專利名稱：：從北青龍衣中分離的新化合物及其制備方法及應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種新的化合物，該化合物是從中藥北青龍衣中提取分離得到的新物質，具有抗腫瘤活性；本發(fā)明還涉及該化合物的制備方法；本發(fā)明還涉及該化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
：癌癥是威脅人類生命的嚴重疾病，因此，抗癌藥物的研究一直是世界關注的熱點。中藥抗腫瘤在提高免疫力和降低致突變毒性方面比之化學藥物具有獨到之處，因此，從祖國醫(yī)藥寶庫中尋找療效確切的抗腫瘤中藥，明確其藥效物質基礎，進而開發(fā)出高效低毒的新藥，成為中醫(yī)藥領域多年研究的焦點。北青龍衣為胡桃科植物核桃楸(/^7a/^Jfe77flfe力w^caMAXIM.)的未成熟果實，盛產于東北城郊各縣，在民間常用作治療各種癌癥和皮膚病以及各種疼痛的止痛藥。2001年北青龍衣被收載于黑龍江省藥材標準而成為一種中藥應用于臨床和生產。北青龍衣的粗提物制劑治療胃癌、食管癌等消化道癌癥，有二十多年治療觀察的病例證明(李中原.青龍衣治療食管賁門癌120例臨床觀察.0^"莠#:唐，1988，(3):3)，其抗腫瘤作用是無庸置疑的。然而其藥效物質基礎研究并沒有深入展開，文獻報道多停留在其粗提物的藥理作用而缺乏其有效成分的抗腫瘤作用研究上(季宇彬，馬宏圖，楊波，汲晨鋒.北青龍衣不同提取部位的抗腫瘤作用研究.^享藥，2004，35(10):1145-1147),因而導致北青龍衣這一藥用資源開發(fā)的嚴重滯后。我們在針對北青龍衣抗腫瘤有效成分的研究中，經過乙醇提取、色譜分離純化與細胞活性檢測相結合的方法，最終獲得了具有抗腫瘤活性的一個新的化合物，并采用質譜與高分辨核磁共振技術，確定了該化合物的結構。該化合物具有優(yōu)良的抗癌活性，可以與藥物賦形劑制成適合于臨床使用的抗腫瘤藥物，也可作為先導化合物，對其構效關系進行進一步研究，合成一系列的抗癌藥物和藥物組合，更可以作為北青龍衣藥材及其制劑質量控制的指標成分，實現(xiàn)北青龍衣藥材及其制劑質量的穩(wěn)定和可控，突破目前北青龍衣研究開發(fā)的瓶頸。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種具有抗腫瘤活性、從中藥北青龍衣中提取分離得到的新化合物。該化合物的制備方法以及該化合物新用途。上述的目的通過以下的技術方案實現(xiàn)從北青龍衣中分離的抗腫瘤新化合物，命名為青龍衣素A，該化合物的結構式為所述的一種北青龍衣中抗腫瘤新化合物的制備，取新鮮的北青龍衣用乙醇浸泡提取，提取液濃縮，濃縮液加水分散，離心后取上清液，上清液通過大孔吸附樹脂，將吸附樹脂用乙醇洗脫，洗脫液蒸干后用甲醇溶解，過濾后注入葡聚糖凝膠，收集甲醇洗脫液，硅膠薄層定性，合并同一組分，得該化合物，純度98%。所述的一種北青龍衣中抗腫瘤新化合物的制備，所述的取新鮮的北青龍衣用乙醇浸泡提取，提取液濃縮，是將新鮮的北青龍衣用75%乙醇浸泡一周，提取三次，合并提取液，減壓濃縮至相對密度1.10—1.14(50。C)。5所述的一種北青龍衣中抗腫瘤新化合物的制備，所述的濃縮液加水分散，離心后取上清液，上清液通過大孔吸附樹脂，將吸附樹脂用乙醇洗脫，是指濃縮液加10倍量水分散，離心，取上清液，注入到已處理好的大孔吸附樹脂中，濃縮液與樹脂的比例為1:50，流速為10ml/min,分別以3倍柱床體積的水洗、5倍柱床體積的30%乙醇洗，收集30%乙醇洗脫液，將洗脫液減壓蒸干得到殘渣，殘渣用少量甲醇溶解，過濾后注入葡聚糖凝膠，收集甲醇洗脫液，硅膠薄層定性，合并同一組分，得該化合物，純度98%。