專利名稱：用于疫苗用途的經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及改造百日咳桿菌粘附素(Pertactin，Prn) 蛋白以將其用在針對(duì)百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的無(wú)細(xì)胞疫苗中。所述 經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素在其結(jié)構(gòu)中包含不同菌株的多態(tài)性，并且當(dāng)作為疫苗進(jìn)行檢驗(yàn) 時(shí)，其誘導(dǎo)具有更大的保護(hù)能力和更高的調(diào)理吞噬的活性的抗體應(yīng)答。
背景技術(shù)：
百日咳是一種高度傳染性的急性呼吸系統(tǒng)疾病，其由百日咳博德特氏菌引起， 所述百日咳博德特氏菌是由Bordet和Gengou在1906年首次分離出的微生物[Bordet， J 和 0. Gengou. Ann Inst Pasteur (Paris)，1906. 20 :p. 731-41]。最近，據(jù)估計(jì)，全世界 的感染的年發(fā)病率為4850萬(wàn)。該病在小于6個(gè)月的兒童中是特別嚴(yán)重的，全部死亡者 (300, 000-400, 000)中的 90%與該人口亞群相關(guān)[Crowcroft, N. S.等人，Lancet Infect Dis, 2003. 3(7) :p. 413-8]。存在有各種類型的針對(duì)百日咳博德特氏菌的疫苗，它們被分成兩個(gè)大組細(xì)胞疫 苗，和更新近的無(wú)細(xì)胞類型的疫苗。通過(guò)疫苗接種，產(chǎn)生了該病發(fā)生率的顯著降低，并且還 產(chǎn)生了由兒童轉(zhuǎn)向青少年和成人的病例發(fā)生率的轉(zhuǎn)移。許多研究表明，青少年是百日咳博 德特氏菌的主要貯庫(kù)，并且是向部分受保護(hù)的兒童傳染的主要來(lái)源。因此，百日咳仍是未解 決的問(wèn)題，對(duì)于其來(lái)說(shuō)需要開(kāi)發(fā)新的疫苗以更好地控制疾病流行、再出現(xiàn)的爆發(fā)，和可能在 地方流行區(qū)域根除該疾病[Cherry, J. D. Pediatrics, 2005. 115 (5) :p. 1422-7 ；Singh,M.和 K. Lingappan, Chest,2006. 130(5) :p. 1547—53]。博德特氏菌屬(Bordetella)包括九個(gè)種，其中四個(gè)種與哺乳動(dòng)物中的感染相關(guān)， 即霍氏博德特氏菌(B.holmesii)、支氣管炎博德特氏菌(B. bronchis印tica)、副百日咳 博德特氏菌(B. parapertussis)和百日咳博德特氏菌(B. pertussis)，后兩種是人中的感 染的主要參與者(Mattoo，S.等人，F(xiàn)ront Biosci，2001. 6 :p. E168-86)。大部分的毒力 因子在轉(zhuǎn)錄水平上受到稱為BvgA/S(博德特氏菌毒力基因激活物/傳感物(Bordetella virulence genes Activator/Sensor))白勺雙iii胃會(huì)充白勺ijf [Stibitz, S. 入，Nature, 1989. 338(6212) :p. 266-9]。其中，最相關(guān)的因子是百日咳毒素(PT)，氣管定居因子，腺苷 酸環(huán)化酶；以及絲狀植物凝集素(FHA)、菌毛蛋白(Fim)和百日咳桿菌粘附素(Prn)蛋白這 些粘附素，本發(fā)明集中于百日咳桿菌粘附素蛋白。Prn是一種外膜蛋白，其屬于V型自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族。其特點(diǎn)在于催化自身轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò) 外膜[Henderson, I. R. Trends Microbiol, 2000. 8 (12) :p. 534-5]。在支氣管炎博德特氏菌 [Henderson, I. R. Infect Immun，2001. 69 (3) :p. 1231-43]、百日咳博德特氏菌[Charles, I. G.等人，Proc Natl Acad Sci USA, 1989. 86 (10) :p. 3554-8]和副百日咳博德特氏菌[Li， L.J.等人，Mol Microbiol, 1991. 5(2) :p. 409-17]中，成熟的 Prn 分別為 68kDa、69kDa 禾口 70kDa的蛋白質(zhì)。其結(jié)構(gòu)包括形成0螺旋和V型橫斷面的16條平行鏈[EmSley，P.等人， Nature, 1996. 381(6577) :p. 90_2]。從該螺旋狀核心拋射出許多套圈。其中之一是三聯(lián)體 Arg-Gly-Asp(RGD)，其是與粘附至組織相關(guān)的基元[Leininger，E.等人，Infect Immun,1992.60(6) :p. 2380-5 ；Emsley, P.等人，Nature，1996. 381 (6577) :p. 90-2]?；猂GD和許多富含脯氨酸的區(qū)域的存在與在粘附過(guò)程中Prn的功能相關(guān)。通過(guò) 實(shí)驗(yàn)已觀察到，Prn能夠介導(dǎo)與呼吸上皮細(xì)胞的粘附[Everes t, P.等人，Microbiology， 1996. 142(Ptll) :p. 3261-8]。然而，在所研究的條件下，人血清抑制百日咳博德特氏菌粘附 至A549細(xì)胞系(人肺泡上皮)的試驗(yàn)沒(méi)有表明，在該過(guò)程中Prn是關(guān)鍵因素[Rodriguez， M.E.等人，F(xiàn)EMS Immunol Med Microbiol, 2006. 46(1) :p. 39-47]。Prn蛋白存在于具有三種或更多種組分的無(wú)細(xì)胞疫苗中。無(wú)細(xì)胞疫苗可以由下列 構(gòu)成1) 一種組分，百日咳毒素(PT) ；2)兩種組分PT和絲狀植物凝集素(FHA) ；3)三種 組分PT、FHA和Prn ；以及4)五種組分，包括前面提及的三種組分，以及菌毛蛋白2 (FIM2) 和菌毛蛋白3(FIM3)。