專(zhuān)利名稱(chēng)：一種無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疫苗生產(chǎn)菌株研發(fā)領(lǐng)域，具體涉及一種無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
百日咳是由百日咳桿菌引起的急性呼吸道傳染病。其臨床特征為陣發(fā)性痙攣性咳嗽伴有深長(zhǎng)的“雞鳴”樣吸氣性吼聲。百日咳桿菌，Bordetella pertussis，其主要侵犯的對(duì)象是孩童，有一半的個(gè)案是一歲以下的嬰兒。百日咳桿菌的致病因子主要是百日咳毒素，pertussis toxin, PT,是由五個(gè)不同亞基sl-s5 (編碼基因?yàn)閜txA, ptxB, ptxD, ptxE, ptxC組成的蛋白復(fù)合物,其毒性來(lái)自于si 亞基的ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶的活性。已采用的無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗中，除PT外，還包含其他抗原分子如絲狀血凝素，filamentous hemagglutinin, FHA,和百日咳粘著素，pertactin, Prn,而現(xiàn)有的無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗生產(chǎn)工藝中，采用野生型百日咳桿菌菌株對(duì)抗原組分FHA，Pt，Prn進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，F(xiàn)HA的純化過(guò)程中Pt的含量高于規(guī)定的指標(biāo)，往往使用一系列的化學(xué)試劑如甲醛對(duì)抗原FHA進(jìn)行Pt脫毒處理。然而,這樣的脫毒方法有如下的不利因素I.毒性逆轉(zhuǎn)；2.在脫毒處理過(guò)程中的劇烈條件下降低FHA的免疫原性和得率；3.大量實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)每一批制劑中Pt毒性回復(fù)的程度，非常耗時(shí)；4.脫毒處理過(guò)程接觸到有毒試劑，對(duì)于實(shí)驗(yàn)人員存在危險(xiǎn)。此外，采用野生型百日咳桿菌菌株對(duì)抗原組分Prn進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，其表達(dá)水平過(guò)低。因此，現(xiàn)有技術(shù)的針對(duì)無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗中組分FHA，Pt，Prn采用野生型百日咳桿菌菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，無(wú)法做到使得每一個(gè)抗原的表達(dá)量在已掌握的技術(shù)能力下達(dá)到最優(yōu)水平，會(huì)造成發(fā)酵工藝優(yōu)化的瓶頸；此外，F(xiàn)HA，Pt和Prn同時(shí)在同一野生型百日咳桿菌菌株菌種中表達(dá)在純化過(guò)程中會(huì)造成相互干擾，這些不利因素?zé)o疑增加了生產(chǎn)的人力，物力以及生產(chǎn)時(shí)間上的延長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種分別使用單獨(dú)的百日咳桿菌基因工程改造菌株無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是包括如下步驟(I)將pt基因敲除的Fha百日咳桿菌基因工程菌株發(fā)酵純化得到抗原組分fha ；(2)將fha基因敲除的Pt百日咳桿菌基因工程菌株發(fā)酵純化得到抗原組分Pt ；(3)將fha基因敲除的Prn百日咳桿菌基因工程菌株發(fā)酵純化得到抗原組分prn ；(4)將所述抗原組分fha、pt和prn配制成一種無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗。
