專利名稱：一種防治哮喘的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防治哮喘的新方法，具體公開了百日咳疫苗可以防治哮喘 的口服免疫耐受途徑。
背景技術(shù)：
哮喘是常見的呼吸系統(tǒng)變應性疾病，嚴重危害人們的健康。3受體激動藥和 糖皮質(zhì)激素是目前治療哮喘的一線藥物，主要用于哮喘癥狀和持續(xù)狀態(tài)的控制 治療或危重發(fā)作的搶救。但由于不良反應或耐藥性等問題，在應用過程中有諸 多的局限性。
口服耐受，是黏膜耐受的一種。指口服某種食用蛋白或細菌抗原，導致局 部腸相關(guān)淋巴組織的特異免疫，從而抑制全身免疫應答，是一種特異性的自身 耐受反應。百日咳疫苗是用于預防百日咳的傳統(tǒng)藥物。全細胞百日咳疫苗又被
證實可選擇性的引起人和動物的Thl反應，腹腔給予全細胞百日咳疫苗可顯著 減輕小鼠哮喘模型的氣道重塑及細胞因子分泌等，維持Thl/Th2的平衡，減輕 哮喘癥狀。
與傳統(tǒng)的注射法相比，口服耐受具以下優(yōu)點O)采用口服給予而避免皮下 注射引起的疼痛，且減輕注射局部的炎癥反應，便于重復使用；②存在共同的 黏膜免疫系統(tǒng)(common mucosal immunity system, CMIS)，即一個黏膜部位的免 疫系統(tǒng)反應可以誘發(fā)遠隔部位黏膜出現(xiàn)免疫反應；Q)黏膜免疫不僅能有效的誘 發(fā)遠隔部位的黏膜免疫，同時還能誘發(fā)該部位的系統(tǒng)免疫應答；④通過口服給 予變應原，引起特殊形式的免疫耐受，且使變應原有較長的保留時間，便于更 好、持久的發(fā)揮作用，以達到有效的防治作用。在此基礎(chǔ)上，以百日咳疫苗作 為變應原，通過口服給予，產(chǎn)生免疫耐受迸行防治哮喘的研究。
現(xiàn)有百日咳疫苗傳統(tǒng)用途是預防百日咳，用法是肌肉注射給藥， 一般可以 達到80% 90%的有效率，目前尚未有通過口服方式給藥的。盡管口服疫苗有以上諸多好處，但并非所有的疫苗都適合于口服給藥，很 多疫苗在口服時都存在諸多問題，如在腸道有限的吸收率、無法在黏膜表面存 活，口服后消化道對疫苗的滅活導致的抗原性降低等。雖然這些問題都亟須解 決，口服黏膜免疫仍然是未來疫苗發(fā)展的一個重要方向，這項研究具有極大潛 力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種防治哮喘的新方法，該方法首創(chuàng)性的采用口服百 日咳疫苗的方式，用于哮喘的防治和氣道重塑的改善。
一種防治哮喘的方法，是將低劑量百日咳疫苗通過口服給藥。
上述所說的低劑量以每只小鼠計為2X 104-2X 106 cfu。優(yōu)選2X 105cfu。 本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)得知人用劑量，如按照標準體重小鼠(20g)
給予2Xl()Scfu，換算成標準體重的人(70kg)的劑量為2.22X10"cfU/人。
該方法不僅首次將百日咳疫苗應用于哮喘防治；同時根據(jù)"口服耐受"的
理論，采用口服給藥的方式，也會使給藥更便利，療效更持久。打破了以"抗
炎、舒張氣道平滑肌"為靶點對哮喘的傳統(tǒng)治療方法，建立了 "哮喘預防為主"
的新途徑，從而為控制發(fā)作及預防哮喘開辟新途徑。
具體實施例方式
在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明， 一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員 通常理解的含義。
下面結(jié)合具體的實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細地描述本發(fā)明。應理解，這 些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。 在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。 所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標明， 其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標明的內(nèi)容相同。 實施例
41. 制備百日咳桿菌疫苗
本試驗用百日咳菌種購自中國藥品生物制品檢定所(菌株號58004)， 37'C培 養(yǎng)。收集對數(shù)生長期的百日咳菌，適當溫度下滅活，制得一定濃度的全細胞百 日咳桿菌疫苗。
2. 急性毒性試驗