在人中，抗-Prn、抗-FIM2和抗-PT抗體的水平與針對(duì)該疾病的保 護(hù)水平相關(guān)[Cherry, J. D.等人，Vaccine, 1998. 16(20) :p. 1901-6 ；Storsaeter, J.等人， Vaccine,2003. 21 (25-26) :p.3542-9]。用百日咳博德特氏菌和支氣管炎博德特氏菌的Prn進(jìn)行的主動(dòng)免疫接種產(chǎn)生 針對(duì)Prn的特異性抗體應(yīng)答，其在各種不同的動(dòng)物模型中賦予了保護(hù)[Charles，I. G.等 人，Eur J Immunol, 1991. 21 (5) :p. 1147-53 ；Roberts, M.等 A, Vaccine, 1992. 10(1) P. 43-8]。類似地，被動(dòng)施用抗-Prn單克隆抗體(MAbs)在呼吸系統(tǒng)攻擊模型中保護(hù)了小鼠 [King A.J.等人，Microbiology，2001. 147 (Ptll) :p. 2885-95]。通過(guò)向包含 PT 和 FHA 的 疫苗中添加Prn，提高了小鼠(呼吸系統(tǒng)攻擊-鼻內(nèi)模型)中的保護(hù)水平[Guiso，N.等人， Vaccine, 1999. 17(19) :p. 2366-76]。最近觀察到，Prn是無(wú)細(xì)胞疫苗中的產(chǎn)生與調(diào)理吞噬 的活性相關(guān)的抗體應(yīng)答水平的唯一組分[Hellwig，S.M.等人，J Infect Dis，2003. 188(5) p. 738-42]。盡管存在有有效的疫苗以及已為大家認(rèn)可的疫苗接種程序，百日咳依然在美洲、 歐洲和亞洲區(qū)域流行，其被認(rèn)為是再出現(xiàn)的疾病[Raguckas，S. E.等人，Pharmacotherapy， 2007. 27(1) :p. 41-52]。所提出的用于解釋這種現(xiàn)象的假說(shuō)之一是由于抗性菌株的出現(xiàn)而 導(dǎo)致的疫苗效力的喪失[Moo i，F(xiàn). R 等人，Emerg Infect Dis, 2001. 7 (3Suppl) :p. 526-8]。 Prn是百日咳博德特氏菌中最具多態(tài)性的蛋白質(zhì)之一。它含有兩個(gè)可變區(qū)，稱為區(qū)域1(R1) 和區(qū)域2 (R2)，其中分別觀察到富含脯氨酸的重復(fù)的氨基酸序列Gly-Gly-X-X-Pr0(GGXXP) 和Pro-Gin-Pro (PQP)。R1區(qū)域位于靠近氨基末端(N-末端)并與基序RGD鄰近的突起 的套圈中，而R2區(qū)域位于朝向羧基末端(C-末端)處[Hijnen，M.等人，Infect Immun, 2004.72(7) :p. 3716-23] 0迄今，在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)的數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)于百日咳博德特氏菌已鑒定出了總共
12 種 Prn 變體(Prnl、Prn2、Prn3......Prn 12)。攜帶 Prnl、Prn2 和 Prn3 的菌株是更具世
界分布的菌株。對(duì)于在美洲、歐洲、亞洲和澳洲各個(gè)地區(qū)中的分離物(追溯的和當(dāng)前流行 的)的眾多表征研究顯示出Prn2菌株逐漸代替Prnl菌株的趨勢(shì)，Prn2菌株在大部分國(guó)家 中占優(yōu)勢(shì)地位[Mooi，F(xiàn). R.等人，Infect Immun, 1998. 66(2) :p. 670-5 ；Cass iday，P 等人， J Infect Dis, 2000. 182(5) :p. 1402-8 ；Weber, C.等人，J Clin Microbiol, 2001. 39(12) p. 4396-403 ；Hal lander, H. 0.等人，J Clin Microbiol, 2005. 43 (6) :p. 2856-65 ；van Amersfoorth, S. C.等人，J Clin Microbiol, 2005. 43 (6)p. 2837-43 ；Byrne, S 等人，BMC Infect Dis,2006. 6 :p.53]。
細(xì)胞疫苗(DTPc)和無(wú)細(xì)胞疫苗(DTPa)中的Prn的氨基酸序列不同于當(dāng)前流行的 菌林這一事實(shí)支持了關(guān)于由于新菌株的出現(xiàn)而造成目前疫苗的效力喪失的假說(shuō)。對(duì)于在 荷蘭和意大利用DTPc和DTPa進(jìn)行疫苗接種和未進(jìn)行疫苗接種的人群的研究表明，這種類 型的疫苗更好地提供針時(shí)具有類似特征的當(dāng)前流行的菌株的保護(hù)[Mooi，F(xiàn).R等人，Infect Immun,1998. 66(2) :p. 670-5 ；Mas trantonio, P.等 K, Microbiology, 1999. 145(Pt8) p. 2069-75]。與這些發(fā)現(xiàn)相一致，小鼠模型顯示，用DTPc進(jìn)行的疫苗接種區(qū)別性地提供針 對(duì)攜帶Prnl和Prn2的菌株的保護(hù)，這表明Prn的R1區(qū)域中的變異可賦予抗性程度[King
