專利名稱：：具有抗微生物活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的制作方法具有抗微生物活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸序列表本發(fā)明包含序列表。發(fā)明領域本發(fā)明涉及具有抗微生物活性的分離的多肽和編碼該多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細胞，以及用于產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。發(fā)明背景本發(fā)明的目的是提供具有抗微生物活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸。發(fā)明簡述本發(fā)明涉及具有抗微生物活性的分離的多肽，其選自下組(a)多肽，其具有與SEQIDNO:2的氨基酸1至21有至少60%同一性的氨基酸序列；(b)由核苷酸序列編碼的多肽，所述核苷酸序列在至少中嚴緊條件下與(i)SEQIDNO:l的核苷酸496至558，(ii)SEQIDNO:l的核苷酸1至558中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；(c)變體，其包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的氨基酸l至21;和(d)具有微生物活性的(a)或(b)的片段。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其編碼具有抗微生物活性的多肽，所述分離的多核苷酸選自下組(a)編碼多肽的多核苷酸，所述多肽具有與SEQIDNO:2的氨基酸1至21有至少60%同一性的氨基酸序列；(b)與SEQIDNO:l的核苷酸496至558有至少60%同一性的多核苷酸；和(c)多核苷酸，其在至少中嚴緊條件下與(i)SEQIDNO:l的核苷酸496至558,(ii)SEQIDNO:l的核苷酸1至558中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、重組表達載體和重組宿主細月包。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生這些具有抗微生物活性的多肽的方法，其包括(a)將包含核酸構(gòu)建體的重組宿主細胞在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)，所述核酸構(gòu)建體包含編碼所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明所述多肽和多核苷酸的方法。定義抗微生物活性術(shù)語"抗微生物活性"在本文中定義為能夠殺死或抑制微生物細胞生長的活性。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"抗微生物"的意思指存在殺細菌的(bactericidal)和/或抑細菌的(bacteriostatic)和/或殺真菌的(fungicidal)和/或抑真菌的(fungistatic)作用和/或殺病毒的作用，其中應將術(shù)語"殺細菌的，，理解為能夠殺死細菌細胞。應將術(shù)語"抑細菌的，，理解為能夠抑制細菌生長，即，抑制生長的細菌細胞。應將術(shù)語"殺真菌的"理解為能夠殺死真菌細胞。應將術(shù)語"抑真菌的"理解為能夠抑制真菌生長，即，抑制生長的真菌細胞。應將術(shù)語"殺病毒的"理解為能夠使病毒失活。術(shù)語"微生物細胞"代表細菌或真菌細胞(包括酵母)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"抑制微生物細胞的生長"的意思指細胞處于非生長的狀態(tài)，即，它們不能增殖。f尤本發(fā)明而言,可才艮才居Lehrerefa/"JournalofImmunologicalMethods,Vol.137(2)pp.167-174(1991)所描述的方法測定抗微生物活性?；蛘撸刮⑸锘钚钥筛鶕?jù)CLSI(臨床和實驗室標準協(xié)會(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute);先前稱為國家臨床和實驗室標準委員會(NationalcommitteeforClinicalandLaboratoryStandards))的NCCLS準則測定。在具有抗微生物活性的多肽的25%(重量/重量)水溶液中，優(yōu)選在10%(重量/重量)的水溶液中，更優(yōu)選在5%(重量/重量)的水溶液中，甚至更優(yōu)選在1%(重量/重量)的水溶液中，最優(yōu)選在0.5%(重量/重量)的水溶液中，并且特別6是在0.1%(重量/重量)的水溶液中，于2CTC溫育24小時之后(優(yōu)選12小時之后，更優(yōu)選8小時之后，更優(yōu)選4小時之后，更優(yōu)選2小時之后，最優(yōu)選1小時之后，并且特別是30分鐘之后)，具有抗;徵生物活性的多肽可能能夠?qū)⒋竽c桿菌(DSM1576)的活細胞數(shù)減少至1/100。當以1000ppm的濃度添加時，優(yōu)選當以500ppm的濃度添加時，更優(yōu)選當以250ppm的濃度添加時，甚至更優(yōu)選當以100ppm的濃度添加時，最優(yōu)選當以50ppm的濃度添加時，并且特別是當以25ppm的濃度添加時，具有抗微生物活性的多肽可能還能夠于25。C在微生物的生長底物(growthsubstrate)中將大腸桿菌(DSM1576)的生長暈(outgrowth)抑制24小時。在具有抗微生物活性的多肽的25%(重量/重量)水溶液中，優(yōu)選在10%(重量/重量)的水溶液中，更優(yōu)選在5%(重量/重量)的水溶液中，甚至更優(yōu)選在1%(重量/重量)的水溶液中，最優(yōu)選在0.5°/。(重量/重量)的水溶液中，并且特別是在0.1%(重量/重量)的水溶液中，于20。C溫育24小時之后(優(yōu)選12小時之后，更優(yōu)選8小時之后，更優(yōu)選4小時之后，更優(yōu)選2小時之后，最優(yōu)選1小時之后，并且特別是30分鐘之后)，具有抗微生物活性的多肽可能能夠?qū)⒖莶菅挎邨U菌(5ac/〃wwte'fe)(ATCC6633)的活細胞數(shù)減少至1/100。當以1000ppm的濃度添加時，優(yōu)選當以500ppm的濃度添加時，更優(yōu)選當以250ppm的濃度添加時，甚至更優(yōu)選當以100ppm的濃度添加時，最優(yōu)選當以50ppm的濃度添加時，并且特別是當以25ppm的濃度添加時，具有抗微生物活性的多肽可能還能夠于25。C在微生物的生長底物中將枯草芽孢桿菌(ATCC6633)的生長暈抑制24小時。本發(fā)明的多肽具有至少20%,優(yōu)選至少40%,更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少60%,更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少80%,甚至更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少100%的由SEQIDNO:2的氨基酸1至21所示氨基酸序列組成的多肽的抗微生物活性。分離的多肽術(shù)語"分離的多肽"用于本文中指，如通過SDS-PAGE測定的，其為至少20%純，優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，最優(yōu)選至少90%純，并且甚至最優(yōu)選至少95%純的多肽?；旧霞兊亩嚯男g(shù)語"基本上純的多肽"在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物按重量計含有至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%,更優(yōu)選至多5%,更優(yōu)選至多4%，至多3%，甚至更優(yōu)選至多2°/。，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5。/。的與其天然結(jié)合的(associated)的其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計是至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99%純，最優(yōu)選至少99.5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式。具體而言，優(yōu)選所述多肽是"基本上(essentially)純的形式"，即，所述多肽制備物基本上不含與其天然結(jié)合的其它多肽材料。這能夠通過以下方法實現(xiàn)，例如，通過公知的重組方法或由經(jīng)典純化方法制備多肽。在本文中，術(shù)語"基本上純的多肽"與術(shù)語"分離的多肽"和"分離形式的多肽"同義。同一性參數(shù)"同一性"描述兩個氨基酸序列之間或兩個核香酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的同一性程度通過使用包括在FASTA程序包版本2.0x中的程序FASTA(參見W.R.PearsonandD.J,Lipman(1988),"ImprovedToolsforBiologicalSequenceAnalysis",PNAS85:2444-2448;和W.R.Pearson(1990)"RapidandSensitiveSequenceComparisonwithFASTPandFASTA",MethodsinEnzymology183:63隱98)來測定。使用的計分矩陣是BLOSUM50，缺口罰分(gappenalty)是-12，并且缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)是-2。兩個核苷酸序列之間的同一性程度使用與上述相同的算法和軟件包來測定。使用的計分矩陣是同一性矩陣，缺口罰分是-16,并且缺口延伸罰分是-4?？晒┻x擇的是，兩個氨基酸序列的比對通過使用EMBOSS軟件包(http:〃emboss.org)版本2.8.0的Needle程序來測定。Needle程序執(zhí)行總體比對算法(globalalignmentalgorithm),所述算法描述于Needleman,S.B.andWunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453中。使用的取代矩陣是BLOSUM62，缺口開啟罰分(gapopeningpenalty)是10,并且缺口延伸罰分是0.5。本發(fā)明的氨基酸序列(如SEQIDNO:2的氨基酸1至43)和不同的氨基酸序列之間的同一性程度，是以兩個序列的比對中精確匹配的數(shù)目，除以"本發(fā)明序列"的長度(氨基酸殘基數(shù))來計算；或者使用Needle標記為"最長同一性"的輸出作為百分比同一性，如下計算(同一殘基xiooy(比對的長度-比對中缺口凄t)。結(jié)果以百分比同一性表示。多肽片段術(shù)語"多肽片段"在本文中定義為從SEQIDNO:2的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個氨基酸的多肽或其同源序列，其中所述片段具有抗微生物活性。在實施方式中，所述片段包括至少15，優(yōu)選至少16，更優(yōu)選至少17,甚至更優(yōu)選至少18，最優(yōu)選至少19并且特別是至少20個連續(xù)的SEQIDNO:2的氨基酸。亞序列術(shù)語"亞序列(subs叫uence)"在本文中定義為從SEQIDNO:l的5，和/或3，端缺失一個或多個核苷酸的核苷酸序列或其同源序列，其中所述亞序列編碼具有抗微生物活性的多肽片段。等位變體(allelicvariant):術(shù)語"等位變體"在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或更多種可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基l踏列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽?；旧霞兊亩嗪讼闼嵝g(shù)語"基本上純的多核苷酸"用于本文指無其它外來的或不期望的核苷酸的多核苷酸制備物，并且所述多核苷酸制備物處于適合于在遺傳工程的蛋白質(zhì)產(chǎn)生體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苦酸按重量計含有至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%,更優(yōu)選至多5%,更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%,最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5'和3，非翻譯區(qū)，例如啟動子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98%純，最優(yōu)選至少99%,并且甚至最優(yōu)選至少99.5%純。本發(fā)明所述多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式。具體而言，優(yōu)選在本文公開的多核苷酸是"基本上純的形式"，即，所述多核苷酸制備物基本上不含與其天然結(jié)合的其它多核苷酸材料。在本文中，術(shù)語"基本上純的多核苷酸"與術(shù)語"分離的多核苷酸，，和"分離形式的多核苷酸"同義。所述多核苷酸可以是基因組的、cDNA、RNA、半合成的、合成的來源，或它們的任何組合。cDNA:術(shù)語"cDNA"在本文中定義為能夠通過反轉(zhuǎn)錄從得自真核細胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過一系列的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。這些步驟包括通過稱為剪接的過程去除內(nèi)含子序列。源自mRNA的cDNA因而沒有任何內(nèi)含子序列。核酸構(gòu)建體術(shù)語"核酸構(gòu)建體"用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或?qū)⑺龊怂岱肿右员緛聿淮嬖谟?nototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的片段。當所述核酸構(gòu)建體含有本發(fā)明的編碼序列表達所需的調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語"表達盒"同義。調(diào)控序列(controls叫uence):術(shù)語"調(diào)控序列，，在本文定義為包括對編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸表達是必需的或有利的所有成分。各種調(diào)控序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻i奪的終止信號。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接。可操作地連接術(shù)語"可操作地連接"在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的合適位置，使得調(diào)控序列指導多肽編碼序列的表達。編碼序列當用于本文時術(shù)語"編碼序列"的意思是直接指定其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷S吏序列。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和TTG開始。編碼序列可以是DNA、cDNA或重組核苷酸序列。表達術(shù)語"表達"包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達載體術(shù)語"表達載體，，在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達的額外核香酸可操作地連接。