青龍衣中抗腫瘤新化合物的制備，所述的濾液注入葡聚糖凝膠，收集甲醇洗脫液，是指濾液注入葡聚糖凝膠LH-20柱上，色譜柱直徑2cm，柱長2m，上樣量為lg殘渣/每次，以甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，硅膠薄層定性，合并同一組分，得該化合物，純度98%。所述的一種北青龍衣中抗腫瘤新化合物的制備，所述收集甲醇洗脫液，硅膠薄層定性，合并同一組分，是指洗脫液在硅膠板上進行薄層層析，展開劑為氯仿-甲醇，體積份數(shù)比為84:16,合并Rf值為0.3的單一組分。所述的一種北青龍衣中抗腫瘤新化合物的制備，合并Rf值為0.3的單一組分，用甲醇重結晶得該化合物，純度為9896以上。從北青龍衣中分離的新化合物在抗腫瘤藥物中的應用。這個技術方案有以下有益效果l.本發(fā)明提供了一種未報道過的具有抗腫瘤作用的化合物，通過對癌細胞抑制試驗和藥效學試驗，證明了該化合物具有優(yōu)良的抗癌活性，可與藥物賦形劑制成適合于臨床使用的抗腫瘤藥物。2采用本實驗的篩選方法導致了從中藥北青龍衣中分離純化了該化合物，且純度達到98%以上。該化合物為從天然植物中提取分離，具有結構新穎、作用獨特的優(yōu)點，一方面可與藥物賦形劑制成適合于臨床使用的抗腫瘤藥物，另一方面也可作為先導化合物，對其構效關系進行進一步研究，合成一系列的抗癌藥物和藥物組合。3中藥及其制劑質量的穩(wěn)定和可控一直是中藥現(xiàn)代化的瓶頸，該化合物為中藥北青龍衣的有效成分之一，可以作為北青龍衣藥材及其制劑質量控制的指標，在此基礎上建立以該成分為指標的鑒別和含量測定項目的質量控制標準，實現(xiàn)北青龍衣藥材及其制劑質量的穩(wěn)定和可控，該化合物將作為中藥對照品廣泛使用。附圖1為本發(fā)明化合物的力-'HCOSY譜中觀察到的結構圖。附圖2為本發(fā)明化合物的HMBC譜中觀察到的結構圖。本發(fā)明的具體實施例方式實施例l:從北青龍衣中分離的抗腫瘤新化合物，命名為青龍衣素A，該化合物的結構式為所述的一種北青龍衣中抗腫瘤新化合物的制備，取新鮮的北青龍衣用乙醇浸泡提取，提取液濃縮，濃縮液加水分散，離心后取上清液，上清液通過大孔吸附樹脂，將吸附樹脂用乙醇洗脫，洗脫液蒸干后用甲醇溶解，過濾后注入葡聚糖凝膠，收集甲醇洗脫液，硅膠薄層定性，合并同一組分，得該化合物，純度98%。所述的一種北青龍衣中抗腫瘤新化合物的制備，所述的取新鮮的北青龍衣用乙醇浸泡提取，提取液濃縮，是將新鮮的北青龍衣用75%乙醇浸泡一周，提取三次，合并提取液，減壓濃縮至相對密度1.10-1.14(50。C)。所述的一種北青龍衣中抗腫瘤新化合物的制備，所述的濃縮液加水分散，離心后取上清液，上清液通過大孔吸附樹脂，將吸附樹脂用乙醇洗脫，是指濃縮液加10倍量水分散，離心，取上清液，注入到已處理好的大孔吸附樹脂中，濃縮液與樹脂的比例為1:50,流速為10ml/min，分別以3倍柱床體積的水洗、5倍柱床體積的30%乙醇洗，收集30%乙醇洗脫液，將洗脫液減壓蒸干得到殘渣，殘渣用少量甲醇溶解，過濾后注入葡聚糖凝膠，收集甲醇洗脫液，硅膠薄層定性，合并同一組分，得該化合物，純度98%。青龍衣中抗腫瘤新化合物的制備，所述的濾液注入葡聚糖凝膠，收集甲醇洗脫液，是指濾液注入葡聚糖凝膠LH-20柱上，色譜柱直徑2cm，柱長2m,上樣量為lg殘渣/每次，以甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，硅膠薄層定性，合并同一組分，得該化合物，純度98%。所述的一種北青龍衣中抗腫瘤新化合物的制備，所述收集甲醇洗脫液，硅膠薄層定性，合并同一組分，是指洗脫液在硅膠板上進行薄層層析，展開劑為氯仿-甲醇，體積份數(shù)比為84:16，合并Rf值為0.3的單一組分。