專利名稱：輔助亞基KChIP4與Kv4鉀通道相互作用的結(jié)構(gòu)和功能位點的應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及輔助亞基KChlP4與Kv4鉀通道相互作用的結(jié)構(gòu)和功能位點的應用。
技術(shù)背景離子通道是大分子膜蛋白在細胞膜上圍成的含水分子孔道。K+通道存在于所有 的真核細胞中并發(fā)揮著多種重要的生物學功能。簡單地講，反應細胞生死、存亡的 一個客觀指標就是判斷該細胞是否還存在著細胞膜負電位，而K+通道的正常功能活 動不僅負責建立細胞膜的靜息負電位，同時也參與調(diào)節(jié)動作電位的頻率、幅度，是 維持各種細胞電活動和生命過程的基礎。K+通道的結(jié)構(gòu)與功能研究起始于1988年Jan研究組對果蠅K+通道基因 的發(fā)現(xiàn)。根據(jù)Shaker通道的同源性比較，哺乳類電壓門控K+通道(Kv)超大家族主要 由四種功能獨立的亞家族，即Kvl 、 Kv2CS^6)、 Kv3(幼mv)和Kv4(幼a/)組成(Pak, M.D., et al., m幼a/, a 5^6y^w辦。/^4-妙e c/z朋"e/ c/o"ecfmam/wa//a 6ra/". Proc Natl Acad Sci USA, 1991. 88(10): p. 4386-90.) 。 Kv鉀通道的a蛋白亞基 結(jié)構(gòu)相似，均含有六個跨膜(6TM)的a螺旋(Sl至S6)、胞漿內(nèi)的N-末端和C-末端 以及位于S5和S6之間的K+通道孔道區(qū)(pore domain) 。K+孔道區(qū)含有由氨基酸TxGYG (其中x表示任一氨基酸)組成的K+過濾器，它是鉀通道必需的保守序列，亦稱指 紋序歹ll (signature sequence) (Heginbotham， L., et al" Mw她'o"sAe尺+ c/za朋e/ —^匿，腦ce. Biophys J， 1994. 66(4): p. 1061-7.) 。 1998年MacKinnon研究組 運用X射線衍射技術(shù)，解析了原核細胞細菌鉀離子通道KcsA的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，這一突 破性成果在原子層次上首次揭示了鉀離子通道的工作原理(Doyle, D.A., et al., 7TzeScience, 1998. 280(5360): p. 69-77.)。Kv4(幼a/)亞家族由三個基因成員組成Kv4. 1、 Kv4. 2和Kv4. 3，由這三個基因 編碼的通道蛋白在跨膜區(qū)部分有極高的同源性，它們之間的主要差別在于通道的N-末端和C-末端。Kv4. 1、 Kv4.2和Kv4. 3基因的組織學分布也很相似，主要在腦、 心臟和骨骼肌有高度表達。受膜電位的刺激，Kv4鉀通道的基本生物學功能是在瞬 間激活后便快速關(guān)閉失活，通道的開放激活(activation)和關(guān)閉失活(inactivation)過程稱為門控(gating),是Kv4鉀通道重要的生理和生物物理學特征。與其它電壓門 控Kv鉀通道相比，三種Kv4鉀通道都具有被低閾值膜電壓快速激活、激活后能快 速地自身失活以及失活后恢復的生理特點，屬于快速失活(rapidly inactivating)型電 壓門控鉀通道。Kv4在神經(jīng)元和心肌細胞分別編碼瞬間低閾值A型K+電流IsA (transient subthreshold A-type K+ current)禾口瞬間夕卜向K+電流IT0 (transient outward K+ current) (Serodio, P.， C. Kentros, and B. Rudy, /c/e"^/ caf/o" o/mo/ecw/ar compowewta o/c/za朋eAs aWvfl"'wg W 5^6//zms/zo/(i/ ofew"血J Neurophysiol, 1994. 72(4): p. 1516-29. Wickenden, A.D., et al" i eg/o"a/ cowfr沾w"om q/XW.《《v4.2, a"<i A^v" to /mra/e"f owrtvani cwre"Z /" raf ve旨/c/e. Am J Physiol, 1999. 276(5 Pt 2): p. H1599-607.)，對各自的動作電位發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。例如，神經(jīng)元A型Kv4 K+ 電流通常在靜息細胞膜電位在-50到-60mV時已經(jīng)失活，但Kv4鉀通道在動作電位 后的瞬間后超級化(after-hyperpolarization)過程中從失活中迅速恢復。當細胞膜繼續(xù) 去極化時，Kv4 K+電流被低閾值電壓再次激活，從而對細胞的興奮性起到負反饋調(diào) 節(jié)的抑制作用。電壓依賴的Kv4 K+電流的失活時間和失活動力學過程對神經(jīng)元或心 肌細胞動作電位的幅度、時程和放電頻率發(fā)揮著重要的精細調(diào)節(jié)作用(Suzuki, T. and K. Takimoto, D跌re"^/ exjwe肌'o" o/_pore-》rm/"g tm<i i^CTz/f* flwx///a/-_y sw6wm'fe /" raZ wteriw t/鵬'"g/>/-egwawcy. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2005. 288(2》p. E335-41. Shibata， R., et al.,A> cwre^ mWatedf/ze《v4 c/w朋e/ /-egw/afeygeweraWo" q/"actow / ote油'a/ / riew/o/ /"g cere6e〃ar graww/e ce〃s. J Neurosci, 2000. 20(11): p. 4145-55.)?？焖偈Щ钚碗妷洪T控Kv4 K+通道的自身失活動力學以及失活過程的精細調(diào)節(jié)是 Kv4通道發(fā)揮其生理功能的核心，其失活功能發(fā)揮的結(jié)構(gòu)基礎主要依賴于通道的N-末端。近十幾年來對Shaker K+通道的研究結(jié)果表明，電壓門控Kvl(幼^^) K+通道 存在兩種不同的失活動力學，即數(shù)十毫秒的快速失活和數(shù)百毫秒的慢速失活。兩種 失活的分子機制也大不相同。第一種失活即快速失活是普遍接受的N-型或"球-鏈"失活機制。N-型失活是由Kvl(幼flfer) K+通道ot亞基氨基末端("鏈")的前 20-30個氨基酸所形成的"球"狀結(jié)構(gòu)在通道開放時將通道的內(nèi)側(cè)孔道入口處堵塞 而造成的快速失活。實驗證明，刪除N-端的"球-鏈"部分，Shaker通道的失活功 能便喪失。如果將N-端短肽再放回細胞中，通道的失活功能便可恢復(Zagotta, W.N., T. Hoshi, and R.W. Aldrich， We加rado" o//"a"/爐/ow /" m幽船o/5Tzafer / otow,謂c/z朋"e^ a/7ep"A de〃Ve^/W m ^S7 丑Science, 1990. 250(4980): p. 568-71.)。第二種失活形式是由孔道區(qū)外部的c-末端氨基酸的構(gòu)象改變而導致通道的緩慢關(guān)閉的c-型失活。