宿主細胞如本文中所使用的術(shù)語"宿主細胞"包括任何細胞類型，所述細胞類型對于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導等是易感的(susceptible)。fl"飾術(shù)語"修飾"在本文的意思是對由SEQIDNO:2的氨基酸1至21組成的多肽的任何化學修飾，以及對編碼這種多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸以及取代一個或多個氨基酸側(cè)鏈；或在氨基酸序列中使用具有相似特性的非天然氨基酸。具體而言所述修飾可以是?；?，例如C末端的酰胺化。人工變體當用在本文時，術(shù)語"人工變體"的意思是具有抗微生物活性的多肽，所述多肽由表達SEQIDNO:l的修飾的核苷S^列的生物體產(chǎn)生。所述》務飾的核苷酸序列通過人為干預(humanintervention)通過修飾公開于SEQIDNO:l的核苷S吏序列來獲得。發(fā)明詳述具有抗微生物活性的多肽在第一個方面，本發(fā)明涉及具有抗微生物活性的分離的多肽，所述多肽具有與SEQIDNO:2的氨基酸1至21(即，成熟多肽)有至少60%，優(yōu)選至少65%,更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%,甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少97%的同一性程度的氨基S交序列(下文中的"同源多肽")。在優(yōu)選的方面，所述同源多肽具有氨基S交序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的氨基酸1至21相差10個氨基酸，優(yōu)選5個氨基酸，更優(yōu)選4個氨基酸，甚至更優(yōu)選3個氨基酸，最優(yōu)選2個氨基酸，并且甚至最優(yōu)選1個氨基酸。本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO:2的氨基S吏序列或其等位變體；或它們的具有抗微生物活性的片段。在優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在另外的優(yōu)選方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸l至21,或其等位變體；或它們的具有抗微生物活性的片段。在另外的優(yōu)選方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1至21。在另外的優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基S吏序列或其等位變體；或它們的具有抗微生物活性的片段組成。在另外的優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成。在另外的優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸1至21或其等位變體；或它們的具有抗微生物活性的片段組成。在另外的優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸l至21組成。在第二個方面，本發(fā)明涉及具有抗微生物活性的分離的多肽，所述分離的多肽由多核苦酸編碼，所述多核香酸在非常低嚴緊條件下，優(yōu)選低嚴緊條件下，更優(yōu)選中嚴緊條件下，更優(yōu)選中-高嚴緊條件下，甚至更優(yōu)選高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選非常高嚴緊條件下與以下序列雜交(i)SEQIDNO:l的核苦酸496至558,(ii)SEQIDNO:1的核香酸1至558中包含的cDNA序列，(Hi)(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch,andT.Maniatus,1989,Mo/ecw/arC7om'"g,Za6oraforjMa"wa/,2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:1的亞序列含有至少IOO個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。此外，所述亞序列可以編碼具有抗微生物活性的多肽片段。SEQIDNO:l的核苦酸序列或其亞序列，以及SEQIDNO:2的氨基酸序列或其片段，可以用以設計核酸探針，以根據(jù)本領域內(nèi)公知的方法從不同屬和種的菌抹鑒定和克隆編碼具有抗微生物活性的多肽的DNA。具體而言，根據(jù)標準的Southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑒定和分離其中相應的基因。這些探針可明顯短于完整序列，^旦長度上應為至少14,優(yōu)選至少25,更優(yōu)選至少35，并且最優(yōu)選至少70個核苷酸。然而，優(yōu)選所述核酸纟笨針的長度是至少100個核苷酸。例如，所述核酸探針可以是至少200個核苷酸，優(yōu)選至少270個核苷酸。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標記以探測相應的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標記)。將這些探針包含于本發(fā)明中。因而，可從由這些其它生物體制備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交并且編碼具有抗微生物活性的多肽。可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過其它分離技術(shù)分離來自這些其它生物體的基因組或其它DNA?？梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉(zhuǎn)移定與SEQIDNO:l或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料用在Sounthern印跡中。就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴緊條件下與對應于SEQIDNO:l中所示核苷酸序列的標記的核g史探針、它的互補鏈或它們的亞序列雜交?？墒褂肵射線片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與所述核酸探針雜交的分子。在優(yōu)選的方面，核酸探針是多核苷S臾序列，所述多核苷S吏序列編碼SEQIDNO:2的多肽或其亞序列。在另外的優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:l。在另外的優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:l的成熟多肽編碼區(qū)。對于長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴緊條件定義為在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200嗎/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中預雜交和雜交，并且對于非常低和低嚴緊性為25%的曱酰胺、對于中和中-高嚴緊性為35%的曱酰胺或?qū)τ诟吆头浅８邍谰o性為50%的曱酰胺，根據(jù)標準的Southern印跡法進行最佳12至24小時處理。對于長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2XSSC、0.2。/。SDS優(yōu)選至少在45。C(非常低嚴緊性)，更優(yōu)選至少在50。C(低嚴緊性)，更優(yōu)選至少在55。C(中嚴緊性)，更優(yōu)選至少在60。C(中-高嚴緊性)，甚至更優(yōu)選至少在65。C(高嚴緊性)，并且最優(yōu)選至少在70。C(非常高嚴緊性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴緊條件定義為在比用根據(jù)Bolton和McCarthy計算法(1962，PraceW/"^Jca&myo/5We"cayt7&448:1390)得出的Tm低大約5。C至大約10。C，在0.9MNaCl、0.09MTris-HClpH7.6、6mMEDTA、0.5%NP-40、IXDenhardt溶液、1mM焦碌酸鈉(sodiumpyrophosphate)、1mM石粦酸二氬鈉(sodiummonobasicphosphate)、0.1mMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根據(jù)標準的Southern印跡步驟進行預雜交、雜交和雜交后洗滌。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在6XSSC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，并用6XSSC在比計算的Tm低5。C至10°C的溫度下洗滌兩次，每次15分鐘。在第三個方面，本發(fā)明涉及人工變體，所述人工變體包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2或其成熟多肽。優(yōu)選氨基酸改變對性質(zhì)是不重要的(ofaminornature),即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為1至大約10個氨基酸的小缺失；小的氨基或欺基末端延伸，例如氨基末端曱硫氨酸殘基；多至大約20-25殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進純化的小延伸，例如多組氛酉臾序歹寸(poly-histidinetract)、4元原表4立(antigenicepitope)或結(jié)合i或。保守取代的實例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和曱硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領域已知的，并且由例3口H.NeumthandR丄.Hill,1979，/"，JTze/Vofe/m1，AcademicPress,NewYork4苗述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。除了20個基本氨基酸，非基本氨基酸(例如4-羥脯氨酸、6-7V-曱基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和a-曱基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基。"非天然氨基酸"在蛋白質(zhì)合成后已經(jīng)修飾，和/或在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上能夠獲得的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolicacid)、p塞唑烷羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫脯氨酸、3-和4-曱基脯氨酸，和3,3-二曱基脯氨酸?？晒┻x擇的是，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)以使多肽的物理化學性質(zhì)改變。例如，氨基酸改變可改進多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適pH等。能夠根據(jù)本領域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(CunninghamandWells,1989，5We"ce244:1081-1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，并且測試所得突變分子的生物活性(即，抗微生物活性)以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton"a/.，1996，■/5/o/.C/7em.271:4699-4708。生物相互作用也能夠通過結(jié)構(gòu)的物理分析而測定，如通過以下這些技術(shù)如核磁共振、晶體學、電子衍射或光親和標記，連同推定的接觸位點氨基酸的突變來測定。參見，例如，deVos"a/.,1992,5b/e"ce255:306-312;Smithef1992，J.Mo/.5w/.224:899-904;Wlodaver"a/.,1992，F(xiàn)五^S309:59-64。必需氨基酸的同一性也能夠從與多肽的同一性分析推斷，所述多肽與根據(jù)本發(fā)明的多肽相關(guān)。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關(guān)的篩選方法，例如那些由Reidhaar-OlsonandSauer,1988，5We廳241:53-57;BowieandSauer,1989,尸rac.iVa"爿o^.5W.175^486:2152-2156;WO95/17413;或WO95/22625公開的那些方法來進行和測試單個或多個氨基酸取代。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowmanaa/.,1991,Aoc/zem.30:10832-10837;美國專利號5,223,409;WO92/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshireda/.，1986,G朋e46:145;Ner"a/.,1988,DiVJ7:127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細胞表達的克隆的、誘變的多肽的活性。能夠從宿主細胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領域內(nèi)標準方法快速測序。這些方法允許快速測定感興趣的多肽中單獨氨基酸殘基的重要性，并且能夠應用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。SEQIDNO:2的氨基酸1至21的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10,優(yōu)選9,更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選至多6，更優(yōu)選至多5,更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選l。在實施方式中，本發(fā)明的多肽包括至少4個半胱氨酸殘基，優(yōu)選所述多肽精確地包括4個半胱氨酸殘基。在另外的實施方式中，所述多肽是環(huán)式多肽(cyclicpolypeptides)。N-末端延伸本發(fā)明所述多肽的N-末端延伸可以適合地由1-50個氨基酸，優(yōu)選2-20個氨基酸，特別是3-15個氨基酸組成。在一個實施方式中，N-末端肽延伸不含Arg(R)。在另外的實施方式中，N-末端延伸包含將在下文進一步定義的kex2或kex2-樣切割位點。在優(yōu)選的實施方式中，N-末端延伸是肽，其包含至少兩個Glu(E)和/或Asp(D)氨基酸殘基，例如包含以下序列之一的N-末端延伸EAE,EE，DE和DD。Kex2位點Kex2位點(參見，例如，MethodsinEnzymologyVol185，ed.D.Goeddel,AcademicPressInc.(1990),SanDiego,CA，"GeneExpressionTechnology，，)禾口kex2-樣位點是存在于某些蛋白質(zhì)的前肽編碼區(qū)和成熟區(qū)之間的二元(di-basic)識別位點(即，切割位點)。在某些情況下kex2位點或kex2-樣位點的插入顯示改進了在前肽切割位點處正確的內(nèi)肽酶加工，致使增加的蛋白質(zhì)分泌水平。在本發(fā)明的上下文中，kex2位點或kex2-樣位點的插入導致在N-末端延伸的特定位置獲得切割的可能性，所述切割導致與SEQIDNO:2的氨基酸1至21所示的成熟多肽相比得到延伸的抗^t生物多肽。