專利名稱：：用于減緩生理疲勞的牛樟芝環(huán)己烯酮化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是關(guān)于一種用于抗疲勞的化合物，尤其是關(guān)于一種由牛樟芝(^2加W/acamp/wrato)萃取物分離純化制得、用于減緩生理疲勞的環(huán)己烯酮化合物。技術(shù)背景牛樟芝(」Wra&acam;^orato)，又稱樟芝、牛樟菇或紅樟芝等，屬于非褶菌目(Aphyllophorales)多孔菌科(Polyporaceae)的多年生蕈菌類，為臺灣特有種真菌，僅生長于臺灣保育類樹種-牛樟樹(C/朋amm/mAzweWra/Hay)的中空腐朽心材內(nèi)壁上。由于牛樟樹分布數(shù)量極為稀少，加上人為的盜伐，使得寄生于其中方能生長的野生牛樟芝數(shù)量更形稀少，且由于其子實體生長相當(dāng)緩慢，生長期亦僅在六月至十月之間，因此價格非常昂貴。牛樟芝的子實體多年生，無柄，呈木栓質(zhì)至木質(zhì)，其具強烈的樟樹香氣，且形態(tài)多變化，有板狀、鐘狀、馬蹄狀或塔狀。初生時為扁平型并呈鮮紅色，之后其周邊會呈現(xiàn)放射反巻狀，并向四周擴展生長，顏色亦轉(zhuǎn)變?yōu)榈t褐色或淡黃褐色，并有許多細孔，且為牛樟芝的藥用價值最豐富的部位。在臺灣民俗醫(yī)學(xué)上，牛樟芝具有解毒、減輕腹瀉癥狀、消炎、治療肝臟相關(guān)疾病及抗癌等功用。牛樟芝如同一般食藥用蕈菇類，具有許多復(fù)雜的成分，已知的生理活性成分中，包括三碎類化合物(triterpenoids)、多糖體(polysaccharides,如卩-D-葡聚糖)、腺苷(adenosine)、維生素(如維生素B、煙堿酸)、蛋白質(zhì)(含免疫球蛋白)、超氧歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、微量元素(如鈣、磷、鍺)、核酸、固醇類以及血壓穩(wěn)定物質(zhì)(如antodiaacid)等，這些生理活性成分被認(rèn)為具有抗胂瘤、增加免疫能力、抗過敏、抗病菌、抗高血壓、降血糖、降膽固醇、保護肝臟及抗疲勞等多種功效。牛樟芝眾多成分中以三萜類化合物被研究的最多，三萜類化合物是由三十個碳元素結(jié)合成六角形或五角形天然化合物的總稱，牛樟芝所具的苦味即主要來自三碎類此成分。1995年時，Chemg等人發(fā)現(xiàn)牛樟芝子實體萃取物中含有三種新的以麥角甾烷(ergostane)為骨架的三辟類化合物antcinA、antcinB與antcinC(Cherng，I.H.，andChiang,H.C.1995.ThreenewtriterpenoidsfromAntrodiacinnamomea.J.NatProd.58:365-371)。Chen等人以乙醇萃取樟芝子實體后發(fā)現(xiàn)zhankuicacidA、zhankuicacidB及zhankuicacidC等三種三萜類化合物(Chen,C.H.，andYang,S.W.1995.NewsteroidacidsfromAntrodiacinnamomea,-afUngusparasiticonCinnamomummicranthum.J.NatProd.58:1655-1661)。此外，Chiang等人于1995年也由子實體萃取物中發(fā)現(xiàn)另外三種分別為倍半碎內(nèi)酉旨(sesquiterpenelactone)與兩種雙酚類布亍生物的新三萜類化合物，此即antrocin,4,7-二甲氧基-5-曱基-1，3-苯并二氧環(huán)(4，7-dimethoxy-5-methy-l，3-benzodioxole)與2，2'，5，5'-四曱氧基國3,4，3,，4,-雙陽亞曱二氧基-6，6'-二曱基聯(lián)苯(2,2'，5，5'-temmethoxy-3，4，3'，4'國bi-methylenedioxy-6，6'-dimethylbiphenyl)(Chiang,H.C.,"Wu，D.P.,Cherng，I.andUeng,C.H.1995.Asesquiterpenelactone,phenylandbiphenylcompoundsfromAntrodiacinnamomea.Phytochemistiy.39:613-616)。到了1996年，Chemg等人以同樣分析方法再度發(fā)現(xiàn)四種新的三萜類化合物antcinE、antcinF、methylantcinateG、methylantcinateH(Cherng，I.H.，Wu，D.R，andChiang,H.C.1996.TriteroenoidsfromAntrodiacinnamomea.Phytochemistiy.41:263-267);而Yang等人則發(fā)現(xiàn)了二種以麥角甾烷為骨架的新化合物zhankuicacidD、zhankuicacidE,和三種以羊毛甾烷(lanostane)為骨架的新化合物15a-乙酰-去氫硫色多孔菌酸(15a畫acetyl-dehydrosulphurenicacid)、去氫齒孔酸(dehydroeburicoicacid)與去水硫色多孑L菌酸(dehydrasulphurenicacid)(Yang,S.W"Shen，Y.C.,andChen，C.H.1996.SteroidsandtriterpenoidsofAntrodiacinnamomea-afUngusparasiticonCinnamomummicranthum.Phytochemistiy.41:1389-1392)。雖然由目前諸多的實驗可得知牛樟芝萃取物具有前述功效，且其所含成分亦陸續(xù)被分析出，但究竟為萃取物中的何種有效成分可促成牛樟芝的該些功效，并沒有具體相關(guān)有效成分發(fā)表，其中牛樟芝萃取物所含可抗疲勞的成分，也有待進一步實-險研究來弄清，所以如果能找出該萃取物中所含真正有效抗疲勞的成分，將有利于研究牛樟芝抗疲勞的相關(guān)機制，并對牛樟芝應(yīng)用于人體減緩生理疲勞產(chǎn)生莫大的幫助。
