體、四價抗體、v-NAR禾口 bi s-scFv (參見例如，Hollinger 和 Hudson, 2005, NatureBiotechnology, 23,9,1126-1136)。 抗體的抗原結(jié)合部分可以接枝到基于多肽的支架上，例如III型纖連蛋白(參見美國專利 號6，703，199，其描述了纖連蛋白多肽單體(monobody))?？乖Y(jié)合部分可以整合到包含成對串聯(lián)的Fv片段(Vh-CHI-Vh-CHI)的單鏈 分子中，和互補的輕鏈多肽一起形成成對的抗原結(jié)合區(qū)(Zapata等人，1995 Protein Eng. 8(10) 1057-1062 ；和美國專利號 5，641，870)。
如本文中使用的，“分離的C3b結(jié)合分子”指這樣的結(jié)合分子，所述結(jié)合分子基本不 含對C3b以外的抗原具有抗原特異性的分子(例如，特異性結(jié)合C3b的分離的抗體是基本 不含特異性結(jié)合C3b以外其它抗原(例如C3)的抗體)。但是，特異性結(jié)合C3b的分離的結(jié) 合分子可以與其它抗原(例如來自其它物種的C3b分子)具有交叉反應(yīng)。如果基本不含細(xì) 胞物質(zhì)，則分離的結(jié)合分子是“純化的”。如本文中使用的，術(shù)語“單克隆抗體組合物”指單分子組成的抗體分子制品。單克 隆抗體組合物表現(xiàn)出對特定表位單一的結(jié)合特異性和親和力。如本文中使用的，術(shù)語“人抗體”意在包括具有可變區(qū)的抗體，其中框架區(qū)和CDR 區(qū)都源自人源的序列。此外，如果抗體含有恒定區(qū)，恒定區(qū)也源自此類人序列，例如人種系 序列，或人種系序列的突變版本。本發(fā)明的人抗體可以包括不由人序列編碼的氨基酸殘基 (例如，通過在體外的隨機或定點誘變，或通過在體內(nèi)的體細(xì)胞突變而引入的突變)。然而， 如本文中使用的，術(shù)語“人抗體”并非意在包括這樣的抗體，所述抗體的CDR序列源自另一 種哺乳動物物種的種系(例如小鼠)，并移植到人框架序列上。術(shù)語“人單克隆抗體”指表現(xiàn)出單一結(jié)合特異性的抗體，其具有框架和CDR區(qū)都源 自人序列的可變區(qū)。在一個方面，人單克隆抗體是通過雜交瘤產(chǎn)生的，所述雜交瘤包括與永 生化細(xì)胞融合的獲得自轉(zhuǎn)基因非人動物(例如，轉(zhuǎn)基因小鼠，其基因組包含人重鏈轉(zhuǎn)基因 和輕鏈轉(zhuǎn)基因)的B細(xì)胞。如本文中使用的，術(shù)語“重組人抗體”包括任何通過重組方法制備、表達(dá)、創(chuàng)造或分 離的人抗體，例如從對于人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體動物(例如，小鼠)中，或 從所述動物制備的雜交瘤中分離的抗體；從轉(zhuǎn)化表達(dá)人抗體的宿主細(xì)胞中分離的抗體，例 如來自轉(zhuǎn)染瘤；從重組的、組合的人抗體文庫中分離的抗體；和通過任何其他涉及將部分 或全部人免疫球蛋白基因序列剪接至另一種DNA序列的方法來制備、表達(dá)、創(chuàng)造或分離的 抗體。此類重組人抗體具有可變區(qū)，其中框架和⑶R區(qū)源自人種系免疫球蛋白序列。然而，在一些方面，此類重組人抗體經(jīng)歷體外誘變(或者，當(dāng)使用人Ig序列的轉(zhuǎn)基因動物時，在體 內(nèi)進(jìn)行體細(xì)胞誘變)，從而使重組抗體的Vh和\區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列，所述序列 源自或與人種系％和\序列相關(guān)，但不天然的存在于人的人抗體種系所有組成成分中。如本文中使用的，“同種型”指通過重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類別(例如，IgM、 IgE、IgG 如 IgGl 或 IgG4)。詞組“識別抗原的抗體”和“特異性針對抗原的抗體”在本文中可以與術(shù)語“與抗 原特異性結(jié)合的抗體”互換的使用。如本文中使用的，術(shù)語“高親和力”當(dāng)指IgG抗體時，表示抗體對靶抗原具有ICT9M 或更低的Kd。如本文中使用的，“特異性結(jié)合C3b”的C3b結(jié)合分子(例如，抗體或其抗原結(jié)合部 分)意在指與C3b結(jié)合，并具有IxlO-7M或更低的Kd的C3b結(jié)合分子。本發(fā)明優(yōu)選的結(jié)合 分子與C3b新表位結(jié)合，具有等于或小于InM的Kd(例如，0.01nΜ、0· 1nΜ、0. 25nΜ、0·5nΜ)。與抗原交叉反應(yīng)的C3b結(jié)合分子(例如，抗體)指這樣的C3b結(jié)合分子，其與抗原 結(jié)合，具有IxlO-6M或更低的KD。在特定的實施方案中，C3b結(jié)合分子結(jié)合非人靈長類(例 如，食蟹猴)的C3b新表位，具有的Kd是人的Kd的5-10倍。在另一個特定的實施方案中， C3b結(jié)合分子結(jié)合小鼠的C3b新表位，具有的Kd等于人的，或在人的Kd的100倍內(nèi)。不與給定抗原交叉反應(yīng)的C3b結(jié)合分子(例如，抗體)指這樣的C3b結(jié)合分子，其 不與給定抗原可檢測的結(jié)合，或者結(jié)合具有IxlO-5M或更高的KD。在一些方面，不與抗原交 叉反應(yīng)的此類結(jié)合分子，在標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測定中，針對這些蛋白質(zhì)表現(xiàn)出基本不可檢測的結(jié)合。C3b結(jié)合分子本發(fā)明的結(jié)合分子與C3b的新表位結(jié)合，所述新表位具有與下列一個或多個新表 位至少90%相同的氨基酸序列表 1 表1的氨基酸是根據(jù)SwissProt數(shù)據(jù)庫(www. expasy. org)中登錄的C03_HUMAN 所示指導(dǎo)條例編號的。C3b結(jié)合分子可以特異性的結(jié)合線性或非線性的表位，包括選自表1的新表位。該 本發(fā)明包括的是與非線性表位結(jié)合，調(diào)節(jié)C3b生物活性的結(jié)合分子。C3b結(jié)合分子包括例如，與C3b新表位(不論游離的或復(fù)合的形式)結(jié)合的抗體， 以及包括此類抗體的抗原結(jié)合部分的多肽。C3b結(jié)合分子還包括這樣的分子，其中結(jié)合部分 不源自抗體，例如源自具有免疫球蛋白樣折疊的多肽的C3b結(jié)合分子，且其中抗原結(jié)合部分通過隨機化、選擇和親和力成熟進(jìn)行改造，而結(jié)合C3b新表位。優(yōu)選的C3b結(jié)合分子包括 抗體、其片段或人工構(gòu)建體，包括設(shè)計為模擬抗體或其片段的結(jié)合的抗體、其片段或人工構(gòu)
建體。
本發(fā)明的特征還包括不是抗體的C3b結(jié)合分子。此類C3b結(jié)合分子包括C3b結(jié) 合結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域具有與源自非抗體多肽的免疫球蛋白樣(Ig-樣)折疊的氨基酸 至少60%、65%、75%、80%、85%或90%相同的氨基酸序列，例如下列之一腱生蛋白 (tenascin)、N_鈣粘著蛋白、E-鈣粘著蛋白、ICAM、肌聯(lián)蛋白(titin) ,GCSF-受體、細(xì)胞因子 受體、糖苷酶抑制劑、抗生素色素蛋白、髓磷脂膜粘附分子P0、⑶8、⑶4、⑶2、1類MHC、T-細(xì) 胞抗原受體、⑶1、VCAM-I的C2和I-組結(jié)構(gòu)域、肌球蛋白-結(jié)合蛋白C的I組免疫球蛋白 結(jié)構(gòu)域、肌球蛋白-結(jié)合蛋白H的I組免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、端蛋白(telokin)的I組免疫球 蛋白結(jié)構(gòu)域、NCAM、顫搐蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)蛋白、生長激素受體、促紅細(xì)胞生成素受體、催乳素 受體、Y干擾素受體、β-半乳糖苷酶/葡萄糖醛酸酶、α-葡萄糖醛酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、 T-細(xì)胞抗原受體、超氧化物歧化酶、組織因子結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞色素F、綠色熒光蛋白、GroEL或 奇舌甘蛋白(thaumatin) ο通常，相對于免疫球蛋白樣折疊的氨基酸序列，C3b結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列是改 變的，使C3b結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性的結(jié)合C3b新表位(即，其中免疫球蛋白樣折疊不特異性的 結(jié)合C3) οC3b結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與纖連蛋白、細(xì)胞因子受體或鈣粘著蛋白的免疫球 蛋白樣折疊的氨基酸序列是至少60%相同的(例如，至少65%、75%、80%、85%或90%相 同)。C3b結(jié)合分子特異性結(jié)合和調(diào)節(jié)C3b的一種或多種生物活性。因此，本發(fā)明涉及這 樣的C3b結(jié)合分子，其抑制C3b與備解素、因子H、因子B、因子I、膜輔助因子和/或其復(fù)合 體的結(jié)合。相對于對照(例如，相對于缺少C3b結(jié)合分子條件下的結(jié)合)，C3b結(jié)合分子還 抑制 C3b 形成 MAC 至少 5%、10%、15%、25%或 50%。本發(fā)明的C3b結(jié)合分子抑制C3b與C3轉(zhuǎn)化酶(例如，雙分子復(fù)合體C3bBb)的結(jié) 合，而阻斷補體旁路中C5轉(zhuǎn)化酶(例如，三分子復(fù)合體C3bBbC3b)的形成。在另一個方面， C3b結(jié)合分子抑制C3b與C3轉(zhuǎn)化酶(例如，雙分子復(fù)合體C4bC2a)的結(jié)合，而阻斷經(jīng)典通路 中C5轉(zhuǎn)化酶(例如，三分子復(fù)合體C3bC4bC2a)的形成。這些生物學(xué)活性是由涉及C3蛋白 切割的反饋環(huán)路中的競爭結(jié)合機制產(chǎn)生的。因此，相對于對照(例如，相對于缺少C3b結(jié)合 分子條件下的活性)，C3b結(jié)合分子抑制C3切割至少5 %、10 %、15 %、25 %或50 %。根據(jù)本領(lǐng)域已知的和本文描述的方法，確定C3b結(jié)合分子抑制并調(diào)節(jié)一種或多種 C3b生物活性(例如，生物化學(xué)的、細(xì)胞學(xué)的、生理學(xué)或其他由于補體通路活化導(dǎo)致的生物 活性)，可以理解，這樣的C3b結(jié)合分子相對于在缺少C3b結(jié)合分子的條件下(例如，存在不 相關(guān)特異性的對照分子)觀察的結(jié)果，特定的功能性質(zhì)會產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)顯著的下降。調(diào)節(jié)C3b 生物活性的C3b結(jié)合分子產(chǎn)生此類統(tǒng)計學(xué)顯著的下降，為所測量參數(shù)的至少5%。在一些方 面，相對于對照，C3b結(jié)合分子可以使選定的功能性質(zhì)產(chǎn)生至少10%、20%、30%或50%的 下降。評估分子與多個物種的C3b，特別是與C3b表位結(jié)合的能力的標(biāo)準(zhǔn)測定法是本領(lǐng) 域已知的，包括例如，ELISA和Western印跡?？梢允褂秒谋砦桓偁帨y定來確定C3b結(jié)合分子是否與C3b的特定表位結(jié)合。例如，將C3b結(jié)合分子與對應(yīng)目標(biāo)C3b表位的肽，在飽和的肽濃度下孵育。測試預(yù)孵育的C3b結(jié)合分子與固定化C3b的結(jié)合，例如通過；Biaeore 分析。 預(yù)孵育肽對C3b結(jié)合的抑制作用表明C3b結(jié)合分子與肽表位結(jié)合(參見例如美國專利公開 20070072797)。還可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測定來評估結(jié)合動力學(xué)，例如Biaeore 分 析。下文更詳細(xì)的描述了評估C3b結(jié)合分子對C3b功能性質(zhì)的影響的檢測?？梢酝ㄟ^測量以下內(nèi)容來確定C3b抑制作用，例如(a)在體外測定中，患者血清 阻斷紅血細(xì)胞溶血的能力；(b)血清C3a或C5a水平；(c)血漿、組織或其他生物組分(例如 眼物質(zhì)或組分)中的可溶性MAC水平。在存在C3b結(jié)合分子的條件下，C5a、C3a或C5b_9 水平的降低表示C3b結(jié)合分子抑制C3b和/或它的生物活性。檢測可以使用來自受試者的多種生物學(xué)樣品，例如從任何器官、組織或細(xì)胞，以及 血液、尿或其他體液(例如，眼液體)獲得的樣品。對于一些診斷方法，優(yōu)選的樣品是眼液 體。對于其他一些方法，優(yōu)選的組織樣品是全血及其來源地產(chǎn)物，例如血漿和血清。可以從 血跡獲得血樣，例如來自格思里卡的血斑(blood-spot)。其他組織樣品的來源是皮膚、頭 發(fā)、尿、唾液、精液、糞便、汗、乳、羊水、肝、心、肌肉、腎和其他身體器官。其他組織來源是從 來自受試者的原代細(xì)胞增殖的細(xì)胞系。通常裂解組織樣品以釋放樣品中的細(xì)胞的蛋白質(zhì)和 /或核酸內(nèi)容物。然后，在檢測前，來自此類粗制裂解物的蛋白質(zhì)部分可以進(jìn)行部分或完全 純化。其它可接受本發(fā)明的C3b結(jié)合分子治療的受試者包括，除黃斑變性相關(guān)性病癥 夕卜，未患其他已知的補體相關(guān)疾病的個體。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了補體相關(guān)疾病或病癥，例如 在美國專利號6，169，068中。已知的補體相關(guān)疾病的實例包括神經(jīng)疾病、多發(fā)性硬化、中 風(fēng)、格-巴二氏綜合征、外傷性腦損傷、帕金森氏病、不當(dāng)或不期望的補體激活的病癥、血液 透析并發(fā)癥、超急性同種異體移植排斥、異種移植排斥、在IL-2療法中白介素-2誘導(dǎo)毒性、 炎性疾病、自體免疫病的炎癥、克隆病、成人呼吸窘迫綜合癥、熱傷包括燒傷或凍傷、缺血后 再灌注病、心肌梗阻、球囊血管成形術(shù)、心肺轉(zhuǎn)流或腎轉(zhuǎn)流中的泵后綜合癥、血液透析、腎缺 血、無脈重建后的腸系膜動脈再灌注、感染性疾病或膿毒癥、免疫復(fù)合體病和自體免疫病、 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、SLE腎炎、增殖性腎炎、溶血性貧血和重癥肌無 力。此外，其他已知的補體相關(guān)疾病是肺病和病癥如呼吸困難、咯血、ARDS、哮喘、慢性阻塞 性肺病(COPD)、肺氣腫、肺栓塞和梗塞、肺炎、致纖維化粉塵病、惰性粉塵和礦物(例如，硅、 煤塵、鈹和石棉)、肺纖維化、有機粉塵病、化學(xué)損傷(由于刺激性氣體和化學(xué)物質(zhì)，例如， 氯、光氣、二氧化硫、硫化氫、二氧化氮、氨和鹽酸)、煙損傷、熱損傷(例如，燒傷、凍傷)、哮 喘、過敏、支氣管縮窄、過敏性肺炎、寄生蟲病、古德帕斯徹氏綜合征、肺血管炎和免疫復(fù)合 體-相關(guān)性炎癥。用本發(fā)明的治療劑治療的受試者還可以用已知的治療黃斑變性相關(guān)病情的方法 施用其他治療劑，例如美國專利號6，218，368中描述的抗生素治療。在其他治療中，免疫 抑制劑例如環(huán)孢菌素，是能夠抑制免疫反應(yīng)的試劑。這些試劑包括細(xì)胞毒性藥物、皮質(zhì)類 固醇、非類固醇類抗炎藥物(NSAID)、特異性T-淋巴細(xì)胞免疫抑制劑、抗體或其片段(參見 Physicians‘ Desk Reference，第 53 片反，Medical Economics Company Inc.，Montvale， N.J. (1999))。免疫抑制治療通常以一周、一個月、三個月、六個月或一年的周期持續(xù)。在一 些患者中，患者余生均施用治療。