所述的一種北青龍衣中抗腫瘤新化合物的制備，合并Rf值為0.3的單一組分，用甲醇重結晶得該化合物，純度為98%以上。從北青龍衣中分離的新化合物在抗腫瘤藥物中的應用。實施例2:化合物的制備材料來源北青龍衣為胡桃科植物核桃楸(/收7朋sife/wfe力i/w'caMAXIM.)的未成熟果實，于7月中旬采于黑龍江省五?？h，植物標本樣本收藏于黑龍江省藥品檢驗所中藥標本館。提取和分離將新鮮的北青龍衣用75%乙醇浸泡一周，共提取三次，合并提取液，減壓濃縮，濃縮至相對密度l.10-1.14(50°C)的濃縮液，濃縮液加10倍量水分散，離心，取上清液，注入已處理好的DiaionHP-20大孔吸附樹脂中(濃縮液與樹脂的比例為1:50)，流速10ml/min，分別以3倍柱床體積的水洗、5倍柱床體積的30%乙醇洗，收集30%乙醇洗脫液，洗脫液減壓蒸干得到殘渣，殘渣用少量甲醇溶解，濾過，濾液注入葡聚糖凝膠LH-20柱上(色譜柱直徑2cm,柱長2m，上樣量為lg殘渣/每次)，以甲醇洗脫，流速1.0ml/min，洗脫液在硅膠板上進行薄層層析，展開劑為氯仿-甲醇(84:16),合并Rf值為0.3的單一組分，用甲醇重結晶得該化合物，純度為98%以上?；衔锏慕Y構測定結構測定用ShimadzuUV-160分光光度計測定紫外光譜，用JASCOFT/IR-300E(KBr壓片)分光光度計測定紅外光譜，用JASC0DIP-370digitalpolarimeter測定旋光度，用IXQmassanalyzer測定ESI-MS,用JEOLMstationspectrometer測定HR-FAB-MS，!H-和13C-NMR譜用JE0LECP-500spectrometer,TMS作內標?；衔锏睦砘再|化合物為無定形粉末。IR(KBr)vnax:3414，2924,2857，2372,1618,1456，1391，1263，1116，618。UV(Me0H)hax(logs):209nm(3.52)，263nm(3.92)，344nm(4.41)。[a]D25-21。(c=0.1，Me0H)。'H-腿(500MHz,CD30D)和"C-NMR(125MHz,00300)譜數(shù)據(jù)見表l。ESI-MS(positive)邊/么379.1[M+Na];HR-FAB-MS(positive)379.1002[M+Na](計算值d9H,ANa379.1005)?；衔锏牧?NMR譜中顯示有五個芳香質子，在S6.67(lH,dd，8.2，1.1)，S7.42(1H，dd，/=8.2，7.8)，S7.29(1H，dd，/=7.8，1.l)為一套ABC偶合系統(tǒng)，S6.53(1H,s)，57.06(1H，s)為一套對位氫取代的芳香系統(tǒng)，在高場區(qū)S2.50(1H，dd，/=12.4，4.2)，S2.57(1H，dd，/=12.4，1.8)為一個亞甲基和一個次甲基在S3.15(1H，d，/=4.2，1.8)鄰位偶合，其余三個質子分別在S3.31(1H，m)和S2.68(2H，m)鄰位偶合，這些在'H」HCOSY譜中得到確證(見附圖l)。"C-NMR譜結合HMQC譜可知S208.7為羰基碳，在S48.9和S36.7分別為一個亞甲基和一個次甲基，S70.9為連有羥基的叔碳。HMBC譜中S2.50(H-3)，S2.57(H-3)的亞甲基與S208.7(C-l)羰基相關，S3.15(H-2)的次甲基與570.9(C-4)相關，可以推斷分子中含有四氫萘酮結構。HMBC譜中S6.67(H-5)與S70.9(C-4)相關也證明了這一點，且表明四氫萘酮中的苯環(huán)為ABC偶合系統(tǒng)。另外一套芳香系統(tǒng)是連接在S70.9(C-4)上，這在HMBC譜中可以觀察到S7.06(H-5')與S70.9(C-4)的相關峰。