A.J.等人，Microbiology，2001.147 (Ptll) :p. 2885-95]。然而，通過(guò)考慮來(lái)源國(guó)家、疫苗接 種狀況和疫苗類型(DTPc和DTPa)而進(jìn)行的對(duì)百日咳博德特氏菌菌株實(shí)施分級(jí)的更大規(guī)模 的研究并未揭示出，對(duì)于當(dāng)前流行的菌株和疫苗接種程序來(lái)說(shuō)在等位基因prn、ptxC、ptxA 或tcfA2的頻率方面存在顯著的差異[van Amersfoorth, S. C.等人，J Clin Microbiol, 2005. 43(6)p. 2837-43]。雖然這些發(fā)現(xiàn)難以證明疫苗接種使得新變體出現(xiàn)，但是Prn2菌林在許多國(guó)家中 的流行升高表明，某些方式有助于Prn2菌株的傳播。一方面，引人注目的是，在那些研 究[van Amersfoorth, S. C.等人，J Clin Microbiol, 2005. 43 (6)p. 2837-43]中，分離出 的具有與所采用的疫苗的等位基因類似的等位基因的三株臨床菌株只存在于未疫苗接種 的兒童中。無(wú)論是否是偶然事件，這暗示Prnl菌株在沒(méi)有特異性免疫力的小生境中是受 優(yōu)待的。另一方面，近來(lái)鑒定出了通過(guò)作為初級(jí)受體的Prn而感染博德特氏菌的噬菌體 (BPP-1)，這使得人們考慮，在該蛋白質(zhì)中的變異可能是由于與免疫系統(tǒng)的那些不同的選擇 壓力而產(chǎn)生的[Liu, M.等人，Science, 2002. 295(5562) :p. 2091-4]。并沒(méi)有排除這樣的 可能性，即這兩種現(xiàn)象與其他未知因素一起相互協(xié)調(diào)地導(dǎo)致百日咳博德特氏菌群體中的變
B. 升。已經(jīng)通過(guò)數(shù)學(xué)模型模擬了百日咳流行病學(xué)的可能的演變，所述數(shù)學(xué)模型獨(dú)立地 整合了該疾病的發(fā)生率和病原體的傳播[Aguas，R.等人，Lancet InfectDis, 2006. 6 (2) p. 112-7]。該模型預(yù)測(cè)，常規(guī)的加強(qiáng)劑量將不能去除在實(shí)際的疾病流行中所觀察到的該疾 病的嚴(yán)重度等級(jí)。很有可能的是，這是由于可用的無(wú)細(xì)胞疫苗所賦予的短的保護(hù)持續(xù)時(shí)間 (4-12年)，以及所產(chǎn)生的免疫力的可變性和疫苗的多樣性而引起的。該模型預(yù)測(cè)，最佳的 情形是擁有產(chǎn)生優(yōu)于天然免疫力的免疫力的疫苗，這是當(dāng)前的細(xì)胞疫苗和無(wú)細(xì)胞疫苗所追 求的典范。本發(fā)明的主要目的在于開(kāi)發(fā)更有效的針對(duì)百日咳的無(wú)細(xì)胞疫苗。在本發(fā)明之前的 主要工作著眼于找到更有效的疫苗，這基于通過(guò)應(yīng)用Prn (Nicole Guiso等人，W0 01/90143 A2 和 US 2006/0008474 A1)或 Prn R1 區(qū)域的合成肽(Frederik Mooi 等人，W0 02/00695 A2)的混合物來(lái)獲得免疫原性制劑。因此，預(yù)防百日咳的一個(gè)重要問(wèn)題是開(kāi)發(fā)出更有效的無(wú) 細(xì)胞疫苗。發(fā)明詳述本發(fā)明有助于解決上述問(wèn)題，并且包括改造編碼稱為百日咳桿菌粘附素(Prn)的 百日咳博德特氏菌外膜蛋白的prnA基因。本發(fā)明通過(guò)下列方式滿足了現(xiàn)有技術(shù)中所表明 的需要使獲得經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素的各種不同變體成為可能，從而在單個(gè)分子中 包含Prn R1區(qū)域的兩個(gè)不同的多態(tài)性結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的多能性還考慮改造新的Prn，其另外還包含R1區(qū)域的三個(gè)或更多個(gè)不同的多態(tài)性結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的目標(biāo)是編碼經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素蛋白的多核苷酸序列，其中所述 經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素蛋白包含靠近給定類型的天然成熟百日咳桿菌粘附素的N-末 端的直至前300個(gè)氨基酸(PrnX300)，以及合靠近給定類型的天然成熟百日咳桿菌粘附素 的C-末端的直至最后620個(gè)氨基酸的氨基酸序列(PrnY620)，這導(dǎo)致得到經(jīng)改造的百日咳 桿菌粘附素 PrnX300-PrnY620。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素”是指通過(guò)下列方式而產(chǎn)生 的蛋白質(zhì)將包含靠近天然成熟百日咳桿菌粘附素分子的N-末端的直至前300個(gè)氨基酸的 片段與包含靠近天然成熟百日咳桿菌粘附素分子的C-末端的直至最后620個(gè)氨基酸的另 一片段毗鄰地或不毗鄰地相連接。經(jīng)改造的新的百日咳桿菌粘附素變體通過(guò)分子誘變而獲得，其中將包含靠近給定 類型的天然成熟百日咳桿菌粘附素的N-末端的直至前300個(gè)氨基酸的序列與包含接近給 定類型的天然成熟百日咳桿菌粘附素的C-末端的直至最后620個(gè)氨基酸的序列毗鄰地相 連接。經(jīng)改造的新的Prn在單個(gè)分子中包含來(lái)自不同類型的Prn的序列，而不影響保護(hù)性 免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，獲得了各種不同的經(jīng)改造的Prn變體，其由標(biāo) 示為SEQ ID N0:l-SpQ ID NO :6的核酸序列編碼。通過(guò)用所述各種不同的變體對(duì)小鼠進(jìn) 行免疫接種，獲得了比用天然Prn (單獨(dú)地或以混合物進(jìn)行配制)所獲得的那些顯著更高的 保護(hù)水平和調(diào)理吞噬的活性水平。用經(jīng)改造的Prn所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答針對(duì)表達(dá)不同類型的 Prn的菌株是同樣有效的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，包含靠近給定類型的天然成熟百日咳桿菌粘附素的 N-末端的前300個(gè)氨基酸的片段(PrnX300)相應(yīng)于博德特氏菌屬的百日咳桿菌粘附素。