發(fā)明內(nèi)容為明了牛樟芝萃取物中究竟哪種成分具有抗疲勞的效果，本發(fā)明由牛樟芝萃取物中分離純化出具式(l)結(jié)構(gòu)式的化合物；其中，X為氧()或硫(S)，Y為氧或硫；&為氫(H)、甲基(CH3)或(CH2)m-CH3，R2為氫、甲基或(CH2)m-CH3，113為氫、甲基或(CH2)m-CH3，m=l-12;n=l-12。如式(l)結(jié)構(gòu)式的化合物中，優(yōu)選如下式(2)所示的化合物式(2)的化合物，化學(xué)名為4-羥基-2,3-二甲氧基-6-曱基-5(3，7,11-三甲基-2，6，10-十二碳三埽)-2-環(huán)己晞酮(4-hydroxy-2，3-dimethoxy-6-methy-5(3,7,1l-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl)-cyclohex-2-enone),分子式為C24H3804,外觀為淡黃色敘\末狀，分子量為390。本發(fā)明中式(l)、式(2)的環(huán)己烯酮化合物分離純化自牛樟芝的水萃取物或有機溶劑萃取物，有機溶劑可包括醇類(例如甲醇、乙醇或丙醇)、酯類(例如乙酸乙酯)、烷類(例如己烷)或卣代烷(例如氯曱烷、氯乙烷)，但并不以此為限，其中較佳者為醇類，更佳者為乙醇。通過前述式(l)、式(2)的環(huán)己烯酮化合物，本發(fā)明將所述化合物應(yīng)用于減緩生理疲勞上，在80%最大攝氧量(80%V02max)的高強度衰竭運動后，立即補充牛樟芝環(huán)己烯酮化合物有助于體內(nèi)肌酸激酶(creatinephosphatekinase;CPK)與血氨(Ammonia)的代謝及其濃度的恢復(fù)，減緩因運動所致的肌肉細胞損傷，并改善因血液中血氨堆積引起的中樞疲勞及外圍疲勞現(xiàn)象，進而達到抗疲勞的功效。以下將配合附圖進一步說明本發(fā)明的實施方式，下述所列舉的實施例用以闡明本發(fā)明，并非用以限定本發(fā)明的范圍，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可做些許更動與潤飾，因此本發(fā)明的保護范圍當(dāng)視后附的權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。圖1為本發(fā)明實施例受試者進行衰竭運動或無運動后，分別補充安慰劑或牛樟芝環(huán)己烯酮化合物，于各時間點的體內(nèi)肌酸激酶濃度結(jié)果；圖中口無運動并給予安慰劑(PR);圏有運動并給予安慰劑(PE);△:無運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DR);▲:有運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DE);圖2為本發(fā)明實施例受試者進行衰竭運動或無運動后，分別補充安慰劑或牛樟芝環(huán)己烯酮化合物，在各時間點的體內(nèi)血糖濃度結(jié)果；圖中口無運動并給予安慰劑(PR);團有運動并給予安慰劑(PE);△:無運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DR);▲:有運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DE);圖3為本發(fā)明實施例受試者進行衰竭運動或無運動后，分別補充安慰劑或牛樟芝環(huán)己烯酮化合物，在各時間點的體內(nèi)血氨濃度結(jié)果；圖中口無運動并給予安慰劑(PR);園有運動并給予安慰劑(PE);△:無運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DR);▲:有運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DE);圖4為本發(fā)明實施例受試者進行衰竭運動或無運動后，分別補充安慰劑或牛樟芝環(huán)己烯酮化合物，在各時間點的體內(nèi)血乳酸濃度結(jié)果；圖中口無運動并給予安慰劑(PR);園有運動并給予安慰劑(PE);△:無運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DR);▲:有運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DE);圖5為本發(fā)明實施例受試者進行衰竭運動或無運動后，分別補充安慰劑或牛樟芝環(huán)己烯酮化合物，于各時間點的體內(nèi)游離脂肪酸濃度結(jié)果；圖中口無運動并給予安慰劑(PR);麗有運動并給予安慰劑(PE);△:無運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DR);▲:有運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DE);具體實施方式首先取牛樟芝(Antrodiacamphorata)菌絲體、子實體或二者的混合物，利用公知萃取方式，以水或有機溶劑進行萃取，借以取得牛樟芝水萃取物或有機溶劑萃取物。其中，有機溶劑可包括醇類(例如曱醇、乙醇或丙醇)、酯類(例如乙酸乙酯)、烷類(例如己烷)或卣代烷(例如氯甲烷、氯乙烷)，但并不以此為限。其中較佳者為醇類，更佳者為乙醇。經(jīng)萃取過后的牛樟芝水萃取物或有機溶劑萃取物，可進一步通過高效液相層析加以分離純化，之后再對每一分液(fraction)進行與抗疲勞相關(guān)的生化測試。最后，則針對具抗疲勞效果的分液進行成分分析，將可能產(chǎn)生抗疲勞效果的成分再分別進一步做與抗疲勞相關(guān)的生化測試。最終即發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中如式(1)/式(2)的化合物具有減緩生理疲勞的功效。為方便說明本發(fā)明，以下將以式(2)的4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5(3，7,11-三甲基-2，6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮化合物進行說明。