抗體本文描述的抗C3b抗體包括人單克隆抗體。在一些方面，結(jié)合C3b的抗體的抗原 結(jié)合部分(例如，Vh和八鏈)是“混合且匹配的”(mixed andmatched)，來創(chuàng)造其它抗C3b 結(jié)合分子?？梢允褂蒙鲜鼋Y(jié)合測定(例如，ELISA)來測試此類“混合且匹配的”抗體的結(jié) 合。當(dāng)選擇與特定\序列混合并匹配的Vh時，通常選擇與其在和\配對時所取代的Vh結(jié) 構(gòu)相似的VH。同樣地，通常用結(jié)構(gòu)相似的全長重鏈序列取代在特定全長重鏈/全長輕鏈對 中的全長重鏈序列。同樣地，應(yīng)該用結(jié)構(gòu)相似的八序列取代在特定VH/\對中的八序列。 同樣地，應(yīng)該用結(jié)構(gòu)相似的全長輕鏈序列取代在特定全長重鏈/全長輕鏈對中的全長輕鏈 序列。上下文中的鑒別結(jié)構(gòu)相似性是本領(lǐng)域熟知的方法。在其他方面，本發(fā)明提供了這樣的抗體，所述抗體包括不同組合的一個或多個C3b 結(jié)合抗體的重鏈和輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3。考慮到每個上述抗體都可以結(jié)合C3b，以及 抗原結(jié)合特異性主要由⑶Rl、2和3區(qū)提供，故可以“混合并匹配” VhOTR1、2和3序列以及 \CDR1、2和3序列(可以混合并匹配來自不同抗體的CDR)?？梢允褂帽疚拿枋龅慕Y(jié)合測 定(例如，ELISA)測試此類“混合并匹配”的抗體的C3b結(jié)合。當(dāng)VhCDR是混合且匹配之 時，應(yīng)該用結(jié)構(gòu)相似的⑶R序列取代特定Vh序列的⑶R1、⑶R2和/或⑶R3序列。同樣地， 當(dāng)VfDR是混合且匹配之時，應(yīng)該用結(jié)構(gòu)相似的⑶R序列取代特定\序列的⑶R1、⑶R2和 /或CDR3序列。上下文中的鑒別結(jié)構(gòu)相似性是本領(lǐng)域熟知的方法。如本文中使用的，如果抗體的可變區(qū)或全長鏈獲得自使用人種系免疫球蛋白基因 作為序列來源的系統(tǒng)，則人抗體包括的重鏈或輕鏈可變區(qū)或者全長的重鏈或輕鏈“源自，，特 定種系序列，或是其“產(chǎn)物”。在一個此類系統(tǒng)中，人抗體是在攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基 因小鼠中產(chǎn)生的。用目標(biāo)抗原(例如，本文描述的C3b的新表位)免疫轉(zhuǎn)基因小鼠?？蛇x 的，通過提供噬菌體展示的人免疫球蛋白基因文庫，并用目標(biāo)抗原(例如，本文描述的C3b 的新表位)篩選所述文庫，來鑒別人抗體。通過比較人抗體的氨基酸序列和人種系免疫球蛋白的氨基酸序列，并選擇序列中 與人抗體序列最接近的(即，最大％同一性)人種系免疫球蛋白序列，可以鑒別“源自”人種 系免疫球蛋白序列的人抗體，或是其“產(chǎn)物”的人抗體。“源自”特定人種系免疫球蛋白序列 的人抗體，或是其“產(chǎn)物”的人抗體與種系編碼序列相比，可以包含氨基酸差異，差異源自例 如天然發(fā)生的體細(xì)胞突變或人工的定點突變。然而，選定的人抗體通常具有與人種系免疫 球蛋白基因編碼的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列，并包含這樣的氨基酸殘基，當(dāng) 與其它物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，小鼠種系序列)比較時，所述氨基酸殘基 確定所述人抗體是人的。在一些情況下，人抗體的氨基酸序列與種系免疫球蛋白基因編碼 的氨基酸序列可以至少60%、70%、80%、90%或至少95%相同，甚至至少96%、97%、98% 或99%相同。兩條序列之間的百分比同一性是在考慮到為兩條序列的最佳比對所引入的空位 的數(shù)目和各個空位長度的條件下，序列共享的相同位置數(shù)的函數(shù)(即，％同一性=相同位 置數(shù)/總位置數(shù)χ 100)。序列的比較和兩條序列之間百分比同一性的確定是使用E. Meyers ^P W. Miller (1988Comput. Appl. Biosci.，4 :11_17)的算法來確定的，所述算法已經(jīng)整合到 ALIGN程序(2. 0版)中，使用PAM120權(quán)重殘基表，空位長度罰分為12，空位罰分為4。通常，源自特定人種系序列的人抗體的￥11或\可以表現(xiàn)出與人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列不超過10個氨基酸的差異。在一些情況下，人抗體的￥11或\可以表 現(xiàn)出與種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列不超過5個，甚至不超過4、3、2或1個氨基 酸的差異。駝科動物抗體(Camelidantibody)從駱駝和單峰駝科(雙峰駝(Camelus bactrianus)和獨峰駝 (Calelusdromaderius))，包括其新世界成員例如，美洲駝(羊駝(Lama paccos)、駝羊 (Lama glama)和小羊駝(Lama vicugna))，獲得的抗體蛋白以就大小、結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和相對于 人對象的抗原性進(jìn)行了表征。在該哺乳動物科中天然發(fā)現(xiàn)的一些IgG抗體缺少輕鏈，因此 在結(jié)構(gòu)上與其它動物抗體通常具有兩條重鏈和兩條輕鏈的四條鏈四級結(jié)構(gòu)是不同的。參見 W0 94/04678?？梢酝ㄟ^遺傳工程獲得駝科動物抗體的小的、單一可變結(jié)構(gòu)域的區(qū)域，鑒別為 Vhh來產(chǎn)生對目標(biāo)具有高親和力的小蛋白，得到稱為“駝科動物納米抗體”的低分子量、抗 體來源地蛋白質(zhì)。參見美國專利號5，759,808 ；還參見Stijlemans等人，2004J. Biol. Chem. 279 1256-1261 ；Dumoulin 等人，2003 Nature 424 :783_788 ；Pleschberger 等人， 2003 BioconjugateChem. 14 440-448 ；Cortez-Retamozo 等人，2002Int. J. Cancer 89 456-62 ；和Lauwereys等人，1998 EMB0 J. 17 :3512_3520。駝科動物抗體和抗體片段的改 造文庫是可商購的，例如自Ablynx，Ghent, Belgium。類似其它非人來源的抗體，可以重組 地改變駝科動物抗體的氨基酸序列，獲得與人序列更相似的序列，即，可以“人源化”納米抗 體。因此，還可以進(jìn)一步降低駝科動物抗體對人的天然低抗原性。駝科動物的納米抗體的分子量大約是人IgG分子的十分之一，所述蛋白質(zhì)具有僅 數(shù)納米的物理直徑。小尺寸的一個結(jié)果是駝科動物抗體可以結(jié)合對于大抗體蛋白功能性不 可見的抗原位點的能力，即，駝科動物的納米抗體可用作試劑，來檢測對于經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù) 隱蔽的抗原，并可以用作潛在的治療劑。由此，小尺寸的另一個結(jié)果是，作為結(jié)合目標(biāo)蛋白 的溝或狹縫中的特定位點的結(jié)果，駝科動物的納米抗體可以抑制目標(biāo)蛋白，從而在功能上 可以更近似地模擬經(jīng)典低分子量藥物而非經(jīng)典抗體的功能，而發(fā)揮作用。低分子量和致密的尺寸還導(dǎo)致駝科動物納米抗體是高度熱穩(wěn)定的，對極端pH和 蛋白水解消化作用穩(wěn)定，并且是弱抗原性的。另一個結(jié)果是駝科動物的納米抗體可以方便 的從循環(huán)系統(tǒng)移動到組織中，甚至跨越血腦屏障，并可以治療影響神經(jīng)組織的疾病。納米抗 體還可以促進(jìn)跨越血腦屏障的藥物運輸。參見于2004年8月19日公開的美國專利公開號 20040161738。上述特征與在人體內(nèi)低抗原性的組合提示著巨大的治療潛力。此外，還可以 在原核細(xì)胞(例如，大腸桿菌)中完整的表達(dá)這些分子。因此，本發(fā)明的一個特征是與C3b具有高親和力的駝科動物抗體或駝科動物的納 米抗體。在本文的一些方面，在駝科動物中天然的產(chǎn)生駝科動物抗體或納米抗體，即，使用 本文描述的用于其它抗體的技術(shù)，通過用C3b或其肽片段免疫駝科動物后，由駝科動物生 產(chǎn)?？蛇x的，改造抗C3b駝科動物納米抗體，即，例如，利用C3b或本文描述的C3b新表位作 為靶，使用淘選(panning)程序，從展示適當(dāng)誘變的駝科動物納米抗體的噬菌體文庫中，通 過選擇來產(chǎn)生。還可以通過遺傳工程進(jìn)一步定制改造的納米抗體，使在接受受試者中的半 衰期從45分鐘增加到2周。二價抗體
二價抗體是二價的、雙特異性的分子，其中在單個多肽鏈上表達(dá)VH和\結(jié)構(gòu)域， 所述結(jié)構(gòu)域之間由接頭連接，接頭的長度太短，不允許同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間配 對。結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對，從而創(chuàng)造了兩個抗原結(jié)合位點(參見 例如，Holliger 等人，1993Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448 ；Poljak 等人，1994 Structure2 :1121_1123)?？梢酝ㄟ^在同一細(xì)胞內(nèi)表達(dá)兩條多肽鏈來生產(chǎn)二價抗體，所述多 肽鏈具有結(jié)構(gòu)VhA-\B和VhB-\A (Vh-Vl構(gòu)型)，或\A_VhB和\B-VhA (Vl-Vh構(gòu)型)。大部分 都可以在細(xì)菌中以可溶形式表達(dá)。通過使用約15個氨基酸殘基的接頭連接兩條二價抗體形成多肽鏈來產(chǎn)生單鏈二 價抗體(scDb)(參見，Holliger 禾口 Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother.，45(34) 128-30 ;Wu 等人，1996 Immunotechnology, 2 (1) :21_36)。可以在細(xì)菌中以可溶的、活性 單體形式表達(dá) scDb (參見，Holliger 禾口 Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34) 128-30 ；ffu 等 A,1996 Immunotechnology,2 (1) 21-36 ；Pluckthun 和 Pack, 1997Immunotechnology, 3 (2) 83-105 ；Ridgway ^A, 1996 Protein Eng. ,9(7) :617_21)。二價抗體可以與Fc融合，產(chǎn)生“雙-二價抗體”(參見，Lu等人，2004J. Biol. Chem. ,279(4) 2856-65)。改造的和修飾的抗體可以使用具有一個或多個VH和/或VL序列的抗體作為起始材料以改造修飾的抗 體而進(jìn)一步制備本發(fā)明的抗體，其中所述修飾的抗體可以具有與起始抗體不同的特性。可 通過修飾一個或兩個可變區(qū)(即，VH和/或VL)，例如，一個或多個⑶R區(qū)內(nèi)和/或一個或 多個構(gòu)架區(qū)內(nèi)的一個或多個殘基，從而改造抗體。額外地或備選地，抗體可以通過修飾恒定 區(qū)內(nèi)的殘基來改造，例如以改變抗體的效應(yīng)子功能。一種可以進(jìn)行的可變區(qū)改造是⑶R嫁接?？贵w主要通過位于六個重鏈和輕鏈⑶R 中的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。因為這個原因，所以各抗體之間CDR內(nèi)的氨基酸序列 比CDR外的序列有更大的差異。因為CDR序列負(fù)責(zé)大部分的抗體-抗原相互作用，所以可以 通過構(gòu)建表達(dá)載體來表達(dá)模擬特定天然存在的抗體的性質(zhì)的重組抗體，其中所述的表達(dá)載 體包括嫁接到具有不同性質(zhì)的不同抗體構(gòu)架序列上的特定天然抗體的CDR序列(參見，例 如Riechmann.等人，1998 Nature 332 :323_327 Jones.等人，1986 Nature 321 :522_525 ； Queen.等人，1989 Proc. Natl. Acad. See. U. S. A. 86 :10029-10033 ；美國專利號 5，225，539， 以及美國專利號 5，530，101,5, 585，089,5, 693，762 和 6，180，370)。構(gòu)架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫或公開的參考文獻(xiàn)獲 得。例如，人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數(shù)據(jù)庫 (在因特網(wǎng) www. mrccpe. cam. ac. uk/vbase 可獲得)、以及在 Kabat.等人，1991 Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 第 5 版，U.S. Department of Health and HumanServices, NIH Publication No. 91-3242 ；Tomlinson.等人，1992 J. Mol. Biol. 227 776-798 :776-798和Cox.等人，1994 Eur. J Immunol. 24 :827_836 中找到，其中所述的每篇 參考文獻(xiàn)的內(nèi)容都清楚地引入本文作為參考?？梢詫fDRl、2和3序列以及VfDRl、2和3序列嫁接到構(gòu)架區(qū)上，該構(gòu)架區(qū)具 有與其所來源的種系免疫蛋白基因中的構(gòu)架區(qū)序列同一的序列，或者可以將CDR序列嫁接 到相比較于該種系序列含有一個或多個突變的構(gòu)架區(qū)上。例如，已發(fā)現(xiàn)在一些情況下，突變構(gòu)架區(qū)內(nèi)的殘基對于保持或增強抗體的抗原結(jié)合能力是有利的(參見例如美國專利號5，530，101,5, 585，089,5, 693，762 和 6，180，370)。⑶R還可以移植到除免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以外的多肽的框架區(qū)上。合適的支架形成 構(gòu)象穩(wěn)定的、展示移植殘基的框架，從而形成局部化的表面并與目標(biāo)靶(例如，C3b抗原)結(jié) 合。例如，CDR可以移植到這樣的支架上，所述支架的框架區(qū)是基于纖連蛋白、錨定蛋白、月旨 質(zhì)運載蛋白(lipocalin)、新制癌菌素、細(xì)胞色素b、CPl鋅指、PST1、卷曲螺旋、LACl-DU Z 結(jié)構(gòu)域或 tendramisat (參見例如，Nygren 禾口 Uhlen, 1997 Current Opinion inStructural Biology, 7,463-469)。另一類型的可變區(qū)修飾是突變VH和/或VL⑶R1、⑶R2和/或⑶R3區(qū)內(nèi)的氨基 酸殘基從而提高目的抗體的一種或多種結(jié)合性質(zhì)(例如，親和性)，稱作“親和性成熟”?？?以進(jìn)行定點誘變或者PCR介導(dǎo)的誘變以引入突變，并且可以用如本文所述提供的體外或體 內(nèi)測試法評估對抗體結(jié)合或者其它感興趣的功能性質(zhì)的影響?？梢砸氡Ｊ匦揎棥Ｍ蛔兛?以是氨基酸替代、添加或缺失。此外，通常改變CDR區(qū)內(nèi)不超過一個、兩個、三個、四個或五 個殘基。本發(fā)明的改造的抗體包括已對Vh和/或&內(nèi)的框架殘基進(jìn)行修飾的抗體，從而例 如改善抗體的性質(zhì)。通常，進(jìn)行此類框架修飾作用來降低抗體的免疫原性。例如，一種方法 是“回復(fù)突變” 一個或多個框架殘基至相應(yīng)的種系序列。更特別的，已經(jīng)歷體細(xì)胞突變的抗 體可以包含與所述抗體來源的種系序列不同的框架殘基?？梢酝ㄟ^比較抗體框架序列與所 述抗體來源的種系序列，鑒別此類殘基。為了將框架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，可以將體細(xì) 胞突變“回復(fù)突變”為種系序列，通過例如定點誘變或PCR-介導(dǎo)的誘變。本發(fā)明也旨在涵 蓋此類“回復(fù)突變”抗體。另一種類型的框架修飾涉及突變框架區(qū)內(nèi)的一個或多個殘基，或者甚至在一個或 多個CDR區(qū)內(nèi)的，來移除T細(xì)胞表位，從而降低抗體潛在的免疫原性。該方法也稱為“脫免 疫作用(deimmunization) ”，更詳細(xì)地描述在Carr等人的美國專利公開號20030153043中。除了對框架或⑶R區(qū)內(nèi)進(jìn)行修飾外或替代地，還可以改造本發(fā)明的抗體使其包括 Fc區(qū)內(nèi)的修飾，通常改變抗體的一種或多種功能性質(zhì)，例如血清半衰期、補體固定、Fc受體 結(jié)合，和/或抗原依賴性細(xì)胞毒性。此外，可以化學(xué)修飾本發(fā)明的抗體(例如，可以在抗體 上附加一個或多個化學(xué)部分)，或者修飾以改變其糖基化，亦可改變抗體的一種或多種功能 性質(zhì)。在一個方面，修飾CHl的鉸鏈區(qū)，從而改變鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基數(shù)，例如增加 或減少。該方法進(jìn)一步描述在Bodmer等人的美國專利號5，677，425中。例如，改變CHl的 鉸鏈區(qū)內(nèi)的半胱氨酸殘基數(shù)，以有利于輕鏈和重鏈的裝配，或者增加或降低抗體的穩(wěn)定性。在另一個方面，突變抗體的Fc鉸鏈區(qū)，以降低抗體的生物半衰期。更特別的，將一 個或多個氨基酸突變引入到Fc鉸鏈片段的CH2-CH3結(jié)構(gòu)域界面區(qū)內(nèi)，使相對于天然的Fc 鉸鏈結(jié)構(gòu)域葡萄球菌蛋白A(SpA)結(jié)合，所述抗體具有受損的SpA結(jié)合。該方法更詳細(xì)的描 述在Ward等人的美國專利號6，165，745中。在另一個方面，修飾抗體以增加它的生物學(xué)半衰期，可以使用多種方法。例如，美 國專利號6，277，375描述了下列在IgG中的突變，可以增加它的體內(nèi)半衰期T252L、T254S、 T256F。可選的，為了增加生物學(xué)半衰期，可以在CHl或CL區(qū)改變抗體，從而含有取自IgG的Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域二環(huán)的補救受體結(jié)合表位，如Presta等人的美國專利號5，869，046 和6，121,022中描述的。在其他方面，通過用不同的氨基酸殘基取代至少一個氨基酸殘基來改變Fc區(qū)，以 改變抗體的效應(yīng)子功能。與之親和力被改變的效應(yīng)子配體可以是例如，F(xiàn)c受體或補體的C1 組分。例如，可以用不同的氨基酸殘基取代一個或多個氨基酸，使抗體具有對效應(yīng)子配體 改變的親和力，但仍保留了親代抗體的抗原結(jié)合能力。