專利名稱：一種具有治療乳腺癌作用的寡核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種寡核苷酸以及其用于治療乳腺癌的用途。
技術(shù)背景乳腺癌(mammary carcinoma)是發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，是全球婦女最常見的惡性腫瘤之一, 發(fā)病率逐年攀升，且呈年輕化態(tài)勢，為婦女惡性腫瘤死因的首位。乳腺癌在我國的發(fā)病率僅次于宮頸癌，人 群發(fā)病為23/10萬；占全身各種惡性腫瘤的7~10%。乳腺癌的治療方法和措施較多，包括手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療及生物治療等。手術(shù)治療目前是 乳癌治療的主要手段，對早期尚無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌療效較好；放射治療通常用于手術(shù)后，以防止 局部復(fù)發(fā)，對于孤立性的局部復(fù)發(fā)病灶，以及乳腺癌的骨骼轉(zhuǎn)移灶均有一定的姑息性療效；化學(xué)藥物治療 是一種必要的全身性輔助治療，常用藥物有環(huán)磷酰胺,洛莫司汀,苯丁酸氮芥等；內(nèi)分泌治療乳腺癌是非治 愈性的，但對于激素依賴性乳癌卻可收到不同程度的姑息療效；生物治療分為免疫治療、基因治療、干細 胞治療和血管生成抑制治療，是隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)、細胞生物學(xué)興起的一類治療手段(WeiYQ，Wu Y，Advances in Biotherapy for Breast Cancer,China J Bases Clin General Surg,2004,11(1):3-5)。盡管孚L 腺癌有多種治療方式，但單獨應(yīng)用都難以取得滿意的療效。因此，目前乳腺癌的治療大都采用以手術(shù)為主， 以各種治療方式為輔的綜合治療。 發(fā)明內(nèi)容1、 本發(fā)明提供了一種寡核苷酸。該寡核苷酸在體外具有刺激免疫細胞增殖、活化的功能。動物實驗 表明，該種寡核苷酸可以用于預(yù)防和治療乳腺癌。2、 本發(fā)明提供的寡核苷酸在用于預(yù)防和治療乳腺癌的用途時，可將該寡核苷酸用藥物性載體承載應(yīng) 用，其給藥方式可經(jīng)腸道、非腸道(如腫瘤直接注射、瘤旁淋巴結(jié)注射、淋巴結(jié)內(nèi)注射、皮下注射、肌肉 注射和靜脈注射等)等應(yīng)用。3、 本發(fā)明提供的寡核苷酸作為主要成分可形成各種藥物組合物或劑型，包含有效治療劑量的該類寡 核苷酸可單獨或聯(lián)合其它治療方式用于治療乳腺癌和其它腫瘤的用途。4、 本發(fā)明提供的寡核苷酸可以經(jīng)過各種化學(xué)修飾。 發(fā)明中的術(shù)語除非特別強調(diào)，本發(fā)明中的術(shù)語具有可以被本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所理解的通常意義。若出現(xiàn)含 義上的沖突，應(yīng)遵從本發(fā)明中的解釋、界定或說明。"寡核苷酸"寡核苷酸是由糖(如脫氧核糖或核糖)，磷酸基團和堿基組成的單核苷酸連接而形成的分子，其中糖分子和堿基連接成核苷(nucleoside),核苷由磷酸基團連接形成核苷酸(nucleotide),形 成核苷的堿基有嘧啶和嘌呤，嘧啶有胸腺嘧啶(thymine，縮寫為T或t)和胞嘧啶(cytosine，縮寫為C或 c)，嘌呤有腺嘌呤(adenine,縮寫為A或a)和鳥嘌呤(guanine,縮寫為G或g)。寡核苷酸可以是單鏈 的也可以是雙鏈的。在本發(fā)明中，"寡核苷酸"(Oligodeoxynucleotide， ODN)可以用它的英文縮寫ODN代 替。"化學(xué)修飾"與自然的DNA相比，本發(fā)明中的寡核苷酸可以經(jīng)各種化學(xué)修飾，修飾的部位可發(fā)生在 核苷之間的磷酸二酯鍵，核糖單位或/和有機堿基(A、 T、 C、 G，尿嘧啶，uridine,縮寫為U或u)。在 寡核苷酸的合成期間或合成后都可以進行修飾。在合成期間的化學(xué)修飾可以在寡核苷酸的內(nèi)部或5'端進行 修飾。合成后的寡核苷酸可以但不限于在活性基團(如5'或3'端的磷酸或羥基)進行化學(xué)修飾。專業(yè)人員 可以了解這些化學(xué)修飾具體方式。本發(fā)明中的化學(xué)修飾包括寡核苷酸的骨架修飾。其中，至少一個核苷酸 間鍵合中的非橋性磷酸氧原子被硫原子取代。寡核苷酸的骨架也可發(fā)生非離子DNA類似物，如烷基、芳 香-碳磷酸鹽化合物(帶電荷的碳磷酸鹽化合物氧原子被烷基、芳香基取代)修飾，再如磷酸二酯和烷基磷 酸三酯中的氧原子部分被烷基化修飾。