此外，為證實4-羥基-2,3-二甲氧基-6-曱基-5(3,7,11-三甲基-2，6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮化合物具抗疲勞效果，本發(fā)明中通過檢測經(jīng)80%最大攝氧量(80%V02max)衰竭運動后的受試者體內(nèi)的肌酸激酶、血乳酸、血糖、血氨及游離脂肪酸等疲勞指標(biāo)，以測得牛樟芝環(huán)己烯酮化合物的抗疲勞能力。由該些生化測試結(jié)果證實4-羥基-2,3-二甲氧基-6-曱基-5(3,7，11-三曱基-2,6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮化合物具減緩運動后所致生理疲勞的功效。茲對前述實施方式詳盡說明如下實施例1:4-羥基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7,11-三甲基-2,6,10沖二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮的分離將100克左右的牛樟芝菌絲體、子實體或二者的混合物，置入三角錐形瓶中，加入適當(dāng)比例的水與醇類(例如70%以上的醇類水溶液)，于20-25。C下攪拌萃取至少l小時以上，之后以濾紙及0.45iim濾膜過濾，收集萃取液。將前述收集的牛樟芝萃取液，利用高效液相色譜儀(HighPerformanceLiquidchromatography)，以RP18的色譜柱(column)進行分析，并以曱醇(A)及0.1。/。-0.5。/。醋酸水溶液(B)作為流動相(mobilephase)(其溶液比例為0~10分鐘，B比例為95%~20%;10~20分鐘，B比例為20%~10%;20-35分鐘，B比例為10%~10%;35-40分鐘，B比例為10%~95%),在每分鐘1ml的速度下洗脫，同時以紫外-可見光全波長檢測器分析。將25分鐘至30分鐘的洗脫液收集濃縮即可得淡黃色粉末狀的固體產(chǎn)物，此即4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5(3，7，11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮。經(jīng)分析，其分子式為<:24113804，分子量390，熔點(m.p.)為48°C-52°C。核磁共振(NMR)分析值如下所示lH-NMR(CDC13)S(ppm):1.51、1.67、1.71、1.75、1.94、2.03、2.07、2.22、2.25、3.68、4.05、5.07與5.14。13C-NMR(CDC13)S(ppm):12.31、16.1、16.12、17.67、25.67、26.44、26.74、27.00、39.71、39.81、4.027、43.34、59.22、60.59、120.97、123.84、124.30、131.32、135.35、135.92、138.05、160.45與197.12。實施例2:80%最大攝氧量(80°/。V02max)運動負荷測試為測得衰竭運動后補充牛樟芝環(huán)己烯酮化合物對于抗疲勞能力的影響，本試驗利用80o/。最大攝氧量運動負荷來進行后續(xù)的衰竭運動，故需先測得最大攝氧量，以進一步推算出80%最大攝氧量的速度。其中，攝氧量是指心輸出量與動靜脈血氧濃度差的乘積，而最大攝氧量是指一個人在海平面上，從事最劇烈的運動時，組織細胞每分鐘所能消耗或利用氧的最高值，其為評價心肺耐力的最佳指標(biāo)，本發(fā)明是以實驗室內(nèi)直接測量法，利用原地跑步機，以漸增運動負荷至最大運動負荷時，用氣體分析儀直接測量出最大攝氧量，此種漸進式遞增運動負荷持續(xù)性運動，較能誘發(fā)實際的最大攝氧能力，因此其為直接準(zhǔn)確測量最大攝氧量的方法。(1)受試者基本資料收集本發(fā)明以15名年滿20歲健康自愿的男性為測試對象，篩選未服用藥物、肝腎功能正常、無心血管疾病，且平日無抽煙、喝酒、及使用營養(yǎng)增補劑習(xí)慣者，并量測記錄每位受試者的基本數(shù)據(jù)包括年齡、身高、體重以及BMI值。受試者于進行正式測試前至少需空腹八小時，而于測試期間需維持正常的飲食型態(tài)，并避免服用營養(yǎng)補充劑或其它藥物，以避免影響實驗數(shù)據(jù)。(2)so%最大^l氧量的運動負荷測試受試者于正式測試前必須經(jīng)過二次前測，借以求出最大^it氧量(V02max),并預(yù)估80%最大攝氧量的運動負荷，再進行一次80%最大攝氧量的確認(rèn)試驗，以確保在此特定負荷下為受試者的80%最大攝氧量的運動強度，而其測試流程詳述如下。首先進行最大攝氧量測試，在受試者抵達前，需先進行氣體分析儀(VmaxSpectra,SensorMedics)的氧量及不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)氣體校正。待受試者抵達后，使其戴上心跳檢測表(Polar810i)并記錄安靜心跳率，并將心跳檢測帶置于靠近受試者心臟的處，且將檢測表置于距檢測帶l米內(nèi)。受試者先于原地跑步機(Vision,T8600)上慢跑3-5分鐘暖身適應(yīng)，并自行作伸展運動，接著讓受試者站在跑步機上，戴上采氣面罩，并將采氣面罩與呼吸管相連接，且該呼吸管與氣體分析儀相通連，借以使受試者呼出的氣體可經(jīng)采氣面罩及呼吸管而傳送至氣體分析儀中。繼而將跑步機的運轉(zhuǎn)速度固定在9.6km/hr，測試開始的03分鐘內(nèi)，跑步機設(shè)定為0%坡度，開始測試3分鐘后，每3分鐘需增加跑步機3%坡度，直到受試者衰竭即停止運動。分析氣體分析儀的數(shù)據(jù)后，求出每次升坡度前l(fā)分鐘及運動衰竭前的攝氧量，而測試中所得的攝氧量的最大值即為最大攝氧量。