Kv4鉀通道亦有快速和慢速兩種失活。然而，Kv4的失活機制尚不清楚，目前 存在各種解釋和不同的學說(Jerng， H.H., M. Shahidullah, and M. Covarrubias, 7naWvfl"o" o/XW / oto肌'扁c/za""eAsv mo/ecw/ar /她ra"/ora /"vo/W"g Ae/"群wW/歸e戸e. J Gen Physiol, 1999. 113(5): p. 641-60.)。 一種觀點認為， Kv4鉀通道的失活與經(jīng)典的Kvl (Shaker)通道N-型失活機制相似。刪除Kv4. 2 N-端 的第2-40位氨基酸，Kv4.2鉀通道的快速失活功能喪失。這一結(jié)果提示，Kv4通道 的N—端是其失活的結(jié)構(gòu)基石出(Bahring， R., et al., Coraerved《v4 A^e/7m'"a/ cr/"cfl/々r 。/"ATv c/zar朋e"wfera"/"g/ ra/e/" 22 ow cAa朋e/ ex/ r咖/ow朋c/ ga""g. J Biol Chem, 2001. 276(26): p. 23888-94.)。另一種觀點則認為，Kv4通道的 失活既不屬于N-型失活也不屬于C-型失活，而是由N-端和C-端共同參與、協(xié)調(diào)完 成的一種特殊失活。因此，關(guān)于Kv4通道的確切失活機制和失活的結(jié)構(gòu)基礎仍不清 楚，尚需進一步的研究和闡明。在Kv4亞家族各成員之間，電壓門控K+通道a亞基通過形成四聚體而組成功能 性的通道。通道四聚體(tetramerization)形成的結(jié)構(gòu)基礎是由保守的胞漿N-端親水的 部分Tl結(jié)構(gòu)域(Tl domain)即四聚體結(jié)構(gòu)域(tetramerization domain)介導完成(Li, M., Y.N. Jan， and L.Y. Jan, 5^ec折cfl"cw o/ra6wmY awemZ /y Aj^x>/ M,c flm/wo-term/wa/ cfoma/w o/f/ze S7zaA:er /w^xw/wm c/zaw e/. Science, 1992. 257(5074): p. 1225-30. Scannevin, R.H., et al.， T衡■/V-feryw/^/ <io/w<7z>w o/Xv4 A"卩+」c/za朋e/s regw/她 to om/mo^/a"'o" &/COz/P/. Neuron, 2004. 41(4): p. 587-98.) 。 Tl結(jié)構(gòu)域由 位于N-末端的第一跨膜a螺旋Sl之前的130個氨基酸組成，Tl在胞漿內(nèi)進行特異 的組裝形成穩(wěn)定的四聚體結(jié)構(gòu)。Kvl通道的Tl晶體結(jié)構(gòu)顯示，Tl結(jié)構(gòu)域極性氨基 酸之間的相互作用，以對稱的形式圍繞著中心的空腔呈四聚體排列。最近所解析的 Kv4.3Tl晶體結(jié)構(gòu)亦顯示，Tl結(jié)構(gòu)域除以四聚體折疊形式存在外，亦含有四個ZnW 原子(每個Tl的C-端含有一個Zn2+原子結(jié)合位點)起著穩(wěn)定Tl四聚體的作用。Zn2+ 原子結(jié)合位點突變會影響四聚體的穩(wěn)定性，導致Kv4通道電流表達顯著降低。因此， Kv通道Tl的主要功能是促進通道的四聚體化，它是形成功能性鉀離子通道的重要 結(jié)構(gòu)基礎。同時，Tl也可能參與通道的門控，影響通道的激活和失活的動力學過程5(Scannevin, R.H., et al., 7Vo Werm/wa/ ^foma,m1 0/尺v4 A^+j c/za朋e/s regw/她to awd w油/a"ow ATC7z/尸A Neuron, 2004. 41(4): p. 587-98. Wang, H., et al" X紐c似ra/ Z "j/j1々r o/A"+ c/za朋e/jawx///ar_y A"C7z/P sw6wm'to. NatNeurosci， 2007. 10(1): p. 32-9. Choe, S., et al.，五xc/to緣Xv ^ met//afe<iZ/ze 77 ctomcf/w o/f/ze vo/toge-ga&dpoto^/wm c/zawwe/. Novartis Found Symp, 2002. 245: p. 169-75; discussion 175-7， 261-4. Zhou, W., et al., 5Yrw"wra/ /腦.g/zto /"to yi^c"om / /她ra"/ow o/A:C/2//7 w油幼a/-妙e牟j c/z扁ek Neuron, 2004. 41(4): p. 573-86.)。輔助P亞基對電壓門控K+通道在細胞膜上的表達、通道的生物物理學和藥理學 特征等也有重要的調(diào)節(jié)作用。已知的離子通道的P亞基有膜蛋白和胞漿蛋白兩種。 利用酵母雙雜交(yeast two-hybrid, YTH)系統(tǒng)和免疫共沉淀方法以Kv4 N-端為誘餌， 2000年發(fā)現(xiàn)了三種與Kv4鉀通道特異結(jié)合的胞漿蛋白KChIPs (Kv4 channel interacting proteins)，即KChIPl、 KChlP2和KChlP3 (An, W.F., et al" Afod"/""w7 v4-妙e/ otoW調(diào)c/zfl朋e/sa々m辦o/ca/c/wm semon Nature, 2000. 403(6769》p. 553-6.)。隨后，KChlP4作為早老素(presenilin)的分子伴侶也被克隆(Morohashi，Y., et al.,Mo/ect//ar c/ow/wg朋d c/^racfe/-/za"cw o/C4ZJVATC7zZP《a wove/ ^EF-Zzfl/Wprate," /"ferach,"g / resew〃/" 2 awt/ vo/fage-gated/w^xw/wm c/zaw"e/ sm6iot" iCv4. J Biol Chem, 2002. 277(17): p. 14965-75.)。到目前為止，共發(fā)現(xiàn)四種KChIP蛋白(分別含 有216至259個氨基酸)。其中，KChlP4由229個氨基酸組成，其氨基酸序列如序 列表中的序列l(wèi)所示。免疫雙染色實驗還證明，Kv4通道與KChIPs在細胞內(nèi)共定位形成Kv4-KChlPs 通道自然復合體。KChlPs影響Kv4電流的密度、失活動力學和失活后的恢復。KChlPs 屬于鈣結(jié)合蛋白恢復蛋白-神經(jīng)元鈣感受器超大家族(recoverin-neuronal calcium sensor superfamily)的成員，與神經(jīng)元!丐感受器1 (neuronal calcium sensor 1， NCS-1) 蛋白序列有同源性。KChlP3與鈣衰蛋白(calsenilin)和DREAM (downstream regulatory element antagonist modulator)是同一蛋白的不同命名。四種胞內(nèi)可溶性KChIP蛋白的核心區(qū)和C-末端部分相對保守，但它們的N-末 端卻大不相同。KChIP蛋白含有四個類似EF-hand樣鈣結(jié)合模體(EF-hand-like calcium-binding motif)。