寡核苷酸還可以是磷硫酰和磷酸二酯的嵌合體。化學(xué)修飾還包括堿 基替代，如C-5丙炔嘧啶和7-deaza-7替代嘌呤替代?；瘜W(xué)修飾還包括堿基修飾。修飾的堿基在化學(xué)上不 同于典型的自然中的堿基，但具有它們基本的化學(xué)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中的寡核苷酸還可以用胞嘧啶衍生物或胸 腺嘧啶核苷衍生物修飾。這里胞嘧啶衍生物是指胞嘧啶樣核苷(除外胞嘧啶)。胸腺嘧啶核苷衍生物是指胸腺嘧樣核苷(不包括胸腺嘧啶)。另外，本發(fā)明中的寡核苷酸的修飾可以是在寡核苷酸的兩個或一個末 端連接一個二元醇，如四乙二醇或六乙二醇。"腫瘤"本發(fā)明中的"腫瘤"即現(xiàn)代醫(yī)學(xué)定義的腫瘤，可以分為非致癌性的良性腫瘤和致癌性的惡性腫瘤。"個體"本發(fā)明中的個體是指人或非人的脊椎動物。"免疫反應(yīng)"免疫應(yīng)答和免疫反應(yīng)有相似的意義。免疫反應(yīng)是免疫細胞如B細胞、T細胞、NK細胞、 細胞、NKT細胞、樹突細胞、巨噬細胞和粒細胞等對抗原或其它刺激作出的反應(yīng)。免疫應(yīng)答包括天然 免疫應(yīng)答和獲得性(特異性)免疫應(yīng)答。獲得性免疫應(yīng)答包括細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。"治療腫瘤"這里的治療是指對發(fā)生腫瘤的個體采取的治療性措施，用來控制疾病的進展，延長發(fā)生腫瘤個體的生存期，改善發(fā)生腫瘤個體的生存質(zhì)量，減輕的疾病的癥狀，使癌腫縮小甚至消除。"藥物學(xué)可接受的載體"藥物學(xué)可接受的載體是指一種或多種固體或液體的填充劑、稀釋劑或包 封物質(zhì)，此載體適合將本發(fā)明中的寡核苷酸應(yīng)用于個體。該載體可以是有機的、無機的、天然的或合成的。 該載體包括各種溶液、稀釋劑、溶劑、分散劑、脂質(zhì)體、乳劑、糖衣、抗菌劑、抗真菌劑、等滲的和延緩 吸收的試劑、和其他的適合本發(fā)明中的寡核苷酸應(yīng)用的載體。可注射用的載體包括水、生理鹽水、平衡鹽 溶液、緩沖液、葡萄糖溶液、甘油等。對于固體混合物(如粉末、丸、片劑、膠囊形式)而言，常用的非 毒性固體載體包括具有藥理學(xué)純度的甘露醇、乳糖、淀粉和硬脂酸鎂等。另外，作為生物學(xué)上中性的載體，應(yīng)用的藥理學(xué)組分中可以含有非毒性的輔助物質(zhì)，包括濕化或乳化劑、防腐劑、ra緩沖試劑，醋酸鈉和單月桂酸酯等。"治療有效劑量"為了治療腫瘤，給個體應(yīng)用劑量是治療有效劑量。該治療有效劑量是指在治療腫 瘤的過程中，給予個體后可產(chǎn)生理想的預(yù)防或治療效果的寡核苷酸或其功能類似物的劑量。這個"劑量" 的多少決定于本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員應(yīng)知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，還要參考其他因素，包括并不限于個體的大小和健康 情況和疾病的嚴(yán)重程度。本發(fā)明中的寡核苷酸可以用作單次治療或多次治療。本發(fā)明中的寡核苷酸或其功能類似物每次應(yīng)用到個體的劑量范圍從1 ng到1000 mg。為了達到理想的治療效果，本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員可以對應(yīng)用的劑量作調(diào)整，如主治醫(yī)生在可靠的醫(yī)療判斷的基礎(chǔ)上，做出的劑量調(diào)整，其劑量范圍可以是前述范圍的10倍到1000倍。"給藥途徑"本發(fā)明中的寡核苷酸在單獨應(yīng)用或按配方制作成藥物組合物應(yīng)用時，其給藥途徑可以 是腸內(nèi)、腸外、外用或吸入途徑。腸內(nèi)給要途徑包括經(jīng)口、胃、結(jié)腸或直腸給藥；腸外給藥途徑包括經(jīng)靜 脈、腹膜、鞘內(nèi)、肌肉、皮下、皮內(nèi)、局部、瘤旁淋巴結(jié)、腫瘤組織直接注射，經(jīng)陰道、夕卜用、鼻粘膜和 肺吸入等。外用給藥途徑包括經(jīng)皮膚、口腔、眼睛、耳和鼻子。"藥物組合物"藥物組合物指的是本發(fā)明中治療有效劑量的寡核苷酸與藥物學(xué)上可接受的載體組成 的混合物。藥物組合物分可以包含一個或多個本發(fā)明中的寡核苷酸。本發(fā)明的注射劑藥物組合物包括藥學(xué) 上可接受的水溶液、非水溶液、分散劑、懸濁劑、乳劑或粉劑，注射前用無菌的注射用水或分散劑溶解。 