融合多肽本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合在本發(fā)明所述多肽或其片段的N-末端或C-末端。通過將編碼另外多肽的核苦酸序列(或其部分)融合至本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)來產(chǎn)生融合多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領域已知的，包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中，并使融合多肽的表達在相同啟動子和終止子的控制下。具有抗^t生物活性的多肽的來源本發(fā)明的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源有關(guān)的術(shù)語"獲得自"，意思是核苷酸序列編碼的多肽由所述來源產(chǎn)生，或由其中插入了來自所述來源的核苷酸序列的菌抹產(chǎn)生。在優(yōu)選的方面，獲得自給定來源的所述多肽是胞外分泌的。本發(fā)明的多肽可以是細菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽性細菌多肽例如芽孢桿菌屬0Bac/〃w)多肽，例如嗜堿芽孢桿菌CBa"7/wa/&/op/2//wiO、解淀粉芽孑包軒菌C6"c/〃ws^/2cz'em1)、短芽孑包軒菌(Bac/〃ws6mW力、環(huán)狀芽孑包才干菌(5fl"7/w51cz>cw/<ms)、凝結(jié)芽孑包桿菌(B(3cf〃wscoagw/<ms)、杣爛芽孑包桿菌0Bac/〃1^/aWw)、遲緩芽孢桿菌CSac/〃M/e^w"、地衣芽孢桿菌(5ac/〃ws/z'c/zemybrm/s)、巨大芽孑包片干菌(5ac〃/w51mega/en'wm)、口耆熱月旨肪芽孑包^f菌(5acz'〃wssteara^zermo;/2z7w力、枯草芽孑包桿菌(Bac/〃wssw6"/k)或蘇云金芽孑包桿菌CBac〃/w"/mn'"gZe"^)多肽；或鏈霉菌屬OSb^ptomyces)多肽，例如，淺青紫鏈霉菌(5^eptomyces//v/(i(ms)或鼠灰鏈霉菌(5^e/tow^cesmwn.ww力多肽；或革蘭氏陰性細菌多肽，例如，大腸桿菌或假單胞菌屬菌種CP化w^wo"os^.)多肽。本發(fā)明的多肽也可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選酵母多肽例如念珠菌屬(Ca"^/a)、克魯維酵母屬(K/wyveram少ce力、畢赤酵母屬(戶/c/zz'a)、酵母屬(5bcc/zaramycas)、裂殖酵母屬(5b/n'zc^acc/wramyce"或西洋蓍霉屬(l&7To>Wa)多肽；或更優(yōu)選絲狀真菌多肽例如枝頂孢霉屬04cwmom^w)、曲霉屬(y45/erg/〃w力、短梗霉屬(v4wm36鼎'血w)、隱球菌屬(CV^tococc—、Fz加os7,(i/ww、鐮孑包屬(尸wsorz'w附)、腐質(zhì)霉屬(Z/iww/co/a)、梨孑包菌屬(Afag"apoW/ze)、毛霉屬(Mwco"、毀絲霉屬(^\^^//6^/^0陽)、新考瑪脂霉屬(7Veoca〃/m"Wx)、脈孢菌屬(7Vewra5pora)、擬青霉屬(戶ae"7cwyc&s)、青霉屬(戶ew'c/〃z'ww)、瘤胃壺菌屬(尸z'ra"^cas)、裂褶菌屬(5b/n'zop/^〃wm)、踝節(jié)菌屬(ra/ara"^ce"、熱子嚢菌屬(7Tzer附oascws)、斗麥孑包殼屬(77n.e/av/")、彎3員審屬(7b/;^oc/a(^.w附)或木審屬(7Hc/zocfe環(huán)a)多狀。在優(yōu)選的方面，所述多肽是具有抗微生物活性的卡爾酵母(6^cc/zara/^cascar/Aergem/s)、酉良酒酵母(iSacc/zflramycas1cerev/s/ae)、jf唐4t酵母(5bcc/2aramycasAayto"c—、■道格拉氏酵母(Sacc/wrawycas<iowg/os")、克魯弗酵母(Sacc/zarawycayA:/w_yven〕、諾地酵母(/Sacc/zara，cay"or6e服》或卵形酵母在另外的優(yōu)選方面，所述多肽是棘孢曲霉(y^p^g/〃^acw/eafw)、泡盛曲霉(^5/erg/〃wsawamon')、》因曲霉(y4^yperg7'〃ws_/lw7/gaft^)、臭曲霉^45perg/〃us々W(iws)、日本曲霉(^ype/^/〃w乂a/ow'CM力、構(gòu)巢曲霉(Asperg77/ww油Ams)、黑曲審(y4s/erg77/wm'ger)、米曲審(/1s/ergz'〃1^c^yzae)、坤干孑包習犬嫌孑包(尸z^an'wm6acfrWo,fifey)、禾谷嫌孑包(Fus"n.應cerea叫、庫威嫌孑包(Fws腦'w附craoAwe〃e"se)、大刀鐮孑包(Fw"Wwmcw/morw附)、禾本-牛鐮孑包(Fwfln'wwgram/"earww)、禾赤鐮孑包(Fwsan'wmgra柳Z"wm)、異孑包鐮孑包(Fwsan'wm/7etero5porw附)、合？欠木嫌孑包(7^MSflr/w附"egw"t/()、尖嫌孑包(^Ft^an'w附ox_y5/orww)、多枝鐮孑包(Fwsan.wmrWcw/a&m)、粉紅鐮孑包(尸wsan.wmmsewm)、接骨木鐮孑包(Ft^an'wmsam6wc/"ww)、月夫色鐮孑包(Fuswz'wmsarcoc/zraw附)、^以分才支孑包鐮孑包(Fiwan'm附jporofn'c/n'o/(iay)、石克色嫌3包(^Fz^a廠/w附sw/p/zwrgwmh圓嫌3包(i^kyan'w附tora/oram)、#以絲孑包鐮孑包(尸mot/mwWc/zo//2ec/o/(i&5)、4裏片鐮孑包(Fwsan.wmvewewo^wm)、4爭異腐質(zhì)霉(//wm/co/a7rao/era)、疏u才帛習犬腐質(zhì)霉(//wm/co/a/fl"喂'"osa)、米黑毛霉(Mwcormz'e/2gz')、嗜熱毀絲霉(Afyce/Zop/^/zoraf/zerwo//zz7a)、斗且4造月永孑包菌(TVewnwponacn3ssa)、產(chǎn)青霉(尸e"/c〃/z'w附/wr/wragewwm)、哈茨木審(2Hc/zO(imna/zarz/a"w柳)、康于木審(7HcAo(ie削(a！、長斗支木審(7>/c/zo<ierwa/0"g/6n3c/7/afwm)、里氏木審(rn'c/zocfermarease/)或綠色木霉(7Hc/zo^fe渭av/nWe)多肽。在另外的優(yōu)選方面，所述多肽是沙躅(Aem'co/aman'"a)多肽，例如，SEQIDNO:2的多肽?？衫斫獾氖菍τ谇笆龅姆N，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates)兩種，和其它分類學的等同物(equivalent)，例如無性型(anamorph),無論它們已知的屬名。本領域熟練技術(shù)人員將輕易地識別適合的等同物的同一性。這些種的菌抹在許多培養(yǎng)物保藏中心對于公眾能夠輕易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammiungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得這些多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術(shù)是本領域內(nèi)公知的。隨后可通過相似地篩選其它微生物的基因組或cDNA文庫來獲得所述多核苷酸。一旦用所述探針^r測到編碼多肽的多核香酸序列，就能夠使用本領域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)將所述多核苦酸分離或克隆(參見，例3口，Sambrookda/.,1989,見上文)。本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼另一種多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)來產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領域已知的，包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中，并且融合多肽的表達在相同啟動子和終止子的控制下。多核苷酸本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸具有編碼本發(fā)明多肽的核苦酸序列。在優(yōu)選的方面，所述核苷S吏序列示于SEQIDNO:l。在另外的優(yōu)選方面，所述核苷酸序列是SEQIDNO:l的成熟多肽編碼區(qū)。本發(fā)明還包含編碼多肽的核香S吏序列，所述多肽具有SEQIDNO:2或其成熟多肽的氨基酸序列，由于遺傳密碼的簡并性所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:l。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:l的亞序列，其編碼SEQIDNO:2的具有抗微生物活性的片段。本發(fā)明還涉及突變多核苷酸，所述突變多核苷酸在SEQIDNO:l的成熟多肽編碼序列中包含至少一個突變，其中所述突變核苷S臾序列編碼由SEQIDNO:2的氨基酸1至21組成的多肽。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領域內(nèi)已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合?？赏ㄟ^例如使用熟知的聚合DNA片段，從而實現(xiàn)從這種基因組DNA克隆本發(fā)明的多核香酸。參見，例^口,Innisef1990，尸C7.'Gw/ofetoawdJ/7//z.ca^w,AcademicPress,NewYork。可以使用其它核酸擴增方法，例如連接酶鏈式反應(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(ligatedactivatedtranscription;LAT)和基于核苦酸序歹l)的擴增(NASBA)?？梢詮纳初顚俚哪ǎ驈钠渌蛳嚓P(guān)的生物體克隆多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。本發(fā)明還涉及具有下述核苷酸序列的編碼活性多肽的多核苷酸，所述核苦酸序列與SEQIDNO:l的成熟多肽編碼序列(即，核苷酸496至558)具有至少60%，優(yōu)選至少65%,更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少85%,更優(yōu)選至少90%，甚至更優(yōu)選至少95%，并且最優(yōu)選至少97%同一性的同一性程度。修飾編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列對于合成與所述多肽基本上相似的多肽可能是必需的。術(shù)語與所述多肽"基本上相似"指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于從其天然來源分離的多肽，例如，比活性、熱穩(wěn)定性、最適pH等方面不同的人工變體?？梢栽谧鳛镾EQIDNO:l的多肽編碼區(qū)存在的核苷酸序列，例如其亞序列的基礎上，和/或通過引入如下核苦酸取代來構(gòu)建變體序列所述取代不產(chǎn)生由核苷酸序列編碼的多肽的另外的氨基S交序列，但是符合意欲產(chǎn)生酶的宿主生物體的密碼子選擇；或者所述取代可產(chǎn)生不同的氨基酸序列。關(guān)于核苷酸取代的概述，參見，例i口,Ford&a/.,1991，尸rafe/"Expr&wz.ow<3"d尸wr訴co打'ow2:95-107。對于本領域技術(shù)人員顯而易見的是，這些取代能夠在對于分子功能重要的區(qū)域之外進行，并且仍然產(chǎn)生活性多肽。對于由本發(fā)明的分離的多核苷酸編碼的多肽活性關(guān)鍵的并且因此優(yōu)選不進行取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領域公知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(參見，例如，CunninghamandWells,1989，5We"ce244:1081-1085)來鑒定。在后一的技術(shù)中，將突變引入到分子中的每個正電殘基處，并且測試所得突變分子的抗微生物活性，以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。底物-酶相互作用的位點也能夠通過分析三維結(jié)構(gòu)測定，通過如核^磁共振分析、晶體學或光親和標記這樣的4支術(shù)來測定(參見，例如，deVos"a/.,1992，Sc/e"ce255:306-312;Smithdg/.，1992，《/。"層/o/Mo/ec*編ogy224:899-904;Wlodaver""/.,1992,i^AS丄e/tera309:59-64)。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸在低嚴緊條件下，更優(yōu)選中嚴緊條件，更優(yōu)選中-高嚴緊條件，甚至更優(yōu)選高嚴緊條件，并且最優(yōu)選非常高的嚴緊條件下，與以下序列雜交(i)SEQIDNO:l的核苷酸496至558,(ii)SEQIDNO:l的核香酸1至558中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈；或它們的等位變體和亞序列(Sambrook"a/.,1989，見上文)，如本文所定義的。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸通過以下方法獲得(a)在低、中、中-高、高或非常高嚴緊條件下，將DNA的群體與以下序列雜交(i)SEQIDNO:l的核苷酸496至558,(ii)SEQIDNO:l的核苦酸1至558中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有抗微生物活性的多肽。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述分離的多核苷酸與一個或多個調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在合適的宿主細胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導編碼序列的表達。可以用許多方式操作編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸以提供多肽的表達。依賴于表達載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對其進行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術(shù)是本領域熟知的。調(diào)控序列可以是合適的啟動子序列，其是由用于表達編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細胞識別的核苷酸序列。啟動子序列含有介導多肽的表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子可以是在所選的宿主細胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷20酸序列，包括突變的、截斷的和雜合的啟動子，并且可以從編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于指導本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄，特別是在細菌宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下述獲得的啟動子大腸桿菌/ac操縱子、天藍色鏈霉菌0S^^omyc^coe/z'co/w)瓊脂糖酶基因(^^4)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因0acS)、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因("^y丄)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(am;;竭、解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶基因Omy0、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因0^w尸)、枯草芽孢桿菌xyL4和wW基因和原核(3-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroffefa/"1978，/Vocee<iz>7g5o/f/zeiVadowa/Jcacfew^o/5"cz'e"c&y園75:3727-3731)，以及toc啟動子(DeBoerda/"1983，尸raceW，。