每個EF-hand樣鈣結(jié)合模體由約12個氨基酸形成的環(huán)狀結(jié) 構(gòu)和兩個a螺旋側(cè)翼序列構(gòu)成。理論上每個EF-hand可以結(jié)合一個Ca"，但是DREAM 和NCS家族其它成員共有的CPXG(半胱氨酸-脯氨酸-X-甘氨酸)序列阻止了EF-handl與Ca"的結(jié)合。最近解析的KChIPl晶體結(jié)構(gòu)顯示，EF-hand 3和EF-hand 4 對Ca"的親和力較高，可以與Ca"結(jié)合，而EF-handl和EF-hand2對C的親和力較 低，不能與Ca2+結(jié)合。異源表達系統(tǒng)和在體形態(tài)學研究證明，KChIPs與Kv4通道相 互作用，在細胞內(nèi)以復合體形式共存(Shibata, R., et al.,爿/w^fomewto/ ra/e/orc/2a朋ek J Biol Chem, 2003. 278(38): p. 36445-54.)。KChIPl、 KChlP2和KChlP3對Kv4通道有相似的生理學和生物物理學調(diào)節(jié)作用， 表現(xiàn)在增加Kv4.2的電流密度(即通道蛋白的表達增加)、通道激活-電壓曲線向超 極化方向左移、減慢通道的失活速率和加速通道從失活中的快速恢復等方面。KChIPl對Kv4. 2的作用效果在很大程度上與神經(jīng)細胞所記錄的Kv4電流的生物 物理學特性相吻合。免疫熒光實驗證實，C0S-l細胞中Kv4.2的表達主要出現(xiàn)在細 胞核周圍，即典型的蛋白滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的分布形式。KChlPl-3與Kv4的共表達 明顯地改變了 Kv4. 2通道蛋白在細胞內(nèi)的分布，使Kv4離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到達高爾基體并 向細胞膜轉(zhuǎn)運的過程加速，最終Kv4.2在細胞膜的表達顯著增加。研究還表明， KChlP1-3還可增加Kv4的磷酸化，改變其溶解性和穩(wěn)定性等，此作用機制可能與 KChIPs遮蔽Kv4 N-末端疏水性結(jié)構(gòu)±或有關(guān)(Shibata, R., et al., j/w"ctowe"to/ ra/e/wc/^""ek J Biol Chem, 2003. 278(38): p. 36445-54.)。與其它KChIPs相比，KChlP4對Kv4的作用明顯不同。KChlP4不能促進Kv4. 2 在細胞膜上的表達，對Kv4通道的電流密度和失活中的恢復均無影響，但卻能完全 消除Kv4通道的失活，使快速失活型Kv4通道變成非失活的延遲整流型 (delayed-rectifier) Kv4通道。KChlP4與其它KChIPs之間相互競爭與Kv4通道結(jié)合。 初步研究表明，KChlP4對Kv4失活的影響可能與其N-端的KIS (K-channel inactivation suppressor)結(jié)構(gòu)域有關(guān)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種使KChlP4功能轉(zhuǎn)換成KChIPl的方法。 本發(fā)明所提供的使KChlP4功能轉(zhuǎn)換成KChIPl的方法，是將KChlP4的下述1)和2)這兩組中的至少一組氨基酸殘基同時進行突變1) KChlP4的自氨基末端第11位的纈氨酸、第14位的纈氨酸和第15位的異亮氨酸(Valll、 Val14、 Ilel5);2) KChlP4的自氨基末端第18位的苯丙氨酸、第21位的亮氨酸和第25位的苯 丙氨酸(Phel8、 Leu21、 Phe25);本發(fā)明的第二個目的是提供一種使KChlP4誘導的Kv4通道電流失活變快的方法。本發(fā)明所提供的使KChlP4誘導的Kv4通道電流失活變快的方法，是將KChlP4 的自氨基末端第61位的苯丙氨酸和第68位的異亮氨酸(Phe61和Ile68)同時進 行突變。本發(fā)明的第三個目的是提供一種篩選改變神經(jīng)元興奮性的藥物的方法。 本發(fā)明所提供的篩選改變神經(jīng)元興奮性的藥物的方法，是基于Kv4和KChlP4 相互作用的下述l) 、 2)和3)這三組中的至少一組氨基酸殘基進行藥物設計，篩 選能夠減弱或增強Kv4和KChlP4蛋白間相互作用的化學小分子或生物大分子1) KChlP4的自氨基末端第11位的纈氨酸、第14位的纈氨酸和第15位的異亮 氨酸；2) KChlP4的自氨基末端第18位的苯丙氨酸、第21位的亮氨酸和第25位的苯 丙氨酸；3) KChlP4的自氨基末端第61位的苯丙氨酸和第68位的異亮氨酸。 所述KChlP4來源于人或動物，如猴、狗、貓、兔、豚鼠、大鼠、小鼠等。 本發(fā)明通過X-射線晶體衍射手段解析KChlP4晶體的原子結(jié)構(gòu)，通過與近期解析出的Kv4-N-KChIPl復合結(jié)晶中KChIPl晶體原子結(jié)構(gòu)的比較(Wang， H., et al., Sfrw"wra/ 6flWs々r mot/w/adow o/《v4 c/ fl朋e/sam:///ar_y AO/尸5^6wmYs. Nat Neurosci, 2007. 10(1): p. 32-9.)，并結(jié)合生化、分子生物學、電生理學和生物物理 學等交叉學科的研究方法，解析了 KChlP4晶體的原子結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)KChlP4與Kv4相 互作用并引起Kv4各項生物物理學以及細胞生物學指標發(fā)生變化的關(guān)鍵氨基酸作用 位點，為基于KChlP4和Kv4相互作用的接觸界面結(jié)構(gòu)進行藥物設計，以改變KChlP4 蛋白對Kv4的特異調(diào)節(jié)作用提供了基礎。


圖l為KChlP4的晶體結(jié)構(gòu)圖2為突變KChlP4的自氨基末端第11位的纈氨酸、第14位的纈氨酸和第15 位的異亮氨酸(Valll、 Val14、 Ilel5)，對Kv4. 3和KChlP4在卵母細胞的共表達 電流幅度和失活動力學的影響圖3為突變KChlP4的自氨基末端第18位的苯丙氨酸、第21位的亮氨酸和第 25位的苯丙氨酸(Phel8、 Leu21、 Phe25)，對Kv4. 3和KChlP4在卵母細胞的共表 達電流幅度和失活動力學的影響圖4為突變KChlP4的自氨基末端第61位的苯丙氨酸和第68位的異亮氨酸 (Phe61和Ile68) ， KChlP4對Kv4. 3的調(diào)節(jié)功能喪失。圖5為分別突變KChlP4的自氨基末端第11位的纈氨酸、第14位的纈氨酸和 第15位的異亮氨酸(Valll、 Val14、 Ilel5)、突變KChlP4的自氨基末端第18位 的苯丙氨酸、第21位的亮氨酸和第25位的苯丙氨酸(Phel8、 Leu21、 Phe25)和 突變KChlP4的自氨基末端第61位的苯丙氨酸和第68位的異亮氨酸(Phe61和 Ile68) ， KChlP4對Kv4. 3轉(zhuǎn)運的影響。
具體實施方式