所述pt基因敲除的Fha百日咳桿菌基因工程菌株是通過(guò)下述方法獲得的(I)通過(guò)同源重組用第一種抗生素抗性基因替換野生型百日咳桿菌基因組上的pertussis toxin編碼基因(NCBI Reference Sequence :NC002929. 23987858-3992567)，所述 pertussis toxin 用 Pt 表不；(2)選擇步驟(I)中得到的Pt基因敲除的Fha百日咳桿菌基因工程菌株。所述fha基因敲除的Pt百日咳桿菌基因工程菌株是用下述方法獲得的(I)通過(guò)同源重組用第一種抗生素抗性基因替換野生型百日咳桿菌基因組上的fha 編碼基因(NCBI Reference Sequence:NC002929. 21968781-1979553)；(2)選擇步驟(I)中得到的敲除fha編碼基因的百日咳桿菌菌株antIK A fha ；(3)將野生型百日咳桿菌基因組中的PT編碼基因(NCBI Reference Sequence:NC 002929. 23987858-3992567)進(jìn)行克隆并與第二種抗生素抗性基因連接成基因盒cassette pt-antll ；(4)通過(guò)同源重組用所述的基因盒cassette :pt_antll替換步驟(2)得到的百日咳桿菌菌株antIK A fha中基因組上的anti抗生素抗性基因；(5)選擇步驟(4)中得到的fha基因敲除的Pt百日咳桿菌基因工程菌株。所述fha基因敲除的Prn百日咳桿菌基因工程菌株是用下述方法獲得的(I)通過(guò)同源重組用第一種抗生素抗性基因替換野生型百日咳桿菌基因組上的fha編碼基因；(2)選擇步驟(I)中得到的敲除fha編碼基因的百日咳桿菌菌株antIk A fha ；(3)將野生型百日咳桿菌基因組中的PRN的編碼基因(NCBI Reference Sequence:NC_002929. 21098091-1100823)進(jìn)行克隆并與第二種抗生素抗性基因連接成基因盒cassette prn-antll ；(4)通過(guò)同源重組用所述的基因盒cassette prn-antll替換步驟(2)得到的antIE A fha百日咳桿菌菌株中基因組上的anti抗生素抗性基因；(5)選擇步驟(4)中得到的fha基因敲除的Prn百日咳桿菌基因工程菌株。所述fha、pt 和 prn 的質(zhì)量比為 2. 5-20:5-20:2-5。所述第一種抗生素抗性基因?yàn)榭敲顾乜剐曰?、四環(huán)素抗性基因、慶大霉素抗性基因或氯霉素抗性基因。所述第一種抗生素抗性基因和第二種抗生素抗性基因不同，各自選自卡那霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、氯霉素抗性基因。所述野生型百日咳桿菌為百日咳桿菌Tohoma I菌株(ATCC，BAA-589 )或Bordetella pertussis Cs百日咳桿菌Cs菌株(中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，菌株編號(hào)CMCC58003。anti表示為第一種抗生素抗性基因；antll表示為第二種抗生素抗性基因；卡那霉素抗性基因(pCfffi 2. IVector, Invitrogen)、四環(huán)素抗性基因(GenBank:AY532632. ICloning vector pLAFR)、氯霉素抗性基因(GenBank:AY952933. !Cloning vector pHTSUB-106)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的方法在百日咳桿菌內(nèi)進(jìn)行特定抗原基因的敲除或拷貝數(shù)的增加，或基因啟動(dòng)子的替換，從而構(gòu)建出用于特定抗原生產(chǎn)的百日咳桿菌基因工程菌株，一方面使用單獨(dú)的百日咳桿菌基因工程菌株，有利其單個(gè)目的抗原表達(dá)的發(fā)酵工藝優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)單個(gè)目的抗原的高效表達(dá)，在Prn和Pt百日咳桿菌基因工程菌株基因組DNA上的fha基因的敲除，Prn和Pt百日咳桿菌基因工程菌株生長(zhǎng)速度明顯加快，使得發(fā)酵周期從48 52h縮短為36 40h ;另一方面FHA百日咳桿菌工程菌株實(shí)現(xiàn)Pt基因敲除后，克服了現(xiàn)有技術(shù)存在的FHA生產(chǎn)過(guò)程中需要pt脫毒處理的工藝步驟，從而避免了 Pt脫毒工藝中的弊端，有利于保持抗原FHA的免疫原性和提高了 FHA的抗原得率，降低了生產(chǎn)時(shí)間和生產(chǎn)成本。本發(fā)明提供的prn的百日咳桿菌基因工程菌株，其prn基因在fha啟動(dòng)子的作用下，其表達(dá)水平提高了 5倍以上，提高了抗原組分Prn的得率，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝和降低了生產(chǎn)成本。