在 一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該片段相應(yīng)于百日咳博德特氏菌或副百日咳博德特氏菌的百日咳 桿菌粘附素，優(yōu)選地相應(yīng)于百日咳博德特氏菌的Prnl、Prn2和Prn3變體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，靠近給定類型的天然成熟百日咳桿菌粘附素的 C-末端的最后620個(gè)氨基酸(PrnY620)相應(yīng)于博德特氏菌屬的百日咳桿菌粘附素。在本發(fā) 明的一個(gè)特別的實(shí)施方案中，片段PrnY620相應(yīng)于百日咳博德特氏菌或副百日咳博德特氏 菌的百日咳桿菌粘附素，優(yōu)選地相應(yīng)于百日咳博德特氏菌的Prnl、Prn2和Prn3變體。本發(fā)明的多核苷酸序列編碼多肽鏈，所述多肽鏈包含以PrnX300-PrnY620形式的 給定類型的百日咳桿菌粘附素的任何可能的組合。在本發(fā)明的多核苷酸序列中，氨基酸序列PrnX300和PrnY620毗鄰地或者通過(guò)使 用序列 IDNATWVMTDN 或 IDNATWVMTDNIDNATWVMTDN 相連接。在本發(fā)明中，氨基酸序列PrnX300和PrnY620可以沒(méi)有重復(fù)序列，優(yōu)選地沒(méi)有R1 和R2區(qū)域的GGXXP和PQP序列。支持這一特點(diǎn)的證據(jù)如下包含重復(fù)序列GGXXP的區(qū)域1被 人和兔血清很弱地識(shí)別，這表明其不是免疫顯性區(qū)域[Hijnen，M.，F(xiàn). R. Mooi等人，(2004). Infect Immun 72(7) 3716-23] 0另一方面，近來(lái)的工作報(bào)道了 Prn突變體，其中缺失了重 復(fù)序列GGXXP和PQP或者包含這些序列的區(qū)域。GGXXP的缺失未影響所獲得的突變體的物理 化學(xué)性質(zhì)，正如對(duì)于突變型Prn和時(shí)于非突變型Prn通過(guò)使用相同的條件在表達(dá)和純化方 法中所證明的[Hijnen，M.，P. G. van Gageldonk 等人，(2005) Protein Expr Pur if 41(1)106-12]。類似地，GGXXP的缺失未顯著影響結(jié)構(gòu)性質(zhì)，因?yàn)樵趨^(qū)域1中發(fā)生突變的Prn被 針對(duì)天然百日咳桿菌粘附素而產(chǎn)生的構(gòu)象單克隆抗體(MAbs)所識(shí)別，而不被抗-GGXXP序 列MAbs所識(shí)別。此外，已觀察到，在區(qū)域1中的確定的突變可以增強(qiáng)確定的構(gòu)象MAbs的結(jié) 合能力。最后，有證據(jù)表明區(qū)域1 (GGXXP)和區(qū)域2(PQP)形成單個(gè)表位[Hijnen, M.，R. de Voer 等人，(2007). Vaccine 25(31) :5902_14]。本發(fā)明的目標(biāo)還在于編碼經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素的多核苷酸序列，其中氨基 酸序列PrnX300和PrnY620包含作為輔助T表位起作用的肽，所述輔助T表任優(yōu)選地為白 喉、破傷風(fēng)、HBV、脊髓灰質(zhì)炎病毒、牛痘、HIV或流感病毒的表位。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，插 入這種類型的表位導(dǎo)致了通過(guò)具有所述表位的分子所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的增強(qiáng)。本發(fā)明的目標(biāo)還在于根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列在 密碼子使用方面進(jìn)行了優(yōu)化，以用于在細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。 用于增加通過(guò)重組而獲得的分子的表達(dá)的該形式是本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛知曉的?？紤]到作為本發(fā)明目標(biāo)的新蛋白質(zhì)是聯(lián)合疫苗的多個(gè)組分之一，強(qiáng)調(diào)了沒(méi)有任何 先前的發(fā)明打算獲得較少可能數(shù)目的滿足本領(lǐng)域需要的分子實(shí)體。最后，在現(xiàn)有技術(shù)中，需要擁有考慮了百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌 之間的交叉保護(hù)的疫苗制劑?？紤]到博德特氏菌屬的不同物種的百日咳桿菌粘附素之間的 高度同源性，本發(fā)明包括產(chǎn)生經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素，其在單個(gè)分子中考慮了來(lái)自博 德特氏菌屬的不同物種的不同的多態(tài)性區(qū)域。出乎意料地，作為本發(fā)明目標(biāo)的經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素不僅能產(chǎn)生針對(duì)表達(dá) Prnl和Prn2的百日咳博德特氏菌的不同菌株的有效免疫應(yīng)答，而且還誘導(dǎo)相對(duì)于天然百 日咳桿菌粘附素蛋白而言更有效的抗體應(yīng)答，正如在呼吸系統(tǒng)攻擊模型和調(diào)理吞噬試驗(yàn)中 所證實(shí)的。令人驚訝地，由經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答也優(yōu)于由Prnl和 Prn2的等摩爾混合物(Prnl+Prn2)所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答?；谕晃锓N或不同物種的不同百日咳桿菌粘附素的混合物的疫苗組合物(盡 管涵蓋了多態(tài)性)導(dǎo)致與生產(chǎn)過(guò)程相關(guān)的技術(shù)困難，例如不希望的污染物濃度的增加和各 批次之間的生產(chǎn)不一致性。