示例性氨基酸突變發(fā)生在選自234、 235、236、237、252、254、256、297、309、311、315、318、320、322、433 和 / 或 434 的位置。本發(fā) 明的C3b結(jié)合分子特別涵蓋了根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)所制備和使用的共有Fc抗體結(jié)構(gòu)域。優(yōu) 選的抗C3b抗體包括在選自234和/或235位的Fc突變。該方法詳細(xì)的描述在Winter等 人的美國專利號5，624，821和5，648，260中。在另一個方面，可以用不同的氨基酸殘基取代一個或多個選自這樣的氨基酸殘基 的氨基酸，使抗體具有改變的Clq結(jié)合和/或降低或消除的補體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。該 方法更詳細(xì)的描述在Idusogie等人的美國專利號6，194，551中。在另一個方面，可以改變一個或多個氨基酸殘基，從而改變抗體固定補體的能力。 該方法更詳細(xì)的描述在Bodmer等人的W094/29351中。在另一個方面，修飾Fc區(qū)以增加抗體介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的能力，和 /或通過修飾一個或多個氨基酸增加抗體與Fc Y受體的親和力。該方法更詳細(xì)的描述在 Presta 等人的 W000/42072 中。此外，已經(jīng)定位了人 IgGl 上的 Fc y RI、Fc y RII、Fc y RIII 和FcyRn的結(jié)合位點，并描述了具有改善的結(jié)合的變體(參見，Shields, R. L.等人，2001 J. Biol. Chem. 276 :6591_6604)。在另一個方面，修飾了抗體的糖基化。例如，可以制備無糖基化的抗體(即，無糖 基化的抗體)?？梢愿淖兲腔?，從而例如增加抗體與抗原的親和力。可以通過例如改變抗 體序列內(nèi)的一個或多個糖基化位點，實現(xiàn)此類碳水化合物修飾。例如，可以進(jìn)行一個或多個 氨基酸取代，導(dǎo)致消除一個或多個可變區(qū)框架的糖基化位點，從而消除該位點的糖基化。此 類無糖基化可以增加抗體對抗原的親和力。此類方法更詳細(xì)的描述在Co等人的美國專利 號 5，714，350 和 6，350，861 中。額外的或可選的，可以制備具有改變的糖基化類型的抗體，例如具有減少的巖藻 糖殘基量的低巖藻糖化抗體，或者具有增加的平分型GlcNac結(jié)構(gòu)的抗體。此類改變的糖 基化模式已證實增加了抗體的ADCC能力?？梢酝ㄟ^例如在具有改變的糖基化機制的宿主 細(xì)胞中表達(dá)抗體來實現(xiàn)此類碳水化合物修飾。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了具有改變的糖基化機制 的細(xì)胞，所述細(xì)胞可以用作表達(dá)本發(fā)明的重組抗體的宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生具有改變糖基化 的抗體。例如，Hang等人的EP 1，176，195，描述了具有功能性破壞的FUT8基因的細(xì)胞系， 所述基因編碼巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，使此類細(xì)胞系中表達(dá)的抗體表現(xiàn)出低巖藻糖化。Presta的 PCT公開W003/035835描述了變異的CH0細(xì)胞系LeC13細(xì)胞，所述細(xì)胞系將巖藻糖連接到與 Asn(297)相連的碳水化合物上的能力是降低的，也導(dǎo)致宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的抗體的低巖藻糖 化(還參見，R. L.等人，2002J. Biol. Chem. 277 :26733-26740)。Umana 等人的 W0 99/54342 描述了改造的細(xì)胞系表達(dá)糖蛋白修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，0 (1，4)-N乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移 酶III (GnTIII))，使改造的細(xì)胞系中表達(dá)的抗體表現(xiàn)出增加的平分型GlcNac結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo) 致抗體增加的 ADCC 活性(還參見，Umana 等人，1999 Nat. Biotech. 17 176-180)。
本文中本發(fā)明考慮的另一種抗體修飾作用是聚乙二醇化?？梢詫⒖贵w聚乙二醇 化，從而例如增加抗體的生物學(xué)(例如，血清)半衰期。為了聚乙二醇化抗體，通常在一個或 多個聚乙二醇(PEG)部分與抗體或抗體片段將連接的條件下，將抗體或其片段與PEG (例如 PEG的反應(yīng)活性酯或醛的衍生物)反應(yīng)。通過與反應(yīng)活性的PEG分子(或類似的反應(yīng)活性 水溶性聚合物)的?；磻?yīng)或烷基化反應(yīng)，可以進(jìn)行聚乙二醇化。如本文中使用的，術(shù)語 “聚乙二醇”意在涵蓋用于衍生其他蛋白質(zhì)的任意形式的PEG，例如單(Cl-ClO)烷氧基-或 芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來酰亞胺。在一些方面，聚乙二醇化的抗體是無糖基化 的抗體。用于聚乙二醇化蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域已知的，可用于本發(fā)明的抗體。參 見例如， Nishimura 等人的 EP 0 154 316，和 Ishikawa 等人的 EP 0 401 384。此外，可以通過引入非天然的氨基酸，在C3B結(jié)合多肽的任何部分實現(xiàn)聚乙二醇 化?？梢酝ㄟ^ Deiters 等人，J Am Chem Soc 125 :11782_11783，2003 ;Wang 和 Schultz， Science 301 :964_967，2003 ；Wang 等人，Science292 498-500, 2001 ；Zhang 等人，Science 303 :371-373，2004或美國專利號7，083，970中描述的技術(shù)引入一些非天然氨基酸。簡而言 之，一些這類表達(dá)系統(tǒng)涉及定點誘變，向編碼本發(fā)明的多肽的開放閱讀框中引入無義密碼 子，例如琥珀TAG。然后，將此類表達(dá)載體引入宿主，所述宿主可以使用特異針對所引入的無 義密碼子的tRNA，并裝載所選擇的非天然氨基酸。對向本發(fā)明的多肽綴合某部分(moiety) 這一目的有利的特定非天然氨基酸包括具有乙炔基和疊氮基側(cè)鏈的氨基酸。然后，可以在 蛋白質(zhì)中上述選定的位點將含有這些新氨基酸的多肽聚乙二醇化。改造抗體的方法如上所述，可以通過修飾全長重鏈和/或輕鏈序列、Vh和/或\序列或其連接的 恒定區(qū)，使用抗C3b抗體創(chuàng)造新的抗C3b抗體。例如，可以將抗體的一個或多個⑶R區(qū)與已 知的框架區(qū)和/或其他⑶R重組組合，來創(chuàng)造新的、重組改造的抗C3b抗體。其他類型的修 飾包括在上文章節(jié)中描述的。用于改造方法的起始材料是一個或多個Vh和/或\序列或 其一個或多個⑶R區(qū)。為了創(chuàng)造改造的抗體，實際地制備(即，作為蛋白質(zhì)表達(dá))具有一個 或多個Vh和/或\序列或其一個或多個CDR區(qū)的抗體并不是必需的。更確切地說，將序列 含有的信息用作創(chuàng)造源自起源序列的“第二代”序列的起始材料，然后，制備“第二代”序列 并作為蛋白質(zhì)表達(dá)?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)制備和表達(dá)改變的抗體序列。改變的抗體序列編 碼的抗體是保留其來源的抗C3b抗體的一種、一些或全部功能性質(zhì)的抗體，所述功能性質(zhì) 包括但不限于，與C3b特異性結(jié)合、抑制C3b復(fù)合體形成、抑制C3轉(zhuǎn)化酶激活、抑制C5轉(zhuǎn)化 酶激活、抑制MAC形成?？梢允褂帽绢I(lǐng)域可獲得的和/或本文描述的標(biāo)準(zhǔn)測定(例如，ELISA)來評估改變 的抗體的功能性質(zhì)。在本發(fā)明的改造抗體的方法的一些方面，可以沿著全部或部分抗C3b抗體編碼序 列隨機的或選擇性的引入突變，可以如本文所述篩選所獲得的修飾的抗C3b抗體的結(jié)合活 性和/或其他功能性質(zhì)(例如，抑制C3或C5轉(zhuǎn)化酶活性、抑制MAC形成、調(diào)節(jié)補體通路功 能失調(diào))。本領(lǐng)域已描述了突變方法。例如Short的PCT公開WO 02/092780描述了用于創(chuàng) 造和篩選抗體突變的方法，使用飽和誘變、合成連接裝配，或其組合?？蛇x的，Lazar等人的 WO 03/074679描述了使用計算機篩選方法來優(yōu)化抗體的生理化學(xué)的方法。
如果已經(jīng)過改變，使其使用在生產(chǎn)細(xì)胞或生物體中偏愛的密碼子來編碼氨基酸序 列，則認(rèn)為所述核苷酸是“優(yōu)化的”，所述細(xì)胞通常是真核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞(如畢赤酵 母)、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞(如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或人細(xì)胞)。改造的優(yōu)化核苷 酸序列編碼的氨基酸序列與所來源的起始核苷酸序列編碼的氨基酸序列相同或幾乎相同， 后者也稱為“親本”序列。非抗體C3b結(jié)合分子本發(fā)明還提供了表現(xiàn)出抗體的功能性質(zhì)，但其框架和抗原結(jié)合部分源自其他多肽 (例如，除抗體基因以外的其他基因編碼的多肽，或通過體內(nèi)抗體基因重組產(chǎn)生的多肽)的 C3b結(jié)合分子。這些結(jié)合分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，C3b結(jié)合結(jié)構(gòu)域)是通過直接演化 過程產(chǎn)生的。參見美國專利號7，115，396。具有與抗體可變結(jié)構(gòu)域相似的整體折疊(免疫 球蛋白樣折疊)的分子是合適的支架蛋白。適合衍生抗原結(jié)合分子的支架蛋白包括纖連蛋 白或纖連蛋白二聚體、腱生蛋白、N-鈣粘著蛋白、E-鈣粘著蛋白、ICAM、肌聯(lián)蛋白(titin)、 GCSF-受體、細(xì)胞因子受體、糖苷酶抑制劑、抗生素色素蛋白、髓磷脂膜粘附分子P0、CD8、 ⑶4、⑶2、I類MHC、T-細(xì)胞抗原受體、⑶1、VCAM-I的C2和I-組結(jié)構(gòu)域、肌球蛋白-結(jié)合 蛋白C的I組免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、肌球蛋白_結(jié)合蛋白H的I組免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、端蛋白 (telokin)的I組免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、NCAM、顫搐蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)蛋白、生長激素受體、促紅 細(xì)胞生成素受體、催乳素受體、Y干擾素受體、β "半乳糖苷酶/葡萄糖醛酸酶、α -葡萄糖 醛酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、T-細(xì)胞抗原受體、超氧化物歧化酶、組織因子結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞色素F、 綠色熒光蛋白、GroEL或奇甜蛋白(thaumatin)。非抗體結(jié)合分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，免疫球蛋白樣折疊)可以具有小于 IOKd或大于7. 5Kd的分子質(zhì)量(例如，在7. 5-10Kd之間的分子質(zhì)量)。用于衍生抗原結(jié)合 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)是天然存在的哺乳動物蛋白(例如，人蛋白)，而與其來源的蛋白質(zhì)的免疫 球蛋白樣折疊相比，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括達(dá)50% (例如，達(dá)34%、25%、20%或15% )的突 變氨基酸。具有免疫球蛋白樣折疊的結(jié)構(gòu)域通常由50-150個氨基酸組成(例如，40-60個 氨基酸)。為了產(chǎn)生非抗體結(jié)合分子，創(chuàng)造了這樣的克隆文庫，其中位于形成抗原結(jié)合表面 的支架蛋白區(qū)域的序列(即，與抗體可變結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白折疊的CDR在位置和結(jié)構(gòu)上相 似的區(qū)域)是隨機化的。測試文庫克隆與目標(biāo)抗原(例如，C3b)的特異性結(jié)合，以及其他 的功能(例如，抑制C3b的生物學(xué)活性)?？梢允褂眠x定的克隆作為進(jìn)一步隨機化和選擇的 基礎(chǔ)，來產(chǎn)生與抗原具有高親和力的衍生物。例如，使用纖連蛋白III(kiFM)的第十模塊作為支架，產(chǎn)生高親和力的結(jié)合分子。 針對uiFr^在殘基23-29、52-55和78-87處的三個⑶R-樣環(huán)分別構(gòu)建文庫。為了構(gòu)建各 文庫，通過寡核苷酸合成隨機化編碼與各CDR-樣區(qū)域重疊的序列的DNA片段。用于產(chǎn)生可 選擇的kiFM文庫的技術(shù)描述在美國專利號6，818，418和7，115，396中；以及Roberts和 Szostak, 1997 Proc. Natl. Acad. Sci USA 94 :12297 ；美國專利號 6，261，804 ；美國專利號 6，258，558 ；和 Szostak 等人，W098/31700 中。非抗體結(jié)合分子可以作為二聚體或多聚體生產(chǎn)，以增加 對靶抗原的親合力 (avidity) 0例如，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域表達(dá)為與形成Fc-Fc 二聚體的抗體恒定區(qū)(Fe)的融合 物。參見例如，美國專利號7，115,396。
編碼本發(fā)明抗體的核酸分子本發(fā)明的另一方面涉及編碼本發(fā)明⑩結(jié)合分子的核酸分子。核酸可以存在于 完整細(xì)胞、細(xì)胞裂解物中，或者可以是部分純化或者基本上純的形式的核酸。當(dāng)通過標(biāo)準(zhǔn) 技術(shù)純化核酸以除去其它細(xì)胞組分或其它污染物，例如，其它細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì)時，核酸 是“分離的”或“使得基本上純的”，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括堿/SDS處理、CsCl分帶(banding)、 柱層析、瓊脂糖凝膠電泳和本領(lǐng)域公知的其他技術(shù)。參見F.Ausubel等人編著，1987 Current Protocolsin Molecular Biology， Greene Publishing and Wiley Interscience,紐約。本發(fā)明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含有或不含有內(nèi)含子 序列。在一方面，核酸是cDNA分子。核酸可以存在于載體，諸如噬菌體展示載體，或者重組 質(zhì)粒載體中?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)得到本發(fā)明的核酸。對于通過雜交瘤(例如，如下 文進(jìn)一步描述的從攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠制備的雜交瘤)表達(dá)的抗體，編碼 通過雜交瘤制備的抗體的輕鏈和重鏈的cDNA可以通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增或cDNA克隆技術(shù)得 到。對于從免疫球蛋白基因文庫(例如，使用噬菌體展示技術(shù))得到的抗體，可以從作為文 庫成員的多種噬菌體克隆回收編碼所述抗體的核酸。一旦得到編碼VH和\區(qū)段的DNA片段，就可以通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)進(jìn)一步操作 這些DNA片段，例如，以將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)變成全長抗體鏈基因、Fab片段基因，或者scFv基 因。在這些操作中，將編碼Vl_或VH的DNA片段有效地連接到另一 DNA分子，或者編碼另 一蛋白質(zhì)的片段，諸如抗體恒定區(qū)或柔性接頭。該上下文中使用的術(shù)語“有效地連接”意指 兩個DNA片段以功能方式連接，例如，使得這兩個DNA片段編碼的氨基酸序列保持符合閱讀 框，或者使得該蛋白質(zhì)在所希望的啟動子控制下表達(dá)。可以通過將編碼VH的DNA有效地連接到編碼重鏈恒定區(qū)(CHI、CH2和CH3)的另 一 DNA分子而將編碼VH區(qū)的分離的DNA轉(zhuǎn)變成全長重鏈基因。人重鏈恒定區(qū)基因的序列 是本領(lǐng)域己知的(參見例如，Kabat 等人，1991Sequences of Proteins of Immunological Interes,第五版，U. S. Departmentof Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)并且可以通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增得到包含這些區(qū)域的DNA片段。重鏈恒定區(qū)可以 是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)。對于Fab片段重鏈基因，可以將編 碼VH的DNA有效地連接到僅編碼重鏈CH1恒定區(qū)的另一 DNA分子?？梢酝ㄟ^將\編碼DNA有效地連接到編碼輕鏈恒定區(qū)CL的另一 DNA分子從而 將分離的編碼\區(qū)的DNA轉(zhuǎn)變成全長輕鏈基因(以及轉(zhuǎn)變?yōu)镕ab輕鏈基因)。人輕鏈恒 定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域已知的(見例如，Kabat等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)，并且包含這些區(qū)的DNA片段可以通過標(biāo)準(zhǔn)DNA擴(kuò)增得到。輕鏈 恒定區(qū)可以是k或\恒定區(qū)。為了產(chǎn)生scFv基因，可以將編碼VH和\的DNA片段有效地連接到編碼柔性接頭 (例如，編碼氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的另一片段，由此使VH和\序列能夠表達(dá)為具有通 過柔韌接頭連接的區(qū)的連續(xù)單鏈蛋白質(zhì)(見，例如，Bird等人，1988 Science 242 423-426 ；Huston 等人，1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879_5883 ；McCafferty 等人， 1990 Nature348 :552_554)。
