專利名稱：一種從木豆枝葉提取物中分離純化木豆素和球松素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從植物中分離純化功能性成分的一種方法，具體是從木豆枝葉乙 醇提取物中分離純化木豆素和球松素。
背景技術(shù)：
木豆[Oy'amw(L.) Mmsp.]為豆科木豆屬一年生或多年生木本植物、常 綠灌木。又名鴿子豆、樹黃豆等，是一種民間用藥。有清涼、消熱、解毒、止痛 止血、抑菌消炎等功效，民間用于治療外傷、燒傷、感染、褥瘡和抗菌消炎等(劉 中秋等，1998;孫紹美等，1995)。此外，木豆提取物制劑在印度、巴西、古巴、 墨西哥、南非等國用于治療感冒、支氣管炎、麻疹、痢疾、肝炎、皮膚病、燒傷、 潰瘍、腫瘤等疾病(Abbiw DK., 19卯；Duke JA. et al， 1994; Milliken W., 1997; GroverJK.，2002),療效顯著。我國臨床組方用于治療股骨頭壞死以及循環(huán)系統(tǒng) 疾病(袁浩等，2004)。
現(xiàn)在已知的木豆中活性成分包括芹菜素、木犀草素、牡荊苷、異牡荊苷、木 豆素、木豆素A、木豆素C、球松素、水楊酸、j3-谷甾醇、柚皮素-4'、 7-二甲醚、 三i烷、二i""一烷、Cajanol和一些揮發(fā)油類成分(林勵等，1999; Christopher JC. etal,服;程誌青等，1992)。
木豆中的木豆素和球松素含量較高并且活性突出。木豆素與另外兩種芪類化 合物組方可以抑制骨丟失，維持骨小梁結(jié)構(gòu)完整；木豆素的類雌激素作用具有良 好的藥用開發(fā)前景(陳迪華，孫蘭等，2007)。而球松素是一種具有較強(qiáng)活性的 天然黃酮類成分(劉香等，2006)，具有抗菌(Bhamarapravati et al, 2006)、抗 芳香、抗增殖等活性(Jean-Christophe Le Bail, 2000)，近年來的藥理研究發(fā)現(xiàn) 其對抗?jié)儭⒖寡?、止痛、胥排空?胃脹)等方面具有明顯的生理活性(潘永峰 等，2005)。盡管從天然植物中獲得的木豆素和球松素的活性突出，但是到目前 為止關(guān)于其生產(chǎn)過程的報道很少，只有中國專利(CN1666745A)"—種用于治療 骨質(zhì)疏松癥的藥物組合物"中涉及到木豆素和球松素提取純化方法，但提純采用 傳統(tǒng)的技術(shù)手段,.經(jīng)a:多次硅膠柱層析，過程漫長、目標(biāo)化合物易損失，而且毒 性較大的有機(jī)溶劑使用量大，不利于健康生產(chǎn)。此外，涉及到球松素的分離純化 均為傳統(tǒng)的方法(周立東，1999;劉雯霞，2006)。
綜上所述，在利用植物提取物分離純化木豆素和球松素的過程中，主要的影 響因素在于分離過程中普遍存在耗時長，目的化合物流失大，使得成本升高。因 此，有必要尋找一種簡便安全經(jīng)濟(jì)高效地分離純化木豆素和球松素的方法。本發(fā) 明旨在建立一種通過多種現(xiàn)代分離純化技術(shù)手段相結(jié)合的方法，實(shí)現(xiàn)簡單快速、 損失少的分離純化得到木豆素和球松素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種以木豆枝葉的乙醇提取物為原料，通過超聲波振 蕩絮凝技術(shù)、負(fù)壓空化混懸液固萃取技術(shù)、大孔吸附樹脂富集技術(shù)、正相硅膠中 壓柱層析分離技術(shù)及低溫析晶和重結(jié)晶技術(shù)大量、快速獲得木豆素和球松素單 體，該方法簡單易行、目標(biāo)化合物損失少。本發(fā)明的目的是通過以下方案來達(dá)到 的