這是對(duì)于開(kāi)發(fā)其中牽涉具有不同特征的多個(gè)抗原的聯(lián)合疫苗來(lái) 說(shuō)至關(guān)重要的方面，它可以累及所述制劑的系統(tǒng)免疫原性。另一方面，預(yù)期到，采用基于R1 區(qū)域的合成肽的策略，將會(huì)獲得不如現(xiàn)有疫苗有效的疫苗，這是因?yàn)閺谋Ｗo(hù)性應(yīng)答中排除 了在天然Prn中存在的相關(guān)的其他表位。為了解決本技術(shù)領(lǐng)域中的這個(gè)問(wèn)題，本發(fā)明提供了藥用細(xì)合物，其包含一種或多 種由根據(jù)權(quán)利要求1-13的多核苷酸序列編碼的經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素，所述經(jīng)改造 的百日咳桿菌粘附素的量足以通過(guò)在哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人中的免疫接種程序而產(chǎn)生針對(duì)博德 特氏菌屬物種的有效的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，包含一種或多 種經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素的藥物組合物產(chǎn)生針對(duì)百日咳博德特氏菌的有效的體液和 細(xì)胞免疫應(yīng)答。本發(fā)明的目標(biāo)還在于包含一種或多種由根據(jù)權(quán)利要求1-13的多核苷酸序列編碼 的經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素的活疫苗或減毒疫苗，其中所述經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素 優(yōu)選地表達(dá)在外膜中。在所述活疫苗或減毒疫苗中，根據(jù)權(quán)利要求1-13的多核苷酸序列可 以被包含在質(zhì)粒載體或細(xì)菌染色體中。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素的根據(jù)權(quán)利要求 1-13的多核苷酸序列被包含在哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中。包含根據(jù)權(quán)利要求1-13的多核苷酸 序列的所述表達(dá)載體是核酸疫苗(其也為本發(fā)明的目標(biāo))的基礎(chǔ)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，由根據(jù)權(quán)利要求1-13的多核苷酸序列編碼的多肽 序列可以在用于檢測(cè)博德特氏菌感染的方法中使用。本發(fā)明的目標(biāo)還在于用于檢測(cè)針對(duì)博 德特氏菌的抗體存在與否的診斷試劑盒，其包含由根據(jù)權(quán)利要求1-13的多核苷酸序列編 碼的多肽序列。附圖簡(jiǎn)述

圖1.在用不同的重組且經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素變體進(jìn)行疫苗接種的Balb/c 小鼠中的保護(hù)實(shí)驗(yàn)。百日咳博德特氏菌菌株Tohama I (Prnl)和臨床分離株CH53 (Prn2)用 于攻擊。柱狀物代表了相對(duì)于用PBS進(jìn)行免疫接種的對(duì)照組而言，在肺中的活細(xì)胞減少的 對(duì)數(shù)的平均值。圖2.由用不同的重組且經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素變體進(jìn)行疫苗接種的Balb/c 小鼠的血清介導(dǎo)的調(diào)理吞噬。該圖顯示了在兩種溫育條件(PE4°C -PE37°C )下，用異硫氰 酸熒光素(FITC)標(biāo)記的細(xì)胞的以任意單位(AU)表示的熒光(藻紅蛋白，PE)的差異。圖3.在用表達(dá)Prnl、Prn2、Prn2CCPrnl和Prn2CLPrnl的質(zhì)粒進(jìn)行免疫接種的小 鼠中產(chǎn)生的針對(duì)Prnl和Prn2CCPrnl的體液免疫應(yīng)答(IgG)。
具體實(shí)施方式
的詳細(xì)描述/實(shí)施例實(shí)施例1.用于在大腸桿菌(Escherichia coli)中細(xì)胞內(nèi)表達(dá)經(jīng)改造的百日咳桿 菌粘附素變體的載體的構(gòu)建，以及其純化使用先前報(bào)道的寡核苷酸1 和 2 [Hijnen, M.，P. G. van Gageldonk 等人，(2005) Protein Expr Pur if 41(1) : 106-12]，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從基因組DNA中擴(kuò)增出 百日咳博德特氏菌菌株Tohoma I (Prnl)和CH53 (Prn2)的prnAl和prnA2基因。使用Nde I和BamH I位點(diǎn)將所獲得的片段克隆到載體pET_28a (Novagen)中。為 了獲得經(jīng)改造的Prn，使用先前由Imai等人于1991年所描述的反向PCR方法[Imai，Y.等 人，Nucleic Acids Res, 1991. 19(10) :p. 2785]。在表1中顯示了用于擴(kuò)增不同序列的寡核 苷酸。寡核苷酸對(duì)1，2用于使載體pET28aprnl和pET28aprn2線性化，它們分別相應(yīng)于百 日咳桿菌粘附素1和2。通過(guò)用寡核苷酸3和4進(jìn)行擴(kuò)增而獲得DomRl片段。另外，通過(guò) 使用寡核苷酸時(shí)3，5和3，6來(lái)擴(kuò)增該區(qū)域，以分別添加編碼短的和長(zhǎng)的連接體的序列。表 2概括了在用于本發(fā)明的各種不同片段的PCR擴(kuò)增中所使用的條件。表1.用于擴(kuò)增各種不同序列的寡核苷酸 表2.