取Balb/c小鼠60只，雌雄各半，灌服不同劑量滅活的全細胞疫苗，進行急性毒 性的檢測。前期試驗結(jié)果，小鼠給予107-1012個/只數(shù)量的全細胞細菌后，均未 出現(xiàn)行為活動異常和死亡。表明小鼠單次給予1012個/只及以下數(shù)量的百日咳細 菌疫苗不會引起小鼠死亡，是安全的。
3. 哮喘模型的建立
取Balb/c雌性小鼠，采用卵白蛋白(OVA)致敏法，分別于試驗的第0和14天 致敏小鼠。第16-18天則每天霧化吸入5XOVA，激發(fā)20min，建立炎癥模型； 連續(xù)激發(fā)8周，建立哮喘以及哮喘氣道重塑模型。對照組小鼠則以生理鹽水代 替OVA。
4. 口服給藥目前，傳統(tǒng)的百日咳苗注射給藥劑量為2X109 5X109cfU，為了 初步探明百日咳疫苗防治哮喘的有效口服劑量，我們設定了 2Xl()Scfu/只、2X 106cfuAR、 2X10Vfu/只的高、中、低三個劑量組。按照以上方法建立小鼠哮 喘模型，按照上述三個劑量給藥后，檢測支氣管肺泡灌洗液中的細胞總數(shù)和嗜 酸細胞數(shù)。得到結(jié)果分別為高劑量組(9.07±0.46, 1.04± 0.08) X 105/ml、中劑 量組(8.28±0.56，0.76±0.09) X10Vml和低劑量組(8.35±0.96, 0.77±0.07) X 105/ml。結(jié)果顯示，中、低劑量的效果要優(yōu)于高劑量；因此我們選擇2Xl()Scfu/ 只作為我們試驗的口服劑量。
于初次致敏前7天，給小鼠口服低劑量(2X105cfuAR)百日咳桿菌疫苗，連
5續(xù)5天。每次給藥前用碳酸氫鈉灌胃以保存菌體完整進入腸腔，以便較好的激 發(fā)粘膜免疫耐受反應。
5. 口服百日咳疫苗對氣道炎癥的影響
于末次激發(fā)24h內(nèi)，收集并測定血清和支氣管肺泡灌洗液(BALF)。計算BALF 中的白細胞總數(shù)和嗜酸細胞數(shù)，酶聯(lián)免疫吸附法測定血清中Thl、 Th2型細胞的 細胞因子含量。經(jīng)檢測，口服百日咳疫苗的治療組小鼠的白細胞總數(shù)和嗜酸細 胞數(shù)(5.50±1.55,0.66±0.82) X 105/ml，盡管高于空白對照組(2.03±0.42， 0.33 ±0.82) X105/ml，但明顯低于模型組小鼠的白細胞總數(shù)和嗜酸細胞數(shù)(10.13± 1.33,7.33±2.34)X105/ml，具有顯著性差異；同時口服百日咳疫苗對外周血中的 IL-4含量也有一定的降低作用。
6. 口服百日咳疫苗對氣道結(jié)構(gòu)的影響
分離氣道重塑模型小鼠的肺和支氣管，固定于福爾馬林溶液，石蠟包埋后制成 切片。取石蠟切片，HE染色，觀察氣管、肺間質(zhì)細胞的組織病理學改變。評估 氣道炎癥和重構(gòu)的程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單位氣道面積內(nèi)，空白對照組、模型組及百 日咳治療組中，模型組炎癥細胞計數(shù)最高，空白對照組最低，給藥治療組顯著 低于模型組，但仍高于空白對照組。同時與空白對照組相比，模型組小鼠出現(xiàn) 了氣道壁增厚，平滑肌層增厚和肺泡萎縮等氣道重塑的病理特點，而在給藥治 療組小鼠中，這些病理學的改變都得到了一定程度的改善。
權(quán)利要求
1、一種防治哮喘的方法，其特征在于，是將低劑量百日咳疫苗通過口服給藥。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所說的防治哮喘的方法，其特征在于，所說的低劑量以每只小鼠計為2X 104-2X 106 cfu。
3、 根據(jù)權(quán)利要求3所說的防治哮喘的方法，其特征在于，所說的給藥劑量為2X105 cfu。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種防治哮喘的新方法，具體是百日咳疫苗通過口服免疫耐受途徑防治哮喘。本發(fā)明經(jīng)實驗表明，口服低劑量的百日咳疫苗能達到防治哮喘的目的。該方法不僅首次將百日咳疫苗應用于哮喘防治；同時根據(jù)“口服耐受”的理論，采用口服給藥的方式，也會使給藥更便利，療效更持久。打破了以“抗炎、舒張氣道平滑肌”為靶點對哮喘的傳統(tǒng)治療方法，建立了“哮喘預防為主”的新途徑，從而為控制發(fā)作及預防哮喘開辟新途徑。
文檔編號A61K39/10GK101485883SQ20081024289
公開日2009年7月22日 申請日期2008年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日
發(fā)明者云 孫, 張寶袁, 王德俊, 深 遲 申請人:揚州大學