實施例l、 KChlP4蛋白的表達和純化一、重組表達載體的構(gòu)建1 、 KChlP4蛋白的重組表達載體pET28a-KChlP4的構(gòu)建提取小鼠全腦組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此cDNA為模板，利用上游引 物5' -GCACATATGAACTTGGAGGGGCTTGAAAT-3，和下游引物5，-AGCTCCTCGAGCTAGATCACATTTTCAAAGAGCTGCATG-3，進行PCR擴增，得到KChlP4基 因全長cDNA片段。將得到的KChlP4基因全長cDNA片段與pET28a質(zhì)粒(Novagen 公司)用限制性內(nèi)切酶vWel和酶切后連接，將得到的重組表達載體命名為 pET28a-KChlP4。 pET28a質(zhì)粒中多克隆位點的上游和下游都含有六個組氨酸標簽 (His-tag)便于后續(xù)實驗中的純化工作。2、 KChlP4蛋白突變體表達載體的構(gòu)建 (1)重組表達表達載體pET28a-KChIP4-VllE-V14E-I15E的獲得重組表達載體pET28a-KChlP4-VllE-V14E-I15E的特異性點突變、氨基酸置換 等均采用PCR方法。以上述步驟1構(gòu)建的重組表達載體pET28a-KChlP4為模板， 設計上游引物5' -CGCGGATCCATGAACTTGGAGGGGCTTGAAATGATAGCAGAACTGATCGAAGAGGTGCT-3，和下游 引物5'-CCGCTCGAGTCAGATCACATTTTCAAAGAG-3'，經(jīng)過一輪PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn) 物回收、酶切，再與用同樣酶切的載體pET28a連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞， 將篩選得到的單克隆小提質(zhì)粒后進行測序，測序結(jié)果表明，所構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒上KChlP4氨基酸序列中，除第11位變?yōu)楣劝彼帷⒌?4位變?yōu)楣劝彼岷偷?5位變 為谷氨酸外，其余氨基酸序列與序列l(wèi)相同，將得到重組表達載體命名為 pET28a-KChlP4-V11E-V14E-115E。(2) 重組表達表達載體pET28a-KChlP4-F18E-L21E-F25E的獲得 重組表達載體pET28a-KChlP4-F18E-L21E-F25E的特異性點突變、氨基酸置換等均采用PCR方法，經(jīng)過兩輪PCR反應，得到最終的PCR產(chǎn)物。具體步驟為第一 輪PCR反應分別擴增產(chǎn)物全長序列的前后兩部分，以上述步驟1構(gòu)建的重組表達載 體pET28a-KChlP4為模板，擴增產(chǎn)物全長序列前一部分的上游引物序列為 5'-CGCGGATCCATGAACTTGGAGGGGCTTGAA-3'，下游引物序列為5' -CAGCCCCTCCTGTTCCAATTCTTTAACCTCAAGCACAAT-3'，經(jīng)過PCR反應得到近3'末端 含有三個氨基酸突變的長度為84bp的片段；以上述步驟1構(gòu)建的重組表達載體 pET28a-KChlP4為模板，擴增產(chǎn)物全長序列后一部分的上游引物序列為 5'-ATTGTGCTTGAGGTTAAAGAATTGGAACAGGAGGGGCTGA-3'，下游引物序列為 5' -CCGCTCGAGTCAGATCACATTTTCAAAGAG-3'，經(jīng)過PCR反應得到近5'末端含有三個氨 基酸突變的長度為628bp的片段；第二輪PCR反應以第一輪PCR擴增得到的兩段產(chǎn) 物為模板，以第一輪PCR反應擴增前一部分片段的上游引物為第二輪PCR反應的上 游引物，以第一輪PCR反應擴增后一部分片段的下游引物為第二輪PCR反應的下游 引物，由此擴增出全長產(chǎn)物，經(jīng)回收、酶切、凝膠回收等步驟，再與經(jīng)同樣酶切的 載體pET28a連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，將篩選得到的單克隆小提質(zhì)粒后進 行測序，測序結(jié)果表明，所構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒上KChlP4氨基酸序列中，除第18 位變?yōu)楣劝彼?、?1位變?yōu)楣劝彼岷偷?5位變?yōu)楣劝彼嵬猓溆嗟陌被嵝蛄信c 序列1相同，將得到重組表達表達載體命名為pET28a-KChlP4-F18E-L21E-F25E。(3) 重組表達表達載體pET28a-KChlP4-F61E-I68E的獲得 重組表達載體pET28a-KChlP4-F61E-I68E的特異性點突變、氨基酸置換等均采用PCR方法，經(jīng)過兩輪PCR反應，得到最終的PCR產(chǎn)物。具體步驟為第一輪PCR 反應分別擴增產(chǎn)物全長序列的前后兩部分，以上述步驟1構(gòu)建的重組表達載體 pET28a-KChlP4為模板，擴增產(chǎn)物全長序列前一部分的上游引物序列為 5'-CGCGGATCCATGAACTTGGAGGGGCTTGAA-3'，下游引物序列為5' -AAGCTCCTGAAGCTCTTTCTTGGTCTCTTT-3'，經(jīng)過PCR反應得到近3'末端含有兩個氨 基酸突變的長度為208bp的片段；以上述步驟1構(gòu)建的重組表達載體pET28a-KChlP4為模板，擴增產(chǎn)物全長序列后一部分的上游引物序列為5'-AAAGAGACCAAGAAAGAGCTT CAGGAGCTT-3，，下游引物序列為5'-CCGCTCGAGTCAGATCACATTTTCAAAGAG-3'，經(jīng)過 PCR反應得到近5'末端含有兩個氨基酸突變的長度為493bp的片段；第二輪PCR反 應以第一輪PCR擴增得到兩段產(chǎn)物為模板，以第一輪PCR反應擴增前一部分片段的 上游引物為第二輪PCR反應的上游引物，以第一輪PCR反應擴增后一部分片段的下 游引物為第二輪PCR反應的下游引物，由此擴增出全長產(chǎn)物，經(jīng)回收、酶切、凝膠 回收等步驟，再與經(jīng)同樣酶切的載體pET28a連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，將 篩選得到的單克隆小提質(zhì)粒后進行測序，測序結(jié)果表明，所構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒上 KChlP4氨基酸序列中，除第61位變?yōu)楣劝彼?、?8位變?yōu)楣劝彼?，其余的氨基?序列與序列l(wèi)相同，將得到重組表達表達載體命名為pET28a-KChlP4-F61E-I68E。以上過程的引物合成和DNA測序均委托北京奧科生物技術(shù)有限責任公司完成。二、蛋白的表達將步驟一得到的重組表達載體pET28a-KChIP4-VlIE-V14E-115E、 pET28a-KChlP4-F18E-L21E-F25E、 pET28a-KChlP4-F61E-168E、 pET28a-KChlP4分別 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，并在其中表達相應蛋白，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳檢測蛋白 的表達情況。將蛋白樣品上清液和N:T resin (樹脂)(Novagen公司)混合后，用清 洗緩沖液清洗。