產(chǎn)生單克隆抗體可以通過多種技術(shù)產(chǎn)生單克隆抗體(mAb)，所述技術(shù)包括常規(guī)的單克隆抗體方法， 例如，Kohler和Milstein，1975 Nature 256 :495的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)；或者使用文庫展 示方法，例如噬菌體展示。用于制備雜交瘤的動物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)。在小鼠中的雜交瘤產(chǎn)生是成熟的方法。用 于分離用于融合的經(jīng)免疫的脾細(xì)胞的免疫方案和技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。融合配偶體(例 如，鼠骨髓瘤細(xì)胞)和融合步驟也是已知的?？苫谌缟鲜鲋苽涞氖髥慰寺】贵w的序列制備本發(fā)明的嵌合或人源化抗體。編 碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA可以從目的鼠雜交瘤得到并使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù) 進(jìn)行改造以含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，為了產(chǎn)生嵌合抗體，可以使用 本領(lǐng)域已知的方法將鼠可變區(qū)連接到人恒定區(qū)(參見，例如，Cabilly等人的美國專利號 4，816，567)。為了產(chǎn)生人源化抗體，可以使用本領(lǐng)域已知的方法將鼠⑶R區(qū)插入到人構(gòu)架 區(qū)。參見例如，美國專利號5，225，539和美國專利號5，530，101 ；5，585,089 ；5，693，762和 6，180，370。 在某方面，本發(fā)明的抗體是人單克隆抗體?？梢允褂脭y帶部分人免疫系統(tǒng)而不是 小鼠免疫系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠產(chǎn)生針對C3b表位的此類人單克隆抗體。這些轉(zhuǎn)基 因和轉(zhuǎn)染色體小鼠包括在本文中分別稱作HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且它們在本文中 統(tǒng)稱為“人Ig小鼠”。HuMAb小鼠 (Medarex, Inc.)含有人免疫球蛋白基因小基因座，其編碼未重排的 人重鏈(μ和Y)和K輕鏈免疫球蛋白序列，以及失活內(nèi)源μ和κ鏈基因座的定向突變 (見例如，Lonberg，等人，1994 Nature 368(6474) :856_859)。因此，小鼠顯示出小鼠 IgM 或κ的降低的表達(dá)，并且在應(yīng)答免疫時，所導(dǎo)入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體 細(xì)胞突變以產(chǎn)生高親和性人IgGK單克隆抗體(Lonberg，N.等人，1994同上；Lonberg， N. , 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113 :49_101 中的綜述；Lonberg， N.禾口 Huszar, D. , 1995 Intern. Rev. Immunol. 13 :65_93,禾口 Harding, F.禾口 Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764 =536-546)。HuMAb小鼠的制備和用途，和此類小鼠攜帶 的基因組修飾在 Taylor，L.等，1992 Nucleic Acids Research 20 6287-6295 ；Chen, J.等，1993International Immunology 5 :647_656 ;Tuaillon 等，1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 :3720-3724 ;Choi 等，1993 Nature Genetics 4 117-123 ；Chen, J.等，1993 EMBO J. 12 821-830 ；Tuaillon 等，1994 J. Immunol. 152 2912-2920 ；Taylor, L.等，1994 International Immunology 579-591 ；禾口 Fishwild, D.等，1996 Nature Biotechnology 14:845-851中進(jìn)一步描述，將它們的內(nèi)容都完整引入本文作為參考。還見，Lonberg和 Kay 的美國專利號 5，545，806,5, 569，825,5, 625，126,5, 633，425,5, 789，650,5, 877，397、 5，661，016,5, 814，318,5, 874，299 和 5，770，429 ；Surani 等人的美國專利號 5，545，807 ；和 Lonberg 和 Kay 的 PCT 公布號 WO 92103918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97113852、WO 98/24884 和 WO 99/45962 ；和 Korman 等人的 PCT 公布號 WO 01/14424。在另一方面，使用在轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體上攜帶人免疫球蛋白序列的小鼠，諸如攜 帶人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體。此類小鼠在本文中稱作 "KM小鼠”，在PCT公布號WO 02/43478中詳細(xì)描述。
此外，表達(dá)人免疫球蛋白基因的備選的轉(zhuǎn)基因動物系統(tǒng)可以在本領(lǐng)域中得到并且 可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗C3b抗體。例如，可以使用稱作XenomouSe(AbgeniX，Inc.)的備 選轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)。此類小鼠在例如Kucherlapati等人的美國專利號5，939，598 ；6, 075，181 ； 6，114，598 ；6，150，584 和 6，162，963 中描述。此外，表達(dá)人免疫球蛋白基因的備選的轉(zhuǎn)染色體動物系統(tǒng)可以在本領(lǐng)域中獲得并 且可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗C3b抗體。例如，可以使用稱作“TC小鼠”的攜帶人重鏈轉(zhuǎn)染色 體和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠；此類小鼠在Tomizuka等人，2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 722-727中描述。此外，攜帶人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)染色體的奶牛已經(jīng)在本領(lǐng)域描述(Kuroiwa 等人，2002 Nature Biotechnology 20:889-894)并且可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗C3b抗體。也可以使用篩選人免疫球蛋白基因文庫的噬菌體展示方法制備本發(fā)明的人單克 隆抗體。本領(lǐng)域中建立了此類用于分離人抗體的噬菌體展示方法。參見例如Ladner等人 的美國專利號5，223，409 ；5，403，484 ；和5，571，698 ；Dower等人的美國專利號5，427，908 和 5，580，717 ；McCafferty 等人的美國專利號 5，969，108 和 6，172，197 ；和 Griffiths 等人 的美國專利號 5，885，793 ；6，521，404 ；6，544，731 ；6，555，313 ；6，582，915 和 6，593,081?？?以在文庫中篩選與全長C3b抗原或與特定C3b新表位的結(jié)合。也可以使用其中已經(jīng)重建了人免疫細(xì)胞從而當(dāng)免疫時可以產(chǎn)生人抗體應(yīng)答 的SCID小鼠制備本發(fā)明的人單克隆抗體。此類小鼠在例如Wilson等人的美國專利號 5，476，996 和 5，698，767 中描述。在人Ig小鼠中產(chǎn)生人單克隆抗體在原核細(xì)胞(例如，大腸桿菌)或真核細(xì)胞(例如，哺乳動物細(xì)胞，如HEK293細(xì) 胞)中表達(dá)的純化的重組人C3b可用作抗原。蛋白可以與載體綴合，例如鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋 白(KLH)。使用HuMab轉(zhuǎn)基因小鼠的HCo7、HCo 12和HCo 17品系以及轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染色體小 鼠KM品系制備針對C3b新表位的全長人單克隆抗體，上述各品系均表達(dá)人抗體基因。在 上述各小鼠品系中，可以純合地破壞內(nèi)源的小鼠k輕鏈基因，如Chen等人，1993 EMB0 J. 12 =811-820中所述，可以純合地破壞內(nèi)源的小鼠重鏈基因，如W0 01109187的實施 例1所述。各上述小鼠品系均攜帶人k輕鏈轉(zhuǎn)基因，Kco5，如Fishwild等人，1996 NatureBiotechnology 14 :845_851中所述。HCo7品系攜帶HCo7人重鏈轉(zhuǎn)基因，如美國專 利號5，545，806 ；5, 625，825和5，545，807中所述。HCo 12品系攜帶HCo 12人重鏈轉(zhuǎn)基因， 如TO 01/09187的實施例2中所述。HCol7品系攜帶HCol7人重鏈轉(zhuǎn)基因。KNM品系含有 SC20轉(zhuǎn)染色體，如W0 02/43478中所述。為了產(chǎn)生針對C3b新表位的全人單克隆抗體，用純化的重組C3b、C3b片段或其綴 合物(例如，C3b-KLH)作為抗原，免疫HuMab小鼠和KM小鼠。用于HuMab小鼠的常規(guī)免疫 方案描述在 Lonberg，N.等人，1994 Nature368 (6474) 856-859 ；Fishwild, D.等人，1996 Nature Biotechnologyl4 :845_851 和 W0 98/24884 中。在第一次抗原注入時，小鼠是 6-16 周齡。使用抗原的純化重組制品(5-50 y g)在腹腔、皮下(Sc)或通過爪墊注射來免疫HuMab 小鼠和KM小鼠。用弗氏完全佐劑或Ribi佐劑中的抗原，在腹腔(IP)、皮下(Sc)或通過爪墊(FP) 免疫轉(zhuǎn)基因小鼠2次，然后用弗氏不完全佐劑或Ribi佐劑中的抗原，進(jìn)行3-21天的IP、Sc或FP免疫(總計達(dá)11次免疫)。通過眶后區(qū)取血監(jiān)控免疫反應(yīng)。通過ELISA篩選血漿，使 用具有足夠的抗C3b人免疫球蛋白滴度的小鼠進(jìn)行融合。在處死并移出脾臟的3天和2天 前，用抗原靜脈加強小鼠。通常，每個抗原實施10-35個融合。每個抗原免疫數(shù)十只小鼠。 用C3b抗原一共免疫了 82只HCo7、HCol2、HCol7和KM小鼠品系的小鼠。
為了選擇產(chǎn)生與C3b新表位結(jié)合的抗體的HuMab或KM小鼠，可以通過ELISA測試 來自免疫小鼠的血清，如Fishwil d等人，1996中所述。簡而言之，用溶于PBS的1-2 μ g/ ml的純化重組C3b包被微滴度板，50 μ 1/孔，在4°C孵育過夜，并用200 μ 1/孔的在PBS/ Tween(0. 05%)中的5%雞血清封閉。向每個孔中添加來自C3b免疫小鼠的稀釋血漿，在環(huán) 境溫度下孵育1-2小時。用PBS/Tween洗滌平板，然后用綴合了辣根過氧化物酶(HRP)的 山羊抗人I gG Fc多克隆抗體在室溫孵育1小時。洗滌后，用ABTS底物(Sigma，A-1888， 0. 22mg/ml)顯色平板，并通過分光光度計在OD 415-495分析。將出現(xiàn)最高滴度的抗C3b抗 體的小鼠脾細(xì)胞用于融合。實施融合，并通過ELISA測試雜交瘤上清液的抗C3b活性。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程，用PEG將分離自HuMab或KM小鼠的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì) 胞融合。然后，篩選獲得的雜交瘤中產(chǎn)生抗原特異性抗體的那些。用50% PEG(Sigma)將 來自免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液與四分之一的SP2/0非分泌型小鼠骨髓瘤細(xì) 胞(ATCC，CRL 1581)融合。按大約IxlO5/孔將細(xì)胞鋪板在平底的微滴度板上，然后在選 擇培養(yǎng)基中孵育約2周，所述選擇培養(yǎng)基是在DMEM(Mediatech，CRL 10013，具有高葡萄糖、 L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉)中含有10%胎牛血清、10% P388D 1 (ATCC，CRLTIB-63)條件培 養(yǎng)基，3-5%Ori gen (IGEN)，以及 5mM HEPBS、0. 055mM2_ 巰基乙醇、50 μ g/ml 慶大霉素和 IxHAT (Sigma, CRL P-7185)。在1_2周后，在用HT取代HAT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。然后，通 過ELISA在各孔中篩選人抗C3b單克隆IgG抗體。一旦出現(xiàn)了大量的雜交瘤生長，通常在 10-14天后監(jiān)控培養(yǎng)基。重新鋪板并再次篩選抗體分泌型雜交瘤，如果仍然對人IgG呈陽 性，則通過有限稀釋對抗C3b單克隆抗體進(jìn)行至少2次亞克隆。然后，在體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞 克隆，在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生少量抗體用于進(jìn)一步鑒定。生成產(chǎn)生人單克隆抗體的雜交瘤為了產(chǎn)生本發(fā)明的產(chǎn)生人單克隆抗體的雜交瘤，可從免疫小鼠分離脾細(xì)胞和/或 淋巴節(jié)細(xì)胞并與合適的永生化細(xì)胞系融合，所述永生化細(xì)胞系諸如小鼠骨髓瘤細(xì)胞系?？?針對抗原特異性抗體的產(chǎn)生篩選所得到的雜交瘤。例如通過50 %的PEG使來自經(jīng)免疫小鼠 脾淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液與1/6數(shù)量的P3X63-Ag8. 653非分泌型小鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCC， CRL1580)融合。將細(xì)胞以約2x145鋪在平底微量滴定板上，然后在選擇培養(yǎng)基中溫育2周， 所述培養(yǎng)基含有20%胎克隆血清、18% “653”條件培養(yǎng)基、5% Origen(IGEN)、4mM L-谷氨 酰胺、ImM丙酮酸鈉、5mM HEPES，0. 055mM 2-巰基乙醇、50單位/毫升青霉素、50iLg/ml鏈 霉素、50iLg/ml慶大霉素和IXHAT (Sigma ；HAT在融合之后24小時添加)。