此外，達最大攝氧量的判斷標(biāo)準(zhǔn)至少必須同時符合下列條件中的二項，方可判定為最大攝氧量(a)受試者已盡全力無法持續(xù)運動測試(受試者腳步變慢無法隨轉(zhuǎn)帶順利前進)；(b)心跳率達(220-年齡)±10次/分；(c)呼吸商(respiratoryquotient,RQ)必需大于1.1以上；(d)自覺量表(ratingperceivedexertion,RPE)已達18或19的階段。通過前測所得的最大攝氧量與負荷強度的回歸方程式可進一步求得80%最大攝氧量的速度，此計算過程通過最大攝氧量測驗中所獲得的耗氧量與速度的數(shù)據(jù)，而求得速度(縱坐標(biāo))和氧攝取量(橫坐標(biāo))的回歸線，再將個人最大氧攝取量乘以80%,求得80%最大攝氧量時的氧攝取量，再畫線找出此點的相對速度。并需再以此負荷強度進行運動10分鐘，且測量第5-6分鐘以及最后l分鐘的攝氧量，以確定真正的80%最大攝氧量運動負荷。其結(jié)果如表一所示。表一、受試者基本數(shù)據(jù)及其最大攝氧量項目測量值(平均數(shù)i標(biāo)準(zhǔn)差)年齡(歲)22.8±0.89身高(米)1.75±0.01體重(千克)67.73±1.81BMI(kgxm-2)22.14±0.63最大攝氧量(ml/min/kg)50.22±0.1780%最大攝氧量速度7.61±1.87n=15實施例3:牛樟芝環(huán)己烯酮化合物的抗疲勞測試運動中肌肉疲勞的廣泛定義為個體生理過程不能維持其機能在一定水平，或各器官不能維持預(yù)定的運動強度，造成身體活動疲勞的原因可包括心理、生理與生化三方面，其中，生化疲勞的潛在機制包括中樞與外圍疲勞兩方面，造成中樞疲勞的機制包括低血糖(hypoglycemia)、血液中關(guān)鍵氨基酸濃度的改變以及大腦中神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)濃度的改變，而外圍疲勞的機制則有肌肉中的磷酸肌酸(phospocreatine;PC)耗竭而導(dǎo)致血氨增加、肌肉中的肝糖耗竭與氧氣供應(yīng)不足等能量短缺現(xiàn)象，以及肌肉中的氫離子堆積所導(dǎo)致的乳酸增加、肌肉中的磷酸堆積等代謝物堆積因素。因此，本發(fā)明通過分別給予受試者含有牛樟芝環(huán)己烯酮化合物以及不含牛樟芝環(huán)己烯酮化合物的安慰劑，并使受試者進行強度為前述80%最大攝氧量運動負荷的衰竭運動，同時于運動前以及運動后分析受試者體內(nèi)的肌酸激酶、血乳酸、血糖、血氨及游離脂肪酸等疲勞指標(biāo)的含量，而測得于衰竭運動后補充牛樟芝環(huán)己烯酮化合物的抗疲勞功效。隨機給予受試者4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5(3,7，11-三曱基-2，6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮化合物以及非牛樟芝環(huán)己烯酮化合物的安慰劑，而安慰劑成分可為玉米淀粉(cornstarch)等任何非牛樟芝環(huán)己烯酮化合物的物質(zhì)，且此測試釆用雙盲交叉設(shè)計，受試者與施測者皆不知所給予的物質(zhì)成分。繼之，基于次序平衡(orderbalance)原則，每位受試者皆需接受下列各組測試無運動并給予安慰劑(PR)、有運動并給予安慰劑(PE)、無運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DR)以及有運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DE),且接受不同組別測試的受試者在完成為期一周的該組試驗后，需于^f木息一周后，再繼續(xù)進行下一組測試，直到每位受試者皆完成上述四組試驗。其中，所做運動是以前述測得的80%最大攝氧量運動負荷的強度(7.61土1.87)在跑步機上進行，并跑至受試者達運動衰竭(exhausted)為止，且于運動后給予受試者牛樟芝環(huán)己烯酮化合物或安慰劑；另外,.安慰劑的給予量為每天0.2克/體重(千克)，而牛樟芝環(huán)己烯酮化合物的給予量為每天0.2克/體重(千克)，測試進行為期七天，并于運動前、衰竭運動后第0、0.5、1、2、24、48、72、120以及168小時進行靜脈采血，血液以含抗凝血劑(如EDTA)的收集管收集，于3000xg離心IO分鐘，取血漿部份，并進行后續(xù)的肌酸激酶、血乳酸、血糖、血氨以及游離脂肪酸等疲勞指標(biāo)的生化分析，并比較運動前以及運動后給予不同補充物質(zhì)的生理及生化值的變化；所有生化分析數(shù)值均以平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差(Mean士SEM)表示，且該些分析數(shù)值需以重復(fù)量數(shù)二因子變異數(shù)分析(repeatedmeasurementtwowayANOVA)進行組內(nèi)、組間各采血點的差異檢定，并以杜凱氏事后比較法(Tukey'shonestlysignificantdifference)進行事后比較，而統(tǒng)計后達顯著水平的臨界值定為a=0.05，而該些生化值的分析方式及其結(jié)果詳述如下(1)肌酸激酶(creatinephosphatekinase;CPK)的分斗斤人體骨骼肌、心肌、腦及前列腺等器官均會產(chǎn)生血清肌酸激酶，其中以骨骼肌含量最豐富，占全身總量96%之多；正常情況時，血清中的肌酸激酶活性很低，而當(dāng)運動時肌肉收縮過程中，肌酸激酶可催化三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)與磷酸肌酸(phosphatecreatine,PC)之間的高能磷酸鍵，其化學(xué)反應(yīng)式為CPKADP+PC-ATP+肌酸以確保劇烈運動時可快速提供肌肉收縮所需能量以及促進ATP的再合成。而運動過程中會促使肌酸激酶活性增高的原因，是由于運動時缺氧，使得代謝產(chǎn)物堆積，細胞內(nèi)外鈣離子恒定失衡，引起肌細胞膜的通透性增增高，或造成肌細胞膜受到損傷例如肌肉牽拉的機械損傷或產(chǎn)生血腫，進而促使肌酸激酶釋入血液循環(huán)，因此肌酸激酶常被用作運動強度與肌肉細胞損傷的指標(biāo)酶。