木豆枝葉70 95%乙醇提取物中加入50 60 。C溫水超聲波振蕩、靜止絮凝， 所得到粘稠絮凝物經(jīng)負(fù)壓空化混懸液固萃取、大孔樹脂法富集和一次正相硅膠中 壓柱層析后分別得到木豆素和球松素的產(chǎn)品，純度大于80%，經(jīng)過低溫析晶和重 結(jié)晶得到純度大于95%的純品。
上述的木豆素和球松素提取純化方法，其特征在于，取一定量的木豆枝葉乙 醇提取物，加入3 5倍體積的50 60 'C溫水，于超聲波振蕩提取器中30 60 KHz條件下振蕩絮凝15 25min,靜止10 15min，得到粘稠絮凝物，以0.04 0.06 MPa負(fù)壓為動力用乙酸乙酯進(jìn)行負(fù)壓空化混懸液固萃取，萃取所用的溶劑 體積為提取物質(zhì)量的0.5 2% (L: g)，萃取次數(shù)為3 5次，所用溶劑除乙酸乙 酯外還包括三氯甲烷、二氯甲垸，濃縮萃取液至干，得到的固形物以20-40%乙 醇混懸，配置成料液濃度為2 4mg/mL混懸藥液，同時將大孔吸附樹脂采用濕 法裝柱，保留液面，將混懸的藥液通過吸附柱，上樣量0.5 1BV，以流速為每 小時6 8 mL/g樹脂、PH= 4條件下過吸附柱。吸附后用30-40%乙醇2 BV洗雜 質(zhì)，然后用75-85。/。乙醇6 8BV解吸。收集解析液，濃縮至干得到固形物。預(yù) 先稱取質(zhì)量為提取物質(zhì)量的2.5 3倍的硅膠，采用濕法裝柱，所用溶劑除石油 醚外，還包括乙醚、正己烷。將所得固形物用少量有機(jī)溶劑溶解，加入與提取物 等質(zhì)量的層析硅膠拌勻、減壓旋干，裝入正相硅膠中壓柱。先后以10-20 BV石 油醚(60-90 。C)、石油醚三氯甲垸(10: 1)、三氯甲烷連續(xù)中壓洗脫，收集洗
脫液，每份1/40 1/20BV。 TLC監(jiān)測收集流分，合并相同部分，展開劑為石油 醚三氯甲垸=5: 1 0: 1，紫外波長為254 nm和360 nm。依次得到球松素和 木豆素溶液，低溫析晶得到產(chǎn)品，重結(jié)晶后得到純品。
上述的木豆中木豆素和球松素的提取純化方法所用的大孔吸附樹脂為 D10K NKA-9、 NKA-2、 H103型等。
上述的木豆中木豆素和球松素的提取純化方法所用硅膠為300 800目。中 壓硅膠柱流動相包括(石油醚、乙醚、正己烷)-(二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸 乙酯、丙酮、甲醇)的不同比例梯度。
重結(jié)晶所用的溶劑為石油醚、乙醚、正己烷、二氯甲烷、三氯甲垸、丙酮、 乙腈和甲醇，重結(jié)晶所用溶劑比例為石油醚(或乙醚、正己烷)三氯甲烷(或 二氯甲烷、丙酮、乙腈、甲醇)=50: 1 1: 1。低溫析晶溫度為-10。C 25。C。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
1. 該方法簡單易行，周期短，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
2. 產(chǎn)品得率高、純度高。


圖1為木豆素的結(jié)構(gòu) 圖2為球松素的結(jié)構(gòu)
具體實(shí)施方案
實(shí)施例1