在HMBC譜中S3.31(H-7，)與5116.1(C-2，)相關，S6,53(H-2，)與織3(C-7，)相關，表明S40.3(C-7')和S45.6(C-8')連接在另一個苯環(huán)上。其中52.68(H-8，)和48.9(C-2)遠程相關，S3.31(H-7，)柳208.7(C-l)遠程相關，表明C-7'連接在C-2上，這可以通過S3.31(H-7')與S36.7(C-3)，S2.50(H—3)，S2.57(H-3)與S40.3(C-7，)的遠程相關得到確證。從苯環(huán)上的取代基看，四氫萘酮上有兩個羥基，分別位于C-4和C-8，另一個苯環(huán)上有兩個鄰位羥基，分子式中尚有兩個氧原子，結合"C-NMR譜(5176.9)數(shù)據(jù)，表明有一個羧基存在，它只能連接在C-8'上。因此，化合物的力-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)排布如表l。從HMBC譜(附圖2)中，該化合物的結構得到了確證。表1化合物的^-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)No.SHSc120823.15dd(4.2，1.8)48,32.50dd(12.4，4.2)362.57dd(12.4，1.8)47056.67dd(8.2,1.1)11667.42dd(8.2，7.8)13877.29dd(7.8，1.1)1148163,911510155,1'128,2'6.53s1163'146.4'145.5'7.06s113.6'135.7'3.31m40.8'2.68(2H，m)45.9'176.實施例3:一種上述化合物在抗癌領域的應用。抑制人HL-60白血病細胞，人Kato-III胃癌細胞和人A柳肺癌細胞的活性實驗細胞培養(yǎng)人HL-60白血病細胞，人Kato-ni胃癌細胞和人&49肺癌細胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基，補加10%FBS、L-glutamine、100U/ml青霉素以及100網/ml鏈霉素。取對數(shù)生長期的細胞計數(shù)，以3xl04個/ml的濃度接種于96孔板，每孔180^1，在37。C、5%0)2的孵箱中培養(yǎng)24小時。細胞毒測定不同濃度(1-100jiM)的藥物以EtOH-H20(l:9)為溶劑溶解至20nl，空白組加入20nl的EtOH-H20(l:9)溶液，細胞繼續(xù)培養(yǎng)72小時，然后采用MTT法進行測定，即培養(yǎng)后的細胞，加入l(HilMTT(5mg/ml)磷酸鹽緩沖液，37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時，離心，取上清液150pi棄去，加入175filDMSO,振搖10分鐘后，用酶標儀在550nm測定吸光值。根據(jù)下面的公式計算，繪圖得IC5。。抑制率(％)=(對照孔A值-空白孔A值)-(試驗孔A值-空白孔A值)X100%對照孔A值-空白孔A值對照孔僅加細胞不加藥物空白孔僅加溶劑不加細胞和藥物實驗孔加細胞再加藥物試驗結果見表2。結果表明，化合物對三種腫瘤細胞均有不同程度的抑制作用。表2.化合物抑制三種腫瘤細胞的IC5oOiM)值樣品HL-60KATOIIIA549CDDP化合物0.3±0.0618.0±8.43.3±0.8112.8±9.32.7±0.7132.5±16.4注每個數(shù)值為三次獨立實驗的平均值i標準偏差藥效學試驗試驗動物昆明種小鼠，體重18g-22g,雌雄兼用。藥物與試劑注射用生理鹽水(空白對照)，環(huán)磷酰胺(陽性對照)，化合物。瘤株:小鼠肝癌H22。試驗方法1、對小鼠瘤重及免疫器官指數(shù)的影響:小鼠隨機分組，雌雄各半。