在一些情況下，為了延長本發(fā)明中寡核苷酸作用效果，藥物組合物可被處理于合適的持續(xù)釋放系統(tǒng)后應(yīng)用。 發(fā)明中的寡核苷酸或其功能類似物或藥物組合物可以被處理成帶有結(jié)晶的懸膠液或水分較少的非結(jié)晶物 質(zhì)，來穩(wěn)定地延緩釋放。注射用的本發(fā)明中寡核苷酸或其功能類似物的延緩釋放可以通過用疏水物質(zhì)(如， 可接受的油性載體)溶解來實現(xiàn)。用于注射形式的藥物組合物，可以是脂質(zhì)體包裹的寡核苷酸或乳粒，或 可生物降解的半透性聚合物，如多乳酸化合物、多正酯類或聚酐。"抗腫瘤制劑"抗腫瘤制劑是指在個體用于治療腫瘤的制劑，包括化療藥物、非特異性免疫增強劑、 表皮細胞生長因子受體(EGFR)-酪氨酸激酶(-TK)激活抑制劑、腫瘤細胞突變蛋白酪氨酸激酶抑制劑、腫 瘤血管抑制劑、抗腫瘤抗體和腫瘤疫苗、RNA干涉物等。"化療藥物"；化療藥物是指用于腫瘤治療的化學(xué)藥物?；熕幬锇ǖ幌抻诘妗h(huán)磷酰胺、 消瘤芥、鹽酸氮芥，卡氮芥、環(huán)乙亞硝脲、噻替派、馬利蘭、順鉑，亞硝脲類、5-氟脲嘧啶、阿糖胞苷、 甲氨喋呤、巰基嘌呤、6-巰基嘌呤，羥基脲、阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素、米托蒽醌、絲裂霉素、博采 霉素、自力霉素、放線菌素D、長春新堿、長春花堿、長春花堿酰胺、三尖杉脂堿、喜樹堿、鬼臼乙叉甙、 美登素、欖香烯乳、三苯氧胺、腎上腺皮質(zhì)激素、甲基芐肼、羥基甲基芐肼、左旋門冬酰胺酶、鉑類(順 鉑、卡鉑、草酸鉬)、氮烯咪胺、六甲嘧胺、泰索帝或培美曲賽(Alinita)、諾維本、希羅達、伊立替康、拓撲替康、草酸鉬、多烯紫杉醇(Docetaxel)。聯(lián)合應(yīng)用的化療藥物如泰素(紫杉醇)+順鉑、泰素+卡鉑、健擇(鹽酸吉西他濱)+順鉑、泰索帝(多西紫杉醇)+順鉑、泰素D或健擇+順鉑、順鉑("51513"11) +長春瑞賓(vi加relbine)、 吉西他濱(gemcitabine) +卡鉑(Carboplatin)、紫杉醇(paclitaxel) +卡鉑。"非特異性免疫增強劑"是指能非特異增強個體抗腫瘤免疫反應(yīng)的制劑，這些制劑包括單但不限于 卡介苗(BCG) 、 a型干擾素(IFN-a)和白細胞間介素(IL-2)。"表皮細胞生長因子受體(EGFR)-酪氨酸激酶(-TK)激活抑制劑"此類制劑包括但不限于吉非替 尼或易瑞沙(Gefitinib， Iressa)和埃羅替尼(Erlotinib， Tarceva) (Bezjak, A. ， et al. JClinOncol 24: 3831-3837 2006)。"腫瘤細胞突變蛋白酪氨酸激酶抑制劑"是指抑制腫瘤細胞突變蛋白酪氨酸激酶活性的制劑。此類制 劑包括但不限于甲磺酸伊馬替尼(Gleevec或STI—571或Imatinib mesylate)。甲磺酸伊馬替尼是突變 蛋白質(zhì)(Bcr—Abl)酪氮酸激酶磷酸化抑制劑(Rubin BP, DuensingA. Mechanisms of resistance to small molecule kinase inhibition in the treatment of solid tumors. Lab Invest. 2006 Aug 21)。"腫瘤血管抑制劑"是指通過抑制腫瘤血管形成而發(fā)揮抗腫瘤作用的制劑。這類制劑包括但不限于阿 瓦斯丁 (Avastin或bevacizumab)、恩度(END0STAR)和peg即tinib。阿瓦斯丁是結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)的人源化單克隆抗體(Gridelli C， et al. New antiangiogenetic agents and non-small cell lung cancer. Crit Rev Oncol Hematol. 2006 Jul 12)。恩度是重組人血管內(nèi)皮抑制素。pegaptinib是 一種以具有抗體樣識別功能和親和力的小分子核酸為主要要學(xué)成分的靶向血管內(nèi)皮細胞生長因子的抗血 管生成的藥物，治療以血管增生為特征的眼部疾患(Gatto B， Cavalli M. From proteins to nucleic acid—based drugs: the role of biotech in anti-VEGF therapy. Anticancer Agents Med Chem. 2006 Jul;6(4):287-301)。"抗腫瘤抗體"是指對腫瘤細胞生長有治療作用的抗體類藥物，如Herc印tin等。 "腫瘤疫苗"是指能誘生個體產(chǎn)生抗腫瘤特異性免疫應(yīng)答的制劑。腫瘤疫苗中的腫瘤抗原是誘生腫瘤 特異性免疫應(yīng)答的核心物質(zhì)，這些腫瘤抗原包括但不限于恥Cl和HER-2。