圖I為不同百日咳菌株的生長(zhǎng)曲線。圖2為來(lái)自野生型百日咳菌株制備的Fha樣品的SDS-PAGE圖譜。圖3為來(lái)自野生型百日咳菌株制備的Fha樣品的層析圖譜。圖4為來(lái)自Pt基因敲除的Fha百日咳桿菌基因工程菌株制備的Fha樣品的SDS-PAGE 圖譜。圖5為來(lái)自pt基因敲除的Fha百日咳桿菌基因工程菌株制備的Fha樣品的層析圖譜。圖6來(lái)自fha基因敲除的Pt百日咳桿菌基因工程菌株和來(lái)自fha基因敲除的Prn百日咳桿菌基因工程菌株制備的Pt和Prn的SDS-PAGE圖譜。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及的野生型百日咳菌株來(lái)源Bordetella pertussis Tohoma I百日咳桿菌 Tohoma I 菌株(ATCC, BAA-589 ) > Bordetella pertussis Cs 百日咳桿菌 Cs 菌株(中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，菌株編號(hào)CMCC58003。文獻(xiàn)微生物學(xué)報(bào)5 (4) 4111957)下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。下面的說(shuō)明是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但不對(duì)本發(fā)明作任何限制。 實(shí)施例中的方法若無(wú)特殊說(shuō)明均為常規(guī)方法。實(shí)施例Ipt基因敲除的Fha百日咳桿菌基因工程菌株是通過(guò)下述方法獲得的(I) pBS-ptx_up-KANA-ptx_down (SEQ ID. No. I)線性 DNA 的獲得利用質(zhì)粒pBSptx_up_KANAptx_down上的單酶切位點(diǎn)ScaI酶切后得到線性DNA進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。(2)電轉(zhuǎn)化和同源重組2ug以上的線性DNA在1500V/lmm的電壓強(qiáng)度下電轉(zhuǎn)200ul百日咳桿菌CS菌株感受態(tài)細(xì)胞(制備方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)I)涂布于含有25ug/ml卡那霉素的抗性平板上進(jìn)行抗性篩選，含有25ug/ml卡那霉素的培養(yǎng)平板上生長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行篩選Pt基因敲除的Fha百日咳桿菌基因工程菌株?？敲顾乜剐曰蛞部梢蕴鎿Q為四環(huán)素抗性基因或氯霉素抗性基因。實(shí)施例2fha基因敲除的Pt百日咳桿菌基因工程菌株是用下述方法獲得的(I) pBS-fha_up-TET-ptx_down(SEQ ID. No. 2)質(zhì)粒線性 DNA 的獲得利用質(zhì)粒pBS-fha_up-TET_ptx_down上的單酶切位點(diǎn)ScaI酶切后得到線性DNA進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。(2)電轉(zhuǎn)化和同源重組2ug以上的線性DNA在1500V/lmm的電壓強(qiáng)度下電轉(zhuǎn)200ul百日咳桿菌CS菌株感受態(tài)細(xì)胞(制備方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)I)涂布于含有l(wèi)Oug/ml四環(huán)素的抗性平板上進(jìn)行抗性篩 選，含有l(wèi)Oug/ml四環(huán)素的培養(yǎng)平板上生長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行篩選fha基因敲除四環(huán)素抗性的TetK&AFHA。