/_/Va〃o"(3/^C(3(iew少o/5We"cesf/5L480:21-25)。另夕卜的啟動子在"Usefblproteinsfromrecombinantbacteria"in6We油ycJ膨n'ca"，1980,242:74-94中；和在Sambrookefa/.，1989，見上文中有所描述。用于指導本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下列酶的基因獲得的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫4艮毛霉(i/^omwcwm/e/zez')天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(g/aj)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀粉葡糖普酶(WO00/56900)、鑲片鐮孢Daria(WO00/56900)、鑲片鐮孢Quinn(WO00/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(WO96/00787)、里氏木霉p-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉(3-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性a-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變的、截斷的和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ENO-l)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氬酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUP1)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對于酵母宿主細胞其它有用的啟動子由Romanos"a/.,1992,8:423-488描述。錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3'末端可搮:作地連接。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯曱酸合酶、黑曲霉a-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對于酵母宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對于酵母宿主細胞其它有用的終止子由Romanos"a/.，1992,見上文描述。調(diào)控序列還可以是合適的前導序列，其是對于宿主細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5，-末端?？梢詫⒃谒x宿主細胞中有功能的任何前導序列用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的前導序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。對于酵母宿主細胞合適的前導序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ENO-l)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母a因子和釀酒酵母醇脫氬酶/甘油醛-3-磷酸脫氬酶(ADH2/GAP)。調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核香酸序列的3'末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時，宿主細胞將其識別為將聚腺苦殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號?？梢詫⒃谒x宿主細胞中有功能的任何聚腺香酸化序列在本發(fā)明中使用。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯曱酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉a-葡糖苷酶。對于酵母宿主細胞有用的聚腺香酸化序列由GuoandSherman,1995，Mo/ecw/arCW/w/ar說o/ogy15:5983-5990描述。調(diào)控序列還可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的氨基末端相聯(lián)的氨基酸序列，并且指導編碼的多肽進入細胞的分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5'端可固有地包含信號肽編碼區(qū)，其與編碼分泌多肽的編碼區(qū)片段一起天然地連接在翻i奪閱讀框中?？晒┻x擇的是，編碼序列5'端可含有對于所述編碼序列是異源的信號肽編碼區(qū)。異源信號肽編碼區(qū)在編碼序列不天然地含有信號肽編碼區(qū)時可能是必需的?；蛘撸庠葱盘栯木幋a區(qū)可以簡單地取代天然信號肽編碼區(qū)以增強多肽的分泌。然而，指導表達的多肽進入所選宿主細胞的分泌途徑的任何信號肽編碼區(qū)可在本發(fā)明中使用。對于細菌宿主細胞有效的信號肽編碼區(qū)是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼區(qū)芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌(3-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(";^r,"pWW)和枯草芽孢桿菌praj。另外的信號肽由SimonenandPalva，1993,M/craZ/o/og/ca/57:109-137描述。對于絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼區(qū)是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼區(qū)米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶和疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶。在優(yōu)選的方面，信號肽編碼區(qū)是SEQIDNO:l的核苷酸1至72，其編碼SEQIDNO:2的氨基酸-165至-142。對于酵母宿主細胞有用的信號肽從釀酒酵母a因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼區(qū)由Romanos"a/.,1992,見上文，描述。調(diào)控序列還可以是前肽(propeptide)編碼區(qū)，其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無活性的并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)化成成熟活性多肽?？梢詮目莶菅挎邨U菌堿性蛋白酶(opr^)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶0^r7)、釀酒酵母a因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶(WO95/33836)的基因獲得前肽編碼區(qū)。在優(yōu)選的方面，前肽編碼區(qū)是SEQIDNO:l的核苷酸73至495，其編碼SEQIDNO:2的氨基酸-141至-1。當信號肽和前肽區(qū)二者均出現(xiàn)在多肽的氨基末端時，將前肽區(qū)置于緊接著(nextto)多肽的氨基末端，并且將信號肽區(qū)置于緊接著前肽區(qū)的氨基末端。同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對于宿主細胞的生長來調(diào)節(jié)多肽的表達。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例是引起基因表達響應化學或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括/ac、toc和^p操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用TAKAa-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀4分酶啟動子作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些序列包括在氨曱蝶呤(methotrexate)存在下擴增的二氬葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴增的金屬疏蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。表達載體本發(fā)明還涉及重組表達載體，所述重組表達載體包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。上述的多種核酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達載體，所述表達載體可以包括一個或多個方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的核苦酸序列?？晒┻x擇的是，可以通過在合適的用于表達的載體中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸構(gòu)建體來表達本發(fā)明的核苷酸序列。在產(chǎn)生表達載體的過程中，將編碼序列置于載體中，從而將該編碼序列與適當?shù)谋磉_調(diào)控序列可操作地連接。重組表達載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其能夠方便地進行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生核苷酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復制載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其復制獨立于染色體復制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復制的手段(means)?；蛘撸d體可以是一種當被引入宿主細胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復制的載體。此外，可以使用單獨的載體或質(zhì)?；騼蓚€或更多個載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細胞基因組的完整DNA(totalDNA)，或可以使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有一個或多個選擇性標記，其允許簡單選擇轉(zhuǎn)化的細胞。選擇性標記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。細菌選擇性標記的實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的^/基因，或賦予抗生素抗性的標記，所述抗生素抗性例如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。對于酵母宿主細胞合適的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記包括但不限于am^S(乙酰胺酶)、(鳥氨酸氨曱?；D(zhuǎn)移酶)、(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、/zp/z(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、m'aZ)(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pjK7(乳清酸才亥苦-5，隱石岸酉吏脫羧酶)(orotidine-5，-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)和化pC(鄰氨基苯曱酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等價物。優(yōu)選用在曲霉屬細胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amd51和p^rG基因和吸水鏈霉菌(iS^e/towycay/zygnwcop/cw力的基因。本發(fā)明的載體優(yōu)選含有元件，其允許載體整合入宿主細胞基因組或載體在細胞中獨立于基因組的自主復制。為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件。或者，載體可以含有額外的核苷酸序列，用于指導通過同源重組整合入宿主細胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應該優(yōu)選含有足夠數(shù)量的核酸，如100至IO，OOO堿基對，優(yōu)選400至IO，OOO堿基對，并且最優(yōu)選800至10,000堿基對，其與相應的目標序列具有高度同一性以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細胞基因組中的目標序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細胞基因組中。為了自主復制，載體可以進一步包含復制起點，其使載體能夠在所述的宿主細胞中自主地復制。復制起點可以是介導自主復制的任何質(zhì)粒復制子(replicator),其在細胞中發(fā)揮功能。術(shù)語"復制起點"或"質(zhì)粒復制子"在本文定義為能夠^f吏質(zhì)?；蜉d體體內(nèi)復制的核苷酸序列。細菌復制起點的實例是允許在大腸桿菌中復制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復制起點，和允許在芽孢桿菌屬中復制的質(zhì)粒pUB110、pE194、pTA1060和pAM卩1的復制起點。用于酵母宿主細胞中的復制起點的實例是2微米復制起點，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細胞中有用的復制起點的實例是AMA1和ANSI(Gems"a/.，1991,G緩98:61-67;Cullene/a/.，1987，M/c/e/c」c^ie廳rc/215:9163-9175;WO00/24883)。分離AMA1基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)?；蜉d體能夠根據(jù)公開于WO00/24883中的方法完成?？梢詫⒍嘤谝粋€拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細胞以增加基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過如下方法獲得將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組，或包括可與多核苷酸一起擴增的選擇性標記基因，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細胞來選擇含有選擇性標記基因的擴增拷貝的細胞，并且由此來選擇含有多核苷酸的額外拷貝的細胞。