RNA干涉物是指具有序列特異性基因靜默(sequence-specific gene silencing)作用的小RNA分 子，它可以是人工合成的小RNA分子，也可以是可產(chǎn)生RNA干涉物質(zhì)?；虿《据d體如腺病毒。多種RNA干 涉物在動物實驗中表現(xiàn)出抗腫瘤的作用(Takeshita F, 0chiya T. Therapeutic potential of RNA interference against cancer. Cancer Sci. 2006 Aug;97(8):689-96)."遞送載體"本發(fā)明中的寡核苷酸或其功能類似物可以用遞送載體遞送應(yīng)用。遞送載體包括但不 限于類固醇(如膽固醇)、絡(luò)合物、乳化物、免疫刺激復(fù)合物(ISCOMs)、脂質(zhì)(如陽離子脂質(zhì)和陰離 子脂質(zhì))、脂質(zhì)體、活的細菌載體(如沙門氏菌、大腸桿菌、分枝桿菌志賀(氏)桿菌、乳酸桿菌)和病毒載 體(如牛痘苗、腺病毒、單純皰疹病毒)、病毒小體、病毒樣顆粒、微球、核酸疫苗、高分子材料(如羧 甲基纖維素、脫乙酰殼多糖)、環(huán)狀多聚物。遞送載體也是靶向特異性受體的配體分子。"生物治療"乳腺癌的"生物治療"包括免疫治療(如抗體類治療藥物和腫瘤疫苗)、血管生成 抑制治療、基因治療和干細胞治療等。"內(nèi)分泌治療"乳腺癌的內(nèi)分泌治療是應(yīng)用激素來輔助治療激素依賴性乳腺癌。


圖l:寡核苷酸(ODN)對人外周血單個核細胞增生的剌激作用橫座標(biāo)為人工合成ODN的劑量，縱座標(biāo)為樣品1分鐘的放射性讀數(shù)(cpm)。結(jié)果表明，YW101能有 效的刺激人外周血單個核細胞增殖，其刺激作用隨著YWIOI的劑量的增加而增強。 圖2:寡核苷酸(ODN)對小鼠脾細胞增生的刺激作用橫坐標(biāo)代表不同的ODN，縱坐標(biāo)為樣品1分鐘的放射性讀數(shù)(cpm)。結(jié)果表明，YWIOI， YW102 能有效的刺激小鼠的脾細胞增殖。圖3:寡核苷酸(ODN)對人外周血B細胞，NK細胞和單核細胞的激活作用散點圖橫軸為前向散射，縱軸分別為PE標(biāo)記的CD19、 CD56和CD14的單克隆抗體，CD19、 CD56 和CD14分別是B細胞，NK細胞和單核細胞的特征性表面標(biāo)志；直方圖的橫軸為FITC的平均強度，即 相應(yīng)的CD69的活化情況，縱軸為相應(yīng)強度的細胞個數(shù)。結(jié)果表明，YW101， YW102可以有效的上調(diào)人PBMC中B細胞(圖3A)， NK細胞(圖3B)和單核 細胞(圖3C)中CD69的表達。圖4:寡核苷酸(ODN)對小鼠乳腺癌的治療作用(腫瘤體積) 橫座標(biāo)為注射腫瘤后的天數(shù)，縱座標(biāo)為腫瘤的體積。結(jié)果表明，與注射PBS比較，腹股溝注射YWIOI， YW102都能有效的抑制腫瘤的生長(PO.05), 其中右側(cè)(即腫瘤的同側(cè))淋巴結(jié)注射YW101后抑制腫瘤生長的效果最明顯(PO.01)。 圖5:寡核苷酸(ODN)對小鼠乳腺癌的治療作用(生存率)圖中橫座標(biāo)為注射腫瘤后的天數(shù)，縱座標(biāo)為小鼠的生存率。結(jié)果表明，與PBS組相比，在腫瘤同側(cè)和對側(cè)的腹股溝注射YW101可以有效的抑制腫瘤的生長 (p<0.05)，在腫瘤同側(cè)的腹股溝注射YW102也可以有效抑制腫瘤生長(p<0.05)，其中在腫瘤同側(cè)注射 YW101的抑瘤效果最明顯(p-O.OOl)。圖6:寡核苷酸(ODN)對小鼠乳腺癌的預(yù)防作用(腫瘤重量)橫座標(biāo)代表組別PBS:右側(cè)腹股溝注射PBS; 25嗎右側(cè)腹股溝注射25嗎YW101 ， 50嗎右側(cè)腹 股溝注射50 ngYW101;縱坐標(biāo)代表腫瘤重量。結(jié)果表明，與注射PBS比較，注射50叫YW101能有效抑制腫瘤發(fā)生(PO.05),種瘤前注射25嗎 也可以有效抑制腫瘤生長(P=0.035)。
具體實施方式