大約兩周之后， 可將細(xì)胞培養(yǎng)在HAT被HT替代的培養(yǎng)基中。然后可以通過ELISA篩選每一個孔中的人單 克隆IgM和IgG抗體。一旦發(fā)生了廣泛的雜交瘤生長，通常在10-14天之后對培養(yǎng)基進(jìn)行 分析。可以將分泌抗體的雜交瘤重新鋪平板，再次篩選，并且如果仍然對人IgG呈陽性，可 以通過有限稀釋亞克隆單克隆抗體至少2次。然后在體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆，以在組織培 養(yǎng)基中制備少量用于進(jìn)行表征的抗體。為了純化人單克隆抗體，可使所選擇的雜交瘤在2L搖瓶中生長以用于單克隆抗體純化。上清液過濾并濃縮后進(jìn)行蛋白A-瓊脂糖親和層析(PharmacihPiscataway，^)。 洗脫的IgG通過凝膠電泳和高效液相層析檢查以確保純度。可將緩沖溶液換成PBS，并且可 在0D280用1. 43消光系數(shù)測定濃度。單克隆抗體分成等份并儲存于-80°C。生成產(chǎn)生單克隆抗體的轉(zhuǎn)染瘤還可以在宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤中產(chǎn)生本發(fā)明的抗體，使用例如，本領(lǐng)域公知的重組DNA 技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法的組合(例如，Morrison，S. (1985) Science 229:1202)。例如，為了表達(dá)抗體或者其抗體片段，可以通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(例如，PCR 擴(kuò)增或cDNA克隆，使用表達(dá)目的抗體的雜交瘤)得到編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA， 并且可以將DNA插入到表達(dá)載體中，使得基因有效連接到轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列。在該上下 文中，術(shù)語“有效連接”意指抗體基因連接到載體中，從而載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列發(fā) 揮它們調(diào)節(jié)抗體基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的預(yù)期功能。選擇表達(dá)載體和表達(dá)控制序列以與所用的表 達(dá)宿主細(xì)胞相容?？梢詫⒖贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因插入到單獨的載體，或者更一般地， 可以將兩種基因插入到相同的表達(dá)載體中。通過標(biāo)準(zhǔn)方法將抗體基因插入表達(dá)載體中(例 如，連接抗體基因片段或載體上的互補限制性位點，或者如果不存在限制性位點，則為平末 端連接)。本文所述抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)可以通過下述方法用于產(chǎn)生任何抗體同種型 的全長抗體基因?qū)⑺龌虿迦氲揭呀?jīng)編碼所希望同種型的重鏈恒定區(qū)和 輕鏈恒定區(qū)的 表達(dá)載體中，使得VH區(qū)段有效連接載體內(nèi)的CH區(qū)段并且VL區(qū)段有效連接載體內(nèi)的CL區(qū) 段。額外地或備選地，重組表達(dá)載體可以編碼信號肽，其方便抗體鏈從宿主細(xì)胞的分泌。可 以將抗體鏈基因克隆到載體中使得信號肽與抗體鏈基因的氨基端符合讀框地連接。信號肽 可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即，來自非免疫球蛋白蛋白質(zhì)的信號肽)。除了抗體鏈基因外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還可以攜帶控制抗體鏈基因在宿主 細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”意在包括啟動子、增強子和其它表達(dá)控制元件 (例如，多聚腺苷酸化信號)，其控制抗體鏈基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯。此類調(diào)節(jié)序列描述于例如 Goeddel(Gene ExpressionTechnology. Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA 1990)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白表達(dá)載體的設(shè)計，包括調(diào)節(jié)序列的選擇，可以依賴 于此類因素，諸如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、所希望的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，等等。哺乳動物宿 主細(xì)胞表達(dá)的調(diào)節(jié)序列包括指導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞中高水平蛋白質(zhì)表達(dá)的病毒元件，諸如啟動 子和/或增強子，其來自巨細(xì)胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要 晚期啟動子(AdMLP))，和多瘤病毒。備選地，可以使用非病毒調(diào)節(jié)序列，諸如遍在蛋白啟動 子或P珠蛋白啟動子。此外，調(diào)節(jié)元件包括不同來源的序列，諸如SRa啟動子系統(tǒng)，其含有 來自SV40早期啟動子的序列和人T細(xì)胞白血病病毒1型的長末端重復(fù)的序列(Takebe等 人，1988 Mol. Cell. Biol. 8 466-472)。除了抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以攜帶額外的序列，諸 如調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中載體復(fù)制的序列(例如復(fù)制起點)和可選擇標(biāo)記基因?？蛇x擇標(biāo)記基 因方便已經(jīng)導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞的選擇(參見，例如，Axel等人的美國專利號4，399，216， 4，634，665和5，179,017)。例如，通常，可選擇標(biāo)記基因?qū)σ呀?jīng)導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞賦予 對藥物(諸如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性?？蛇x擇標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶 (DHFR)基因(用于dhfr-宿主細(xì)胞，使用氨甲蝶呤選擇/擴(kuò)增)和neo基因(用于G418選 擇)。
對于輕鏈和重鏈的表達(dá)，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼重鏈和輕鏈的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入宿主 細(xì)胞中。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”的多種形式意在包括常用于向原核或真核宿主細(xì)胞中導(dǎo)入外源DNA 的多種技術(shù)，例如，電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等等。在理論上可能在原核或真 核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的抗體。討論了抗體在真核細(xì)胞，尤其哺乳動物宿主細(xì)胞中的表 達(dá)，因為此類真核細(xì)胞，尤其哺乳動物細(xì)胞，比原核細(xì)胞更可能裝配和分泌正確折疊的和免 疫活性抗體。已經(jīng)報導(dǎo)抗體基因的原核表達(dá)對于產(chǎn)生高產(chǎn)量的活性抗體是無效的(Boss和 Wood，1985 Immunology Today 6:12-13)。用于表達(dá)本發(fā)明的重組抗體的哺乳動物宿主細(xì)胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì) 胞(包括 dhfr-CHO 細(xì)胞，描述于 Urlaub 和 Chasin，1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 4216-4220，使用 DH FR 可選擇標(biāo)記，如 Kaufman 和 Sharp，1982 Mol. Biol. 159 601-621 中 描述)、NSO骨髓瘤細(xì)胞、COS細(xì)胞和SP2細(xì)胞。特別地，對于使用NSO骨髓瘤細(xì)胞，另一表 達(dá)系統(tǒng)是顯示于WO 87/04462、W0 89/01036和EP 338，841中的GS基因表達(dá)系統(tǒng)。當(dāng)將編 碼抗體基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動物宿主細(xì)胞時，通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞足以允許抗體在 宿主細(xì)胞中表達(dá)或者將抗體分泌到宿主細(xì)胞所生長的培養(yǎng)基中的一段時間來產(chǎn)生抗體?？?以使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法從培養(yǎng)基回收抗體。雙特異件分子另一方面，本發(fā)明描述了包含本發(fā)明的C3b結(jié)合分子(例如抗C3b抗體或其片段) 的雙特 異性。本發(fā)明的C3b結(jié)合分子可以被衍生或連接到另一功能分子，例如，另一肽或蛋 白質(zhì)(例如，另一抗體或受體的配體)以產(chǎn)生雙特異性分子，其結(jié)合至少兩個不同的結(jié)合位 點或靶分子。實際上可以將本發(fā)明的C3b結(jié)合分子衍生或連接到一個以上的其它功能分子 以產(chǎn)生結(jié)合兩個以上不同的結(jié)合位點和/或靶分子的多特異性分子；此類多特異性分子也 意在被本文使用的術(shù)語“雙特異性分子”包括。為了產(chǎn)生本發(fā)明的雙特異性分子，可以將本 發(fā)明的抗體功能連接(例如，通過化學(xué)偶聯(lián)、遺傳融合、非共價結(jié)合或其它方法)到一個或 多個其它結(jié)合分子，諸如另一抗體、抗體片段、肽或結(jié)合模擬物，從而產(chǎn)生雙特異性分子。因此，本發(fā)明包括這樣的雙特異性分子，所述分子包括至少一個針對C3b新表位 的第一結(jié)合特異性，和針對第二靶表位的第二結(jié)合特異性，所述第二靶表位包括例如因子 B、因子D、備解素、因子H、因子I或在MAC產(chǎn)生中涉及的補體蛋白/酶，如C5、C6、C7、C8和 C9。在一個方面，本發(fā)明的雙特異性分子包含作為結(jié)合特異性的至少一種抗體或其抗 體片段，包括如Fab、Fab，、F (ab，)2、Fv或單鏈Fv?？贵w還可以是輕鏈或重鏈二聚體，或者 其任何最小片段，諸如Ladner等人的美國專利號4，946，778中描述的Fv或單鏈構(gòu)建體，將 其內(nèi)容明確引入本文作為參考?？墒褂帽疚囊阎姆椒ㄍㄟ^綴合組分結(jié)合特異性來制備本發(fā)明的雙特異性分子。 例如，可以分別地產(chǎn)生雙特異性分子的每種結(jié)合特異性，然后將它們相互連接。當(dāng)結(jié)合特 異性是蛋白質(zhì)或肽時，多種偶聯(lián)劑或交聯(lián)劑可以用于共價連接。交聯(lián)劑的實例包括蛋白 A、碳二亞胺、N-琥珀酰亞胺基-S-乙?；?硫代乙酸酯(SATA)、5，5’ - 二硫代二(2-硝 基苯甲酸)(DTNB)、鄰苯二馬來酰亞胺(oPDM)、N-琥珀酰亞胺基_3-(2_吡啶基二硫代) 丙酸酯(SPDP)，以及硫代琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(硫 代-SMCC)(參見例如Karpovsky 等人，1984 J. Exp. Med. 160 1686 ；Liu，MA等人，1985 Proc.Natl. Acad. Sci. USA 82:8648)。其它方法包括 Paulus，1985 Behring Ins. Mitt. No. 78， 118-132 ；Brennan 等人，1985 Science 229 :81_83，和 Glennie 等人，1987 J. Immunol. 139 2367-2375中描述的那些。綴合劑是SATA和硫代SMCC，它們都可以從PierceChemical Co. (Rockford, IL)得到。當(dāng)結(jié)合特異性是抗體時，它們可以通過兩個重鏈的C-端鉸鏈區(qū)的巰基鍵合而綴 合。在一個特定的方面中，修飾鉸鏈區(qū)以在綴合前含有奇數(shù)個巰基，例如，一個巰基。備選地，可以在相同載體中編碼兩種結(jié)合特異性并在相同的宿主細(xì)胞中表達(dá)和裝 配。當(dāng)雙特異性分子是mAbXmAb、mAbXFab、FabXF(ab，)2或配體XFab融合蛋白時，該方 法尤其有用。本發(fā)明的雙特異性分子可以是包含一個單鏈抗體和結(jié)合決定簇的單鏈分子， 或者包含兩個結(jié)合決定簇的單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可以包含至少兩個單鏈分 子。用于制備雙特異性分子的方法在例如美國專利號5，260，203 ；美國專利號5，455，030 ； 美國專利號4，881，175;美國專利號5，132，405;美國專利號5，091，513;美國專利號 5，476，786 ；美國專利號5，013，653 ；美國專利號5，258，498 ；和美國專利號5，482，858中描 述。雙特異性分子與它們的特定靶標(biāo)的結(jié)合可以通過例如酶聯(lián)免疫吸附測定法 (ELISA)、放射免疫測試法(REA) ,FACS分析、生物測試法(例如，生長抑制)，或者蛋白質(zhì)印 跡測試法證實。這些測試法的每一種通常通過使用對目的復(fù)合體特異的標(biāo)記試劑(例如， 抗體)檢測具體目的蛋白質(zhì)_抗體復(fù)合體的存在。篩選和測定補體激活測定可以在體外和體內(nèi)測試C3b結(jié)合分子的功能特征。例如，可以測試結(jié)合分子抑制 C3b和補體蛋白相互作用的能力，所述補體蛋白例如備解素、因子H、因子B、因子I、膜輔助 因子和/或其復(fù)合體?？梢詼y試其他結(jié)合分子抑制C3和/或C5轉(zhuǎn)化酶活性的能力，根據(jù) Wiesmann，C，等人，(2006). Nature 444，217-220?？梢允褂酶鞣N方法測量補體通路分子的活性和補體系統(tǒng)的激活(參見例如，美國 專利號 6，087，120 ；禾口 Newell 等人，J Lab CLin Med, 100 :437_44，1982)。例如，可以通過 (i)測量對補體_介導(dǎo)的紅血細(xì)胞裂解(溶血)的抑制；(ii)測量抑制C3或C5切割的能 力；和(iii)對經(jīng)典通路和/或旁路介導(dǎo)的溶血的抑制，來監(jiān)控補體活性。兩類最常使用的技術(shù)是溶血測定(參見例如，Baatrup等人，Ann RheumDis, 51 892-7,1992)和免疫學(xué)測定(參見例如，Auda 等人，Rheumatollnt，10 185-9，1990)。溶血 技術(shù)測量完整序列——經(jīng)典通路或旁路——的功能性能力。免疫學(xué)技術(shù)測量特定補體組分 或分裂產(chǎn)物的蛋白質(zhì)濃度?？捎糜谠诒景l(fā)明方法中檢測補體激活或測量補體組分活性的其 他測定包括，例如T細(xì)胞增殖測定(Chain等人，J Immunol Methods，99 :221_8，1987)，和 遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)測定(Forstrom 等人，1983，Nature303 :627_629 ；Halliday 等人， 1982,in Assessment of Immune Status bythe Leukocyte Adherence Inhibit ion Test, Academic, New York，第 1-26 頁，Koppi 等人，1982，Cell. Immunol. 66 394-406 ；和美國專 利號 5，843，449)。在溶血技術(shù)中，所有合適的補體組分必需存在且是 有功能的(根據(jù)所測量的通 路，需要的組分可以不同)。因此，溶血技術(shù)可以同時篩選補體系統(tǒng)的功能完整性和缺陷(參見例如，Dijk 等人，J Immunol Methods 36 :29_39，1980 ;Minh等人，CLin Lab Haematol. 5 :23-341983 ；和 Tanaka 等人，J Immunol 86:161-170,1986)。例如，為了測量 經(jīng)典通路的功能能力，使用包被了凝血素(針對綿羊紅血細(xì)胞的兔IgG)的綿羊紅血細(xì)胞 (也可以使用來自其它物種的紅血細(xì)胞，例如可以使用雞紅血細(xì)胞)作為靶細(xì)胞(敏化細(xì) 胞)。當(dāng)組分是有功能的，并存在足夠的濃度時，上述Ag-Ab復(fù)合體激活經(jīng)典通路，導(dǎo)致靶 細(xì)胞裂解。為了確定旁路的功能能力，使用兔紅血細(xì)胞作為靶細(xì)胞(參見例如，美國專利號 6，087，120)。溶血補體測量可用于檢測補體蛋白的缺陷和功能紊亂(例如在受試者的血液 中)，因為它基于補體誘導(dǎo)細(xì)胞裂解的功能，所述功能需要完整范圍的有功能的補體蛋白。 已經(jīng)擴(kuò)展了用于確定經(jīng)典通路激活的所謂的CH50方法，和用于旁路的AP50方法，通過使用 特異的、分離的補體蛋白取代全血清，而高度稀釋的測試樣品則含有未知濃度的有限補體 組分。通過該方法，可以實施更細(xì)致的補體系統(tǒng)測量，提示哪種組分是缺陷的。免疫學(xué)技術(shù)使用抗多種補體組分(例如，C3、C4或C5)的不同表位的多克隆或單克 隆抗體，來檢測例如，補體組分的分裂產(chǎn)物(參見例如，Hugli等人，Immunoassays CLinical Laboratory Techniques 443-460,1980 ；Gorski ^A, J Immunol Meth 47 61-73,1981 ； Linder 等人，J ImmunolMeth 47 :49_59，1981 ；和 Burger 等人，J Immunol 141 :553_558， 1988)。然后，可以測量抗體結(jié)合分裂產(chǎn)物，與結(jié)合已知濃度的標(biāo)記分裂產(chǎn)物的競爭?？墒?用多種測定，例如放射性免疫測定、ELISA和輻射擴(kuò)散測定，來檢測補體分裂產(chǎn)物。免疫學(xué)技術(shù)為檢測補體激活提供了高靈敏度，因為其允許測量在患有或未患黃 斑變性相關(guān)病癥的測試受試者和對照受試者的血液中形成的分裂產(chǎn)物。因此，在本發(fā)明 的一些方法中，通過定量測試受試者的血漿中的補體組分的可溶性分裂產(chǎn)物(例如，C3a、 C4a、C5a和C5b_9終末復(fù)合體)，測量異常的補體激活，來獲得與黃斑變性相關(guān)的病癥的 診斷?？梢匀缋?Chenoweth 等人，N Engl J Med 304 :497_502，1981 ；和 BhaKDi 等人， BiochimBiophys Acta 737 :343_372，1983所述，實施測量。優(yōu)選的，僅測量在體內(nèi)形成的 補體激活。這可以通過將受試者的生物學(xué)樣品(例如，血清)收集在含有補體系統(tǒng)抑制劑 的培養(yǎng)基中，然后測量樣品中的補體激活(例如，定量分裂產(chǎn)物)來實現(xiàn)。在患有與黃斑變性相關(guān)的病癥的患者的臨床診斷或監(jiān)控中，與來自正常受試者的 相應(yīng)生物學(xué)樣品中的水平相比，補體蛋白的檢測是患者患有與黃斑變性相關(guān)的病癥的指