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明重組表達載體的方法是本領域技術(shù)人員熟知的(參見，例如，Sambrook"a/.，1989,見上文)。宿主細胞本發(fā)明還涉及重組宿主細胞，所述重組宿主細胞包含本發(fā)明的多核苷酸，將其有利地用于多肽的重組產(chǎn)生中。將包含本發(fā)明多核苷酸的載體引入宿主細胞中，乂人而將該載體保留作為染色體整合體(chromosomalintegrant)或作為前述的自復制的染色體外載體。術(shù)語"宿主細胞"包含親本細胞的任何子代，其由于復制過程中發(fā)生的突變而與親本細胞不相同。宿主細胞的選擇將很大程度依賴于編碼多肽的基因和它的來源。宿主細胞可以是單細胞微生物，例如，原核生物，或非單細胞微生物，例如，真纟亥生物。有用的單細胞微生物是細菌細胞，例如革蘭氏陽性細菌，包括但不限于，芽孢桿菌屬細胞，例如，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌CSac///^c/aww7)、凝結(jié)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌；或鏈霉菌屬細胞，例如，淺青紫鏈霉菌和鼠灰鏈霉菌，或革蘭氏陰性細菌例如大腸桿菌和假單胞菌屬菌種。在優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在另外優(yōu)選的方面，芽孢桿菌屬細胞是嗜堿的芽孢桿菌屬?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將載體卩1入到細菌宿主細胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，ChangandCohen,1979,Mo/ec*G麼ra/G匿ri"168:111-115)，4吏用感受態(tài)纟田月包(參見，例3口，YoungandSpizizin，1961，Jow""Z5a"e"'o/。^81:823-829或DubnauandDavidoff-Abelson,1971,Jbwma/o/M/ec油r歷o/ogy56:209-221),電穿孔(參見，例如，ShigekawaandDower,1988，5/ofec/zw々was6:742-751)或4妄合(參見，例如，KoehlerandThorne,1987，Jowwa/o,"er油gy169:5771-5278)。宿主細胞還可以是真核生物，例如哺乳動物、昆蟲、才直物或真菌細胞。在優(yōu)選的方面，宿主細胞是真菌細胞。"真菌，，用在本文包括以下門子嚢菌門(Ascomycota)、4旦子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)禾口接合菌門(Zygomycota)(^口由Hawksworthda/.，v4z>why/2awd5&Z》D/"/ow"o/772eFw"g/,她edition,1995，CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworthaa/.,1995,見上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicflingi)(Hawksworthda/.,1995,見上)。在更優(yōu)選的方面，真菌宿主細胞是酵母細胞。"酵母"用在本文包括產(chǎn)子嚢酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)孑包霉目(Endomycetales》、產(chǎn)擔子酵母(basidiosporogenousyeast)牙口屬于半^口菌類(FungiImperfecti)(芽孑包《岡(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來可能改變，就本發(fā)明而言，一尋酵母定義為如Jcriv/Z/eyo/lfeast(Skinner,F.A"Passmore，S.M.,andDavenport,R.R.,eds,iSoc.jpp.5ac/en.o/.5ympay/ww5"e〃'esNo.9,1980)中所述。在更加優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是念珠菌屬、漢遜酵母屬(i/awe肌/a)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細胞。在最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母細胞。在另外最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母(《/w"eramyces/acfe)細胞。在另外最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是KjroiWa/z》o/;^'ca細胞。在另外更優(yōu)選的方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。"絲狀真菌"包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworthda/.,1995，見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進行營養(yǎng)生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長通過單細胞菌體的出芽生殖(budding)進行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。在甚至更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(坊erA^"ciera)、Or—Wo戶'51、鬼傘屬(C。pr/mw)、革蓋菌屬(Cw7'o/w力、隱球菌屬、i^7/k^Wwm、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬(7\^%^//^0^&)、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬(/7wf"erac/7aete)、射脈菌屬(P/7/eWa)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(P/ewrofw力、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子嚢菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(rrame^)或木霉屬細胞。在最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、曰本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細胞。在另外的最優(yōu)選方面，絲狀真菌宿主細胞是桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢細胞。在另外最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是黑刺煙管菌CByeHfca"&raCer—n.op^swZn^z、或Cen》on.o戸isw6verm—ora、灰蓋鬼傘(C。j9".wwsc/"ere^)、毛革蓋菌(Con'o/ws/z/raw^s)、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌(尸/w"erac/w"ec/z/7^ospon'wm)、輻射射月永菌(/Vz/e6/araWata)、尸/ewra^yery"gz7、土生才炎孑包霉、7h附ete51vz'〃oa、7h3wefesv6rw'co/o廠、p合茨木審、康于木審、長片支木審、里氏木霉或綠色木霉菌抹細胞?？梢詫⒄婢毎ㄟ^涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細胞壁重建的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細胞的合適方法在EP238023和Yeltonefa/.,1984,/VoceW"g>s。/Ae7Va"owa/爿cacfemyo/5WenceyC^481:1470-1474中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardierda/,，1989，G簡78:147-156和WO96/00787描述?？梢允褂糜扇缦挛墨I描述的方法專爭4匕酵母BeckerandGuarente,/"Abelson,J.N.andSimon,M.I.,editors,Gw/deto1fea^Gewe".c51oro/Mo/ecw/arMef/zo<is五"zy膨/ogy,Volume194,pp182-187,AcademicPress,Inc.,NewYork;Itoa/.,1983,Jbwnia/o/\6acfe"'o/ogy153:163;和Hinnena/.,1978，尸raceW"gso/A^加'owa"ca^，o/5Wewcayf7S475:1920。產(chǎn)生方法本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細胞，所述細胞以其野生型形式能夠產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。優(yōu)選地，所述細胞是沙躅屬04rem'co/a)細胞，并且更優(yōu)選沙躅。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)宿主細胞；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)宿主細胞，其中所述宿主細胞包含突變核苷酸序列，其在SEQIDNO:l的成熟多肽編碼區(qū)中具有至少一個突變，其中所述突變核苷酸序列編碼由SEQIDNO:2的氨基酸1至21組成的多肽，和(b)回收所述多肽。在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，使用本領域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養(yǎng)，和實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應商獲得或可以根據(jù)公布的成分制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收該多肽。如果多肽不分泌到培養(yǎng)基中，其能夠從細胞裂解物(lysate)回收。可以使用本領域已知的對于所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用。例如，抗微生物活性試驗(antimicrobialactivityassay)可用于測定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。本發(fā)明的多肽可以通過多種本領域已知的方法純化，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提耳又(參見,例如,iVoto,"P,yc加'o",J.-C.JansonandLarsRyden，editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。植物本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細胞，將其用編碼本發(fā)明的具有抗;微生物活性的多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)化，從而以可回收的量表達和產(chǎn)生所述多肽。多肽可從植物或植物部分回收。或者，同樣可以將含有該重組多肽的植物或植物部分用于改進食品或祠料的質(zhì)量，例如，改進營養(yǎng)價值、適口性(palatability)和流變性質(zhì)(rheologicalproperties)，或用于石皮壞抗營養(yǎng)因子。轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉才直物的實例是草(grasses),如草地早熟禾(meadowgrass)(藍草(bluegrass),早熟禾屬(尸oa));飼用牧草(foragegrass)如羊茅屬(Fas&ca)、黑麥草屬(丄o"ww);寒地型牧草(temperategrass),如Agrostis;和谷類，例如，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物的實例是煙草(tobacco)，豆類(legumes)，如羽扇豆(lupins)，馬鈴薯，糖甜菜(sugarbeet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)才直4勿(十字花牙牛(familyBrassicaceae)),^口花浙卩菜(cauliflower),油菜籽(rapeseed)和緊密相關(guān)的才莫型生物體擬南界(^ra6Wo/wz;sf/za//awa)。植物部分的實例是莖(stem)、愈傷組織(callus)、葉(leaf)、根(root)、果實(fruit)、種子(seed)和塊莖(tuber)，以及包含這些部分的獨立組織，例如，表皮(epidermis)、葉肉(mesophyll)、薄壁組織(parenchyma)、維管組織(vasculartissue)、分生纟且織(meristem)。具體的才直物細月包區(qū)室(compartments),如葉纟錄體(chloroplast)、質(zhì)夕卜體(apoplast)、線粒體(mitochondria)、液泡(vacuole)、過氧化物酶體(peroxisome)和細月包質(zhì)(cytoplasm)也4皮認為是植物部分。此夕卜，任何植物細胞，無論什么組織來源，都被認為是植物部分。同樣地，植物部分，如分離以促進本發(fā)明的應用的具體組織和細胞也被認為是植物部分，例如胚(embryo)、胚享L(endosperm)、舉月4分(aleurone)禾口種皮(seedcoat)。同樣包含于本發(fā)明范圍內(nèi)的還有這些植物、植物部分和植物細胞的子代。表達本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞可以依照本領域已知方法構(gòu)建。簡而言之，通過如下方法構(gòu)建所述植物或植物細胞將編碼本發(fā)明多肽的一個或多個表達構(gòu)建體并入植物宿主基因組，并且繁殖所得的修飾植物或植物細胞成為轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞。表達載體便利地是包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述多核苷酸與在選擇的植物或植物部分中表達該多核苷S吏序列所必需的適當?shù)恼{(diào)節(jié)序列可操作地連接。此外，表達構(gòu)建體可以包含對于鑒定宿主細胞有用的選擇性標記，在所述宿主細胞中整合了表達構(gòu)建體和將該構(gòu)建體？1入到所述植物中所必需的DNA序歹'j(后者依賴于使用的DNA引入方法)。調(diào)節(jié)序列的選擇，例如啟動子和終止子序列和任選地信號或轉(zhuǎn)運序列的30選擇，舉例來說，基于期望何時、何處以及如何表達多肽而確定。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因的表達可以是組成型的或誘導型的，或可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且基因產(chǎn)物可以靶向特定的組織或植物部分例如種子或葉。調(diào)節(jié)序列由例如Tague"a/.,1988,P/a"/i^;w'o/ogy86:506所述。對于組成性表達，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌動蛋白1啟動子(Franck&a/"1980,Ce//21:285-294,Christensenda/"1992,戶teMo.