實施例1寡核苷酸(ODN)對人外周血單個核細胞增生的刺激作用1. 人外周單個核細胞的分離(1) 、儀器設(shè)備、器材、試劑和材料低溫冰箱，二氧化碳孵箱，超凈工作臺，倒置顯微鏡，細胞培養(yǎng)瓶，血球計數(shù)器，水平離心機，加樣 器，各種規(guī)格的滴管等。ODN:均由Takara公司合成，OPC級別，其磷酸骨架除特殊標(biāo)明外均為全硫代修飾。以PBS (配方 參考《分子克隆實驗指南(第三版)》)溶解，紫外分光光度計定量。 肝素抗凝的人外周血白細胞長春市中心血站。 聚葡糖一泛影葡胺比重1.077土0.001，北京鼎國生物技術(shù)公司。RPMI1640培養(yǎng)液L一谷氨酰胺的RPMI1640 (GIBCOBRL) 10.4克，碳酸氫鈉2.0克，慶大霉素 10萬單位，加超純水至1000毫升，0.22微米的濾膜抽濾除菌，分裝。含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基10毫升胎牛血清(Invitrogen)，卯毫升RPMI1640培養(yǎng)基(2) 方法用聚葡糖一泛影葡胺淋巴細胞分離液分離人外周血的單個核細胞。分離液與肝素抗凝濃縮白細胞體積 比為2: 1,水平離心(1， 000 Xg, 30分鐘)，用滴管吸取單個核細胞的液帶，置入另一離心管中，加入 等體積的無血清培養(yǎng)基，1， 000 g離心IO分鐘，棄上清。重復(fù)洗滌兩次，以5毫升的培養(yǎng)基重懸細胞， 細胞計數(shù)。2. 3H-Tdr摻入實驗(1)儀器、設(shè)備、器材、試劑和材料 低溫冰箱，二氧化碳孵箱，超凈工作臺，倒置顯微鏡，細胞培養(yǎng)瓶，血球計數(shù)器，水平離心機，p計數(shù)儀，加樣器，玻璃纖維濾紙等。3H-胸腺嘧啶核苷中國科學(xué)院上海原子核研究所。閃爍液稱取2， 5—二苯基噁唑(PPO)4克，1, 4雙[5—苯基噁唑基一2]苯100毫克，溶解于1000 毫升二甲苯中。RPMI1640培養(yǎng)液同上。采用的ODN為YW101， 2216， 2006和C274 。 2216是指CpG2216 (5'gggggacgatcgtcgggggg3，) (Dominique De Wit, et al. Blood plasmacytoid dendritic cell responses to CpG oligonucleotides are impaired in human newborns. Bloody 1 Feb, 2004,Vol 103, Num 3:1030-103) 。 2006 是指 CpG2006 (5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3,) (Dominique De Wit, et al. Blood plasmacytoid dendritic cell responses to CpG oligodeoxynucleotides are impaired in human newborns. Blood, 1 Feb, 2004,Vol 103， Num 3:1030-103)。 C274 是指CpG C274 (5，-tcgtcgaacgttcgagatgat3，) (Omar Duramad，et al. Inhibitors of TLR-9 Act on Multiple Cell Subsets in Mouse and Man In Vitro and Prevent Death In Vivo from Systemic Inflammation. The Journal of Immunology, 2005, 174: 5193—5200)。YW101的序歹!]為5'-tegcgaacgttcgccgcgttcgaacgcgg-3'。2006的序列為5，-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3'。2216的序列為5'-GGgggacgategtcGGGGGg-3'(其中大寫的G為全硫代修飾)。 C274的序列為5 '-tcgtcgaacgttcgagatgat-3 ，。(2)方法采用96孔圓底培養(yǎng)板，以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)人外周血單個核細胞，6"05個細胞/孔。 設(shè)立實驗組和對照組，實驗組加入ODNYW101,對照組分別加入ODN2006、 2216、 C274。每組培養(yǎng)孔中 ODN的終濃度均為3 pg/ml。ODN作用48小時后，加入SH-Tdr, 0.5 M^i/ L，再作用16小時，收集細胞于玻璃紙上，50 。C 3個 小時烘干。將相應(yīng)玻璃紙加入到閃爍液中，作用12小時，用P計數(shù)儀檢測1分鐘的放射性讀數(shù)(cpm)。3.實驗結(jié)果YW101可以有效的刺激人外周血單個核細胞增殖，具有劑量依賴的線性關(guān)系(圖l)。 結(jié)論YW101可以有效的刺激人外周血單個核細胞的活化增殖。實施例2寡核苷酸(ODN)對小鼠脾細胞增生的刺激作用1.小鼠脾細胞的分離(1)儀器、設(shè)備、器材、試劑和材料 低溫冰箱，二氧化碳孵箱，超凈工作臺，倒置顯微鏡，液氮罐，細胞培養(yǎng)瓶，血球計數(shù)器，水平離心 機，加樣器，200目濾網(wǎng)，各種規(guī)格的滴管等。