稱取木豆干枝葉的乙醇提取物300g，加入60'C溫水(1.5 L)中，于超聲波 提取器中30-60 KHz條件下振蕩絮凝20 min，靜止15 min，取粘稠絮凝物，以 0.05 MPa負(fù)壓為動力用4.5 L乙酸乙酯進(jìn)行負(fù)壓空化混懸液固萃取，濃縮萃取液， 以30。/。乙醇配置成料液濃度為4mg/mL混懸藥液，上樣量0.8BV，流速為每小 時8mL/g樹脂、PH-4條件下過NKA-9型大孔過吸附樹脂柱。吸附后用30%乙 醇2BV洗雜質(zhì)，然后用85%乙醇8 BV解吸。收集解吸液，濃縮至干后用少量 甲醇溶解，加入300g目數(shù)為500-800的層析硅膠拌勻、4(TC減壓蒸干。預(yù)先稱 取提取物質(zhì)量2.5 3倍的500-800目硅膠，采用石油醚濕法裝柱，將拌好樣品的 硅膠裝入中壓柱內(nèi)，先后以15BV石油醚(60-90。C)、石油醚三氯甲垸(10: 1)、 三氯甲烷連續(xù)中壓洗脫，TLC監(jiān)測收集流分，濃縮依次得到球松素和木豆素， 低溫析晶得到產(chǎn)品，重結(jié)晶后得到化合物l為球松素，33.82mg，純度為95%、 化合物2為木豆素，31.36 mg，純度為96%。
實(shí)施例2
稱取木豆新鮮枝葉的乙醇提取物300 g，加入55。C溫水(2L)中，于超聲 波提振蕩取器中30 60 KHz條件下振蕩絮凝20 min，靜止15 min,取粘稠絮凝 物，以0.06 MPa負(fù)壓為動力用三氯甲垸進(jìn)行負(fù)壓空化混懸液固萃取，濃縮萃取 液，以30。/。乙醇配置成料液濃度為2mg/mL混懸藥液，上樣量0.6 BV,流速為 每小時8 mL/g樹脂、PH-4條件下過NKA-2型大孔過吸附樹脂柱。吸附后用30% 的乙醇洗雜質(zhì)，之后用85。/o乙醇7BV解吸，收集解吸液，濃縮至干后用少量甲 醇溶解，加入300g目數(shù)為300-400層析硅膠拌勻、4(TC減壓蒸干。預(yù)先稱取提 取物質(zhì)量2.5 3倍的300-400目硅膠，采用石油醚濕法裝柱，將拌好樣品的硅膠 裝入中壓柱內(nèi)，先后以13 BV石油醚(60-90 。C)、石油醚三氯甲垸(10: 1)、 三氯甲垸連續(xù)中壓洗脫，TLC監(jiān)測收集流分，濃縮依次得到球松素和木豆素， 低溫析晶得到產(chǎn)品，重結(jié)晶后得到化合物1為球松素，30.18mg,純度為95%; 化合物2為木豆素，28.63 mg，純度為95%。
權(quán)利要求
1.一種從木豆枝葉提取物中分離純化木豆素和球松素的方法，其主要特征在于木豆枝葉的乙醇提取物加入60℃溫水超聲波振蕩絮凝，靜止，所得到絮凝物經(jīng)乙酸乙酯負(fù)壓空化混懸液固萃取、大孔吸附樹脂法富集和一次正相硅膠中壓柱層析后分別得到木豆素和球松素的制品，經(jīng)過低溫析晶和重結(jié)晶得到純度大于95％的純品。
2. 按照權(quán)利要求1所述的木豆枝葉乙醇提取物，其特征在于木豆枝葉主要來源于各品種木豆植株的新鮮或干燥枝葉，提取方法包括超聲波輔助提取、熱回流提取、超臨界C02提取、微波輔助提取等，所用溶劑為70-95%乙醇。
3. 按照權(quán)利要求1所述的超聲波振蕩絮凝技術(shù)，其特征在于木豆枝葉乙醇提 取物中加入50 60 'C溫水的體積為提取物質(zhì)量的3 5倍，超聲波振蕩絮凝 時間為15 25min，頻率為30 60 KHz，靜止時間為10 15 min。超聲波的 震蕩作用使得粘稠絮凝物中包含的極性較大的雜質(zhì)逐漸溶出。
4. 按照權(quán)利要求1所述的負(fù)壓空化混懸液固萃取技術(shù)，其特征在于對粘稠絮 凝物進(jìn)行負(fù)壓空化混懸液固萃取，所用溶劑除乙酸乙酯外還包括三氯甲烷、 二氯甲垸，萃取所用的溶劑體積為提取物質(zhì)量的0.5 2% (L: g)，萃取次數(shù) 為3 5次，所用壓力為0.04 0.06MPa。有機(jī)相回收溶劑后所得固形物為目 標(biāo)物。該方法是以負(fù)壓為動力.，利用氣泡產(chǎn)生的空化效應(yīng)、湍流效應(yīng)的一種 強(qiáng)化液固萃取工藝。