本發(fā)明量測血液中肌酸激酶濃度的方法，是利用干式自動血液分析測量儀(Johnson&JohnsonDT-60II),并通過酶作用及比色測定的原理而測得。在定量的血漿中力口入磷酸肌酸葡萄糖氧化酶(creatinephosphateglucoseoxidase)反應(yīng)后，再力p入4誦氨基安替比林(4-aminoantipyrine)及1,7-二羥基萘(l，7-dihydroxynaphthalene),經(jīng)過氧化物酶(peroxidase)作用后產(chǎn)生白色化合物，并于680nm波長下測定其吸光度，再換算得肌酸激酶濃度，結(jié)果如表二及圖1所示。表二、受試者進行衰竭運動或無運動并分別補充安慰劑或牛樟芝環(huán)己烯酮化合物后，各時間點的肌酸激酶濃度(U/L)I運動運動后運動后運動后運動后運動后運動后運動后運動后運動后前0小時0.5小時l小時2小時24小時48小時72小時120小時168小時安慰劑無運動(PR)205.40±42.4920楊±40.28206.27±40.54198.33±42.99194.67±40,77179.73±25.81148.13±18.00194.07±25.92193.40±22.44171.73±22.75有運動(PE)152.00232.13±32,06±38鄰*加219.20±33.56*acd205.53188.47±29.88*acd±32.25*c383.53321.60±134.86c±99.33ac360,20±111.71acd279.73±69.06231.13±"70.20牛樟芝環(huán)己烯酮化合物無運動167.27±19.5150.20±21.7"166.53±19.71167.40±23.16146.33±23.16158.47±21.63133.87±16.51165.73±28.07243.00±48.21183.27±38.37有運動卿226.64±37.20259.57±38.83*c221.86±37.74232.93±32.98208.07±30.53332.50±81.75244.00±49.65193.86±34.44193.86±25.49204.83±31.89n=15，數(shù)值以"平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差"表示承表示p〈05:與前測比有差異存在；a表示p《05:顯著大于同時間點的PR組b表示p〈05:顯著大于同時間點的PE組；c表示p〈05:顯著大于同時間點的DR組d表示p《05:顯著大于同時間點的DE組由表二與圖1可知，進行80%最大攝氧量的高強度衰竭運動后，有運動并給予安慰劑(PE)的組別于運動后0、0.5、1、2及24小時，其肌酸激酶濃度值便持續(xù)增加且均顯著(p〈0.05)高于運動前安靜時的肌酸激酶濃度，此亦表示受試者運動強度已達到肌肉損傷程度；同時有運動并給予安慰劑(PE)的組別所示肌酸激酶濃度值顯著地(p〈0.05)高于無運動并給予安慰劑(PR)與無運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DR)兩組別所示數(shù)值，且該兩組未經(jīng)衰竭運動的組別(PR與DR)直到運動后120小時才沒有差異存在。運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DE)的組別，在高強度的衰竭運動后，其肌酸激酶濃度僅在運動后立即上升，在運動后0.5小時的后即恢復(fù)至運動前的濃度水平。此外，有運動并給予安慰劑(PE)的組別進行衰竭運動后，其肌酸激酶濃度顯著地(p<0.05)高于有運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DE)的組別，且此種濃度差異由進行衰竭運動后持續(xù)至運動后1小時，并于運動后72小時仍可觀察到此現(xiàn)象，此結(jié)果顯示，于衰竭運動后立即補充牛樟芝環(huán)己烯酮化合物，可有效降低代表肌肉損傷指標(biāo)的肌酸激酶濃度，有助于減緩運動后所產(chǎn)生的生理疲勞。(2)飯前血糖(Bloodglucose)的分析運動時，伴隨肌肉收縮時鈣離子的釋放及腎上腺素(epinephrine)的分泌，可活化磷酸化酶(phosphorylase)以增加肌肉中肝糖分解速率，同時增加的腎上腺素亦使肝臟加速肝糖分解反應(yīng)(glycogenolysis)，進而使血液中血糖濃度增力口。于80%最大攝氧量的高強度衰竭運動下所產(chǎn)生的疲勞常導(dǎo)因于體內(nèi)血糖在氧化代謝過程中持續(xù)利用，產(chǎn)生低血糖的現(xiàn)象，而造成肌肉中肝糖的耗盡，因此，檢測運動時體內(nèi)的糖類利用狀況，可作為觀察生理疲勞的指標(biāo)之一。本發(fā)明量測血糖濃度的方法，利用干式自動血液分析測量儀(Johnson&JohnsonDT-60II),并通過酶作用及比色測定的原理而測得。于定量的血漿中加入葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase)反應(yīng)后，再加入4_氨基安替比林(4-aminoantipyrine)及1，7-二羥基萘(1，7-dihydroxynaphthalene)，經(jīng)過氧化物酶(peroxidase)作用后產(chǎn)生紅色化合物，其反應(yīng)式如下一樸葡萄糖氧化酶世^厶卩-D葡萄糖+02+H20-D-葡糖酸+H202過氧化物酶2H202+4-氨基安替比林+1,7-二羥基萘-紅色染料(Reddye)并于555nm波長下測定其吸光度，再換算得血糖濃度，結(jié)果如表三及圖2所示。