百日咳桿菌菌株。四環(huán)素抗性基因也可以替換為卡那霉素抗性基因或氯霉素抗性基因。(3) pBS-fha_up-Pt-KANA-ptx_down(SEQ ID. No. 3)線性 DNA 的獲得利用質(zhì)粒pBS-ptx_up-KANA_ptx_down上的酶切位點(diǎn)DraI酶切后得到線性DNA進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。(4)電轉(zhuǎn)化和同源重組2ug以上的線性DNA在1500V/lmm的電壓強(qiáng)度下電轉(zhuǎn)200ul TetK A FHA百日咳桿菌感受態(tài)細(xì)胞(制備方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)I)涂布于含有25ug/ml卡那霉素的抗性平板上進(jìn)行抗性篩選，含有25ug/ml卡那霉素的培養(yǎng)平板上生長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行篩選fha基因敲除的Pt百日咳桿菌基因工程菌株?？敲顾乜剐曰蛞部梢蕴鎿Q為四環(huán)素抗性基因或氯霉素抗性基因。實(shí)施例3fha基因敲除的Prn百日咳桿菌基因工程菌株是用下述方法獲得的(I) pBS-fha_up-TET-ptx_down(SEQ ID. No. 2)質(zhì)粒線性 DNA 的獲得利用質(zhì)粒pBS-fha_up-TET_ptx_down上的單酶切位點(diǎn)ScaI酶切后得到線性DNA進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。(2)電轉(zhuǎn)化和同源重組2ug以上的線性DNA在1500V/lmm的電壓強(qiáng)度下電轉(zhuǎn)200ul百日咳桿菌CS菌株感受態(tài)細(xì)胞(制備方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)I)涂布于含有l(wèi)Oug/ml四環(huán)素的抗性平板上進(jìn)行抗性篩選，含有l(wèi)Oug/ml四環(huán)素的培養(yǎng)平板上生長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行篩選fha基因敲除四環(huán)素抗性的TetK&AFHA。百日咳桿菌菌株。四環(huán)素抗性基因也可以替換為卡那霉素抗性基因或氯霉素抗性基因。(3) pBS-fha_up-Prn-KANA-ptx_down (SEQ ID. No. 4)線性 DNA 的獲得利用質(zhì)粒pBS-fha_up-Prn_KANA-ptx_down上的酶切位點(diǎn)DraI酶切后得到線性DNA進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。(4)電轉(zhuǎn)化和同源重組2ug以上的線性DNA在1500V/lmm的電壓強(qiáng)度下電轉(zhuǎn)200ul TetK A FHA百日咳桿菌感受態(tài)細(xì)胞(制備方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)I)涂布于含有25ug/ml卡那霉素的抗性平板上進(jìn)行抗性篩選，含有25ug/ml卡那霉素的培養(yǎng)平板上生長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行篩選fha基因敲除的Prn百日咳桿菌基因工程菌株?？敲顾乜剐曰蛞部梢蕴鎿Q為四環(huán)素抗性基因或氯霉素抗性基因。實(shí)施例4、pt基因敲除的Fha百日咳桿菌基因工程菌株、fha基因敲除的Prn百日咳桿菌基因工程菌株、fha基因敲除的Pt百日咳桿菌基因工程菌株與野生型百日咳菌株發(fā)酵及生長(zhǎng)曲線比較取上述三種工程菌和一種野生型百日咳菌株按下述方法分別發(fā)酵初級(jí)培養(yǎng)取一管凍存的菌種，取出200ul加入到百日咳培養(yǎng)基平皿中，均勻涂布，36±2° C，250rpm搖床中培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)后，OD長(zhǎng)到I. 5-2. 0，接種到發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)。二級(jí)培養(yǎng)在2L發(fā)酵罐(含有IL百日咳桿菌培養(yǎng)基)，為1:100接種IOOmL時(shí) OD為I. 5-2. 0的菌液，培養(yǎng)溫度為36±2° C，pH通過(guò)自動(dòng)加入I. 25M磷酸水溶液維持在