然后用咪唑洗脫液進行His-tag融合蛋白的洗脫，得到純化的KChlP4 蛋白、KChlP4蛋白突變體KChlP4-VllE-V14E-I15E、 KChlP4-F18E-L21E-F25E、 KChlP4-F61E-168E。實施例2、解析KChlP4的晶體結(jié)構(gòu)，闡明Kv4通道和KChlP4蛋白相互作用的 結(jié)構(gòu)基礎1、 晶體的生長將實施例1的濃度為6mg/ml的KChlP4蛋白溶液與平衡緩沖液(25mM Tris， pH7. 4， lOOraM NaCl, 10幽DTT和lmM ZnCl2)等體積混合，采用懸滴擴散法篩選 初始結(jié)晶條件。初始結(jié)晶條件的篩選使用Hampton的晶體篩選試劑盒(Hampton Research公司)。最后的晶體在4。C的母液(2. 0M Na,4、 2. OM K2HP04、 0. 2M Li2S04 和0. 1M 3-(環(huán)己胺)-l-丙磺酸(CAPS)， pH 10. 5)中生長，得到KChlP4單晶體。2、 晶體的數(shù)據(jù)收集將蛋白晶體轉(zhuǎn)入含有30% (體積百分含量)甘油的上述母液中，并在液氮中瞬 間冷卻。在-160。C條件下，KChlP4單晶體的數(shù)據(jù)收集使用Quantum 4 CCD探測器以及Beamline5. 0. 2的X射線光源(Comnel， NY)。所有的數(shù)據(jù)分別用DENZO指標化 和SCALEPACK合并。3、 晶體結(jié)構(gòu)的解析使用分子置換法解析晶體結(jié)構(gòu)(CCP4中的AM0RE程序)，采用KChIPl的結(jié)構(gòu) 模型(PDBlslg和lsle)作為初始模型來解析KChlP4的晶體結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)的修正使用 CNS程序完成。4、 KChlP4蛋白的晶體結(jié)構(gòu)揭示KChlP4功能轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵氨基酸位點通過KChlP4單晶體與Kv4. 3N-KChlPl復合晶體中結(jié)合態(tài)的KChIPl晶體的三維 結(jié)構(gòu)特點的比較，分析KChlP4和KChIPl對Kv4通道失活功能調(diào)節(jié)的生物物理學差 異。Kv4. 3N-KChlPl復合體結(jié)構(gòu)的兩個顯著特點在于第一，每個KChIPl分子分別 與臨近的兩個Kv4 N-末端結(jié)合并相互作用。KChIPl N-端的一個ot螺旋和C-端的三 個a螺旋形成的口袋將Kv4.3 N-端的最前端緊密包圍的同時，同一個KChIPl的N-端的a螺旋與臨近的Kv4. 3N-端突出襻相互作用。第二，KChlPl的口袋在與Kv4. 3 N-端的最前端結(jié)合的同時，構(gòu)象發(fā)生了解螺旋的變化。KChlP4的晶體結(jié)構(gòu)如圖1所示。 該晶體與Kv4. 3N-KChIPl復合晶體中KChIPl晶體的結(jié)構(gòu)差異體現(xiàn)在該晶體N端較 KChIPl多出兩個a螺旋，形成一個交叉的形態(tài)位于"疏水口袋"的前端，成為影響 Kv4失活的關(guān)鍵部分。通過晶體結(jié)構(gòu)找到可能改變KChlP4 N端兩個a螺旋位置的關(guān) 鍵位點。實施例3、基于KChlP4的結(jié)構(gòu)特點，將野生型KChlP4和基于結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的三個 突變體KChlP4-VllE-V14E-115E、 KChlP4-F18E-L21E-F25E和KChlP4-F61E-I68E利 用凝膠過濾柱層析方法檢測KChlP4蛋白的聚集狀態(tài)通過讀取凝膠過濾最高吸收峰值對應的毫升數(shù)，與蛋白標準品標定出的蛋白分 子量的標準曲線進行比較，確定野生型KChlP4及其三個突變體蛋白的聚集狀態(tài)為 單聚體、二聚體以及四聚體。結(jié)果表明，三個突變體KChlP4-VllE-V14E-I15E、 KChIP4-F18E-L21E-F25E和KChlP4-F61E-I68E可以改變KChlP4蛋白的聚集形式， 由多聚體向單體轉(zhuǎn)變，說明KChlP4-V11-V14-I15、 KChlP4-F18-L21-F25和 KChlP4-F61-I68這些氨基酸位點是KChlP4發(fā)揮功能的重要部位。實施例4、基于KChlP4與Kv4相互作用的結(jié)構(gòu)特點，利用電生理學記錄方法記 錄野生型Kv4. 3鉀通道和KChlP4以及它們的突變體在爪蟾卵母細胞中的表達，鑒別KChlP4轉(zhuǎn)變成KChIPl的關(guān)鍵氨基酸位點一、 重組表達載體的構(gòu)建電生理功能檢測使用的載體均為pBluescript KSM (以下用KSM表示)(Stratagene) 爪蟾卵母細胞表達載體。分別以上述構(gòu)建在pET28a載體里的重組表達載體 pET-KChlP4、 pET28a-KChlP4-V11E-V14E-115E、 pET28a-KChlP4-F18E-L21E-F25E 和pET28a-KChlP4-F61E-I68E為模板，利用上游引物5'-GAAAGTCGACATGAACTTGGAGGGGCTTGAAAT-3'和下游引物5，-GCTTAGGAATTCCTAGATCACATTTTCAAAGAGCTGCATG-3'進行PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn) 物分別用&7I和fcoy I雙酶切后，與用相同酶酶切的上述KSM載體連接，得到重 組表達載體KSM-KChlP4、 KSM-KChlP4-V11E-V14E-115E、 KSM-KChlP4-F18E-L21E-F25E和KSM-KChlP4-F61E-168E。以hKv4. 3 cDNA clone (Open Biosystems)為模板，以上游引物5，-GAAAGTCGACATGGCGGCCGGAGTTGC-3，及下游引物5'-GCTTAGGAATTCTTACAAGACAGAGACCTTGACAACATTGCT-3，進行PCR擴增，將PCR擴增 產(chǎn)物分別用&2I和^"coi I雙酶切后，與用相同酶酶切的上述KSM載體連接，得到 重組表達載體KSM-Kv4. 3。以rKChIPl cDNA clone (Open Biosystems)為模板，以上游引物5，— GAAAGTCGACATGGGTGCAGTTATGGGT-3'和下游引物5'-GCTTAGGAATTCCTACATGACATTTTGGAACAGC-3'進行PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物分別用 5^I和&oy I雙酶切后，與用相同酶酶切的上述KSM載體連接，得到重組表達載 體KSM-KChIPl。二、 體外轉(zhuǎn)錄生成cRNA取5-10|ig上述步驟一構(gòu)建的重組表達載體KSM-KChlP4、 KSM-KChlP4-V11-V14-115、 KSM-KChlP4-F18E-L21E-F25E、 KSM-KChlP4-F61E-I68E 和KSM-Kv4.3，分別加入10UyV"I限制性內(nèi)切酶，在雙鏈DNA的下游單酶切使上述 DNA線性化。