紅細胞裂解液分別稱取KHC03lg, EDTA.Na2 37.2 g, NH4Cl 8.29g,加入800ml水，調(diào)PH值到 7.2~7.4，再加水至1L，過濾滅菌。RPMI1640培養(yǎng)液同上。C57/BL, BALB/c及昆明鼠均購自北京維通利華公司。采用的ODN為YW101， YW102, 1585, 1826和C274。 1585， 1826是指CpG 1585 (Heidi H.vanOjil^et al.CpG-A and B Oligodeoxynucleotides Enhance the Efficacy of Antibody Therapy by Activating Different Effector Cell Populations.Cancer Research ，1 Sep,2003，Vo163,5595-5600)。 CpG 1826是指(Heidi H.van Ojik^et al.CpG-A and B Oligodeoxynucleotides Enhance the Efficacy of Antibody Therapy by Activating Different Effector Cell Populations.Cancer Research ，1 Sep，2003,Vo163,5595-5600)。YW101序列同上；YW102的序列為5'- tcgcgacgttcgcccgacgttcggta -3'。1585的序列為5'-GGggtcaacgttgaGGGGGg-3'(其中大寫的G為全硫代修飾) 1826的序列為5，-tccatgacgttcctgacgtt-3'; C274:序列同上。(2)方法脫臼處死小鼠后，無菌分離脾臟，將脾臟放置毛玻璃上，研壓脾臟，經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾獲細胞懸液。 水平離心(1， 000 g， 5分鐘)，棄上清，重懸細胞后，加入lml紅細胞裂解液，室溫放置lmin，補加10 %胎牛血清的RPMI1640至5 ml，再次水平離心(1， 000 g， 5分鐘)，重懸后，200目濾網(wǎng)過濾得小鼠 脾細胞懸液，細胞計數(shù)。2. 3H-Tdr摻入實驗(1)儀器、設(shè)備、器材、試劑和材料低溫冰箱，二氧化碳孵箱，超凈工作臺，倒置顯微鏡，細胞培養(yǎng)瓶，血球計數(shù)器，水平離心機，p計 數(shù)儀，加樣器，玻璃纖維濾紙等。 RPMI1640培養(yǎng)液同上。 (2)方法采用96孔圓底培養(yǎng)板，以含10W胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)小鼠脾細胞，5"05個細胞/孔。設(shè)立實 驗組和對照組，實驗組加入ODN YWIOI、 YW102，對照組分別加入1585、 1826、 C274。每組培養(yǎng)孔中 ODN的終濃度均為3 pg/ml。ODN作用48小時后，加入"H-Tdr, 0.5 fiCi/孔，16小時后，收集細胞于玻璃纖維濾紙上，50 'C， 3 個小時烘干。將相應(yīng)玻璃纖維濾紙加入到閃爍液中，12小時后，用p計數(shù)儀檢測1分鐘的放射性讀數(shù) (cpm)。3、 實驗結(jié)果YWIOI， YW102可以有效的刺激小鼠脾細胞增殖(圖2)。 結(jié)論YWIOI， YW102可以有效的剌激小鼠脾細胞的活化增殖。實施例3寡核苷酸(ODN)對人外周血B細胞，NK細胞和單核細胞的激活作用1、 人外周單個核細胞的分離方法同上。2、 ODN剌激人外周血單個核細胞的活化實驗采用24孔板，以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)人外周血單個核細胞，3xl(^個細胞/孔。設(shè)立實 驗組和對照組，實驗組加入ODN YWIOI、 YW102,對照組分別加入2216、 2006、 C274。每組培養(yǎng)孔中 ODN的終濃度均為3 ng/ml，其序列如上所示。ODN作用18小時后，用BD公司(USA)生產(chǎn)的PE標(biāo)記的CD19，CD56和CD14抗體及FITC標(biāo)記的 CD69對細胞進染色。具體方法是:將細胞和PE標(biāo)記的抗體及FITC標(biāo)記的CD69在4'C下避光共孵育30分 鐘。然后收集細胞，利用流式細胞儀(BD， USA)檢測相應(yīng)PE標(biāo)記的細胞的FITC的強度，即CD69的強 度。CD19, CD56, CD14分別是人外周血中B細胞，NK細胞和單核細胞的表面標(biāo)志性分子，CD69做為淋巴 細胞早期活化的標(biāo)志性抗原，主要表達在T, B和NK細胞的表面。3、 實驗結(jié)果YW101, YW102可以有效的上調(diào)人PBMC中B細胞(圖3A), NK細胞(圖3B)和單核細胞(圖3C) 中CD69。