歷o/.18:675-689;Zhang"a/.,1991，戶/a"fCe〃3:1155-1165)。器官特異性啟動子可以是例如來自貯藏庫組織(storagesinktissue)例如種子、馬鈴薯塊莖和果實的啟動子(Edwards&Coruzzi,1990,Jm.iev.Gewe/.24:275-303),或來自代謝庫組織(metabolicsinktissue)例如分生組織的啟動子(ItoWa/.,1994,P/a"fMo/.說o/.24:863-878),種子特異性啟動子諸如來自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)啟動子(Wuda/.,1998,P/朋f朋dCe〃尸/y^o/ogy39:885-889)，來自豆球蛋白(legumin)B4和蠶豆(Wcz'a/aZ^)的未知的種子蛋白基因的蠶豆啟動子(Conrad"1998,Jo^77a/0/戶/朋fi^;w'o/o^y152:708-711)、來自種子油體蛋白(oilbodyprotein)的啟動子(Chenaa/.,1998，PlantandCellPhysiology39:935-941),來自歐洲油菜(5ra^/ca"opw力的貯藏蛋白napA啟動子，或本才支術(shù)領域7^知的任何其他種子特異性的啟動子，例如，在WO91/14772中所描述的。此外，啟動子可為葉特異性的啟動子，如來自稻或番茄的Acs啟動子(Kyozukaefa/.,1993，P/朋f尸/^z'o/ogy102:991-1000),小球藻病毒(chlorellavirus)腺噤呤曱基轉(zhuǎn)移酶(adeninemethyltransferase)基因啟動子(MitraandHiggins，1994,_P/a"/Mo/ecw/arB/o/ogy26:85-93)，或來自稻的基因啟動子(Kagaya"a/.,1995,Mo/簡/ara/^g匿ra/g麼""248:668-674),或傷口資導的啟動子，如馬鈴薯pin2啟動子(Xua/.,1993，尸/awfAfo/ecw/w22:573-588)。同樣地，所述啟動子可通過非生物的處理誘導，所述非生物的處理諸如溫度、干旱或鹽度變化，或通過外源應用的激活所述啟動子的物質(zhì)誘導，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、才直4勿;敫素(planthormones)^口乙丈希、脫落酉交(abscisicacid)、赤霉酉吏(gibberellicacid)和/或重金屬。啟動子增強子元件也可以用于實現(xiàn)本發(fā)明的多肽在植物中的較高表達。例如，啟動子增強子元件可以是內(nèi)含子，將其置于啟動子和編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間。例如Xu&a/.，1993,見上文，公開了使用稻肌動蛋白1基因的第一內(nèi)含子以增強表達。選擇性標記基因和表達構(gòu)建體的任何其它部分可以選自本領域內(nèi)可用的那些。根據(jù)本領域已知的常規(guī)技術(shù)將核酸構(gòu)建體并入植物基因組，所述常規(guī)技術(shù)包括土壤桿菌屬G4gra&c^/ww)介導的轉(zhuǎn)化、病毒介導的轉(zhuǎn)化、顯微注射(microinjection)、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化和電穿孑L(Gasser"a/.,1990,5We"ce244:1293;Potrykus,1990,飾/Tec/wo/ogy8:535;Shimamoto"a/"1989,胸騰338:274)。目前,才艮癌土i襄4干菌fwme^2c/em0介導的基因?qū)幰?genetransfer),是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的優(yōu)選方法(為了參考，見HooykasandSchilperoort,1992,P/a^Mo/ecw/ar19:15-38)，而且它也可以用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，雖然對于這些植物其他的轉(zhuǎn)化方法是常用的。目前，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的優(yōu)選的方法，是用粒子(用轉(zhuǎn)化DNA涂覆的微觀的金或鎢粒子)轟擊胚愈傷組織(embryoniccalli)或發(fā)育中的胚(developingembryos)(Christou,1992,Jbwwst/2:275-281;Shimamoto,1994，CWre"f(9//m'o/75/ofec/7wo/ogy5:158-162;Vasiletal.,1992,歷o/rec/wo/ogy10:667-674)。轉(zhuǎn)化單子葉植物的可供選擇的方法，是基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，如由Omimlleh"a/.,1993,Mo/ecw/ar21:415-428所描述的。轉(zhuǎn)化之后，根據(jù)本領域熟知的方法選擇具有并入的表達構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體并且再生成為完整植物。通常設計轉(zhuǎn)化方法用于通過如下方法在再生期間或在后續(xù)世代中選擇性消除選擇基因例如，使用以兩種獨立的T-DNA構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)化或通過特異性重組酶位點特異性地切除選擇基因。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞，其包含編碼本發(fā)明具有抗微生物活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。組合物本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多肽的組合物，例如藥用組合物(pharmaceuticalcomposition)。優(yōu)選地，所述組合物富含這種多肽。術(shù)語"富含，，表示使所述組合物的抗微生物活性增加，例如，以至少1.1的富集因數(shù)(enrichmentfactor)增力口。所述組合物可以進一步包含其它藥用活性劑，例如另外的殺生物劑或抑生物劑(biocidalorbiostaticagent),例如顯示如上所定義的抗;微生物活性的另外的抗微生物多肽。殺生物劑可以是抗生素，如本領域已知的。抗生素的種類包括青霉素，例如青霉素G、青霉素V、二曱氧基苯青霉素(methicillin)、苯唑西林(oxacillin)、羧千青霉素(carbenicillin)、萘夫西林(nafcillin)、氨千青霉素(ampicillin)等；青霉素組合P-內(nèi)酰胺酶抑制劑，頭孢菌素，例如頭孢克洛(cefaclor)、頭孢唑啉(cefazolin)、頭孢呋辛(cefiiroxime)、頭孢羥羧氧酰胺(moxalactam)等；碳青霉歸類(carbapenems);單環(huán)內(nèi)酰胺類(monobactams);氨基沖唐苷類(aminoglycosides);四環(huán)素類(tetracyclines);大環(huán)內(nèi)酉旨類(macrolides);林可霉素類(lincomycins);多粘菌素類(polymyxins);石黃胺類(sulfonamides);查i若酉同類(quinolones);氯霉素(cloramphenical);曱硝唾(metronidazole);大7見霉素(spectinomycin);曱氧千口定(trimethoprim);萬古霉素(vancomycin)等。所述殺生物劑也可以是抗真菌劑(anti-mycoticagent),包4舌多烯類，例如兩性霉素B(amphotericinB),制霉菌素(nystatin);5-氟可新(5-flucosyn);和唑系(azoles),例長口口米康口坐(miconazol)、酉同康峻(ketoconazol)、^f尹曲康哇(itraconazo1)和氟康峻(fluconazol)。在實施方式中，殺生物劑是非酶促化學劑。在另外的實施方式中，殺生物劑是非多肽化學劑。組合物可包含合適的載體材料。組合物還可包含合適的遞送J某介物(deliveryvehicle),當將所述組合物用作藥物時，該遞送+某介物能夠?qū)⒈景l(fā)明的抗微生物多肽遞送至期望的位置。所述多肽組合物可以根據(jù)本領域已知方法制備，可以是液體或干組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒狀(granulate)或微顆粒狀(microgranulate)的形式?？蓪⒋ㄓ诮M合物中的多肽用本領域已知的方法來穩(wěn)定。在下面給出本發(fā)明多肽組合物的優(yōu)選用途的實施例。本發(fā)明多肽組合物的劑量和使用所述組合物的其它條件可基于本領域已知的方法來決定。方法和用途本發(fā)明還涉及使用具有抗微生物活性的多肽的方法。所述抗微生物多肽在遭受細菌、真菌、酵母或藻類污染的任何位置通常都是有用的。通常而言，所述位置在含水系統(tǒng)中，所述含水系統(tǒng)例如冷卻水系統(tǒng)、洗衣漂洗水(laundryrinsewater);油系統(tǒng)，例如切削油、潤滑劑、油田等，其中需要將微生物殺死或必需控制它們的生長。然而，本發(fā)明也可用在已知抗微生物組合物對其是有用的所有應用中，例如保護木材、膠乳(latex)、粘合劑、膠、紙、紙板(cardboard)、紡織品、皮革、塑料、填縫材料(caulking)和飼料。其它用途包括保存食品，飲料，化妝品例如乳液(lotion)、乳膏(cream)、凝月交(gel)、!欠膏(ointment)、皂(soap)、香)皮(shampoo)、調(diào)節(jié)劑(conditioner)、止汗劑(antiperspirant)、除臭劑(deodorant)、漱口劑(mouthwash)、隱形眼鏡產(chǎn)口口口，酶酉己爭J4勿(enzymeformulation)或食f口成分。因此，本發(fā)明的抗微生物多肽可以作為消毒劑使用，例如，用在處理眼或口的感染、皮膚感染中；在止汗劑或除臭劑中；用于清潔和消毒隱形眼鏡和牙齒(口腔護理)。一般而言，預期將本發(fā)明的抗微生物多肽用于清潔、消毒或抑制任何表面上的微生物生長?？捎欣嘏c發(fā)明的抗微生物多肽接觸的表面的實例是處理設備的表面，所述處理設備用于例如乳制品廠、化學或制藥加工廠、水衛(wèi)生系統(tǒng)(watersanitationsystem)、煉油廠(oilprocessingplant)、紙漿力口工廠(paperpulpprocessingplant)、水處理廠和冷卻纟荅。本發(fā)明的抗樣i生物多肽應該以有效清潔、消毒或抑制所述表面上微生物生長的量來使用。本發(fā)明的抗微生物多肽另外還可用于食品加工廠和任何制備或供應食品的區(qū)域例如醫(yī)院、療養(yǎng)院和餐館的清潔表面和烹飪用具。劑。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的抗微生物多肽或組合物作為藥物的用途。另外，本發(fā)明的抗微生物多肽或組合物也可用于制造控制或抗擊微生物的藥物，所述微生物例如真菌生物體或細菌，優(yōu)選革蘭氏陽性細菌。本發(fā)明的組合物和抗微生物多肽也可用作抗微生物的獸用的(veterinarian)或人用治療劑或預防劑。因此，本發(fā)明的組合物和抗微生物多肽可以用在處理微生物感染的獸用或人用治療劑或預防劑的制備中，所述微生物感染例如細菌或真菌感染，優(yōu)選革蘭氏陽性細菌感染。具體而言所述^^生物感染可與肺病和性傳纟番疾病有關(guān)，所述肺病包括但不限于結(jié)核，肺炎和嚢性纖維化病(cysticfibrosis);所述性傳播疾病包括但不限于淋病和衣原體。本發(fā)明的組合物包含有效量的本發(fā)明的抗微生物多肽。術(shù)語"有效量"在用于本文中時，意思指本發(fā)明的抗微生物多肽的量足夠抑制所述微生物的生長。本發(fā)明還涉及創(chuàng)傷愈合組合物(woundhealingcomposition)或產(chǎn)品例如繃帶、醫(yī)學設備例如導管，并且進一步涉及抗頭皮屑的頭發(fā)產(chǎn)品，例如香波。將本發(fā)明的抗微生物多肽的配制物施用于正遭受微生物感染或?qū)ξ⑸锔腥疽赘械乃拗?。施用依賴于特定的微生物可以是局部?topical)、定位的(localized)或全身的，優(yōu)選所述施用應該是局部化的(localized)。通常，本發(fā)明的抗;微生物多肽的劑量將是足以通過殺死至少大約50%，通常至少1對數(shù)(llog),并且可以是2或更多對數(shù)來將微生物群體減少。將本發(fā)明的化合物按減少微生物群體同時最小化任何副作用的劑量施用。預期所述組合物將在醫(yī)師的指導下獲得并且使用于體內(nèi)用途。將本發(fā)明的抗-微生物多肽具體地用于殺死革蘭氏陰性細菌，包括銅綠假單胞菌CPw^fowo"oyaen^/"osa)和沙眼衣原體(C7z/am;^afrac/zomato);和革蘭氏陽性細菌，包括鏈球菌(streptococci)例如月申炎4連5求菌(5^e/tococcMspwewmom'a),乳房鏈玉求菌(5".w6en'力，S./zyo/"/eW/wa//^酉良膿鏈球菌(S.jyogeway)和5".aga/ac"ae;和葡萄球菌(staphylococci)例如金黃色葡萄球菌0S^p/2少/ococcwsm^ew力'表皮葡萄球菌(5".epWerwWs),模仿葡萄球菌(51.s/mw/(ms),木糖葡萄球菌(5",xy/osw"和肉葡萄球菌(51.camoyws)?？蓪⒈景l(fā)明的抗微生物多肽的配制物施用于正遭受或易感于微生物的肺感染例如肺炎的宿主；或施用于正遭受或易感于微生物創(chuàng)傷感染例如細菌創(chuàng)傷感染的宿主。還可將本發(fā)明的抗微生物多肽的配制物施用于正遭受或易感于皮膚感染的宿主，所述皮膚感染例如痤癡、遺傳過每t性皮炎或脂溢性皮炎；優(yōu)選所述皮膚感染是細菌皮膚感染，例如由表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、瘡皰丙酉臾才干菌(iVop/o"/6ac/en'w附ac"e力、卵形灃泉才比孑包子菌(尸/^ra^j9orw附ov"/e)或凈泉糸匕馬拉色菌(M3/owedaXwr)引起的細菌皮膚感染。不希望引入大量常規(guī)抗生素的情況。例如，可將本發(fā)明的抗微生物多肽添加至動物和/或人的食品制備物中；或可將它們包括作為細胞體外培養(yǎng)的添加劑，以防止組織培養(yǎng)中微生物的過度生長。具體微生物對用本發(fā)明的抗微生物多肽致死的易感性可通過體外測試來測定，詳見實驗部分。通常將微生物的培養(yǎng)物與不同濃度的抗微生物多肽組合一段足以使所述蛋白質(zhì)作用的時間，通常在大約一小時和一天之間。隨后將活;欽生物計it,并且測定致死水平。感興趣的微生物包括但不限于，革蘭氏陰性細菌，例如檸檬酸桿菌屬菌種(C"raZ)a"ww.);腸桿菌屬菌種(五"fera6acfer^.);埃希氏菌屬菌種(」&c/zen'c/2/a5p.),例如大腸桿菌；克雷伯氏菌屬菌種(《/eZwW/as;.);摩才艮氏菌屬菌種(#0^<3"6//"平)；變形菌屬菌種(尸ra^^普羅威登斯菌屬菌種(尸raWde"c/a);沙門氏菌屬菌種(Sa/wowe〃a),例如傷寒沙門氏菌/yp/z/),鼠傷寒沙門氏菌GS,/^p/H'mwn'ww);沙雷氏菌屬菌種(5^ra/z'a^sp.);志賀氏菌屬菌種(57^ge〃a假單胞菌屬菌種CP化wtfowo"osw.),例如銅綠假單胞菌；耶爾森氏菌屬菌種(rera/m'a^.),例如鼠疫耶爾森氏菌(K;"他)、假結(jié)核耶爾森氏菌(7戸ewGfo&6ercM/a^)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Kew&raco份/ca);弗朗西絲氏菌屬菌種(Fra"c&ce〃a5p.);巴斯德氏菌屬菌種(尸"Wwe〃aw.);弧菌屬菌種(J^n'osp.)，例如霍亂弧菌(Kc/zo/erae)、副溶血弧菌(K;ara/7emo/;^cw);彎曲桿菌屬菌種(Cam/^/o6ac&"p,),例如空腸彎曲桿菌(C.m');嗜血菌屬菌種(T^emop/zz71^),例如流感嗜血菌(H/^/7wewzae)、杜氏嗜血菌(//.