7.2±0. I，溶解氧控制在30%，偶聯(lián)攪拌速度200-600rpm，空氣流量為500_100L/h，通過(guò)加入道康寧1520消泡劑維持泡位。培養(yǎng)24小時(shí)后，待OD長(zhǎng)至3. 5-4. 0，開(kāi)始以，4ml/h的速度流加補(bǔ)料，再培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)，待OD不在長(zhǎng)高時(shí)，收獲培養(yǎng)物。圖I中的各百日咳菌株的生長(zhǎng)曲線比較可以看，相對(duì)于野生型百日咳菌株，fha基因敲除的Prn生產(chǎn)菌株和Pt生產(chǎn)菌株其生長(zhǎng)速度明顯加快，縮短了 Prn和Pt生產(chǎn)的發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)和有利于發(fā)酵條件的控制，同時(shí)也增加了 Prn和Pt的總的蛋白產(chǎn)量。實(shí)施例5、FHA的制備和純化野生型百日咳桿菌菌株培養(yǎng)物上清和PT基因敲除的Fha百日咳桿菌基因工程菌株培養(yǎng)物上清分別采用下述方法進(jìn)行fha的分離純化。IL培養(yǎng)物上清加入250g硫酸銨沉淀，I IOOOg離心30min棄上清，沉淀加入50ml (50mMPB, IM NaCl, pH=8. 0)水溶液復(fù)溶，復(fù)溶后的樣品利用孔徑50kd超濾膜包超濾換液至含有50ml 50mM PB，2M尿素，pH=8. 0的水溶液中；后者調(diào)pH至6. 0過(guò)CM SFF層析柱，CM柱采用含50mM PB, 2M尿素，pH=6. 0溶液平衡上樣，用含有50mM PB, 2M尿素，pH=7. 4水溶液預(yù)洗雜蛋白，用含有50mM PB,300mM NaC12M尿素，pH=7. 4的水溶液洗脫目的蛋白，洗脫的目的產(chǎn)物透析至PBS溶液中，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。圖2和圖3表明，層析圖譜和SDS-PAGE顯示純化后的洗脫的野生型百日咳菌株制備的Fha樣品中明顯的Pt的存在；(圖2中I. CP-2L-100 (WT) 25%沉淀復(fù)溶液2. Cp CM上柱樣 3.流穿 4. Elute PT5. Elute FHA6. 30-200Protein Marker)圖4和圖5中(泳道9)，可以發(fā)現(xiàn)層析圖譜和SDS-PAGE圖譜表明pt基因敲除的Fha百日咳桿菌基因工程菌株明顯沒(méi)有Pt的存在，說(shuō)明pt基因敲除的Fha百日咳桿菌基因工程菌株制備的Fha消除了后續(xù)的Pt脫毒處理過(guò)程，同時(shí)也在一定程度上保持了 Fha的得率和免疫原性。(圖4中1. I. 30-200Marker2.超濾前復(fù)溶液3.上柱樣4.流穿(前部分)5.流穿(后邊部分)6. elute FHA8. 16-94maker9. elute (野生型純化時(shí)該位置峰為PT，但敲除PT的菌株此位置為雜蛋白)10. PT純化標(biāo)準(zhǔn)品。)實(shí)施例6、Pt的制備和純化Pt來(lái)自于fha基因敲除的Pt百日咳桿菌基因工程菌株培養(yǎng)物分泌上清。IL培養(yǎng)物上清用300g硫酸銨沉淀后，I IOOOg離心30min棄上清，沉淀加入50ml (50mMPB, IM NaCl，pH=8. 0)水溶液復(fù)溶，復(fù)溶后的樣品利用孔徑30kd超濾膜包超濾換液至含有50ml 30mM PB, 2M尿素，pH8. 0的水溶液中；后者過(guò)CM SFF層析柱。CM層析柱采用含有30mM PB，2M尿素，pH6. 0的水溶液平衡上樣，用含有30mM PB，2M尿素，70mM NaCl,PH7. 4的水溶液洗脫目的蛋白；將洗脫峰樣品用2M尿素稀釋三倍調(diào)pH至7. 4過(guò)羥基磷灰石層析(CHT)柱，CHT層析柱采用含IOmM磷酸鉀緩沖液，IOmM NaCl，2M尿素，pH7. 