分別為化合物組，環(huán)磷酰胺組，生理鹽水組。各組小鼠于右前腋皮下常規(guī)接種H22瘤細胞懸液0.2ml(約lX106-2X106個細胞)，接種后各組ip給藥，連續(xù)7d。末次給藥后處死小鼠，稱體重，稱瘤塊、胸腺及脾臟質量，計算抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。2、對H22小鼠生命延長率的影響小鼠腹腔接種H22瘤細胞懸液0.2ml，每天觀察并記錄小鼠死亡情況。結果見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注與生理鹽水組比較，*P〈0.05;與環(huán)磷酰胺組比較，一〈0.05。本發(fā)明提供的化合物對H22生長有明顯的抑制作用，并可明顯延長小鼠生存時間，具有良好的抗腫瘤作用。權利要求1.一種從北青龍衣中分離的抗腫瘤新化合物，命名為青龍衣素A，其特征是該化合物的結構式為2.—種權利要求1所述的一種北青龍衣中抗腫瘤新化合物的制備，其特征是取新鮮的北青龍衣用乙醇浸泡提取，提取液濃縮,濃縮液加水分散，離心后取上清液，上清液通過大孔吸附樹脂，將吸附樹脂用乙醇洗脫，洗脫液蒸干后用甲醇溶解，過濾后注入葡聚糖凝膠，收集甲醇洗脫液，硅膠薄層定性，合并同一組分，得該化合物，純度98%。3.根據(jù)權利要求2所述的一種北青龍衣中抗腫瘤新化合物的制備，其特征是所述的取新鮮的北青龍衣用乙醇浸泡提取，提取液濃縮，是將新鮮的北青龍衣用75%乙醇浸泡一周，提取三次，合并提取液，減壓濃縮至相對密度1.10-1.14(50°C)。4.根據(jù)權利要求2或3所述的一種北青龍衣中抗腫瘤新化合物的制備，其特征是所述的濃縮液加水分散，離心后取上清液，上清液通過大孔吸附樹脂，將吸附樹脂用乙醇洗脫，是指濃縮液加io倍量水分散，離心，取上清液，注入到已處理好的大孔吸附樹脂中，濃縮液與樹脂的比例為l:50，流速為10ml/min，分別以3倍柱床體積的水洗、5倍柱床體積的30%乙醇洗，收集30%乙醇洗脫液，將洗脫液減壓蒸干得到殘渣，殘渣用少量甲醇溶解，過濾后注入葡聚糖凝膠，收集甲醇洗脫液，硅膠薄層定性，合并同一組分，得該化合物，純度98%。5.根據(jù)權利要求4所述的一種北青龍衣中抗腫瘤新化合物的制備，其特征是所述的濾液注入葡聚糖凝膠，收集甲醇洗脫液，是指濾液注入葡聚糖凝膠LH-20柱上，色譜柱直徑2cm，柱長2m，上樣量為lg殘渣/每次，以甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，硅膠薄層定性，合并同一組分，得該化合物，純度98%。6.根據(jù)權利要求5所述的一種北青龍衣中抗腫瘤新化合物的制備，其特征是所述收集甲醇洗脫液，硅膠薄層定性，合并同一組分，是指洗脫液在硅膠板上進行薄層層析，展開劑為氯仿-甲醇，體積份數(shù)比為84:16，合并Rf值為0.3的單一組分。7.根據(jù)權利要求2或3或4或5或6所述的一種北青龍衣中抗腫瘤新化合物的制備，其特征是合并Rf值為0.3的單一組分，用甲醇重結晶得該化合物，純度為98%以上。8.—種從北青龍衣中分離的新化合物在抗腫瘤藥物中的應用。全文摘要從北青龍衣中分離的新化合物及其制備方法及應用。采用乙醇提取、色譜分離純化與細胞活性檢測相結合的方法，從北青龍衣中分離了一種從未報道過的抗腫瘤作用新化合物，并采用質譜與高分辨核磁共振技術確定了該化合物的結構。所述的新化合物的結構式為右式(Ⅰ)，本發(fā)明應用于醫(yī)學領域。文檔編號C07C62/38GK101468950SQ20071014496公開日2009年7月1日申請日期2007年12月28日優(yōu)先權日2007年12月28日發(fā)明者劉麗娟,巍李申請人:黑龍江大學