表三、受試者進行衰竭運動或無運動并分別補充安慰劑或牛樟芝環(huán)己烯酮化合_物后，各時間點的血糖濃度(mg/dl)_運動運動后運動后運動后運動后運動后運動后運動后運動后運動后組別前O小時O.5小時1小時2小時24小時48小時72小時12Q小時168小時n=15,數(shù)值以"平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差"表示求表示p〈.05:與前測比有差異存在；a表示p〈05:顯著大于同時間點的PR組b表示p<.05:顯著大于同時間點的PE組；c表示p<.05:顯著大于同時間點的DR組d表示p<05:顯著大于同時間點的DE組由表三與圖2可知，有運動并給予安慰劑(PE)以及有運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DE)的組別，于80%最大攝氧量的高強度衰竭運動后，其血糖濃度值與無運動并給予安慰劑(PR)以及無運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DR)組別有顯著的(p〈0.05)差異；此外，有運動并給予安慰劑(PE)以及有運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DE)兩組別，在80%最大攝氧量的高強度衰竭運動后0.5小時的飯前血糖濃度均會恢復(fù)至未運動前的水平并接近安靜值，此結(jié)果顯示，于運動后補充樟芝環(huán)己烯酮化合物對飯前血糖的代謝并無影響。卯.2790.73±1.80±〗,9089.67106.6091.7391.93±1.65±1.9589.21肌43±2.02±4.49*ac92.8792.27土2.62±1.71卯.0097.73±3.34士5.1593.3395.53土2.今9±3.2388.7193.86±1.74±2.0397.2086.87±4.84±1.8599.1392.47士5.90±3.16a103.2090.00±4.35*±1.9101.0794.43±6.03*±1.57a87.73卯.20±1.65±1.08卯.3391.47士2.11±1.57卯.4093.40±2.56士2.3489.2193.00±1.69±1.4288.4787.47±0.90±2."88.1391.07士1.90±1.7594.0092.20±2.65ab±1.9893.2992.93±1.42b±1.34'無運動(PR)有運動(PE)無運動(DR)有運動(3)血氨(Ammonia)的分析血氨為蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物，其主要是由于體內(nèi)呤核循環(huán)(purinenucleotidecycle;PNC)中氨基酸的分解以及腺呤核單磷酸(adenosinemonophosphate;AMP)去氨基作用所形成，而運動時因體內(nèi)磷酸肌酸(creatinephosphate)的耗盡，使得組織中的腺嘌呤核苷酸(adeninenucleotide)分解，以加速ATP的再合成，此時會產(chǎn)生大量的血氨，而血氨濃度的增加會改變中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用，使得細胞外的pH值、電解質(zhì)濃度及神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)濃度受到改變，并干擾克氏循環(huán)(Krebscycle),造成疲勞的產(chǎn)生，因此，血氨堆積亦是造成中樞疲勞及外圍疲勞的因素之一，故血氨常會被用來作為疲勞的指標(biāo)之一。本發(fā)明量測血氨濃度的方法，利用干式自動血液分析測量儀(Johnson&JohnsonDT-60II),并通過比色測定的原理，在定量的血漿中加入呈色劑溴酚藍(bromphenolblue),作用后產(chǎn)生藍色化合物，其反應(yīng)式如下NH3+溴酚藍-藍色染料(Bluedye)并于605nm波長下測定其吸光度，再換算得血氨濃度，結(jié)果如表四及圖3所示。表四、受試者進行衰竭運動或無運動并分別補充安慰劑或牛樟芝環(huán)己烯酮化合物后，各時間點的血氨濃度(嗎/dl)運動運動后運動后運動后運動后運動后運動后運動后運動后運動后<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>n=15，數(shù)值以"平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差，，表示*表示p〈.05:與前測比有差異存在；a表示p《05:顯著大于同時間點的PR組b表示p〈05:顯著大于同時間點的PE組；c表示p夂05:顯著大于同時間點的DR組d表示p〈05:顯著大于同時間點的DE組由表四與圖3可知，有運動并給予安慰劑(PE)以及有運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DE)的組別，于80%最大攝氧量的高強度衰竭運動后，其血氨濃度值顯著地(p<0.05)高于無運動并給予安慰劑(PR)以及無運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DR)的組別。有運動并給予安慰劑(PE)以及有運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DE)兩組的血氨濃度，在運動后1小時即逐漸恢復(fù)，且于該時間點的血氨濃度數(shù)值與運動前測得的血氨濃度比較后并無顯著(p〉0.05)的差異存在；而于運動后2小時，有運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DE)組別與有運動并給予安慰劑(PE)組別間的血氨濃度數(shù)值在統(tǒng)計上出現(xiàn)顯著的(p〈0.05)差異。此外，由表四與圖3中亦可觀察到，于運動后24小時，有運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DE)組別顯示的血氨濃度顯著地(p<0.05)低于未運動前，而于此相同時間點，同樣經(jīng)過衰竭運動的有運動并給予安慰劑(PE)組別的血氨濃度近似于未運動前的數(shù)值，并無出現(xiàn)上述血氨濃度顯著降低的效果，因此，由上述結(jié)果顯示，于運動后補充牛樟芝環(huán)己烯酮化合物有助于血氨的代謝，使運動后堆積于體內(nèi)的血氨可快速代謝，進而減緩衰竭運動后所產(chǎn)生的生理疲勞。