進行DNA純化，具體過程如下在100ul酶切反應體系中加入100ul蒸 餾水，再加入20(^1按照下述體積比例混合的酚-氯仿-異戊醇(25: 24: 1)溶液， 充分混合，13000rpm離心lmin，小心吸出上層水相，轉(zhuǎn)移至另一EP管中，并在剩 余有機相溶液中加入200|il蒸餾水，13000rpm離心lmin，取上層水相與前一步離心 得到的水相合并。加入400ul氯仿，充分混合，13000rpm離心lrain，吸取水相至13另一EP管中，加入3M醋酸鈉，至終濃度為0.3M (40ul)，并加入2倍體積的無 水乙醇畫ul) ， -20。C放置2小時以上。4°C 13000rpm離心30min，棄上清。 加入50(V1 70%的乙醇，13000rpm離心2min，棄上清，自然條件下晾干10min，沉 淀用適量蒸餾水溶解。分別取上述提純后的DNA約lng進行體外轉(zhuǎn)錄，得到Kv4. 3、KChlP4以及KChlP4 蛋白突變體KChlP4-V11E-V14E-115E、 KChlP4-F18E-L21E-F25E和 KChlP4-F61E-I68E的cRNA。轉(zhuǎn)錄采用mMESSAGE mMACHINE T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Ambion, USA)，用無RNA酶的去離子水將得到的Kv4. 3、 KChlP4以及KChlP4突變 體的cRNA稀釋到100ng/n 1。三、 非洲爪蟾卵母細胞CYe朋;ms Oocytes)的獲得雌性非洲爪蟾冰浴麻醉后通過外科手術(shù)取出成熟爪蟾卵細胞(stage V-VI)，經(jīng) 過collagenase I酶消化去除卵細胞外層硬膜，再將卵母細胞置于含10萬U/I青霉 素和鏈霉素的ND-91溶液中，17°C培養(yǎng)，每天換液1次。卵母細胞培養(yǎng)液ND-91(1L) 中各物質(zhì)的濃度為(mM): NaCl 91. 0， HEPES 5. 0， KC1 2. 0， MgCl2 1. 0， CaCl2 0. 3， 丙酮酸鈉550mg，茶堿90rag， pH7.6。注射cRNA采用納升注射器Drummond Nanojector I(Drummond Scientific, USA) 和其專用的玻璃電極。該玻璃電極采用電極拉制器P-97 (Sutter Instrument, USA)拉制 而成。注射時，先在電極中充入礦物油密封隔離，向上述非洲爪蟾卵母細胞中分別 注射46nl WT Kv4. 3、 WT Kv4. 3和WT KChlP4、 WT Kv4. 3和WT KChlP4的各突變 體cRNA (WT是指野生型表達的上述蛋白的cRNA)，每種處理注射20個爪蟾卵母細 胞。為了保證cRNA在卵母細胞中適量表達以及WT Kv4. 3的cRNA與WT KChlP4的 cRNA摩爾比為1: 1 ，各組中WT Kv4. 3的cRNA濃度為20ng/|il, WT KChlP4及其各突 變體的cRNA濃度為50-lOOngAil，對照組注射等體積的無菌去離子水。注射后的爪 蟾卵母細胞在17°C溫箱孵育1-2天后，記錄通道的功能表達。四、 記錄爪蟾卵母細胞的全細胞電流將注射了 WT Kv4. 3、 WT Kv4. 3和WT KChlP4、 WT Kv4. 3和WT KChlP4各突變 體cRNAs且表達1-2天后的爪蟾卵母細胞置于容積為0. 2ml的浴槽內(nèi)，以ND-96溶 液連續(xù)灌流(2. Oml/rain)。采用雙電極電壓鉗(TEVC， two-electrode voltage clamp)方 法以爪蟾卵全細胞方式記錄表達的Kv4鉀電流的幅度、失活動力學和失活恢復的速 率，記錄的鉗制電壓為-80mV，刺激方波為10mV，刺激時間為ls。放大器為GeneClamp500 (Axon, USA)，數(shù)據(jù)采集軟件為Pulse (HEKA，德國)。用于記錄的玻璃 電極采用電極拉制器P-97 (Sutter Instrument, USA)拉制的硼硅玻璃微電極，灌注3M KC1后的電阻在0. 5-1. 0 MQ。電壓鉗指令電位由0-725C卵母細胞電壓鉗放大器產(chǎn) 生并連接計算機進行數(shù)據(jù)采集。PH7. 6的ND-96記錄溶液中各物質(zhì)的濃度為(mM): NaCl 96,0， HEPES 5.0, KC1 2,0， MgCl2 1. 0和CaCl2 1, 0。五、數(shù)據(jù)分析并確定KChlP4的N端在與Kv4. 3相互作用時的關(guān)鍵氨基酸位點 的功能通道失活、失活后恢復等電流曲線采用雙指數(shù)函數(shù)1(t)二A0+Ale—(t一 tO)/Tl+A2e—(t —tO)/T2擬合進行通道的動力學分析。式中AO、 Al、 A2分別表 示去激活電流成分、快速失活電流成分和慢速失活電流成分的幅度，t代表時間， tO為擬合的起始時間，t1和T2代表時間常數(shù)，各電流成分所占的比率用AO、 Al、 A2對最大電流的歸一化表示。通過擬合函數(shù)外推計算的方法得到峰值電流。實驗結(jié)果為5組爪蟾卵母細胞上記錄的電流對各自最大瞬間電流的歸一化平均 值。實驗結(jié)果采用平均值土標準差表示。數(shù)據(jù)分析和作圖采用Igor Pro和Origin6. 0。結(jié)果如圖2-4所示，其中，圖2為突變KChlP4的自氨基末端第11位的纈氨酸、 第14位的纈氨酸和第15位的異亮氨酸(Valll、 Val14、 Ilel5)，對Kv4. 3-KChlP4 復合體在卵母細胞的共表達電流幅度和失活動力學的影響。其中圖2-a、 2-b分別 為Kv4. 3與突變KChlP4的自氨基末端第11位的纈氨酸、第14位的纈氨酸和第15 位的異亮氨酸所得到的氨基酸共表達的I-V曲線以及失活后的恢復曲線；圖2-c為 Kv4. 3、 Kv4. 3和KChIPl、 Kv4. 3和WT KChlP4以及Kv4. 3和突變KChlP4的自氨基 末端第11位的纈氨酸、第14位的纈氨酸和第15位的異亮氨酸所得到的氨基酸標 準化后電流失活速度的比較。從圖2中可以看出，注射Kv4.3和突變KChlP4的自 氨基末端第11位的纈氨酸、第14位的纈氨酸和第15位的異亮氨酸的cRNA組的失 活速度較注射Kv4. 3和WT KChlP4的c腿組的速度明顯加快，且與注射Kv4, 3和 KChIPl的cRNA組的速度相似。表明KChlP4的自氨基末端第11位的纈氨酸、第14 位的纈氨酸和第15位的異亮氨酸為KChlP4與Kv4. 3作用時的關(guān)鍵氨基酸位點。由 于不同的輔助亞基(KChIPl與KChlP4)與a亞基(Kv4.3)相互作用時表現(xiàn)出不同 的失活表型(Phenotype)，而離子通道的失活特征直接與細胞的興奮性相關(guān)，Kv4 與KChIPs在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在且存在共定位，因而通過改變Kv4. 3鉀通道的失 活表型可達到改變神經(jīng)元動作電位的形狀、發(fā)放時間和發(fā)放頻率，近而改變神經(jīng)元的興奮性。KChlP4的自氨基末端第ll位的纈氨酸、第14位的纈氨酸和第15位的 異亮氨酸位于KChlP4的N-端第一個a螺旋上，KChlP4的自氨基末端第11位的纈 氨酸、第14位的纈氨酸和第15位的異亮氨酸的突變體在與Kv4. 3相互作用時可實 現(xiàn)由KChlP4向KChIPl轉(zhuǎn)變，是KChlP4與Kv4. 3相互作用的關(guān)鍵氨基酸位點。