^cre"');博德特氏菌屬菌種CB(mfe&〃a例如百曰咳博德特氏菌屬(5.peWwM&)、支氣管炎博德特氏菌(5.6rawc/z/seprica)、副百日咳博德特氏菌(及parapeWw^&);布魯氏菌屬菌種(8n^e〃of^p.);奈瑟氏J求菌屬菌種(A^&en'a5p.),例如淋病奈瑟氏3求菌C^.gowwT/zoeae)、腦膜炎奈瑟氏球菌(TV.mem'"^^fe)等。其它感興趣的細菌包括軍團菌屬菌種(丄eg/owe〃a5^.),例如4曼月申軍團菌(丄.pwewwop/zZ/a);利斯特氏菌屬菌種(丄/Wen'aW.)，例如單核細胞增生利斯特氏菌(丄.;支原體屬菌種(Afycop/as附a仿H口人型支原、體(M/z。w/"/s)、月申炎支原、體(M/"ew/w。m'ae);分枝桿菌屬菌種(綺co^cfen'wmsp,)，例如結(jié)核分枝桿菌(M.fw6ercw/a^)、麻風分枝桿菌(M/eprae);密螺旋體屬菌種(r^po恥m"w.)，例如徹白密螺旋體(Ipa//zWwm);疏螺旋體屬菌種Cgo^re//a^.)，例如布氏疏螺旋體(及6wrg(io/^n〕；鉤端螺》走體屬(丄e/tos^'rag57.);立克次氏體屬菌種(i/cfetoz'a例如立氏立克次氏體(i.WcA:etoz7)、斑滲傷寒立克次氏體(i.0^/n');衣原體屬菌種(C7^w;^/a例如沙眼衣原體、肺炎衣原體(C.;"wmo"/ae)、鸚鵡熱衣原體(C.戸"toc/);螺桿菌屬菌種(i/e/z'co6acfers;.)，例如幽門螺桿菌(i/.py/or()等。感興趣的非細菌病原體包括真菌和原生動物病原體，例如瘧原蟲屬種(尸/osmo(iZa^p.)，例i口惡'l"生疾原蟲CP力/cz)an^m);錐蟲屬種(7^;""twowasp.)，例如布氏錐蟲(6race/);shistosomes;內(nèi)阿米巴屬種(五"toemoe6a隱J求菌屬菌種(0^ptococcww.);念J朱菌屬菌種(Ca"AV/as/x)，例如白念J朱菌(C.可采用多種施用方法。可將所述多肽配制物口服給予，或血管內(nèi)注射、皮下注射、腹膜注射、通過氣溶膠注射、眼科(opthalmically)注射、膀胱內(nèi)注射、局部(topically)注射等。例如，通過吸入的施用方法是本領域熟知的。所述治療配制物的劑量將依賴于待施用的特定抗微生物多肽、疾病的性質(zhì)、施用的頻率、施用的方式、藥劑自宿主的清除率(clearance)等而廣泛地變化。最初的劑量可以較大，接著是較小的維持劑量(maintenancedose)。所述劑量可每周一次或兩周一次不頻繁地施用，或分成較小的劑量每日一次或每日幾次、半周一次或半周幾次地施用等，以維持有效劑量水平。在許多情況下，口服施用將比靜脈內(nèi)施用需要更高的劑量。為了口服施用時更高的穩(wěn)定性，可將酰胺鍵以及氨基末端和羧基末端進行修飾。例如，可將羧基末端酰胺化。劑型可將本發(fā)明的化合物并入多種用于治療施用的劑型。更具體地，可將本發(fā)明的化合物通過與合適的、可藥用的載體或稀釋劑組合配制成藥用組合物，并且可以配制成固體、半固體、液體或氣體形式的制備物，例如片劑(tablet)、月交嚢(capsule)、粉劑(powder)、顆粒劑(granule)、軟膏(ointment)、乳膏(cream、泡沫(foam)、；容液、4全齊寸(suppository)、注射劑(injection)、吸入劑(inhalant)、凝膠(gel)、微球體(microsphere)、洗劑(lotion)和氣溶膠。同樣地，可以多種方法完成所述化合物的施用，包括口服、頰、直腸、腸胃外、腹膜內(nèi)、真皮內(nèi)、透皮、氣管內(nèi)(intracheal)等施用。本發(fā)明的抗微生物多肽在施用之后可以是全身的，或通過使用植入物或發(fā)揮作用以在植入位點保持活性劑量的其它劑型，可將本發(fā)明的抗微生物多肽定位。在一個實施方式中，局部使用(topicaluse)的劑型包含降低二價陽離子，尤其是鈣和鎂的有效濃度的螯合劑。例如，可包括試劑例如檸檬酸鹽(citrate)、EGTA或EDTA,其中檸檬酸鹽是優(yōu)選的。檸檬酸鹽的濃度將通常是大約1至10mM。本發(fā)明的化合物可單獨施用，^:此組合施用，或它們能夠與其它已知的化合物(例如，穿孔蛋白(perforin)、抗炎劑、抗生素等)組合^f吏用。在藥物劑量形式中，所述化合物可以它們可藥用的鹽形式施用。以下方法和賦形劑僅作為示例性而絕非用以限制。對于口服制備物，所述化合物能夠單獨使用或與合適的添加劑組合使用，以制成片劑、粉劑、顆粒劑或膠嚢，例如，與常規(guī)添加劑組合使用，例如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉；與粘合劑組合使用，例如結(jié)晶狀纖維素(crystaUinecellulose)、纖維素衍生物、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；與崩散劑(disintegrator)組合使用，例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或羧曱基纖維素鈉(sodiumcarboxymethylcellulose);與潤滑劑組合4吏用，例如滑石或石更脂酸4美；并且如果需要的話，與稀釋劑、緩沖劑、潤濕劑、防腐劑和調(diào)味劑組合使用?？赏ㄟ^將所述化合物溶解、懸浮或乳化在含水或非水的溶劑中而將所述化合物配制成用于注射的制備物，所述溶劑例如植物性或其它類似的油，合成的脂肪酸甘油酯，丙二醇或高級脂肪酸的酯類；并且如果需要的話，含有常規(guī)添加劑例如增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。可將所述化合物用于通過吸入施用的氣溶膠劑型中。可將本發(fā)明的化合物調(diào)酉己在可增壓推進劑(pressurizedacceptablepropellant)中，例如二氯二氟曱烷、丙烷、氮等。通過與常規(guī)添加劑例如增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑一起配制，可將所述化合物用作洗劑，例如預防燒傷感染的洗劑。此外，所述化合物可通過與各種基底(base)例如乳化基底(emulsifyingbase)或水溶性基底(water-solublebase)混合制成栓劑。本發(fā)明的化合物可通過栓劑直腸施用。所述栓劑可包括在體溫熔化而在室溫固化的媒介物(vehicle)例如可可油、碳蠟和聚乙二醇?？商峁┛诜蛑蹦c施用的單位劑型(unitdosageform)例如糖漿、酏劑(elixir)和懸劑，其中每劑量單位例如一茶匙(teaspoonflil)、一大湯匙(tablespoonfUl)、片劑或栓劑含有預先確定量的組合物，該組合物中包含一種或多種本發(fā)明的化合物。類似地，用于注射或靜脈內(nèi)施用的單位劑型可在組合物中包含本發(fā)明的化合物，作為無菌水、生理鹽水或其它可藥用載體中的溶液。持續(xù)釋力文劑型的才直入物(implantsforsustainedreleaseformulations)是本領域熟知的。將植入物與生物可降解或生物不可降解的聚合物一起配制成微球體(microsphere)、板(slab)等。例如，乳酸和/或乙醇酸的聚合物形成宿主良好耐受的易受侵蝕的聚合物(erodiblepolymer)。將含有本發(fā)明抗微生物多肽的植入物置于接近感染位點處，從而將活性劑的局部濃度相對于身體的其它部分增力口。術(shù)語"單位劑型，，用于本文指適合作為人和動物受試者單位劑量的物理上的離散單位(physicallydiscreteunit),每單位含有預定量的本發(fā)明化合物，所計算的量足以使本發(fā)明的化合物與可藥用的稀釋劑、載體或媒介物聯(lián)合以產(chǎn)生期望效果。對本發(fā)明的單位劑型的規(guī)格(specification)依賴于所采用的具體化合物、待達到的效果和在宿主中與所述化合物有關(guān)的藥物動力學?？伤幱玫馁x形劑，諸如媒介物、佐劑、載體或稀釋劑，對于公眾是易于獲得的。此外，可藥用的輔助物質(zhì)(auxiliarysubstance)，諸如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑、滲壓調(diào)節(jié)劑(tonicityadjustingagent)、穩(wěn)定劑、潤濕劑等，對于公眾是易于獲得的。對于全身施用的通常劑量范圍是每次施用從0.1皮克至100毫克每千克受試者重量。通常劑量可以是每日2至6次服用一個片劑，或每日一次服用一個含有較高比例活性成分含量經(jīng)時釋放(time-release)膠嚢或片劑。所述經(jīng)時釋放效果可以通過在不同pH值溶解的膠嚢材料、通過按照滲透壓緩慢釋放的膠嚢或通過任何其它已知的控制釋放的方法來獲得。本領域技術(shù)人員易于理解的是，劑量水平可作為特定化合物、癥狀的嚴重性和受試者對副作用的敏感性的函數(shù)而改變。某些特定的化合物比其它化合物更有效。對于指定化合物的優(yōu)選劑量，本領域技術(shù)人員可通過各種方法容易地決定。優(yōu)選的方法是測量指定化合物的生理效價(physiologicalpotency)。使用脂質(zhì)體作為遞送媒介物是一種感興趣的方法。脂質(zhì)體與靶位點的細胞融合，并且在細胞內(nèi)遞送腔室(lumen)的內(nèi)容物。將脂質(zhì)體保持與細胞接觸一段足夠融合的時間，使用各種方法以保持接觸，例如分離、結(jié)合劑等。在本發(fā)明的一個方面，將脂質(zhì)體設計成氣溶膠化用于肺部施用。脂質(zhì)體可與介導膜融合的純化蛋白或肽，例如仙臺(Sendai)病毒或流感病毒等一起制備。脂質(zhì)可以是形成脂質(zhì)的已知的脂質(zhì)體的任何有用的組合，包括陽離子或兩性離子的脂質(zhì)，例如磷脂酰膽堿。剩余的脂質(zhì)通常將是中性或酸性脂質(zhì)，例如膽固醇、磷脂酰絲胺酸、磷脂酰甘油等。對于制備脂質(zhì)體，可使用由Kato"a/.(1991)/歷o/.C&m.266:3361描述的方法。筒而言之，將包含肽的腔室組合物和脂質(zhì)在適當?shù)暮橘|(zhì)中組合，方便地是鹽水介質(zhì)，其中總固體將在約l-10重量百分比的范圍內(nèi)。在劇烈攪拌一段短時間之后(約5-60秒)，將試管置于溫(warm)水浴中(約25_40°C)，并且重復這個循環(huán)約5-10次。然后將組合物超聲處理一段合宜的時間(一般約1-10秒)，并可通過渦旋震蕩進一步攪拌。接著通過加入含水介質(zhì)擴張體積，一般增加約1-2倍體積，然后搖動并且冷卻。這種方法使得高分子量分子并入至腔室中。具有其它活性劑的配制物為了用于本發(fā)明的方法，可將本發(fā)明的抗微生物多肽與其它醫(yī)藥上的活性劑一起配制，具體而言，與其它抗微生物劑一起配制。感興趣的其它劑包括本領域內(nèi)已知的各種抗生素?？股氐姆N類包括青霉素，例如青霉素G、青霉素v、二曱氧基苯青霉素、苯唑西林、羧千青霉素、萘夫西林、氨芐青霉素等；青霉素組合(3-內(nèi)酰胺酶抑制劑、頭孢菌素，例如頭孢克洛、頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢羥羧氧酰胺等；碳青霉烯類；單環(huán)內(nèi)酰胺類；氨基糖苷類；四環(huán)素類；大環(huán)內(nèi)酯類；林可霉素類；多粘菌素類；磺胺類；會諾酮類；氯霉素(cloramphenical);曱硝唑；大觀霉素；曱氧芐啶；萬古霉素等。抗真菌劑也是有用的，包括多烯類，例如兩性霉素B、制霉菌素；5-氟可新；和唑系，例如咪康唑、酮康哇、伊曲康唑和氟康唑?？菇Y(jié)核藥物包括異煙肼(isoniazid)、乙胺丁醇(ethambutol)、鏈霉素和利福平(rifampin)。也可將細胞因子納入本發(fā)明的抗微生物多肽配制物中，例如干擾素y、腫瘤壞死因子a、白細胞介素12等。體外合成本發(fā)明的抗微生物肽可以使用本領域已知的常規(guī)方法通過體外合成制備。可使用多種商業(yè)合成設備，例如AppliedBiosystemsInc.,Beckman的自動合成儀等。通過使用合成儀，可將天然存在的氨基酸用非天然氨基酸取代，尤其是用D-異構(gòu)體(或D型)例如D-丙氨酸和D-異亮氨酸、非對應異構(gòu)體、具有不同長度或官能度(fUnctionaiity)的側(cè)鏈等來取。具體的序列和制備的方式將由簡便性、經(jīng)濟性、所需純度等來決定。可將化學連接提供至多種肽或蛋白質(zhì)，其包含便于鍵合的官能度，例如用于酰胺或取代胺類形成(例如還原胺化)的氨基；用于硫醚或二硫化物形成的硫醇基；用于酰胺形成的羧基等。如果需要，可在合成期間或表達期間將多種基團引入肽中，其允許對其它分子或表面的連接。因此，半胱氨酸能夠用來制備硫醚、用于連接至金屬離子復合體的組氨酸；用于形成酰胺或酯的羧基；用于形成酰胺的氨基等。還可根據(jù)重組合成的常規(guī)方法將多肽進行分離和純化?？芍苽浔磉_宿主的裂解物，并且使用HPLC、排阻層析、凝膠電泳、親和層析或其它純化技術(shù)來純化所述裂解物。在極大程度上，與涉及產(chǎn)品制備及其純化方法的污染物相比，所用組合物將包含按重量計至少20%的期望產(chǎn)品，更通常的情況是包含按重量計至少大約75%的期望產(chǎn)品，優(yōu)選包含按重量計至少大約95%的期望產(chǎn)品，并且對于治療目的通常包含按重量計至少大約99.5%的期望產(chǎn)品。通常而言，所述百分數(shù)將以總蛋白質(zhì)為基礎。動物飼料本發(fā)明還涉及用于將具有抗微生物活性的多肽用于動物飼料的方法，以術(shù)語"動物，，包括所有動物，包括人類。動物的實例是非反芻動物和反芻動物，例如牛、羊和馬。在具體的實施方式中，動物是非反芻類動物。非反芻類動物包括單胃動物，例如豬(pig)或豬(swine)(包括但不限于小豬、成長中的豬(growingpig)和母豬(sows));家禽例如火雞和雞(包括但不限于雛雞(broilerchick)、蛋雞(layer));小牛(youngcalves);和魚類(包括但不限于鮭魚)。術(shù)語"飼料，，或"飼料組合物"的意思是適合于動物攝入或旨在供給動物攝入的任何化合物、制備物、混合物或組合物。在根據(jù)本發(fā)明的用途中，可將抗微生物多肽在々欠食之前、之后或與之同時地喂給動物。后者是優(yōu)選的。在具體的實施方式中，添加至飼料中的形式的抗微生物多肽、或包括在飼料添加物中時的抗微生物多肽是定義明確的。定義明確意味著所述抗微生物多肽制備物由大小排阻層析測定是至少50%純的(參見WO01/58275的實施例12)。在另外的具體實施方式中，抗微生物多肽制備物由此方法測定是至少60、70、80、85、88、90、92、94或至少95%純的。定義明確的抗微生物多肽制備物是有利的。例如，將基本上不含其它干擾或污染抗微生物多肽的抗微生物多肽正確地劑量給藥于飼料要容易得多。術(shù)語"正確地劑量給藥"具體而言指獲得一致的并且恒定的結(jié)果的目的，和基于期望的效果最優(yōu)化劑量的能力。然而，對于在動物飼料中的用途，抗微生物多肽不需要那么純；例如抗微生物多肽可以包括其它酶，在這種情況下可稱其為抗微生物多肽制備物。可將抗微生物多肽制備物(a)直接添加至飼料(或直接使用在植物蛋白的處理過程中)，或(b)可將其用于產(chǎn)生一種或多種中間體組合物，例如后續(xù)加入到飼料中(或在處理過程中使用的)的飼料添加劑或預混合料(premix)。如上所述的純度指原始抗微生物多肽制備物的純度，無論用于如上的(a)或(b)。這種數(shù)量級純度的抗微生物多肽制備物具體而言能夠使用重組產(chǎn)生方法來獲得，而它們不是很容易獲得的，并且當通過傳統(tǒng)發(fā)酵方法產(chǎn)生所述抗微生物多肽時，還要經(jīng)受更嚴重的批次變化(batch-to-batchvariation)。當然，可將這種抗微生物多肽制備物與其它酶混合。術(shù)語"植物蛋白，，用于本文指任何化合物、組合物、制備物或混合物，其包含至少一種書亍生自(derivedfrom)或起源于(originatingfrom)才直物的蛋白質(zhì)，包括修飾的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)衍生物。在具體的實施方式中，植物蛋白的蛋白質(zhì)含量是至少10、20、30、40、50或60°/。(w/w)。植物蛋白可源自植物蛋白來源，諸如豆類和谷類，例如來自豆科(Fa6aceae)(豆科(丄eg騰/"osae))、十字花科(Owc^raceae)、藜科(C/zewo;c^aceae)和禾本科CPoaceae)植物的材料，諸如大豆4分、羽扇豆4分和油菜籽粉。在具體的實施方式中，植物蛋白來源是來自豆科的一種或多種植物的材料，例如大豆、羽扇豆、豌豆或豆。