4的緩沖液平衡上樣，30mM磷酸鉀緩沖液，pH7.4溶液預(yù)洗雜蛋白，含有75mM磷酸鉀緩沖液，225mMNaCl,pH7. 4的溶液洗脫目的蛋白；透析至PBS溶液中，然后SDS-PAGE檢測(cè)、Lowry法進(jìn)行蛋白定量。 圖6中可以看出，來(lái)自fha基因敲除的Pt百日咳桿菌基因工程菌株制備的Pt樣品中，沒(méi)有了 Fha蛋白的存在和干擾，同時(shí)Pt的蛋白含量同時(shí)增加了，為后續(xù)的產(chǎn)品制劑的工藝的開(kāi)展和最后成品疫苗的制備節(jié)省了成本(圖6中1. 16-94kd Marker2. 139 (PT A FHA)3. 140 (PT A FHA)4. 141 (PT A FHA)5. 143 (PT A FHA)6. 144 (PT A FHA)7. 145 (PT A FHA)
8.PT 標(biāo)準(zhǔn)品 9. Prn (Pfha-prn A fha) 10FHA (FHA A PT)注A表示敲除 11. Marker 實(shí)施例7、Prn的制備和純化Prn來(lái)自于fha基因敲除的Prn百日咳桿菌基因工程菌株培養(yǎng)物分泌上清。IL培養(yǎng)物上清經(jīng)350g硫酸銨沉淀，11000g，30min離心后，沉淀用50ml 50mMTris-HCl, pH=8. 0復(fù)溶后，再加入12. 5g硫酸銨沉淀，IlOOOg, 30min離心后的沉淀經(jīng)50ml50mMTris-HCl, IM NaCl，pH=8. 0 溶液復(fù)溶，30kd超濾膜包超濾換液至 50ml 50mM Tris-HCl,pH=8. 5 中，過(guò) Fractogel EMD TMAE 層析柱，TMAE 層析柱采用 50mM Tris-HCl, pH=8. 5 溶液平衡上樣，50mM Tris-HCl, 120mM NaCl，pH=8. 5溶液洗脫目的蛋白；洗脫峰中蛋白樣品用30kd超濾膜包超濾至5mM PB, pH=8. 0中，過(guò)輕基磷灰石層析柱,輕基磷灰石層析柱采用5mMPB，pH=8. 0平衡上樣，取流穿下來(lái)的蛋白透析換液至PBS中，SDS-PAGE檢測(cè)、Lowry法進(jìn)行蛋白定量。圖6中可以看出，來(lái)自fha基因敲除的Prn百日咳桿菌基因工程菌株制備的Prn樣品中，沒(méi)有了 Fha蛋白的存在和干擾，同時(shí)PRN的蛋白含量同時(shí)也增加了。實(shí)施例8、無(wú)細(xì)胞三組分百日咳疫苗配制將發(fā)酵及純化所制備的抗原組分按照表I各種組分進(jìn)行疫苗配置，可以制備出適于嬰幼兒及成人所使用的疫苗。表I無(wú)細(xì)胞三組分百日咳疫苗配制
組分介. (Ug)FM (實(shí)施例5 FIX實(shí)施例6制I (實(shí)施例7
__制備純化) 備純化)_備純化)
HdZi I__20_ 20I 3
KJj 2 S 103
gdi/3__2^5_ 5[ 2上述配制的疫苗還可以加入其他抗原成分，例如白喉類(lèi)毒素，破傷風(fēng)類(lèi)毒素已經(jīng)b型嗜血流感結(jié)合疫苗，用于嬰幼兒或者成人的免疫接種。參考文獻(xiàn)
I. Zealey GR, Loosmore SM，Yacoob RK, Cockle SA, Boux LJ, Miller LD, KleinMH. Gene replacement in Bordetella pertussis by transformation with linear DNA.Biotechnology(N Y). 1990Nov :8(11) :1025_9。 ·
權(quán)利要求
1.一種無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是包括如下步驟 (1)將Pt基因敲除的Fha百日咳桿菌基因工程菌株發(fā)酵純化得到抗原組分fha； (2)將fha基因敲除的Pt百日咳桿菌基因工程菌株發(fā)酵純化得到抗原組分Pt； (3)將fha基因敲除的Prn百日咳桿菌基因工程菌株發(fā)酵純化得到抗原組分prn； (4)將所述抗原組分fha、pt和prn配制成一種無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是所述Pt基因敲除的Fha百日咳桿菌基因工程菌株是通過(guò)下述方法獲得的 (1)通過(guò)同源重組用第一種抗生素抗性基因替換野生型百日咳桿菌基因組上的pertussis toxin 