結(jié)論YW101, YW102可以有效的活化人PBMC中B細胞，NK細胞和單核細胞。 實施例4寡核苷酸(ODN)對小鼠乳腺癌的治療作用1. 儀器、設(shè)備、器材、試劑和材料二氧化碳孵箱，超凈工作臺，倒置顯微鏡，細胞培養(yǎng)瓶，血球計數(shù)器，水平離心機，加樣器，游標(biāo)卡 尺，各種規(guī)格的滴管等。RPMI1640培養(yǎng)基同上。 0.25%胰蛋白酶(Tiypsin)。2. 實驗方法以含10%胎牛血清的RPMI 1640體外傳代培養(yǎng)EMT6細胞[ATCC， BALB/c小鼠的乳腺癌細胞系 (Miaden Korbelik,et al，The Role of Host Lymphoid Populations in the Response of Mouse EMT6 Tumor to Photodynamic Therapy, 15 Dec,Vol 56,5647-5652)],在細胞進入對數(shù)生長期時，以含2mM EDTA的0.25% 的胰酶消化細胞，以無血清RPMI 1640離心洗滌細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度為2.5X10Vml，皮下注射200 ^的 此細胞懸液到BALB/c小鼠右側(cè)背下部靠近尾根部約0.7cm處。待腫瘤可觸及(約3X3mm)后，注射 ODN或PBS。將6 8周齡，18 22 g小鼠分為4組，每組12只，每48小時注射100 pi ODN或PBS —次，ODN 的濃度為250 pg/ml，共注射6次。 實驗分組YW101組，右后肢腹股溝皮下注射； YW102組，右后肢腹股溝皮下注射； YWlOl (對)組，左后肢腹股溝皮下注射； PBS組，右后肢腹股溝皮下注射。3. 實驗結(jié)果在注射ODN后，每兩天體外測量腫瘤的長度和寬度，計算腫瘤體積(腫瘤的體積4/2X長X寬勺(圖 4);記錄小鼠的死亡日期(圖5.).用SPSS對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果表明，與PBS組相比，在腫瘤同側(cè)和對側(cè)的腹股溝注射YWlOl能有效抑制腫瘤生長(p<0.05), 在腫瘤同側(cè)的腹股溝注射YW102也能有效抑制腫瘤生長(p<0.05)，其中在腫瘤同側(cè)注射YWlOl的抑瘤 效果最明顯(p<0.01)(圖4)。與PBS組相比，在腫瘤同側(cè)和對側(cè)的腹股溝注射YWlOl能有效的延長荷瘤小鼠的生存期(p<0.05)， 在腫瘤同側(cè)的腹股溝注射YW102也可以有效的延長荷瘤小鼠的生存期0)=0.027)，其中在腫瘤同側(cè)注射 YWlOl的效果最明顯。=0.001)(圖5)。結(jié)論YWIOI， 102對小鼠乳腺癌有治療作用。實施例5寡核苷酸(ODN)對小鼠乳腺癌的預(yù)防作用 1.儀器、設(shè)備、器材、試劑和材料二氧化碳孵箱，超凈工作臺，倒置顯微鏡，細胞培養(yǎng)瓶，血球計數(shù)器，水平離心機，加樣器，電子天 平，各種規(guī)格的滴管等。RPMI1640培養(yǎng)基同上。0.25%胰蛋白酶(Tiypsin)。 2實驗方法建立小鼠乳腺癌模型的方法同上。將6 8周齡，18 22gBALB/c小鼠小鼠分為3組，每組10只，以注射小鼠腫瘤細胞為第0天計， 分別在-4， -2和0天各注射100 nl ODN或PBS —次。 實驗分組YW101 25嗎組，調(diào)節(jié)濃度為250 pg/mi，右后肢腹股溝皮下注射； YW10150ng組，調(diào)節(jié)濃度為500 ng/ml，右后肢腹股溝皮下注射； PBS組，右后肢腹股溝皮下注射。3.實驗結(jié)果觀察并記錄出瘤率(表l);種瘤后40天處死荷瘤小鼠，取出腫塊，稱重，記錄腫瘤重量(圖6)。用 SPSS對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果表明，與注射PBS比較，注射50嗎YW101能有效抑制腫瘤發(fā)生(P<0.05),種瘤前注射25嗎 也可以有效抑制腫瘤生長(P=0.035)。 表1 小鼠出瘤率實驗分組出瘤小鼠數(shù)/小鼠接種總數(shù)(％)PBS80% (8/10)YW101(25嗎)90%(9闊YW101(50 ng)20%(2/10)結(jié)論YWIOI， 102對小鼠乳腺癌有預(yù)防作用。 序列表<110>長春華普生物技術(shù)有限公司<120> —種具有治療乳腺癌作用的寡核苷酸<160> 2<210> 1 <211>29 <212> DNA <213>人工合成的 <400> 1tcgcgaacgt tcgccgcgtt cgaacgcgg 29<210>2 <211> 26 <212>DNA <213>人工合成的 <400> 2tcgcgacgtt cgcccgacgt tcggta 2權(quán)利要求