圖3為突變KChlP4的自氨基末端第18位的苯丙氨酸、第21位的亮氨酸和第 25位的苯丙氨酸(Phel8、 Leu21、 Phe25)，對Kv4. 3-KChlP4復合體在卵母細胞的 共表達電流幅度和失活動力學的影響。其中圖3-a、3-b分別為Kv4. 3與突變KChlP4 的自氨基末端第18位的苯丙氨酸、第21位的亮氨酸和第25位的苯丙氨酸所得到 的氨基酸共表達時的I-V曲線以及失活后的恢復曲線；圖3-c為Kv4.3、 Kv4.3和 KChIPl、 Kv4. 3和WT KChlP4以及Kv4. 3和突變KChlP4的自氨基末端第18位的苯 丙氨酸、第21位的亮氨酸和第25位的苯丙氨酸所得到的氨基酸標準化后電流失活 速度的比較。從圖3中可以看出，注射Kv4.3和突變KChlP4的自氨基末端第18位 的苯丙氨酸、第21位的亮氨酸和第25位的苯丙氨酸的cRNA組的失活速度較注射 Kv4. 3和WT KChlP4的cRNA組的速度明顯加快，且與注射Kv4. 3和KChIPl的c謹 組相似的速度相似。表明KChlP4的自氨基末端第18位的苯丙氨酸、第21位的亮 氨酸和第25位的苯丙氨酸為KChlP4與Kv4. 3作用時的關(guān)鍵氨基酸位點。由于不同 的輔助亞基(KChIPl與KChlP4)與a亞基(Kv4. 3)相互作用時表現(xiàn)出不同的失活 表型(Phenotype)，而離子通道的失活特征直接與細胞的興奮性相關(guān)，Kv4與KChIPs 在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在且存在共定位，因而通過改變Kv4. 3鉀通道的失活表型可達 到改變神經(jīng)元動作電位的形狀、發(fā)放時間和發(fā)放頻率，近而改變神經(jīng)元的興奮性。 KChlP4的自氨基末端第18位的苯丙氨酸、第21位的亮氨酸和第25位的苯丙氨酸 位于KChlP4的N-端第一個a螺旋上，位置較KChlP4的自氨基末端第11位的纈氨 酸、第14位的纈氨酸和第15位的異亮氨酸稍靠后，KChlP4的自氨基末端第18位 的苯丙氨酸、第21位的亮氨酸和第25位的苯丙氨酸的突變體在與Kv4. 3相互作用 時可實現(xiàn)由KChlP4向KChIPl轉(zhuǎn)變，是KChlP4與Kv4. 3相互作用的關(guān)鍵氨基酸位 點。圖4為突變KChlP4的自氨基末端第61位的苯丙氨酸和第68位的異亮氨酸 (Phe61和Ile68) ， KChlP4對Kv4. 3的調(diào)節(jié)功能喪失。其中圖4-a、 4-b分別為 Kv4. 3與突變KChlP4的自氨基末端第61位的苯丙氨酸和第68位的異亮氨酸共表達 時的I-V曲線以及失活后的恢復曲線；4-c為Kv4. 3、 Kv4. 3和KChIPl、 Kv4. 3和WT KChlP4以及Kv4. 3和突變KChlP4的自氨基末端第61位的苯丙氨酸和第68位的 異亮氨酸所得到的氨基酸標準化后電流失活速度的比較。從圖4中可以看出，注射 Kv4. 3和突變KChlP4的自氨基末端第61位的苯丙氨酸和第68位的異亮氨酸的cRNA 組的失活速度較Kv4. 3和WT KChlP4的cRNA組的速度明顯加快，且與注射Kv4. 3 和KChIPl的cRNA組速度相似。表明KChlP4的自氨基末端第61位的苯丙氨酸和第 68位的異亮氨酸為KChlP4與Kv4. 3作用時的關(guān)鍵氨基酸位點。由于不同的輔助亞 基(KChIPl與KChlP4)與a亞基(Kv4.3)相互作用時表現(xiàn)出不同的失活表型(Phenotype)，而離子通道的失活特征直接與細胞的興奮性相關(guān)，Kv4與KChIPs 在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在且存在共定位，因而通過改變Kv4. 3鉀通道的失活表型可達 到改變神經(jīng)元動作電位的形狀、發(fā)放時間和發(fā)放頻率，近而改變神經(jīng)元的興奮性。 KChlP4的自氨基末端第61位的苯丙氨酸和第68位的異亮氨酸位于KChlP4的N-端 第二個a螺旋上，KChlP4的自氨基末端第61位的苯丙氨酸和第68位的異亮氨酸突 變體在與Kv4. 3相互作用時可調(diào)節(jié)通道特性，使由KChlP4誘導的Kv4. 3通道失活 變快，是KChlP4與Kv4. 3相互作用的關(guān)鍵氨基酸位點。KChlP4改變Kv4. 3電流的失活速率并加速Kv4. 3失活后的恢復，與報道的結(jié)果 相一致。上述結(jié)果表明，將主要氨基酸突變，KChlP4對Kv4的調(diào)節(jié)功能消失，進一 步證明了這幾個氨基酸位點的重要性。 實施例5、細胞免疫熒光實驗通道電流的大小不僅與通道的各種特性相關(guān)，還與通道在膜表面表達量的多少 有關(guān)。KChIPl能夠很明顯地增加Kv4通道的電流，與它能明顯增加細胞膜表面蛋白 表達量的多少有關(guān)，細胞免疫熒光實驗旨在確認KChlP4以及其突變體在改變通道 在膜表面表達量的作用，從而實現(xiàn)其向KChIPl的轉(zhuǎn)變。1、 COS-7細胞培養(yǎng)將C0S-7細胞(ATCC)培養(yǎng)于含有10% (體積百分含量)胎牛血清的DMEM (Dulbecco，s modified Eagle's medium)培養(yǎng)基中，37。C條件下于5%的0)2孵箱中培 養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染前一天傳代至蓋玻片上。2、 細胞免疫熒光實驗 (1)重組表達載體的構(gòu)建將上述實施例3構(gòu)建的各重組表達載體KSM-KChlP4、 KSM-KChlP4-V11E-V14E-I15E、 KSM-KChlP4-F18E-L21E-F25E和KSM-KChlP4-F61E-I68E用i7w I和雙酶切，將酶切產(chǎn)物插入用相同酶切的載 體pcDNA3. 1 (Invitrogen公司)中，得到重組表達載體pcDNA3. 1-KChlP4、 pcDNA3. 1-KChlP4—V11E-V14E—115E、 pcDNA3. 1—KChlP4—F18E—L21E—F25E禾卩 pcDNA3. 1-KChlP4-F61E-I68E;以KSM-KChlP4為模板，分別以上游引物 5' -GCCGGCAAGCTTATGAGCGTGGAAGATGAGCTGGAGAT-3'和下游引物5， -GCTTAGGAATTCCTAGATCACATTTTCAAAGAGCTGCATG-3，進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物用 歷;7dll和雙酶切，將酶切產(chǎn)物插入用相同酶切的載體pcDNA3. 1 (Invitrogen 公司)中，得到刪除了 2-34個氨基酸的重組表達載體pcDNA3. l-KChIP4 del(2-34)。以實例3構(gòu)建的重組表達載體KSM-KChIPl為模板，利用上游引物 5' -GCCGGCAAGCTTATGGGTGCAGTTATGGGT-3'和下游引物5，-GCTTAGGAATTCCTACATGACATTTTGGAACAGC-3'進行PCR擴增，將該PCR產(chǎn)物酶切后 插入用相同酶切的載體pcDNA3. 1中，得到重組表達載體pcDNA3. l-KChIPl。以實例3構(gòu)建的重組表達載體KSM-Kv4. 