5. 按照權(quán)利要求1所述的大孔樹脂富集技術(shù)，其特征在于所用樹脂包括DIOI、 NKA-9、 NKA-2、 H103等廣譜性大孔吸附樹脂，該方法中大孔樹脂吸附步驟 采用濕法裝柱，保留液面，將負(fù)壓空化混懸液固萃取所得到的固形物部分用 20 40%乙醇溶液配制成料液濃度為2 4mg/mL混懸藥液，同時將大孔吸附 樹脂采用濕法裝柱，保留液面，將混懸的藥液通過吸附柱，上樣量為0.5 1 BV，以流速為每小時6 8 mL/g樹脂、PH=4條件下過吸附柱。吸附后用30 40"/。乙醇2BV洗雜質(zhì)，然后用75 85Q/。乙醇6 8BV解吸。收集解吸液，濃 縮至干，所得固形物為目標(biāo)物。
6. 按照權(quán)利要求1所述的正相硅膠中壓柱層析技術(shù)，其特征在于所用樣品為樹脂富集后所得固形物，所用硅膠為300 800目。預(yù)先稱取質(zhì)量為樣品量的 2.5 3倍的硅膠，采用濕法裝柱，所用溶劑除石油醚外，還包括乙醚、IK己 烷。將樣品用少量有機(jī)溶劑溶解，加入與浸膏等質(zhì)量的層析硅膠拌勻、減壓 旋干，裝入預(yù)先裝好的硅膠柱中。先后以10 20BV石油醚(60-卯。C)、石油 醚三氯甲垸(10: 1)、三氯甲烷連續(xù)中壓洗脫，收集洗脫液，每份1/40 1/20BV。用硅膠薄層層析檢測洗脫液成分，合并相同部分，展開劑為石油醚 三氯甲烷-O: 1 5: 1，紫外波長為254 nm和360 nm。中壓硅膠柱流動相包 括(石油醚、乙醚、正己垸)-(二氯甲垸、三氯甲垸、乙酸乙酯、丙酮、甲 醇)的不同比例梯度。
7.按照權(quán)利要求1所述所述的低溫析晶和重結(jié)晶技術(shù)，其特征在于重結(jié)晶所 用的溶劑為石油醚、乙醚、正己垸、二氯甲垸、三氯甲烷、丙酮、乙腈和甲 醇，重結(jié)晶所用溶劑比例為石油醚(或乙醚、正己烷)三氯甲烷(或二氯甲烷、丙酮、乙腈、甲醇)=50: 1 h 1，低溫析晶溫度為-l(TC 25。C。
全文摘要
本發(fā)明涉及中草藥功能性成分木豆素和球松素的分離純化方法，目的是要提供一種簡便安全經(jīng)濟(jì)有效的從木豆枝葉提取物中分離純化得到單體化合物木豆素和球松素的方法，所采取的技術(shù)方案是以木豆枝葉的乙醇提取物為原料，采用超聲波振蕩絮凝技術(shù)、負(fù)壓空化混懸液固萃取技術(shù)、大孔吸附樹脂富集技術(shù)、正相硅膠中壓柱層析分離技術(shù)及低溫析晶和重結(jié)晶技術(shù)等得到精制的木豆素和球松素，純度達(dá)95％以上。本發(fā)明中對提取物經(jīng)簡單除雜再純化，方法簡單、易行，目標(biāo)化合物的損失少，產(chǎn)品得率和純度都很高。適用于工業(yè)應(yīng)用，對產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。
文檔編號C07C65/00GK101172948SQ20071014453
公開日2008年5月7日 申請日期2007年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月1日
發(fā)明者付玉杰, 佟美鴻, 威 劉, 霞 劉, 羽 孔, 琳 張, 李慶勇, 祖元剛, 猛 羅, 陳麗艷 申請人:東北林業(yè)大學(xué);付玉杰