示 ο體內(nèi)診斷或成像描述在中US2006/0067935。簡而言之，這些方法通常包括向患者 施用或?qū)朐\斷有效量的C3b結(jié)合分子，所述分子可操作的連接了通過非侵入方法可檢測 的標(biāo)志物或標(biāo)記。允許抗體-標(biāo)志物綴合物有充分的時間進(jìn)行定位并與眼內(nèi)的補體蛋白質(zhì) 結(jié)合。然后，將患者暴露在檢測儀器下，鑒別可檢測的標(biāo)志物，從而形成C3b結(jié)合分子在患 者眼內(nèi)的定位圖像。通過確定抗體-標(biāo)志物是否結(jié)合眼內(nèi)的組分，來檢測C3b結(jié)合分子或 其復(fù)合體的存在。與沒有AMD病的正常個體相比，檢測到或者升高水平的選定補體蛋白或 其組合，提示與黃斑變性相關(guān)的病癥的易感傾向和/或發(fā)作。本發(fā)明的上述本發(fā)明還優(yōu)選 的用于眼成像方法和組合的血管形成診斷和治療方法。動物模型US2006/0067935中已經(jīng)描述了適用于測試C3b結(jié)合分子調(diào)控C3b的動物模型。已經(jīng)開發(fā)了小鼠中的AMD動物模型，其出現(xiàn)在人的病情中可見的病理學(xué)特征。Ambati，J等人， (2003)Nat Med 9，1390-1397。可以通過標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)程序，在這些實驗動物中確定C3b結(jié)合分子的毒性和療效， 例如，確定LD5C1(50%群體致死的劑量)和ED5tl(50%群體治療有效的劑量)。毒性和療效之 間的劑量比是治療指數(shù)，可表示為比例LD5(i/ED5(i。從動物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于配制一系 列在人體使用的劑量。配制的劑量在動物模型中達(dá)到的循環(huán)血漿濃度范圍包括根據(jù)細(xì)胞培 養(yǎng)確定的IC50 (即，實現(xiàn)癥狀的半最大抑制的測試化合物濃度)。此類信息可用于更精確地 確定人體內(nèi)的可用劑量。例如，可以通過高效液相色譜測量血漿水平。
藥物組合物及其用途藥物組合物在另一個方面，本發(fā)明提供了組合物(例如藥物組合物)，其包括一種本發(fā)明的 C3b結(jié)合分子或其組合(例如，單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分)，與可藥用的載體共同配 制。此類組合物可以包括一種結(jié)合分子或其組合(例如，兩種或多種不同的)。例如，本發(fā)明 的藥物組合物可以包括與靶抗原的不同表位結(jié)合，或具有互補活性的抗體或試劑的組合。本發(fā)明的藥物組合物還可以在組合療法中施用，S卩，與其它試劑組合。例如，組合 療法可以包括抗C3b抗體與至少一種抗炎劑組合?？捎糜诮M合療法的治療劑的實例更詳細(xì) 的描述在下文本發(fā)明試劑的使用的章節(jié)中。如本文中使用的，“可藥用的載體”包括任何的和所有生理上相容的溶劑、分散介 質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑，等滲和吸收延緩劑等。載體應(yīng)該是適合腸胃外給藥的(例如， 通過注射或灌注)。如本文中使用的，“腸胃外的”施用意指除腸和局部施用以外的施用模 式，通常通過注射，并且包括但不限于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心臟內(nèi)、真 皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、眼內(nèi)(包括玻璃體內(nèi))、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、被膜下、蛛網(wǎng)膜下、脊 柱內(nèi)、硬腦膜外和intrastemal的注射和灌注。根據(jù)施用途徑，可以包被C3b結(jié)合分子，或 在遞送材料中提供，以保護(hù)其免受酸或其它可以使本發(fā)明的結(jié)合分子失活的天然條件的作 用。本發(fā)明的藥物組合物可以包括一種或多種可藥用的鹽?！翱伤幱玫柠}”指保留 親本化合物期望的生物學(xué)活性，且不產(chǎn)生任何不期望的毒性效應(yīng)的鹽(參見例如，Berge, S.M.等人，1977 J. Pharm. Sci. 66 1-19)。此類鹽的實例包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加 成鹽包括從無毒無機酸衍生的鹽，例如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等， 以及從無毒的有機酸衍生的鹽，例如脂肪族單羧酸和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷 酸、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸等。堿加成鹽包括源自堿土金屬，例如鈉、鉀、鎂、鈣等的 鹽，以及源自無毒有機胺的鹽，例如N，N' -二芐基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽 堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等。本發(fā)明的藥物組合物還可以包括可藥用抗氧化劑。可藥用抗氧化劑的實例包 括水溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉等； 油可溶的抗氧化劑，諸如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、丁基化羥基甲苯 (BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α生育酚，等等；和金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸 (EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸，等等。可以用于本發(fā)明的藥物組合物中的合適的水性和非水性載體的實例包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇，等等)，和其合適的混合物，植物油，諸如橄欖油， 和可注射的有機酯，諸如油酸乙酯。例如，通過使用諸如卵磷脂的包衣材料，在分散液的情 況中保持所需顆粒大小，以及通過使用表面活性劑來保持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。這些組合物還可以包含佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑。預(yù)防微生物 的出現(xiàn)可以通過同上文的滅菌程序，以及通過引入各種抗細(xì)菌和抗真菌劑(例如對羥基苯 甲酸酯類、氯丁醇、酚山梨酸等)來確保。組合物中可能還需要包括等滲試劑(諸如糖、氯 化鈉等)。此外，可以通過加入延緩吸收的試劑諸如單硬脂酸鋁和明膠來延長可注射藥物形 式的吸收?？伤幱幂d體包括無菌水溶液或分散液，和用于臨時制備無菌可注射的溶液或分散 液的無菌粉末。將此類介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)的用途為本領(lǐng)域已知。除非任何常規(guī) 介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容，否則可在本發(fā)明藥物組合物中應(yīng)用這些介質(zhì)和試劑。補 充的活性化合物也能摻入到組合物中。治療組合物通常在生產(chǎn)和儲存條件下必須是無菌和穩(wěn)定的。本發(fā)明的辺h結(jié)合分 子可制成適合高藥物濃度的溶液、微乳劑、脂質(zhì)體或其它有序結(jié)構(gòu)。載體可以是溶劑或分散 媒介，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及其合適的混合 物。例如可通過使用諸如卵磷脂的包衣，通過在分散液的情況下保持所需的顆粒大小，以及 通過使用表面活性劑來維持合適的流動性。在許多情況下，組合物中可以包括等滲劑(例 如糖)、多元醇(諸如甘露醇、山梨醇)或氯化鈉?？梢酝ㄟ^在組合物中包括延緩吸收的試 劑例如單硬脂酸鹽和明膠來延長可注射組合物的吸收。
無菌注射溶液可以通過在合適溶劑中摻入所需量的活性化合物和所需上述列舉 成分的一個或組合，接著進(jìn)行無菌微量過濾來制備。通常，通過將活性化合物摻入無菌載 體制備分散體，所述載體含有基本分散介質(zhì)和所需的來自上面列舉的那些的其它成分。在 用于制備無菌注射溶液的無菌粉末的情況下，無菌粉末的制備方法是真空干燥和冷凍干燥 (凍干)，該方法從其先前無菌過濾過的溶液中產(chǎn)生活性成分和任何其它所需成分的粉末?？梢耘c載體材料組合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量將取決于受治療的受試者、 具體施用方式而變化?？梢耘c載體材料組合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量將通常是產(chǎn) 生治療效果的組合物的量。通常，以百分比計，該量將為約0.01%至約99%活性成分、約 0. 至約70%，或約至約30%活性成分與可藥用載體組合。調(diào)節(jié)劑量方案以提供最佳的期望應(yīng)答(例如，治療應(yīng)答)。例如，可以施與單一大 丸劑(single bolus)，可以隨時間施與幾個分份劑量，或者可以根據(jù)治療情況的緊迫性成 比例地減小或增加劑量。特別有利的是以劑量單位形式配制腸胃外組合物以容易施與和劑 量統(tǒng)一。如本文所用的劑量單位形式指適宜作為待治療受試者的單一劑量的物理上分散的 單位；每個單位含有預(yù)定量的C3b結(jié)合分子，所述量經(jīng)計算以與所需的藥物載體結(jié)合產(chǎn)生 所希望的治療效果。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格由如下決定并且直接依賴于活性化合 物的獨特特征和待實現(xiàn)的具體治療效果，以及在配制該C3b結(jié)合分子用于治療個體的敏感 性時本領(lǐng)域固有的限制。對于施與抗體，劑量在大約0. 0001至100mg/kg宿主體重、并且更通常為0. 01至 5mg/kg宿主體重的范圍。例如，劑量可以是0. 3mg/kg體重、lmg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/ kg體重或10mg/kg體重、或者在1至10mg/kg的范圍。示例性治療方案采取每周施與一次、每兩周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每三個月一次或者每3-6個月一次。本發(fā)明抗C3b抗體的劑量方案包括經(jīng)靜脈內(nèi)施與lmg/kg體重或3mg/kg體重，其中使用下列劑 量方案之一來給予抗體每四周一次進(jìn)行六次給藥、然后每三個月一次；每三周一次；3mg/ kg體重一次、然后lmg/kg體重每三周一次。C3b結(jié)合分子的優(yōu)選的施用途徑是通過向眼睛局部施用。眼用組合物通常向受影 響的眼睛施用，向受影響的眼睛表面，每天1-4次的施用1-4滴無菌溶液或懸浮液，或相對 應(yīng)量的油膏、凝膠或其它固體或半固體組合物。制劑也可以配制成沖洗溶液，在手術(shù)過程中 施與受影響的眼睛?？梢愿鶕?jù)常規(guī)程序?qū)3b結(jié)合分子配制為適于靜脈、腹腔或玻璃體內(nèi)注射的藥 物組合物。通過靜脈注射施用C3b結(jié)合分子。高劑量的靜脈內(nèi)免疫球蛋白(IVIG)，以及 F(ab’)2_IVIG，甚至不相關(guān)的人單克隆抗體都可以結(jié)合C3a和C5a，并干擾其功能。Basta Μ. ^Α F (ab) ‘ 2-mediatedneutralization of C3a and C5a anaphylatoxins -.a novel effectorfunction of immunoglobulins. Nature Medicine 2003 ;9 :431_8。 "SJ^UiyS* C3b結(jié)合分子的組合物適合向眼部進(jìn)行玻璃體注射。通常，用于注射的組合物是無菌等滲水 性緩沖液的溶液。在需要的情況下，C3b結(jié)合分子也可以包括增溶劑，和局部麻醉劑(例如 利諾卡因)，緩解注射位點的疼痛。通常，在單位劑量形式中分別地或混合地提供各成分，例 如，作為位于提示了活性試劑量的密封容器(如，安瓿或藥袋)中的干燥的凍干粉末或不含 水的濃縮物。在通過灌注施用組合物的情況下，其可以用含有無菌藥物級的水或鹽水的灌 注瓶進(jìn)行配制。在通過注射施用組合物的情況下，可以提供安瓿的注射用無菌水或鹽水，使 可以在施用前混合成分。在一個實施方案中，用于在成年患者中治療新生血管(濕形)衰老相關(guān)的黃斑變 性的合適劑量是每月(約28天)玻璃體內(nèi)注射0. 5毫克(0. 05毫升)至受影響的眼睛。 在結(jié)合分子注射前，給予足量的麻醉劑和廣譜殺菌劑。當(dāng)每月注射不可行時，在前4次注射 后，治療可以降低至每3月注射1次。在另一個實施方案中，用于治療新生血管黃斑變性的 抗體有效量是每月玻璃體內(nèi)注射0. 3毫克。在一些方法中，同時施用兩種或多種具有不同特異性的結(jié)合分子(例如，單克隆 抗體)，在這種情況下，施與的每種抗體的劑量都在所示范圍內(nèi)。C3b結(jié)合分子通常多次施 與。兩個單劑量之間的間隔可以是例如每周、每月、每三月或每年。間隔也可以是不規(guī)則的， 如通過檢測患者中針對C3b新表位的結(jié)合分子的血液水平來指示。在一些方法中，調(diào)整劑 量來實現(xiàn)大約1-1000 μ g/ml的血漿C3b結(jié)合分子濃度，并且在一些方法中為約25-300 μ g/ ml ο備選地，C3b結(jié)合分子可以以持續(xù)釋放制劑來施與，在這種情況下，需要較低頻率 的施用。劑量和頻率依賴于C3b結(jié)合分子在患者中的半壽期而不同。一般而言，人抗體顯 示最長的半壽期、然后是人源化抗體、嵌合抗體和非人抗體。施與的劑量和頻率可以依賴于 治療是預(yù)防性或治療性的而不同。在預(yù)防性應(yīng)用中，在長時間內(nèi)以相對稀的間隔施與相對 低的劑量。一些患者在其余生持續(xù)接受治療。在治療性應(yīng)用中，有時需要以相對短的間隔 施用相對高的劑量，直至疾病的進(jìn)展得到降低或終止、或者直到患者顯示部分或完全的疾 病癥狀改善。此后，可以給患者施與預(yù)防方案。本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可以變化，從而獲得對特定患者、組合物和施用模式而言可以有效完成期望治療反應(yīng)、但對患者無毒的活性成分的量。所選劑量水平依賴于多種藥物代謝動力學(xué)因素，包括采用的特定本發(fā)明組合物或其酯、鹽或酰 胺的活性、施用途徑、施與時間、采用的特定化合物的排泄率、治療持續(xù)時間、與采用的特定 組合物聯(lián)合使用的其它藥物、化合物和/或材料、待治療患者的年齡、性別、體重、狀況、總 體健康、以及先前的治療史等醫(yī)療領(lǐng)域熟知的因素?！