3為模板，用上游引物 5' -ATTTAGAAGCTTGCCACCATGGCGGCCGGAGTTGC-3'和下游引物 5， -GTCAGGCTGCAGCAAGACAGAGACCTTGACAACATTGCT-3，進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物 用沿'/^III和尸W I酶切，然后將酶切產(chǎn)物插入用相同酶切的載體pEGFP-Nl (clontech 公司)中，得到重組表達載體pEGFP-Kv4. 3。 (2)細胞免疫熒光實驗將重組表達載體pEGFP-Kv4. 3分別和以下蛋白共轉(zhuǎn)染C0S-7細胞 pcDNA3. l-KChIPl和pcDNA3. 1-KChlP4，轉(zhuǎn)染24小時后，PBS洗三遍，4%多聚甲醛 固定20分鐘。PBS再洗三遍后，用含0. 2% (體積百分含量)Triton-X100的PBS處 理20分鐘。含3% (質(zhì)量百分含量)BSA (Roche)及0. 1% (體積百分含量)Triton-X100 的PBS封閉1小時后，加入山羊多克隆一抗KChIPl或KChlP4 (Santa Cruz Biotechnology), 4。C過夜，用PBS洗三遍，加入二抗即TRITC標記的驢抗羊IgG(Santa Cruz Biotechnology)，室溫處理1小時，PBS洗三遍后，用抗熒光淬滅封片劑(普 利萊)封片。3、細胞熒光圖像的獲取圖像的獲取采用aZeiss LSM 510 META激光共聚焦掃描系統(tǒng)，后期圖像處理采 用LSM圖像瀏覽器。細胞免疫熒光結(jié)果如圖5所示。KChlP4不像KChIPl —樣能明顯增加Kv4通道在膜表面的表達量，而是使大多數(shù)Kv4通道滯留在胞槳內(nèi)，但是刪除了KChlP4前 34個氨基酸(對應晶體結(jié)構(gòu)上的前兩個ct螺旋)后，能使KChlP4轉(zhuǎn)變成KChlPl， 進而增加通道在膜表面的表達量。但其他關(guān)鍵氨基酸位點的突變對于增加細胞膜表 面通道蛋白表達的作用不如直接刪除前34個氨基酸的作用明顯。結(jié)果表明刪除 KChlP4前34個氨基酸能使KChlP4轉(zhuǎn)變成KChIPl，其它關(guān)鍵氨基酸位點的突變能 使其電生理特性向KChIPl轉(zhuǎn)變，而對于增加膜表面通道蛋白的表達量的作用并不 明顯。序列表<160〉 1<210> 1 <211> 229 〈212〉 PRT<213〉小鼠(Mws扁scw/m) <400> 1Met Asn Leu Glu Gly Leu Glu Met lie Ala Val Leu lie Val lie Val 15 10 15Leu Phe Val Lys Leu Leu Glu Gin Phe Gly Leu lie Glu Ala Gly Leu 20 25 30Glu Asp Ser Val Glu Asp Glu Leu Glu Met Ala Thr Val Arg His Arg 35 40 45Pro Glu Ala Leu Glu Leu Leu Glu Ala Gin Ser Lys Phe Thr Lys Lys 50 55 60Glu Leu Gin lie Leu Tyr Arg Gly Phe Lys Asn Glu Cys Pro Ser Gly 65 70 75 8020Val Val Asn Glu Glu Thr Phe Lys Glu lie Tyr Ser Gin Phe Phe Pro 85 90 95Gin Gly Asp Ser Thr Thr Tyr Ala His Phe Leu Phe Asn Ala Phe Asp 100 105 110Thr Asp His Asn Gly Ala Val Ser Phe Glu Asp Phe lie Lys Gly Leu 115 120 125Ser lie Leu Leu Arg Gly Thr Val Gin Glu Lys Leu Asn Trp Ala Phe 130 135 140Asn Leu Tyr Asp lie Asn Lys Asp Gly Tyr lie Thr Lys Glu Glu Met 145 150 155 160Leu Asp lie Met Lys Ala lie Tyr Asp Met Met Gly Lys Cys Thr Tyr 165 170 175Pro Val Leu Lys Glu Asp Ala Pro Arg Gin His Val Glu Thr Phe Phe 180 185 190Gin Lys Met Asp Lys Asn Lys Asp Gly Val Val Thr lie Asp Glu Phe 195 200 205lie Glu Ser Cys Gin Lys Asp Glu Asn lie Met Arg Ser Met Gin Leu 210 215 220Phe Glu Asn Val lie 22權(quán)利要求
1、一種使KChIP4功能轉(zhuǎn)換成KChIP1的方法，是將KChIP4的自氨基末端第11位的纈氨酸、第14位的纈氨酸和第15位的異亮氨酸同時進行突變。
2、 一種使KChlP4功能轉(zhuǎn)換成KChIPl的方法，是將KChlP4的自氨基末端第18 位的苯丙氨酸、第21位的亮氨酸和第25位的苯丙氨酸同時進行突變。
3、 一種使KChlP4誘導的Kv4通道電流失活變快的方法，是將KChlP4的自氨 基末端第61位的苯丙氨酸和第68位的異亮氨酸同時進行突變。
4、 一種篩選改變神經(jīng)元興奮性的藥物的方法，是基于Kv4和KChlP4相互作用 的下述l) 、 2)和3)這三組中的至少一組氨基酸殘基進行藥物設計，篩選能夠減 弱或增強Kv4和KChlP4蛋白間相互作用的化學小分子或生物大分子1) KChlP4的自氨基末端第11位的纈氨酸、第14位的纈氨酸和第15位的異亮 氨酸；2) KChlP4的自氨基末端第18位的苯丙氨酸、第21位的亮氨酸和第25位的苯 丙氨酸；3) KChlP4的自氨基末端第61位的苯丙氨酸和第68位的異亮氨酸。
5、 權(quán)利要求l一4中任一所述的KChlP4，其特征在于所述KChlP4來源于人 或動物，如猴、狗、貓、兔、豚鼠、大鼠、小鼠。
全文摘要
本發(fā)明公開了KChIP4與Kv4鉀通道相互作用的結(jié)構(gòu)和功能位點的應用。通過X-射線晶體衍射手段解析KChIP4晶體的原子結(jié)構(gòu)，通過與近期解析出的Kv4-N-KChIP1復合結(jié)晶中KChIP1晶體原子結(jié)構(gòu)的比較，并結(jié)合生化、分子生物學、電生理學和生物物理學等交叉學科的研究方法，解析了KChIP4晶體的原子結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)KChIP4與Kv4相互作用并引起Kv4各項生物物理學以及細胞生物學指標發(fā)生變化的關(guān)鍵氨基酸作用位點，為基于Kv4和KChIP4相互作用的接觸界面結(jié)構(gòu)所進行的藥物設計，以改變KChIP4蛋白對Kv4的特異調(diào)節(jié)作用提供了基礎。
文檔編號C07K1/107GK101250214SQ20081010286
公開日2008年8月27日 申請日期2008年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月27日
發(fā)明者崔媛媛, 柴繼杰, 平 梁, 王克威, 王華羿, 灝 陳 申請人:北京大學;北京生命科學研究所