(4)血乳酸(Lactate)的分析乳酸是肌肉及肝臟中肝糖、葡萄糖經(jīng)無氧糖解作用代謝形成的產(chǎn)物，在安靜的狀態(tài)下，乳酸的生成量較少，當(dāng)激烈或長時間運動時，組織缺氧情形較明顯，無氧代謝速度加快，而當(dāng)乳酸的生成速率高于粒線體氧化代謝乳酸的速率時，就會造成增加的乳酸逐漸堆積于肌肉中。乳酸的堆積會促使肌肉中的氫離子濃度上升、pH值下降，此反而會抑制糖酵解的磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，PFK)的活性，造成糖解作用速率減弱及ATP再合成率減少，另因氫離子濃度增加，影響肌漿網(wǎng)中鈣離子的釋放與降低肌纖維的收縮能力，所以乳酸大量的堆積，將會加速疲勞反應(yīng)的發(fā)生，因此，血乳酸常被用作疲勞的指標(biāo)之一。本發(fā)明量測血乳酸濃度的方法，利用干式自動血液分析測量儀(Johnson&JohnsonDT-60II),并通過酶作用及比色測定的原理，于定量的血漿中加入乳酸氧化酶(lactateoxidase)反應(yīng)后，再力。入4-氨基安^^比4木(4-aminoantipyrine)及1,7-二羥基萘(1，7-dihydroxynaphthalene),經(jīng)過氧化物酶(peroxidase)作用后產(chǎn)生紅色化合物，其反應(yīng)式如下乳酸氧化酶乳酸+02-丙酮酸酯+H202過氧(化)物酶2H202+4-氨基安替比林+1，7-二羥基萘-紅色染料(Reddye)并于540nm波長下測定其吸光度，再換算得血乳酸濃度，結(jié)果如表五及圖4所示。表五、受試者進行衰竭運動或無運動并分別補充安慰劑或牛樟芝環(huán)己烯酮化合物后，各時間點的血乳酸濃度(mmo1/1)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>n=15,數(shù)值以"平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差"表示*表示p弋05:與前測比有差異存在；a表示p《05:顯著大于同時間點的PR組b表示p《05:顯著大于同時間點的PE組；c表示p<.05:顯著大于同時間點的DR組d表示p<.05:顯著大于同時間點的DE組由表五與圖4可知，有運動并給予安慰劑(PE)以及有運動并給予牛樟芝環(huán)己蹄酮化合物(DE)的組別，于80%最大攝氧量的高強度衰竭運動后0.5小時內(nèi)，其血乳酸濃度值顯著地(p〈0.05)高于無運動并給予安慰劑(PR)以及無運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DR)的組別，且該有運動兩組組別(PE及DE)的運動強度的介入與無運動組別(PR及DR)所呈現(xiàn)的血乳酸濃度值亦均有顯著差異(p<0.05)。有運動并給予安慰劑(PE)以及有運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DE)兩組的血氨濃度，在運動后l小時即逐漸恢復(fù)并接近運動前的安靜值，且于該時間點的血氨濃度數(shù)值與運動前測得的血乳酸濃度比較后并無顯著的差異存在(p〉0.05),此結(jié)果顯示，于運動后補充樟芝環(huán)己烯酮化合物對血乳酸的代謝并無影響。(5)游離脂肪酸(freefattyacid)的分析游離脂肪酸的產(chǎn)生乃由肌纖維間的脂肪組織，或細胞內(nèi)三酸甘油酯水解而來。耐力運動時，儲存于肌肉中的肝糖會隨的耗盡，而隨著運動持續(xù)的時間增力口，糖解作用速率將會逐漸減弱，體內(nèi)能量的利用趨于脂肪酸的利用，此時ATP的產(chǎn)生便減少，因而造成疲勞；此外，當(dāng)脂肪分解速率提高，使得血漿中游離脂肪酸濃度增加時，游離脂肪酸會與血中色胺酸(Tryptophan)相互竟?fàn)幇椎鞍?Albumin)上的結(jié)合位置，造成血中游離色胺酸增加，色胺酸為血清素的前驅(qū)物，當(dāng)色胺酸進入腦中，則會使血清素合成速率增加。當(dāng)腦中血清素增加時，會損壞中樞神經(jīng)某方面的作用系統(tǒng)，如降低多巴胺(Dopamine)的活性，亦會導(dǎo)致疲勞的產(chǎn)生及睡眠反應(yīng)，因此，血液中游離脂肪酸的濃度可作為脂解及產(chǎn)生疲勞的指標(biāo)。本發(fā)明量測游離脂肪酸濃度的方法，利用酶作用及比色測定的原理，于定量的血漿中加入于定量的血漿中加入酰基輔酶A合成酶(acylCoAsynthetase)、?；o酶A氧化酶(acylCoAoxidase)反應(yīng)之，再經(jīng)過氧化物酶(peroxidase)作用后產(chǎn)生紫色化合物，其反應(yīng)式如下NEFA+ATP+CoA一_Cq、AcylCoA+AMP+PPiAcylCoA一p",AcylCoA+02~~^-2,3-反式-烯酰-CoA+H202H202+TOOS+4-AAP,鵬，紫色產(chǎn)物+4H204國AAP:4-氨基安替比林TOOS:N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)m-曱苯胺(N-ethyl-N畫(2-hydroxy國3-sulphopropyl)m-toluidine)并于550nm波長下測定其吸光度，再換算得血乳酸濃度，結(jié)果如表六及圖5所示。表六、受試者進行衰竭運動或無運動并分別補充安慰劑或牛樟芝環(huán)己烯酮化合<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>0.31±0.050.44±0.05c0.48±0.10a0.30±0.040.28±0.030.32±0.06n=15，數(shù)值以"平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差"表示承表示p〈.05:與前測比有差異存在；a表示p〈05:顯著大于同時間點的PR組b表示p〈05:顯著大于同時間點的PE組；c表示p<.05:顯著大于同時間點的DR組d表示p<.05:顯著大于同時間點的DE組由表六與圖5可知，有運動并給予安慰劑(PE)以及有運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DE)的組別，于80%最大攝氧量的高強度衰竭運動后2小時內(nèi)，其血中游離脂肪酸濃度值顯著地(p〈0.05)高于無運動并給予安慰劑(PR)以及無運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DR)的組別。