用于PCR擴(kuò)增在本發(fā)明中所使用的各種不同片段的條件 將通過(guò)反向PCR獲得的線性載體pET28aprnl和pET28aprn2連接至各種不同片 段，所述片段編碼包含Prnl和Prn2的區(qū)域1的結(jié)構(gòu)域。在這些載體中，經(jīng)改造的新基 因處于T7誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下。將具有正確序列的克隆引入到大腸桿菌菌株BL21-Codonplus(DE3)-RP 中，以用于將其表達(dá)為包含體[Hijnen, M.等人，Protein Expr Purif (2005). 41(1) :p. 106-12]。對(duì)于所有情形，重組百日咳桿菌粘附素1和2以及各種不同變體的表達(dá)水平達(dá)到 15%至20%，這是通過(guò)在用考馬斯藍(lán)染色的聚丙烯酰胺凝膠中施行光密度測(cè)定法而證實(shí) 的。為了純化這些蛋白質(zhì)，將相應(yīng)于每種變體的細(xì)菌膏狀物懸浮在破裂緩沖液中(以 100mg/mL的細(xì)胞濃度)，并通過(guò)超聲波來(lái)裂解細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀溶解在8M尿素中，并通過(guò) 在十二烷基硫酸鈉存在下在聚丙烯酰胺凝膠上的電泳(SDS-PAGE) (12.5% )來(lái)進(jìn)行分級(jí) 分離。通過(guò)咪唑_鋅反向染色對(duì)凝膠進(jìn)行染色，并且在提取緩沖液存在下使相應(yīng)于目的蛋 白的條帶通過(guò)100 ym的鋼網(wǎng)。然后，將提取出的蛋白質(zhì)復(fù)性并通過(guò)超濾進(jìn)行濃縮(使用 Ami con濃縮室，具有50kDa的膜)，并且通過(guò)雙金雞寧酸方法來(lái)測(cè)定濃度。通過(guò)檢驗(yàn)15 y g 的在用考馬斯藍(lán)染色的分析型SDS-PAGE凝膠中純化出的蛋白質(zhì)，沒(méi)有檢測(cè)出污染物，這證 明這些制備物具有超過(guò)95%或更高的純度。在表3中概括了各種不同的構(gòu)建體和所獲得的 經(jīng)改造的Prn的特征。表3.各種不同的構(gòu)建體和經(jīng)改造的Prn的特征 CC 短的連接體；CL 長(zhǎng)的連接體實(shí)施例2.在小鼠模型中的主動(dòng)免疫接種、抗體應(yīng)答和保護(hù)作用用在氫氧化鋁中配制的0. 2iig、0. 02iig或無(wú)(PBS)重組蛋白Prnl、Prn2，Prnl 和Prn2的等摩爾混合物(Prnl+Prn2)，以及6種經(jīng)改造的Prn變體(顯示在表3中)對(duì) 小鼠進(jìn)行免疫接種。所述劑量相應(yīng)于在人中使用的劑量(Infanrix ，8i!g)的1/40和 1/400。所采用的免疫接種途徑為皮下，其中使用lOOiiL的體積。通過(guò)ELISA類型的免疫酶 測(cè)定法來(lái)評(píng)估經(jīng)免疫接種的小鼠的血清?？贵w滴度達(dá)到1.2X103至4.6X104的中值。在 所有情形中，相應(yīng)于較大劑量的滴度的中值顯著不同于用所使用的較小劑量所達(dá)到的滴度(P < 0. 05，Kruskal Wallis-Dunns)。對(duì)于用百日咳桿菌粘附素1和2以及等摩爾混合物 Prnl+Prn2所產(chǎn)生的抗體應(yīng)答，未觀察到差異。類似地，在所述各種不同的經(jīng)改造的變體的 滴度中值之間也沒(méi)有觀察到差異。令人驚訝地，經(jīng)改造的變體的滴度顯著高于未改造的重 組百日咳桿菌粘附素的滴度(ρ < 0.01, Kruskal Wall is-Dunns)。為了進(jìn)行鼻內(nèi)攻擊，使用菌株Tohama I (Prnl)和臨床分離株CH53 (Prn2)。在含有 Bordet-Gengou Agar培養(yǎng)基(Sigma)(補(bǔ)充有甘油和14%去纖維蛋白的綿羊血)的平 板上培養(yǎng)所述細(xì)菌。將平板溫育24小時(shí)(于37°C )，并且將菌落以IO8個(gè)細(xì)胞/mL的密度 重懸浮在Stainer-Scholte培養(yǎng)基中。將該懸浮液用于鼻內(nèi)攻擊。在最后一次免疫接種后 15天，通過(guò)滴注50 μ L細(xì)菌懸浮液(5Χ106個(gè)細(xì)胞)來(lái)攻擊經(jīng)免疫接種的小鼠。在攻擊后 5天，處死小鼠并無(wú)菌地取出肺，并且進(jìn)行勻漿以測(cè)量細(xì)菌負(fù)荷[Den0el，P.等人，Vaccine， 2005. 23(46-47) :p. 5333-41]。所述各種不同的變體顯示出比未經(jīng)疫苗接種的對(duì)照顯著更 高的保護(hù)水平(P < 0.001)。出乎意料地，對(duì)于所述兩種菌株，所述經(jīng)改造的變體顯示出相 比于重組百日咳桿菌粘附素和等摩爾混合物Prnl+Prn2而言更高的保護(hù)水平(ρ < 0. 001)。 在所研究的較小劑量下，可以觀察到，經(jīng)改造的變體同樣地提供了針對(duì)所述兩種菌株的保 護(hù)，而對(duì)于百日咳桿菌粘附素1和2則不是如此。這些結(jié)果證明，這些變體具有不同于且優(yōu) 于分開(kāi)地或以等摩爾混合物形式進(jìn)行檢驗(yàn)的重組百日咳桿菌粘附素1和2蛋白的免疫學(xué)特 性(圖1)。實(shí)施例3.血清的調(diào)理吞噬的活性由抗-Prn抗體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬地活性已顯示為在用無(wú)細(xì)胞疫苗進(jìn)行疫苗接種的 人群的應(yīng)答中的關(guān)鍵參數(shù)[Hellwig, S. Μ.等人，J Infect Dis，2003. 188(5) :ρ· 738-42]。 在本發(fā)明中顯示，各種不同的經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素變體能夠誘導(dǎo)具有這些特征 的抗體。通過(guò)所提及的并經(jīng)調(diào)整而適合于小鼠模型的方法研究了調(diào)理吞噬的活性。