編石馬基因，所述 pertussis toxin 用 Pt 表不； (2)選擇步驟(I)中得到的Pt基因敲除的Fha百日咳桿菌基因工程菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是所述fha基因敲除的Pt百日咳桿菌基因工程菌株是用下述方法獲得的 (1)通過(guò)同源重組用第一種抗生素抗性基因替換野生型百日咳桿菌基因組上的fha編碼基因； (2)選擇步驟(I)中得到的敲除fha編碼基因的百日咳桿菌菌株antIKA fha ； (3)將野生型百日咳桿菌基因組中的PT編碼基因進(jìn)行克隆并與第二種抗生素抗性基因連接成基因盒cassette :pt_antll ； (4)通過(guò)同源重組用所述的基因盒cassette:pt_antll替換步驟(2)得到的百日咳桿菌菌株antIk A fha中基因組上的anti抗生素抗性基因； (5)選擇步驟(4)中得到的fha基因敲除的Pt百日咳桿菌基因工程菌株。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是所述fha基因敲除的Prn百日咳桿菌基因工程菌株是用下述方法獲得的 (1)通過(guò)同源重組用第一種抗生素抗性基因替換野生型百日咳桿菌基因組上的fha編碼基因； (2)選擇步驟(I)中得到的敲除fha編碼基因的百日咳桿菌菌株antIKA fha ； (3)將野生型百日咳桿菌基因組中的PRN的編碼基因進(jìn)行克隆并與第二種抗生素抗性基因連接成基因盒cassette :prn_antll ； (4)通過(guò)同源重組用所述的基因盒cassette:prn_antll替換步驟(2)得到的antIE A fha百日咳桿菌菌株中基因組上的anti抗生素抗性基因； (5)選擇步驟(4)中得到的fha基因敲除的Prn百日咳桿菌基因工程菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是所述fha、pt和prn 的質(zhì)量比為 2. 5-20:5-20:2-5。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是所述第一種抗生素抗性基因?yàn)榭敲顾乜剐曰颉⑺沫h(huán)素抗性基因、慶大霉素抗性基因或氯霉素抗性基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的一種無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是所述第一種抗生素抗性基因和第二種抗生素抗性基因不同，各自選自卡那霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、氯霉素抗性基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求2、3或4所述的一種無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是所述野生 型百日咳桿菌為ATCC, BAA-589 或CMCC58003。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗的生產(chǎn)方法，包括如下步驟將pt基因敲除的Fha百日咳桿菌基因工程菌株發(fā)酵純化得到抗原組分fha；將fha基因敲除的Pt百日咳桿菌基因工程菌株發(fā)酵純化得到抗原組分pt；將fha基因敲除的Prn百日咳桿菌基因工程菌株發(fā)酵純化得到抗原組分prn；將所述抗原組分fha、pt和prn配制成一種無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗。本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)單個(gè)目的抗原的高效表達(dá)，使百日咳桿菌基因工程菌株生長(zhǎng)速度明顯加快；降低了生產(chǎn)時(shí)間和生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102793915SQ20121025991
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月25日
發(fā)明者朱濤, 段磊, 宇學(xué)鋒, 邵忠琦, 毛慧華, 邱東旭 申請(qǐng)人:天津康希諾生物技術(shù)有限公司