而有運動并給予安慰劑(PE)以及有運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DE)兩組在運動后的各時間測試點所測得的血中游離脂肪酸濃度值皆無顯著差異(p〉0.05)，此結(jié)果顯示，于運動后補充樟芝環(huán)己烯酮化合物對血中游離脂肪酸的代謝并無影響。本綜上所述，發(fā)明結(jié)果顯示在80%最大攝氧量的高強度衰竭運動后立即補充樟芝環(huán)己烯酮化合物，肌酸激酶的濃度僅在運動后立即顯著上升，0.5小時后其肌酸激酶濃度即恢復(fù)至運動前水平，此結(jié)果顯示在衰竭運動后立即補充樟芝對于肌酸激酶的代謝具有顯著(p<0.05)效果；而在運動后血氨的代謝上，衰竭運動后立即補充樟芝環(huán)己烯酮化合物(DE)的組別在運動后2小時，其恢復(fù)效果顯著(p〈0.05)優(yōu)于未補充樟芝環(huán)己烯酮化合物(PE)的組別；此外，血糖、血乳酸及游離脂肪酸等疲勞指標(biāo)，在有運動并給予安慰劑(PE)以及有運動并給予牛樟芝環(huán)己烯酮化合物(DE)兩組之間并沒有顯著的差異。因此，于80%最大攝氧量的高強度衰竭運動后立即補充樟芝環(huán)己烯酮化合物有助于體內(nèi)肌酸激酶與血氨的恢復(fù)，進而達到減緩生理疲勞的功效。權(quán)利要求1.一種用于減緩生理疲勞的牛樟芝環(huán)己烯酮化合物，該化合物具有下列結(jié)構(gòu)式其中，X為氧(O)或硫(S)，Y為氧或硫；R1為氫(H)、甲基(CH3)或(CH2)m-CH3，R2為氫基、甲基或(CH2)m-CH3，R3為氫、甲基或(CH2)m-CH3，m＝1-12；n＝1-12。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于減緩生理疲勞的牛樟芝環(huán)己烯酮化合物，其中，所述化合物由牛樟芝的有機溶劑萃取物分離制得。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述用于減緩生理疲勞的牛樟芝環(huán)己烯酮化合物，其中，所述有機溶劑選自由酯類、醇類、烷類或卣代烷所組成的組中。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述用于減緩生理疲勞的牛樟芝環(huán)己烯酮化合物，其中，所述醇為乙醇。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于減緩生理疲勞的牛樟芝環(huán)己烯酮化合物，其中，所述化合物由牛樟芝的水萃取物分離制得。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于減緩生理疲勞的牛樟芝環(huán)己烯酮化合物，其中，所述化合物為4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5(3，7，11-三曱基-2,6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮(4畫hydroxy-2,3畫dimethoxy-6-methy-5(3，7,ll畫trimethyl-dodeca-2,6，10-trienyl)-cyclohex-2-enone)。7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述用于減緩生理疲勞的牛樟芝環(huán)己烯酮化合物，其中，所述化合物通過促進運動后體內(nèi)月幾酸激酶(creatinephosphatekinase)的代謝而抗疲勞。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述用于減緩生理疲勞的牛樟芝環(huán)己烯酮化合物，其中，所述運動為80%最大攝氧量的高強度衰竭運動。9.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述用于減緩生理疲勞的牛樟芝環(huán)己烯酮化合物，其中，所述化合物通過促進運動后體內(nèi)血氨(ammonia)的代謝而抗疲勞。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述用于減緩生理疲勞的牛樟芝環(huán)己烯酮化合物，其中，所述運動為80%最大攝氧量的高強度衰竭運動。全文摘要本發(fā)明是關(guān)于一種用于減緩生理疲勞的牛樟芝化合物，尤其是關(guān)于一種由牛樟芝萃取物中所分離出的4-羥基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7，11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮(4-hydroxy-2，3-dimethoxy-6-methy-5[3，7，11-trimethyl-dodeca-2，6，10-trienyl]-cyclohex-2-enone)可有效減緩生理疲勞。本發(fā)明中，在80％最大攝氧量的高強度衰竭運動后立即補充前述化合物可促進體內(nèi)肌酸激酶與血氨的代謝，并有助于其濃度的恢復(fù)，達到減緩生理疲勞的功效。文檔編號C07C45/00GK101333156SQ20071012680公開日2008年12月31日申請日期2007年6月27日優(yōu)先權(quán)日2007年6月27日發(fā)明者劉勝勇,溫武哲,郭茂田申請人:國鼎生物科技股份有限公司