在 Bordet-Gengou-Agar培養(yǎng)基中生長(zhǎng)百日咳博德特氏菌的Tohama I和CH53菌株，并用FITC 進(jìn)行標(biāo)記(2X IO6菌落形成單位)。然后，于37°C在平板搖動(dòng)器上用經(jīng)免疫接種的小鼠的 血清將經(jīng)標(biāo)記的細(xì)菌調(diào)理30分鐘，所述小鼠是用重組蛋白Prnl、Prn2、Prnl+Prn2以及用兩 種經(jīng)改造的Prn變體(Prn2-CC-Prnl和Prn2-CL_Prnl)進(jìn)行免疫接種的。在粘附步驟中， 將經(jīng)調(diào)理的細(xì)菌和未調(diào)理的對(duì)照與多形核細(xì)胞(PMN) —起進(jìn)行溫育。將樣品分開(kāi)，并于4°C 或37°C再溫育45分鐘。最后，將樣品與山羊抗小鼠-PE綴合物一起于4°C再溫育30分鐘。 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(PARTEC PAS III)來(lái)分析樣品。使用維持于4°C的細(xì)胞的綠色和紅色的強(qiáng) 度作為粘附對(duì)照。將在發(fā)綠色熒光的細(xì)胞中紅色熒光的差異用于驗(yàn)證由各種不同血清介導(dǎo) 的吞噬活性。在圖2中顯示了，所檢驗(yàn)的經(jīng)改造的變體顯示出調(diào)理吞噬的活性。令大驚訝地， 僅在用經(jīng)改造的Prn進(jìn)行免疫接種的組和用PBS接種的小鼠的細(xì)之間具有顯著差異(P < 0. 05,Kruskal Wallis-Dunns)。用未改造的重組百日咳桿菌粘附素(單獨(dú)地或以其混合 物)產(chǎn)生的血清的調(diào)理吞噬的活性達(dá)到對(duì)照PBS的6倍的值，盡管這些差別并不顯著。最 后，這些結(jié)果證明了，所述經(jīng)改造的變體能夠誘導(dǎo)具有顯著的調(diào)理吞噬的活性的抗體，而與 細(xì)菌所攜帶的百日咳桿菌粘附素的類型無(wú)關(guān)。實(shí)施例4.用于在哺乳動(dòng)物中表達(dá)經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素變體的載體的構(gòu) 建，以及體液應(yīng)答的評(píng)估
使用先前報(bào)道的寡核苷酸 1 ^P 2 [Hijnen, M.，P. G. van Gageldonk 等人，(2005). Protein Expr Purif 41(1) 106-12]，通過(guò)PCR從各自的表達(dá)載體(見(jiàn)表3)中擴(kuò)增出基因 prnAl、prnA2，以及基因變體Prn2CCPrnl和Prn2CLPrnl，在此在寡核苷酸1中具有修飾，其 中用BamH I位點(diǎn)替代了寡核苷酸1的Nde I位點(diǎn)。使用該BamH I位點(diǎn)，將所獲得的片段 克隆到載體 PAEC-SPE3 中[Herrera AM, Rodriguez EG 等人，(2000) BBRC，279，548-551]。 該載體計(jì)劃用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行抗原的細(xì)胞外表達(dá)。使用用于純化質(zhì)粒的商業(yè)試劑 盒(Qiagen )來(lái)純化所述載體。以三周的間隔，通過(guò)肌內(nèi)途徑，以l y g/y L的濃度(在PBS 中)用IOOyg DNA對(duì)雌性Balb/c小鼠(6_7周齡)的組免疫接種三次。使用沒(méi)有插入片 段的質(zhì)粒(PAEC-SPE3)，以相同方式免疫接種對(duì)照組。在最后一次接種后15天處死小鼠， 并收集血液以用于血清的評(píng)估。使用1/1000的稀釋度并用等摩爾量的Prnl (2 μ g/mL)和 Prn2CCPrnl (2. 4 μ g/mL)蛋白進(jìn)行包被，通過(guò)ELISA技術(shù)來(lái)評(píng)估血清中存在的特異性IgG。 如在圖3中所觀察到的，相對(duì)于用pAEC-SPE3(沒(méi)有插入片段的載體)進(jìn)行免疫接種的動(dòng)物 而言，用表達(dá)Prnl、Prn2、Prn2CCPrnl和Prn2CLPrnl的各種不同質(zhì)粒進(jìn)行免疫接種的動(dòng)物 產(chǎn)生了特異性的且顯著更高的(P < 0. 001)免疫應(yīng)答(IgG)。與在用蛋白質(zhì)和氫氧化鋁進(jìn) 行免疫接種的小鼠中產(chǎn)生的血清(數(shù)據(jù)未顯示)相類似，在所述經(jīng)免疫接種的小鼠中產(chǎn)生 的血清以比天然Prnl蛋白更高的中值識(shí)別經(jīng)改造的變體Prn2CCPrnl (ρ < 0. 05)，這可能是 由于相比于Prnl而言在Prn2CCPrnl中所述共有的表位更好地暴露。
權(quán)利要求
編碼經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素蛋白的多核苷酸序列，其中所述經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素蛋白包含靠近給定類型的天然成熟百日咳桿菌粘附素的N-末端的直至前300個(gè)氨基酸(PrnX300)，以及含靠近給定類型的天然成熟百日咳桿菌粘附素的C-末端的直至最后620個(gè)氨基酸的氨基酸序列(PrnY620)，這導(dǎo)致得到經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素PrnX300-PrnY620。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸序列，其中PrnX300相應(yīng)于博德特氏菌屬(Bordetella) 的百日咳桿菌粘附素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的多核苷酸序列，其中PrnX300相應(yīng)于百日咳博德特氏菌 (B. pertussis)或副百日咳博德特氏菌(B. parapertussis)的百日咳桿菌粘附素。