爸委熡行┝康摹北景l(fā)明抗C3b抗體可以導(dǎo)致疾病癥狀的嚴(yán)重性下降(例如辺 和/或巡轉(zhuǎn)化酶活性降低)、無疾病癥狀期的頻率和持續(xù)時間的增加、或者預(yù)防由于疾病困 擾導(dǎo)致的損害或殘疾。本發(fā)明的結(jié)合分子可以通過一種或多種施與途徑使用本領(lǐng)域已知的一種或多種 不同方法來施與。如熟練技術(shù)人員將理解的，施與途徑和/或模式依賴于期望結(jié)果而不同。 本發(fā)明C3b結(jié)合分子的施與途徑包括靜脈內(nèi)的、眼內(nèi)、玻璃體內(nèi)、肌內(nèi)的、皮內(nèi)的、腹膜內(nèi) 的、皮下的、脊髓的或其它腸胃外的施與途徑，例如通過注射或輸注。備選地，本發(fā)明的C3b結(jié)合分子可以通過非腸胃外的途徑施與，諸如局部的、表皮 的或粘膜的施與途徑，例如鼻內(nèi)的、經(jīng)口的、舌下的、或局部的?；钚曰衔锟梢杂帽苊饣衔锟焖籴尫诺妮d體制備，諸如控釋制劑，包括埋植劑、 經(jīng)皮的貼片和微囊遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾摹⑸锵嗳莸木酆衔?，諸如乙烯乙酸乙 烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。許多制備此類制劑的方法都獲得了專利， 或者通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。參見，例如Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems, J. R. Robinson Marcel Dekker, Inc. ，M.^, 1978。治療性組合物可以用本領(lǐng)域已知的醫(yī)療裝置來施與。例如，在一個方面，本發(fā) 明的治療性組合物可以用無針頭皮下注射裝置來施與，其中所述裝置諸如美國專利號 5，399，163,5, 383，851,5, 312，335,5, 064，413,4, 941，880,4, 790，824 或 4，596，556 中所 示的裝置?？捎糜诒景l(fā)明的公知的埋植劑和模塊的實例包括美國專利號4，487，603，其 顯示以可控速率分發(fā)藥物的可植入性微輸注泵；美國專利號4，486，194，其顯示通過皮膚 施與藥物的治療性裝置；美國專利號4，447，233，其顯示以精確輸注速率呈遞藥物的醫(yī)療 輸注泵；美國專利號4，447，224，其顯示用于持續(xù)遞送藥物的、可變流量的可植入的輸注裝 置；美國專利號4，439，196，其顯示具有多室區(qū)間的滲透性藥物遞送系統(tǒng)；以及美國專利號 4，475，196，其中顯示滲透性藥物遞送系統(tǒng)。這些專利引入本文作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員 公知許多其它的此類埋植劑、遞送系統(tǒng)和模塊。在某些方面，可以將本發(fā)明的C3b結(jié)合分子配制以確保在體內(nèi)的適當(dāng)分布。例如， 血-腦屏障(BBB)或血-視網(wǎng)膜屏障(BRB)排除了許多高親水的化合物。為了確保本發(fā)明 的治療性化合物能夠穿過BBB或BRB (如需要的話)，可以將它們配制在例如脂質(zhì)體中。制 備脂質(zhì)體的方法參見例如美國專利4，522，811,5, 374，548和5，399，331。脂質(zhì)體可以包含 一個或多個可以選擇性轉(zhuǎn)運進(jìn)入特定細(xì)胞或器官中、并因此可以增強靶向藥物遞送的結(jié)構(gòu) 部分(參見，例如V.V.Ranade，1989 J. Cline Pharmacol. 29 685)。示例性靶向部分包括 葉酸鹽或生物素(參見例如Low等人的美國專利5，416，016)、甘露糖苷(Umezawa等，1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153 1038)、抗體(P. G. Bloeman 等，1995 FEBS Lett. 357 140 ；M-Owais 等人，1995Antimicrob. Agents Chemother. 39 :180)、表面活性劑 A 蛋白受體 (Briscoe 等，1995 Am. J. Physiol. 1233 134)、pl20 (Schreier 等，1994 J. Biol. Chem. 269 9090)；也參 B K. Keinanen ；M. L. Laukkanen, 1994 FEBSLett. 346 123 ;J. J. Killion ； I. J. Fidler,1994 Imrnunomethods 4 :273。用涂和方法本文描述的C3b結(jié)合分子具有體外和體內(nèi)的診斷和治療用途。例如，這些分子可 以施用于在培養(yǎng)中(例如體外或體內(nèi))或在受試者中(例如體內(nèi))的細(xì)胞來治療、預(yù)防或 診斷多種病癥。C3b結(jié)合分子特別適合治療患有AMD或有風(fēng)險患AMD的人類患者，所述病情 在約10%的情況下與新生血管化(濕性AMD)、炎癥和視力喪失相關(guān)。C3b結(jié)合分子還適合 治療患有以下疾病或病癥的人類患者，例如腎炎、哮喘、再灌注損傷、血液透析、類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、牛皮癬、多發(fā)性硬化、移植、阿爾茨海默氏癥、aHUS、MPGN II或任 何其他補體介導(dǎo)的疾病。當(dāng)C3b結(jié)合分子與另一種試劑共同施用時，可以以任意順序或同時施用兩者。在 一些方面，向已接受第二試劑(例如，維替泊芬)治療的受試者施用C3b結(jié)合分子。在其他 方面，結(jié)合分子與手術(shù)治療結(jié)合施用。用于與C3b結(jié)合分子組合治療的合適試劑包括本領(lǐng)域已知的、能夠調(diào)節(jié)補體組 分活性的試劑(參見例如，美國專利號5，808，109)。已報道了消除補體介導(dǎo)的活性的 其它試劑。此類試劑包括氨基酸(Takada, Y.等人，Immunology 1978,34,50 9)；磷酸 酯(Becker, L. Biochem. Biophy. Acta 1967，147，289)；多陰離子物質(zhì)(Conrow, R. B.等 人，J. Med. Chem. 1980，23，242)；磺酰氟(Hansch, C. ；Yoshimoto, M. J. Med. Chem. 1974， 17，1160，和本文引用的參考文獻(xiàn))；多核苷酸(DeCLercq，P. F.等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975，67，255)；海松酸(Glovsky，Μ. M.等人，J. Immunol. 1969，102，1)；卟吩 (Lapidus, M.禾口 Tomasco，J. Immunopharmaco 1. 1981, 3,137)；一些抗炎齊[J (Burge, J. J.等 人，J. Immunol. 1978，120，1625)；苯酚(Muller—Eberhard，H. J. 1978，inMolecular Basis of Biological Degradative Processes, Berlin, R. D.等人編著，Academic Press, New York，第65頁)；和苯甲脒(Vogt，W.等人，Immunology 1979，36，138)。這類試劑中一些通 過普遍抑制蛋白酶和酯酶發(fā)揮作用。其它試劑對補體通路中的任何特定中間步驟都不是特 異的，而是抑制一個以上的補體激活步驟。后一類化合物的實例包括苯甲脒，其阻斷C1、C4 和 C5 使用(參見例如，Vogt 等人，Immunol. 1979，36，138)。本領(lǐng)域已知可以抑制補體組分活性的其它試劑包括K-76，來自葡萄穗霉菌的真 菌代謝物(Corey 等人，J. Amer. Chem. Soc. 104 :5551，1982)。K-76 和 K-76C00H 都已表現(xiàn) 出主要在 C5 步驟抑制補體(Hong 等人，J. Immunol. 122 :2418，1979 ；Miyazaki et al.， Microbiol. Immunol. 24 :1091，1980)，并抑制從正常的人補體產(chǎn)生趨化因子(Bumpers等 人，Lab. CLinc. Med. 102 :421，1983)。在高濃度的 K-76 和 K-76C00H 下，表現(xiàn)出對 C2、C3、 C6、C7和C9及其各自的前中間體的一些抑制作用。還已經(jīng)報道，K-76和K-76C00H抑制補 體的C3b失活系統(tǒng)(Hong等人，J. Immunol. 127 104-108，1981)。其它適合實踐本發(fā)明方法 的試劑包括灰黃霉素(Weinberg, in Principles of Medicinal Chemistry,第 2 版,Foye, W. 0.編著，Lea & Febiger,Philadelphia,Pa.,第 813 頁，1981)、isopannarin(Djura等人， Aust. J. Chem. 36 :1057，1983)和 Siphonodictyoncoralli-phagum 的代謝物(Sullivan 等 人，Tetrahedron 37 :979，1981)。組合治療方案可以是加成的，或者可以產(chǎn)生協(xié)同結(jié)果(例如，比組合使用兩種試劑預(yù)期更多的降低補體通路活性)。在一些方面，使用C3b結(jié)合分子和抗血管生成劑(例 如，抗-VEGF)的組合治療產(chǎn)生協(xié)同結(jié)果(例如，C3b生物活性的協(xié)同降低)。
包括本發(fā)明的組合物和使用說明的試劑盒也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。試劑盒還可以 含有至少一種其它試劑，或者一種或多種本發(fā)明的其它抗體(例如，具有互補活性的抗體， 所述抗體與不同于第一抗體的C3b新表位結(jié)合)。試劑盒通常包括提示試劑盒內(nèi)容物預(yù)期 用途的標(biāo)簽。術(shù)語標(biāo)簽包括在試劑盒上或盒內(nèi)提供的任何書寫的、或記錄的材料，或者伴隨 試劑盒的材料。已經(jīng)全面的描述了本發(fā)明，還通過下列實施例和權(quán)利要求進(jìn)一步示例本發(fā)明，所 述實施例和權(quán)利要求是示例性的，而并非意在進(jìn)一步限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識到，或 能夠使用不超過常規(guī)實驗，確定本文描述的特定程序的多個等價方式。此類等價方式也落 入本發(fā)明和權(quán)利要求的范圍內(nèi)。所有參考文獻(xiàn)的內(nèi)容，包括發(fā)表的專利和公開的專利申請， 都通過引用全文整合到本申請中。
實施例實施例A通過噬菌體展示產(chǎn)生人抗體為了產(chǎn)生抗C3b抗體，使用MorphoSys HuCAL GOLD 噬菌體展示文庫進(jìn)行選 擇。HuCAL GOLD 是基于HuCAL 概念的Fab文庫，其中所有6個⑶R都是多樣化的，并使 用CysDisplay 技術(shù)連接Fab片段和噬菌體表面(Knappik等人，2000 J. Mol. Biol. 296 57-86 ；Krebs 等人，2001 JImmunol. Methods 254 :67_84 ;Rauchenberger 等人，2003 J Biol Chem. 278 (40) 38194-38205 ；WO 01/05950,Lohning, 2001) 噬菌粒拯救、噬菌體擴(kuò)增和純化在含有34 μ g/ml氯霉素和葡萄糖的2xYT培養(yǎng)基(2xYT_CG)中擴(kuò)增 HuCAL GOLD 文庫。在OD6tltlnm為0. 5時，用VCSM13輔助噬菌體感染后(不振蕩條件下在 37°C下30分鐘；在250rpm振蕩條件下在37°C下30分鐘)，離心沉淀細(xì)胞(4120g ；5min ； 4°C )，在2χΥΤ/34 μ g/ml氯霉素/50 μ g/ml卡那霉素/0. 25mM IPTG中重懸，并在22°C生長 過夜。從上清液中PEG沉淀噬菌體2次，重懸在PBS/20%甘油中，并儲存在_80°C。如下進(jìn)行兩輪淘選之間的噬菌體擴(kuò)增用洗脫的噬菌體感染對數(shù)中期的大腸桿菌 TGl細(xì)胞，并鋪板在添加了 葡萄糖和34 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂(LB-CG平板)上。在 30°C孵育過夜后，從瓊脂平板上刮下TGl菌落，用于接種2xYT-CG直到達(dá)到OD6tltlnm為0. 5，如 上所述添加VCSMl3輔助噬菌體用于感染。用HuCAL GOLD 淘選為了選擇識別C 3b新表位的抗體，使用了兩種不同的淘選對策。總而言之，將 HuCAL GOLD 噬菌體-抗體分成包括不同Vh主基因組合的四個池(池ι :νΗ1/5 λ κ，池2 : VH3 λ κ。池3 :Vh2/4/6 λ κ，池4 :VH1_6 λ κ )。這些池分別經(jīng)過3輪固相淘選，針對與巰基 交聯(lián)瓊脂糖珠直接綴合的人C3b，和直接包被硫氫鍵結(jié)合平板的C3b，此外，還經(jīng)歷3輪生物 素化C3b抗原溶液的淘選。第一淘選變量(panning variant)是抗C3b新表位的固相淘選用300 μ 1的 5 μ g/ml C3b包被2孔硫氫鍵結(jié)合平板(Corning)——每孔過夜于4°C。用350 μ 1的PBS洗滌2遍，并用350 μ 1的5% MPBS在微滴度板搖床上RT封閉2h。對于每次淘選，用等體積 的PBST/5%MP在室溫封閉IO13HuCAL GOLD 噬菌體-抗體2h。在封閉后，用350μ 1的PBS 洗滌被包被的孔2遍。向每個被包被的孔添加300 μ 1預(yù)封閉的HuCAL GOLD 噬菌體_抗 體，并在振蕩器上RT孵育2h。通過加入5次350 μ 1的PBS/0. 05% Tween實施洗滌，然后 再用PBS洗滌四次。用溶于IOmM Tris/HCL pH8中的300 μ 1 20mM DTT/孔，實施從平板洗 脫噬菌體10分鐘。將DTT噬菌體洗脫液添加到14ml的大腸桿菌TGl中，在37°C下2YT培 養(yǎng)基中生長至OD6tltlnm為0. 6-0. 8，并在50ml塑料管中37°C下不振蕩地孵育45分鐘，進(jìn)行噬 菌體感染。在5000rpm離心10分鐘后，將細(xì)菌團(tuán)塊分別重懸于500μ 1 2χΥΤ培養(yǎng)基中，接 種在2xYT-CG瓊脂平板上，在30°C孵育過夜。然后，從平板上刮下菌落，如上述拯救并擴(kuò)增 噬菌體。根據(jù)第1輪的規(guī)程針對直接包被的C3b抗原實施第2和第3輪的固相淘選，但增 加洗滌程序中的嚴(yán)謹(jǐn)度。第二淘選變量(panning variant)是抗生物素標(biāo)記的人C3b抗原的溶液淘選對 于溶液淘選，使用與Dynabeads M-280 (Dynal)偶聯(lián)的生物素標(biāo)記的C3b抗原，并使用以下 歸程使用 1. 5ml 用 PBS 1 1 稀釋的 2xChemiblocker 在 4°C封閉 1. 5ml Eppendorf 管過 夜。用200 μ 1的PBS洗滌被200 μ 1抗生蛋白鏈菌素包被的磁性Dynabeads M-280 (Dynal) 一遍，并重懸在200μ 1的IxChemiblocker(用Ix PBS稀釋)中。在預(yù)封閉的管中4°C下 對珠子實施封閉過夜。將用于各淘選條件的噬菌體稀釋于500 μ 1 PBS中，并與500 μ 1的 2xChemiblocker/0. 1 % Tween在室溫下混合Ih (使用轉(zhuǎn)機)。實施2次噬菌體預(yù)吸附向封 閉的噬菌體中添加50 μ 1封閉的抗生蛋白鏈菌素磁珠，在轉(zhuǎn)機上RT孵育30分鐘。在通過磁 性儀器(Dynal MPC-E)分離珠子后，將噬菌體上清液( Iml)轉(zhuǎn)移到新的封閉的管中，并在 50 μ 1封閉的珠子上重復(fù)預(yù)吸附30分鐘。然后，在新的封閉的1. 5ml管中，向封閉的噬菌體 添加200nM生物素化的C3b，在轉(zhuǎn)機上RT孵育lh。向每個淘選的噬菌體池中添加100 μ 1封 閉的抗生蛋白鏈菌素磁珠，在轉(zhuǎn)機上RT孵育10分鐘。與生物素化的C3b結(jié)合的噬菌體固 定在磁珠上，并用磁性顆粒分離器(Dynal MPC-E)收集。然后，用轉(zhuǎn)機將珠子在PBS/0. 05% Tween中洗滌7次，再用PBS洗滌3次。用溶于10mMTris/HCL pH8中的300 μ 1 20mM DTT/ 管，實施從Dynabeads洗脫噬菌體10分鐘。通過磁性顆粒分離器移出Dynabeads，并將上清 液添加到14ml生長至OD600nm為0. 6-0. 8的大腸桿菌TGl培養(yǎng)物中。然后，用200 μ 1 PBS洗 滌珠子1次，將PBS與其他移出的噬菌體一起添加到14ml的大腸桿菌TGl培養(yǎng)物中。培養(yǎng) 物在50ml塑料管中37°C下不振蕩地孵育45分鐘，進(jìn)行噬菌體感染。在5000rpm離心10分 鐘后，將細(xì)菌團(tuán)塊分別重懸于500 μ 1 2χΥΤ培養(yǎng)基中，接種在2xYT-CG瓊脂平板上，在30°C 孵育過夜。然后，從平板上刮下菌落，如上述拯救并擴(kuò)增噬菌體。根據(jù)第1輪的規(guī)程針對生物素化的C3b抗原實施第2和第3輪的溶液淘選，但增 加洗滌程序中的嚴(yán)謹(jǐn)度?？扇苄訤ab片段的亞克隆和表達(dá)將選定的HUCALGGLD 噬菌粒的hb-編碼插入物亞克隆到表 達(dá)載體pM0RPH X9 _Fab_FH中，以利于快速有效的表達(dá)可溶性Fab。