1、選自具有如下序列表中所示序列的一種寡核苷酸SEQ ID NO1、SEQ ID NO2。
2、 以權(quán)利要求l所述的寡核苷酸為基本結(jié)構(gòu)而進行突變的寡核苷酸。這里的"突變的寡核苷酸"是指在權(quán)利要求l所述的寡核苷酸內(nèi)部進行的一個或幾個核苷酸的突變而產(chǎn)生的寡核苷酸。突變的方式包括在權(quán)利要求l所述的寡核苷酸內(nèi)進行的一個或幾個核苷酸的刪除、添 加、置換。
3、 以如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述寡核苷酸為核心結(jié)構(gòu)的寡核苷酸，即在權(quán)利要求l或 權(quán)利要求2所述寡核苷酸兩側(cè)可以添加不限定長度和序列的寡核苷酸。
4、 權(quán)利要求l-3中任一所述的寡核苷酸是經(jīng)化學(xué)修飾后所產(chǎn)生的寡核苷酸。
5、 權(quán)利要求l-4中任一所述的寡核苷酸通過刺激人或鼠免疫細胞增殖而使人或鼠免疫功 能增強的方法。
6、 權(quán)利要求l-4中任一所述的寡核苷酸活化人免疫細胞的方法。這些方法包括但不限于 通過刺激人外周血中的B細胞高表達CD69分子而活化B細胞的方法；通過刺激人外周血中的NK 細胞高表達CD69分子而活化M細胞的方法；通過刺激人外周血中的單核細胞高表達CD69分子 而活化單核細胞的方法。
7、 權(quán)利要求l-4中任一所述的寡核苷酸用于預(yù)防或治療動物模型小鼠乳腺癌的方法。
8、 權(quán)利要求l-4中任一所述的寡核苷酸通過增強免疫功能尤其是抗腫瘤免疫反應(yīng)來預(yù)防或治療動物模型小鼠乳腺癌的方法。
9、 權(quán)利要求1-4中任一所述的寡核苷酸用于制備用于預(yù)防人乳腺癌的制劑的用途。
10、 權(quán)利要求l-4中任一所述的寡核苷酸用于制備用于治療人乳腺癌的制劑的用途。
11、 權(quán)利要求l-4中任一所述的寡核苷酸用于制備用于預(yù)防或治療個體乳腺癌的制劑的用途。
12、 按照權(quán)利要求IO、 ll任一所述的用途，其中的寡核苷酸在給予荷乳腺癌個體時，可 以聯(lián)合應(yīng)用于如下一種或幾種乳腺癌治療方法的用途手術(shù)、化療、放療、生物治療、內(nèi)分 泌治療。
13、 按照權(quán)利要求9一12任一所述的用途，其中的寡核苷酸在給予人或其它個體時，在給 藥形式上可以單獨應(yīng)用或與藥物學(xué)可接受的載體一起應(yīng)用的方法。
14、 按照權(quán)利要求9一13任一所述的用途或方法，其中的寡核苷酸在給予個體時可以作為 藥物組合物中的有效成分進行應(yīng)用的方法。
15、 按照權(quán)利要求9一14任一所述的用途或方法，其中的寡核苷酸在給予個體時可經(jīng)腸內(nèi) 或(和)腸外等給藥途徑施行的方法，其中腸外給藥途徑包括腫瘤組織直接注射、腫瘤旁注射、淋巴結(jié)內(nèi)注射、淋巴結(jié)旁注射、腹膜內(nèi)注射、皮內(nèi)注射、皮下注射、肌肉注射等。
16、 按照權(quán)利要求9一15任一所述的用途或方法,其中的寡核苷酸在給予個體時可以單獨 應(yīng)用，或自身聯(lián)合應(yīng)用，或與一種或幾種其它的抗腫瘤制劑聯(lián)合應(yīng)用的方法。
17、 按照權(quán)利要求9一16任一所述的方法中，其中的寡核苷在給予個體時可以和遞送載體 聯(lián)合應(yīng)用。
18、 按照權(quán)利要求9一17任一所述的方法中，其中的寡核苷酸的應(yīng)用劑量為治療有效劑量。
19、 權(quán)利要求l-4中任一所述的寡核苷酸用于制備用于預(yù)防或治療人類腫瘤的制劑的用 途。這里的人類腫瘤包括但不限于乳腺癌、肺癌、腎癌、胃癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、胰腺 癌、腦膠質(zhì)瘤、淋巴瘤、白血病和骨髓瘤。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種寡核苷酸，該寡核苷酸在體外具有刺激免疫細胞增殖、活化的功能。動物實驗表明，該種寡核苷酸可以用于預(yù)防和治療乳腺癌。該寡核苷酸可以用于制備用于預(yù)防或治療人乳腺癌的制劑的用途。
文檔編號C07H21/04GK101333237SQ20071012346
公開日2008年12月31日 申請日期2007年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月26日
發(fā)明者于永利, 亮 楊, 王麗穎 申請人:長春華普生物技術(shù)有限公司