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的多核苷酸序列，其中PrnX300相應(yīng)于百日咳博德特氏菌的Prnl、 Prn2 禾口 Prn3 變體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸序列，其中PrnY620相應(yīng)于博德特氏菌屬的百日咳桿菌 粘附素。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的多核苷酸序列，其中PrnY620相應(yīng)于百日咳博德特氏菌或副百日 咳博德特氏菌的百日咳桿菌粘附素。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的多核苷酸序列，其中PrnY620相應(yīng)于百日咳博德特氏菌的Prnl、 Prn2 禾口 Prn3 變體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸序列，其編碼多肽鏈，所述多肽鏈包含以 PrnX300-PrnY620形式的給定類型的百日咳桿菌粘附素的任何可能的組合。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸序列，其中氨基酸序列PrnX300和PrnY620毗鄰地或者 通過(guò)使用序列 IDNATWVMTDN 或 IDNATWVMTDNIDNATWVMTDN 相連接。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9的多核苷酸序列，其中氨基酸序列PrnX300和PrnY620沒(méi)有重復(fù) 序列，優(yōu)選地沒(méi)有R1和R2區(qū)域的GGXXP和PQP序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10的多核苷酸序列，其中氨基酸序列PrnX300和PrnY620還包含 作為輔助T表位起作用的肽，所述輔助T表位優(yōu)選地為白喉、破傷風(fēng)、HBV、脊髓灰質(zhì)炎病毒、 牛痘、HIV或流感病毒的表位。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸序列，其包含標(biāo)示為SEQID NO :1至SEQ IDN0 6的核 苷酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列在密碼子使用方面進(jìn)行 了優(yōu)化，以用于在細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。
14.藥物組合物，其包含一種或多種由根據(jù)權(quán)利要求1-13的多核苷酸序列編碼的經(jīng)改 造的百日咳桿菌粘附素，所述經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素的量足以通過(guò)在哺乳動(dòng)物，優(yōu)選 人中的免疫接種程序而產(chǎn)生針對(duì)博德特氏菌屬物種的有效的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的藥物組合物，其產(chǎn)生針對(duì)百日咳博德特氏菌的有效的體液和細(xì) 胞免疫應(yīng)答。
16.包含一種或多種由根據(jù)權(quán)利要求1-13的多核苷酸序列編碼的經(jīng)改造的百日咳桿 菌粘附素的活疫苗或減毒疫苗，其中所述經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素優(yōu)選地表達(dá)在外膜 中。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的活疫苗或減毒疫苗，其中根據(jù)權(quán)利要求1-13的多核苷酸序列被包含在質(zhì)粒載體或細(xì)菌染色體中。
18.包含一種或多種根據(jù)權(quán)利要求1-13的多核苷酸序列的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，所述多 核苷酸序列編碼經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素。
19.包含根據(jù)權(quán)利要求18的表達(dá)載體的核酸疫苗。
20.用于檢測(cè)博德特氏菌感染的方法，其包括使用由根據(jù)權(quán)利要求1-13的多核苷酸序 列編碼的多肽序列。
21.用于檢測(cè)針對(duì)博德特氏菌的抗體存在與否的診斷試劑盒，其包含由根據(jù)權(quán)利要求 1-13的多核苷酸序列編碼的多肽序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并且包括改造百日咳桿菌粘附素(Pertactin，Prn)蛋白以獲得其，并將其用在菌苗中，更特別地，用在針對(duì)百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的無(wú)細(xì)胞疫苗中。所述經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素在其結(jié)構(gòu)中包含不同菌株的多態(tài)性，并且當(dāng)作為疫苗進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)，其誘導(dǎo)具有更大的保護(hù)能力和更高的調(diào)理吞噬的活性的抗體應(yīng)答。本發(fā)明的經(jīng)改造的百日咳桿菌粘附素變體可應(yīng)用于人類醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)。
文檔編號(hào)C07K14/235GK101878038SQ200880114119
公開(kāi)日2010年11月3日 申請(qǐng)日期2008年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月30日
發(fā)明者A·奧瓦雷斯阿科斯塔, D·昆塔納瓦茲蓋斯, G·E·吉倫涅托, T·梅南德斯麥迪納, Y·克魯茲里埃爾 申請(qǐng)人:遺傳工程與生物技術(shù)中心