出于該目的，用XbaI和EcoRI消化選 定菌落的質(zhì)粒DNA，從而切出Fab-編碼插入物(ompA-VLCL和phoA_Fd)，并克隆到XbaI/ EcoRI-消化的表達(dá)載體pM0RPH X9_Fab_ra*。該載體表達(dá)的Fab攜帶兩個C端標(biāo)簽(分別是FLAGTt^n6xH i s)，都可用于檢測和純化。 HuCAL GOLD Fab抗體在大腸桿菌中的微表達(dá)在將選定的Fab亞克隆到pM0RPH X9_Fab_ra表達(dá)載體中以后，將所獲得的氯霉 素-抗性單菌落用于接種到含有100 μ 1 2XYT-CG培養(yǎng)基/孔的96孔微滴度板的各孔中， 在37°C生長過夜。將5 μ 1的各大腸桿菌TG-I培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新鮮、無菌的96孔微滴度板 中，板中預(yù)添加了 ΙΟΟμΙ 2χΥΤ培養(yǎng)基，其中每孔補充了 34 μ g/ml氯霉素和0.1%葡萄糖。 在30°C孵育微滴度板，在滴度板搖床400rpm振蕩微滴度板直到培養(yǎng)物輕微混濁( 2_4小 時)，具有OD6tltlnm為 0.5。向這些表達(dá)平板中，每孔各添加補充了 34μβ/πι1氯霉素和3mM IPTG(異丙 基-β -D-硫代半乳糖苷)的20 μ 1 2χΥΤ培養(yǎng)基(終濃度為0. 5mMIPTG)，用透氣帶密封微 滴度板，在30°C孵育并在400rpm振蕩平板過夜。產(chǎn)生全細(xì)胞裂解液(BEL提取物)向表達(dá)平板的每個孔中，加入含有2. 5mg/ml溶 菌酶的 40 μ 1 BEL 緩沖液(2xBBS/EDTA 24. 7g/l 硼酸，18. 7g NaCL/1,1. 49g EDTA/1, pH 8. 0)，并在微滴度板振蕩器(400rpm)上在22°C孵 育lh。BEL提取物用于ELISA或BioVeris M- series 384分析儀的結(jié)合分析。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)技術(shù)將溶于PBS中的5 μ g/ml的人重組C3b抗原包被在384孔Maxisorp平板 (Nunc-Immunoplate)上，過夜于 4"C。在包被后，用 PBS/0. 05% Tween(PBS-T)洗滌孔 1 次，用PBS洗滌2次。然后，用含2% BSA的PBS-T在RT封閉孔2h。平行的，將15μ1 BEL 提取物和15 μ 1含2% BSA的PBS-T在RT孵育2h。在向孔內(nèi)添加10 μ 1的封閉BEL提取 物前，用PBS-T洗滌封閉的Maxisorp板3次，在RT孵育lh。為了檢測Fab—抗，使用下 列二抗堿性磷酸酶(AP)綴合的AffiniPure F(ab' )2片段、山羊抗人、抗小鼠或抗綿羊 IgG (Jackson Immuno Research) 0為了檢測AP綴合物，根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用熒光底物 如AttoPhos (Roche)。在所有的孵育步驟之間，都用PBS-T洗滌微滴度板的孔3次，在用二 抗最終孵育后，也洗滌3次。可以在TECAN Spectrafiuor讀板器中測量熒光。HuCAL GOLD Fab抗體在大腸桿菌中的表達(dá)和純化使用750ml補充了 34 μ g/ml氯霉素的2xYT培養(yǎng)基，在搖瓶培養(yǎng)中，在TG-I細(xì)胞中 表達(dá)pM0RPH X9_Fab_ra編碼的Fab片段。在30°C振蕩培養(yǎng)物直到OD6tltlnm達(dá)到0.5。通過 添加0. 75mM IPTG，在30°C下誘導(dǎo)表達(dá)20h。用溶菌酶破壞細(xì)胞，通過Ni-NTA層析(Qiagen， Hilden,Germany)分離Fab片段?？梢酝ㄟ^UV-分光光度計確定蛋白質(zhì)濃度(Krebs等人， J ImmunolMethods 254，67-84 (2001))。實施例B通過IXDR3和HCDR2盒的平行交換，令選定的抗C3b新表位Fab親和力 成熟產(chǎn)生用于親和力成熟的Fab文庫為了增加鑒別的抗C3b抗體的親和力和抑制活性，使Fab克隆經(jīng)歷親和力成熟。 出于該目的，使用三核苷酸指導(dǎo)的誘變，通過盒誘變優(yōu)化⑶R區(qū)(Virnekas等人，NuCLeic Acids Res 22，5600-5607，1994)。下段簡要的描述了可用于克隆成熟文庫和Fab優(yōu)化的規(guī)程。將來自表達(dá)載體pM0RPH X9_Fab_raWFab片段克隆到噬菌粒載體pMORPH 25 (美國專利號6，753，136) 中。平行使用兩種不同的對策，同時優(yōu)化親本Fab的親和力和效力。通過單個輕鏈CDR3序列所有組成成分取代LCDR3的六個選定的突變候選物(“親 本”克隆)，來產(chǎn)生噬菌體抗體Fab文庫。平行的，通過單個重鏈⑶R2序列所有組成成分取 代各親本克隆的HCDR2。通過標(biāo)準(zhǔn)克隆程序以及將多樣化的克隆轉(zhuǎn)化到電_感受態(tài)的大腸 桿菌T0P10F’細(xì)胞(Invitrogen)中，來產(chǎn)生親和力突變文庫。如實施例1所述制備呈遞 Fab的噬菌體。建立對應(yīng)各文庫的突變池，并在后續(xù)選擇過程中保持獨立。
成熟淘選對策使用4個抗體池對溶液中的C3b實施3輪淘選，分別如上所述，針對生物素化的 C3b的溶液淘選。通過在各輪淘選中減少生物素化抗原、延長洗滌步驟和通過添加非生物素 化抗原進(jìn)行解離速率選擇，來增加選擇嚴(yán)謹(jǐn)度。使用在細(xì)菌裂解物中檢測C3b結(jié)合Fab的、基于電化學(xué)免疫發(fā)光(BioVeris)的結(jié) 合分析。在 BioVeris M_SERIES 384 分析儀(BioVeris，Europe, Witney, Oxforfshire， UK)中分析大腸桿菌裂解物中的優(yōu)化Fab抗體與C3b的結(jié)合。在測定緩沖液(PBS/0.05% Tween20/0. 5%BSA)中稀釋BEL提取物，用于BioVeris篩選。生物素化C3b與抗生蛋白鏈 菌素包被的順磁性珠子偶聯(lián)，使用 BV-tagTM(BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK) 將抗人(Fab)，2 (Dianova)進(jìn)行釕標(biāo)記。在用BioVeris M-SERIES 384分析儀測量前，向 C3b偶聯(lián)的珠子中添加上述二抗。進(jìn)行BioVeris篩選的命中序列分析，來鑒別Fab克隆。 將選定的Fab抗體亞克隆到IgGl模式中。使用溶液平衡滴定(SET)確定皮摩爾親和力使用Fab的單體級分(至少90%單體含量，通過分析SEC ；Superdex75, Amersham Pharmacia進(jìn)行分析)確定KD?？梢曰救鏗aenel等人，2005所述，實施溶液中的基于 電化學(xué)發(fā)光(ECL)親和力確定和數(shù)據(jù)評估。常量的Fab與不同濃度的C3b溶液平衡(系 列3n稀釋)。添加與順磁性珠子(M-280Str印tavidin，Dynal)偶聯(lián)的生物素化的C3b和 BV-tag (BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK) t示i己白勺㈱入(Fab)‘ 2(Dianova), ^ 孵育混合物30分鐘。然后，使用M-SERIES 384分析儀(BioVeris Europe)，通過ECL檢 測，定量未結(jié)合的Fab濃度。基本如上所述進(jìn)行與另一物種(例如黑猩猩或食蟹猴)的C3b在溶液中的親和力 確定，用黑猩猩或食蟹猴的C3b取代人的C3b。為了檢測游離的Fab，使用與順磁性珠子偶 聯(lián)的生物素化C3b。根據(jù)Haenel等人(2005Anal Biochem 339,182-184)計算親和力。實施例C通過溶血測定檢測補體蛋白從患有衰老相關(guān)性黃斑變性的患者獲得房水和玻璃體液的標(biāo)本。由于潛在疾病 進(jìn)行手術(shù)的患者，在眼內(nèi)手術(shù)開始時獲取標(biāo)本。獲得未稀釋的樣本(100-200μ 1的房水和 200-300 μ 1的玻璃體液)，立即使用或儲藏在_80°C下。從正常人患者獲得房水和玻璃體液樣本，與正常人血清在37°C孵育2小時。使用 標(biāo)準(zhǔn)的CH50和AH50溶血測定，測定混合物對經(jīng)典補體通路和補體旁路的抑制。在這些檢 測中，正常的人血清是從正常的健康受試者獲得的，用作補體的來源，等分的儲存在-80°C。還用從本領(lǐng)域常規(guī)使用的微量離心和凝膠過濾柱獲得的級分處理正常人血清。還確定了房 水和玻璃體液中的總補體活性。CH50 測定Kabat, EA.等)κ, Experimental Immunochemistry 1961.第 133-239 ΜΦ δ Τ CH50測定。使用正常人血清作為補體的來源，等分的儲存在_80°C。還確定了房水和玻璃 體液中各自的總補體活性，并使用綿羊紅細(xì)胞(SRBC)作為靶細(xì)胞(可以使用來自其它物種 的紅血細(xì)胞，例如雞紅血細(xì)胞)。在GVB2+緩沖液(含有Ca2+和Mg2+的明膠/巴比妥緩沖的 鹽溶液)，PH7. 35中制備含有SRBC/ml的懸浮液。滴定溶血素(兔抗綿羊抗血清)，來確定 優(yōu)化的稀釋來敏化SRBC。稀釋的溶血素與等體積的SRBC混合，全混合液在37°C孵育15分 鐘。這導(dǎo)致抗體-包被的紅細(xì)胞(EA)。用2倍系列稀釋的正常人血清或相似稀釋的正常人 血清與測試樣品的混合物在37°C孵育EA 1小時。測試樣品定義為未分餾的房水/玻璃體 液、在尺寸排阻柱后獲得的濾液和在微離心后獲得的持留物。使用用GVB2+孵育的正常人血 清作為對照。通過只用緩沖液(不添加血清)孵育EA獲得背景對照，并通過向EA添加蒸 餾水確定總裂解(100%溶血)。使用1. 2ml冰冷的0. 15M NaC 1終止反應(yīng)，離心混合物沉 淀未裂解的細(xì)胞，并分光光度法(412nm)確定上清液的光密度。相對于100%裂解對照來確 定溶血的百分比。通過確定裂解測定混合物中50%的細(xì)胞所需的血清稀釋度，來定量補體活性。結(jié) 果以CH5tl單位/ml血清表示該稀釋度的倒數(shù)。
AH50 測定使用Kabat等人描述的標(biāo)準(zhǔn)方法，進(jìn)行AH5tl測定，所述方法依賴于人血清通過激活 補體旁路對未敏化的兔紅細(xì)胞(Erab)的裂解。通過向測定緩沖液中添加鈣螯合劑乙二醇 四乙酸(EGTA)，阻止鈣依賴性的經(jīng)典通路的激活，并且向緩沖液中添加兩條通路都必需的 鎂。在GVB-Mg2+-EGTA緩沖液中制備兔RBC的細(xì)胞懸浮液。在GVB-Mg2+-EGTA緩沖液中制備 1. 5倍系列稀釋的正常人血清，或相似稀釋度的正常人血清和測試樣品的混合物，向50 μ 1 的標(biāo)準(zhǔn)化Erab中添加100 μ 1的各血清稀釋。用GVB-Mg2+-EGTA緩沖液孵育的正常人血清作 為對照。然后，振蕩水浴中37°C孵育混合物60分鐘，保持細(xì)胞呈懸浮液，使用1. 2ml冰冷的 NaCl (0. 15M)終止反應(yīng)。在4°C下1250g離心管10分鐘，沉淀細(xì)胞，并分光光度法(412nm) 確定上清液的光密度。在總裂解對照管中，向50 μ 1的Erab懸浮液中添加100 μ 1蒸餾水， 相對于100%裂解對照來確定溶血的百分比。通過確定裂解測定混合物中50%的細(xì)胞所需的血清稀釋度，來定量補體活性。結(jié) 果以ΑΗ50單位/ml血清表示該稀釋度的倒數(shù)。
權(quán)利要求
分離的結(jié)合分子，包括與C3b新表位結(jié)合的抗原結(jié)合部分。
2.分離的C3b結(jié)合分子，包括特異性結(jié)合C3b表位的抗原結(jié)合部分，其中，抗原結(jié)合部 分結(jié)合這樣的人C3b表位，所述表位落入下列之一內(nèi)，或與其重疊(a)SEQ ID NO 1 的氨基酸 GEDTVQSLTQG ；(b)SEQID NO 2 的氨基酸 DEDIIAEENIVSRSEF ；(c)SEQID NO 3 的氨基酸 IRMNKTVAVRT ；(d)SEQ ID NO 4 的氨基酸 SDQVPDTESET ；(e)SEQID NO 5 的氨基酸 VAQMTED ；(f)SEQ ID NO 6 的氨基酸 FVKRAP ；(g)SEQID NO 7 的氨基酸 KDKNRWEDPGKQLYN ；(h)SEQID NO 8 的氨基酸 CTRYRGDQDATMS ；或(i)SEQID NO 9 的氨基酸 GFAPDTDDLKQLANGV。
3.上述權(quán)利要求任一項的C3b結(jié)合分子，其中抗原結(jié)合部分與非人靈長類的C3b抗原 交叉反應(yīng)。
4.上述權(quán)利要求任一項的C3b結(jié)合分子，其中抗原結(jié)合部分與嚙齒類物種的C3b抗原 交叉反應(yīng)。
5.上述權(quán)利要求任一項的C3b結(jié)合分子，其中抗原結(jié)合部分結(jié)合線性表位。
6.權(quán)利要求1-4任一項的C3b結(jié)合分子，其中抗原結(jié)合部分結(jié)合非線性表位。
7.上述權(quán)利要求任一項的C3b結(jié)合分子，其中抗原結(jié)合部分結(jié)合人C3b抗原，具有Kd 等于或小于InM。
8.權(quán)利要求1-6的C3b結(jié)合分子，其中抗原結(jié)合部分結(jié)合非人靈長類的C3b抗原，具有 Kd等于或小于5nM。
9.任一項前述權(quán)利要求的C3b結(jié)合分子，其中抗原結(jié)合部分是人抗體的抗原結(jié)合部分。
10.權(quán)利要求1的C3b結(jié)合分子，其中抗體是人抗體或人源化抗體。
11.任一項前述權(quán)利要求的C3b結(jié)合分子，其中抗原結(jié)合部分是單克隆抗體的抗原結(jié) 合部分。
12.權(quán)利要求1的C3b結(jié)合分子，其中抗原結(jié)合部分是多克隆抗體的抗原結(jié)合部分。
13.權(quán)利要求1的C3b結(jié)合分子，其中C3b結(jié)合分子是嵌合抗體。
14.權(quán)利要求1的C3b結(jié)合分子，其中C3b結(jié)合分子包括抗體的Fab片段、Fab'片段、 F(ab' )2片段或Fv片段。
15.權(quán)利要求1的C3b結(jié)合分子，其中C3b結(jié)合分子包括單鏈Fv。
16.權(quán)利要求1-2的任一項的C3b結(jié)合分子，其中C3b結(jié)合分子包括雙價抗體。
17.任一項前述權(quán)利要求的C3b結(jié)合分子，其中抗原結(jié)合部分源自以下同種型中之一 的抗體=IgGU IgG2、IgG3 或 IgG4。
18.任一項前述權(quán)利要求的C3b結(jié)合分子，其中抗原結(jié)合部分源自以下同種型中之一 的抗體IgGl、IgG2、IgG3或IgG4，其中，F(xiàn)c序列相對于正常序列已經(jīng)改變，從而調(diào)節(jié)效應(yīng)子 功能或改變與Fc受體的結(jié)合。
19.權(quán)利要求18的C3b結(jié)合分子，其中Fc序列的氨基酸殘基234或235已經(jīng)改變。
20.任一項前述權(quán)利要求的C3b結(jié)合分子，其中C3b結(jié)合分子抑制細(xì)胞內(nèi)MAC產(chǎn)生。
21.任一項前述權(quán)利要求的C3b結(jié)合分子，其中C3b結(jié)合分子抑制C3b結(jié)合轉(zhuǎn)化酶。
22.權(quán)利要求21的C3b結(jié)合分子，其中C3b結(jié)合分子抑制C3結(jié)合C3或C5轉(zhuǎn)化酶。
23.任一項前述權(quán)利要求的C3b結(jié)合分子，其中C3b結(jié)合分子抑制C3或C5轉(zhuǎn)化酶的蛋 白水解活性。
24.任一項前述權(quán)利要求的C3b結(jié)合分子，其中C3b結(jié)合分子當(dāng)與細(xì)胞或備解素在存在 C3b抗原的條件下接觸時，相對于無C3b結(jié)合分子時的抑制，降低以下物質(zhì)的產(chǎn)生(i) C3或 C5轉(zhuǎn)化酶；或(ii)C5a或MAC ；或(iii)細(xì)胞表面的C3a或iC3b或C3b。
25.藥物組合物，包括任一項前述權(quán)利要求的C3b結(jié)合分子。
26.抑制(細(xì)胞內(nèi))MAC合成的方法，方法包括將細(xì)胞或備解素與C3b結(jié)合分子接觸。
27.肽，由與選自表1的氨基酸至少90%相同的氨基酸序列組成。
28.調(diào)節(jié)受試者中C3b活性的方法，方法包括向受試者施用C3b結(jié)合分子，所述C3b結(jié) 合分子調(diào)節(jié)受補體系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)胞活性。
29.在需要的受試者中治療眼病的方法，包括向受試者施用有效量的權(quán)利要求25的組 合物。
30.權(quán)利要求28的方法，其中相對于施用組合物前受試者中的MAC水平，受試者的MAC 水平降低了至少5%。
31.權(quán)利要求28的方法，其中受試者還接受第二試劑的治療。
32.權(quán)利要求28的方法，其中受試者具有AMD，或有風(fēng)險患AMD。
33.權(quán)利要求32的方法，其中受試者表現(xiàn)出干形AMD，或有風(fēng)險患濕形AMD。
全文摘要
本文描述了與C3b表位結(jié)合的組合物，以及使用所述組合物的方法。
文檔編號C07K7/00GK101848937SQ200880114277
公開日2010年9月29日 申請日期2008年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月2日
發(fā)明者B·C·吉爾德, B·埃特馬德-吉爾博特遜, D·米哈伊洛夫, I·斯普勞斯基, K·趙, L·B·科立克斯泰恩, M·T·基廷, M·米利克, M·羅古斯卡, Y-I·金 申請人:諾瓦提斯公司