在另外的具體實施方式中，植物蛋白來源是來自藜科的一種或多種植物的材料，例如甜菜(beet)、糖甜菜(sugarbeet)、菠菜(spinach)或昆諾阿藜(quinoa)。植物蛋白來源的其它實例是油菜籽和甘藍。大豆是優(yōu)選的植物蛋白來源。植物蛋白來源的其它實例是谷類諸如大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉蜀黍(玉米)、稻和高粱?？刮⑸锒嚯哪軌蛞匀魏涡问教砑又溜暳希渥鳛橄鄬兊目刮⑸锒嚯模蚺c有意添加至動物飼料的其它成分混合，即以動物飼料添加劑的形式，例如所謂的動物飼料的預混合料。在另外的方面，本發(fā)明涉及在動物飼料中使用的組合物，例如動物飼料和動物飼料添加劑，例如預混合泮牛。除了本發(fā)明的抗微生物多肽之外，本發(fā)明的動物飼料添加劑包含至少一種脂溶性維生素，和/或至少一種水溶性維生素，和/或至少一種痕量礦物質(zhì)，和/或至少一種大量礦物質(zhì)(macromineral)。此外，任選的飼料添加劑成分是著色劑(coloringagents)、芳香化合物(aromacompounds)、穩(wěn)定劑和/或至少一種其它的酶，所述酶選自肌醇六磷酸酶EC3.1.3.8或3.1.3.26;木聚糖酶EC3.2.1.8;半乳聚糖酶EC3.2.1.89;和/或卩-葡聚糖酶EC3.2.1.4。在具體的實施方式中，將這些其它的酶明確定義(如上對于抗微生物多肽制備物的定義)。其它抗樣t生物肽(AMPs)的實例是CAP18、LeucocinA、Tritrpticin、Protegrin-l、Thanatin、防衛(wèi)素(Defensin)、Ovispirin，H口Novispirin(RobertLehrer、2000)，和它們保留抗微生物活性的變體或片段。其它抗真菌多肽(AFPs)的實例是巨大曲霉(^5pergz7/usg/ga"few"和黑曲霉肽，以及它們保留抗真菌活性的變體和片段，如WO94/01459和WO02/090384中所公開。通常脂肪和水溶性維生素、以及痕量礦物質(zhì)形成有意添加至飼料的所謂的預混合料部分，而通常將大量礦物質(zhì)分開添加至飼料。這些組合物類型中的任一個與本發(fā)明的抗微生物多肽一起富集(enrich)時，都是本發(fā)明的動物飼津牛添力口劑。在具體的實施方式中，旨在將本發(fā)明的動物飼料添加劑以0.01至10.0%;更具體而言0.05至5.0%;或0.2至1.0%(%意味著克添加劑/100克飼料)的水平包括于(或規(guī)定為必需包括于)動物飲食或飼料中。尤其對于預混合料而言。以下是這些成分實例的非限定性列表脂溶性維生素的實例是維生素A、維生素D3、維生素E和維生素K，例如維生素K3。水溶性維生素的實例是維生素B12、生物素和膽-威、維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸(niacin)、葉酸和泛酸鹽(panthothenate),例如D-泛酸鈣(Ca-D-panthothenate)。痕量礦物質(zhì)的實例是錳、鋅、鐵、銅、碘、硒和鈷。大量礦物質(zhì)的實例是鈣、磷和鈉。對這些成分的營養(yǎng)需求(用家禽和小豬/豬示例)列于WO01/58275的表A。營養(yǎng)需求的意思是這些成分應該以說明的濃度在飲食中提供?？晒┻x擇的是，本發(fā)明的動物祠料添加劑包含至少一種WO01/58275的表A中指定的單獨成分。至少一種的意思是任一種、一種或多種、一種、或兩種、或三種、或四種等等多至所有十三種、或多至所有十五種單獨組分。更具體而言，將這樣至少一種單獨組分包括在本發(fā)明的添加劑中，所述組分的量提供其飼料中濃度(in-feed-concentration)在表A第4欄、第5欄或第6欄中說明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明還涉及動物飼料組合物。動物飼料組合物或飲食具有相對高的蛋白質(zhì)含量。家禽和豬飲食的特征可如WO01/58275表B的第2-3欄中所說明。魚類飲食的特征可如此表B的第4欄中所說明。此外，這些魚類飲食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。根據(jù)本發(fā)明的動物飼料組合物具有50-800g/kg的粗蛋白含量，并且進一步包含至少一種如本文中所要求的抗微生物多肽。此外，或可供選擇的是(對于上述粗蛋白含量)，本發(fā)明的動物飼料組合物具有10-30MJ/kg的可代謝能量(metabolisableenergy)含量；和/或0.1-200g/kg的鈣含量；和/或0.1-200g/kg的可用磷含量；和/或0.1-100g/kg的曱硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的曱硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的賴氨酸含量。在具體的實施方式中，可代謝能量、粗蛋白、鈣、磷、曱硫氨酸、曱硫氨酸加半胱氨酸和/或賴氨酸的含量在WO01/58275(R.2-5)表B中2、3、4或5任一的范圍內(nèi)。將粗蛋白計算為氮(N)乘以因子6.25,即粗蛋白(g/kg)=N(g/kg)x6.25。氮含量由Kjeldahl方法(A.O.A.C.，1984，OfficialMethodsofAnalysis14thed.，AssociationofOfficialAnalyticalChemists,WashingtonDC)來測定?？纱x能量能句多基于theNRCpublicationNutrientrequirementsinswine,ninthrevisededition1988,subcommitteeonswinenutrition,committeeonanimalnutrition,boardofagriculture,nationalresearchcouncil.NationalAcademyPress,Washington,D.C.，pp.2-6,和theEuropeanTableofEnergyValuesforPoultryFeed-stuffs,Spelderholtcentreforpoultryresearchandextension,7361DABeekbergen,TheNetherlands.GrafischbedrijfPonsen&looijenbv,Wageningen.ISBN90-71463-12-5來計算。完全動物飲食中鈣、可用磷和氨基酸的飲食含量基于飼料表來計算，例^口Veevoedertabel1997，gegevensoverchemischesamenstelling,verteerbaarheidenvoederwaardevanvoedermiddelen,CentralVeevoederbureau,Runderweg6，8219pkLelystad.ISBN90-72839-13-7。在具體的實施方式中，本發(fā)明的動物飼料組合物包含至少一種如上所定義的植物蛋白或蛋白質(zhì)來源。在另外的具體實施方式中，本發(fā)明的動物飼料組合物包含0-80%玉米；和/或0-80%高粱；和/或0-70%小麥；和/或0-70%大麥；和/或0-30%燕麥；和/或0-40%大豆粉；和/或0-10%魚粉；和/或0-20%乳清。能夠?qū)游镲嬍持圃斐衫珲惨猴暳?mashfeed)(非粒狀(nonpelleted))或粒狀飼料。通常而言，將研磨的祠料混合，并且根據(jù)所述物種的具體要求添加足夠量的必要維生素和礦物質(zhì)?？蓪⒚缸鳛楣腆w或液體酶配制物添加。例如，固體酶配制物通常在混合步驟之前或期間添加；液體酶配制物通常在制粒步驟之后添加。也可將酶并入飼料添加劑或預混合料。飲食中的最終酶濃度在0.01-200mg酶蛋白每kg飲食的范圍內(nèi)，例如在5-30mg酶蛋白每kg動物飲食的范圍內(nèi)?？蓪⒖刮⑸锒嚯陌匆韵铝?劑量范圍)的一種或多種來施用0.01-200;或0.01-100;或0.05-100;或0.05-50;或0.10-10——所有這些范圍的單位均為mg抗微生物多肽蛋白每kg飼料(ppm)。為了測定mg抗微生物多肽蛋白每kg飼料，將抗微生物多肽從飼料組合物中純化，并且使用相關(guān)的試驗(參見抗微生物活性、底物和試驗)來測定純化的抗微生物多肽的比活。飼料組合物的抗微生物活性同樣也使用相同的試驗來測定，并且基于這兩種測定，計算出以mg抗微生物多肽蛋白每kg飼料表示的劑量。相同原理應用于測定飼料添加劑中的mg抗微生物多肽蛋白。當然，如果用于制備飼料添加劑或飼料的抗孩t生物多肽的樣品可用，則從此樣品測定比活(無需從飼料組合物或添加劑中純化所述抗微生物多肽)。信號肽和前肽本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含編碼蛋白質(zhì)的基因，其與第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之一或二者可操作地連接；所述第一核苦酸序列由SEQIDNO:l的核香酸1至72組成，其編碼由SEQIDNO:2的氨基酸-165至-142組成的信號肽；所述第二核苷酸序列由SEQIDNO:l的核苷酸73至495組成，其編碼由SEQIDNO:2的氨基酸-141至-1組成的前肽；其中所述基因?qū)τ诘谝缓偷诙塑誗吏序列是外源的。本發(fā)明還涉及包含這些核酸構(gòu)建體的重組表達載體和重組宿主細胞。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包括(a)在適合于產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)這樣的重組表達細胞；和(b)回收所述蛋白質(zhì)?？蓪⒌谝缓偷诙塑誗吏序列單獨地或組合地同其它調(diào)控序列一起可才喿作地與外源基因連接。這些其它調(diào)控序列如上所述。如早前所述，當信號肽和前肽區(qū)二者均存在于蛋白質(zhì)的氨基末端時，前肽區(qū)位置緊接著蛋白質(zhì)的氨基末端，并且信號肽區(qū)位置緊接著前肽區(qū)的氨基末端。所述蛋白質(zhì)對于宿主細胞可以是天然的或異源的。術(shù)語"蛋白質(zhì)"在本文不意指特定長度的編碼產(chǎn)物，并且因此包含肽、寡肽和蛋白質(zhì)。術(shù)語"蛋白質(zhì)"還包含組合以形成編碼產(chǎn)物的兩種或更多種多肽。蛋白質(zhì)還包括雜合多肽，其包含從至少兩種不同蛋白質(zhì)獲得的部分或全部多肽序列的組合，其中一種或多種蛋白質(zhì)對于宿主細胞可以是異源的或天然的。蛋白質(zhì)進一步包括上述蛋白質(zhì)和雜合蛋白的天然存在的等位基因變異和工程變異。優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)是激素或其變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分、或報告分子(reporter)。在更優(yōu)選的方面，蛋白質(zhì)是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶或連接酶。在甚至更優(yōu)選的方面，蛋白質(zhì)是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶(cutinase)、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、卩-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡糖苷酶、|3-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、突變酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。46所述基因可以獲得自任何原核的、真核的和其它的來源。本發(fā)明進一步通過以下實施例來描述，而不應將其理解為對本發(fā)明范圍的限制。實施例用作緩沖液和底物的化學藥品是至少試劑級的商業(yè)產(chǎn)品。在以下實施例中，將如SEQIDNO:2的氨基酸1至21所示的抗孩t生物多肽稱為"Arenicin"。實施例1Arenicin的抗樣i生物活性合成制備如SEQIDNO:2的氨基酸1至21所示的抗微生物肽。根據(jù)CLSI(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute;先前稱為NationalCommitteeforClinicalandLaboratoryStandards)的NCCLS準則-規(guī)程M7-A6,vol.20，No.2:MethodsforDilutionAntimicrobialSusceptibilityTestsforBacteriaThatGrowAerobically，來測定MinimalInhibitoryConcentration(MIC;最小抑制濃度)以測試Arenicin的抗樣i生物活性。針對從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的12種細菌菌抹來測試本發(fā)明的抗;敞生物肽。表l中的結(jié)果是兩個獨立評估的平均值。<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>表1.Arenicin的抗微生物活性實施例2針對臨床真菌的最小抑制濃度針對酵母和真菌的Arenicin的最小抑制活性的測定基本上如NCCLS/CLSI(臨床和試驗室標準協(xié)會)所述。概括而言，將大約1McFarland單位的真菌或酵母懸液以1:100稀釋在PD培養(yǎng)液(8g/L馬鈴薯葡萄糖(potatodextrose))中，并且相對于2倍系列稀釋的Arenicin(0.03-32ng/mL)測試其生長。對于白念珠菌、熱帶念珠菌(Ca"^fofrap/ca/^)、新型隱3求菌(Qyptococcwsweoy^mam1)、須發(fā)蘚菌(7Hc/7o_p/z_ytow/wg"togrc;p/^tes)和絮狀表皮褲菌(五p^er附cip/!yto"y7occosw附)，將試馬全平+反在25-27。C溫育；而對于光滑念珠菌(Cfl"^^g/^)rato)、巴斯德畢赤酵母(尸/c/z/a;oston》、釀酒酵母和黑曲霉，將試驗平板在30。C溫育。在大約40小時的溫育之后，憑視覺觀察(肉眼，傾斜照明(obliqueillumination))記錄生長。結(jié)果示于下表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表2.Arenicin的抗孩i生物活性權(quán)利要求1.具有抗微生物活性的多肽，其選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO2的氨基酸1至21有至少60％同一性的氨基酸序列；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少中嚴緊條件下與(i)SEQIDNO1的核苷酸496至558，(ii)SEQIDNO1的核苷酸1至558中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；(c)變體，其包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO2的氨基酸1至21；和(d)(a)或(b)的片段，其具有抗微生物活性。2.權(quán)利要求1的多肽，其中所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的氨基酸1至21有至少65%同一性，優(yōu)選至少70%同一性，更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少85%同一性，最優(yōu)選至少90%同一性，或至少95%同一性。3.權(quán)利要求l的多肽，其包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。4.權(quán)利要求1的多肽，所述多肽由SEQIDNO:2或其具有抗微生物活性的片段組成。5.權(quán)利要求4的多肽，所述多肽由SEQIDNO:2組成。6.權(quán)利要求4的多肽，所述多肽由SEQIDNO:2的氨基酸l至21組成。7.權(quán)利要求l的多肽，所述多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少中-高嚴緊條件下與(i)SEQIDNO:l的核苷酸496至558,(ii)SEQIDNO:l的核苷酸1至558中包含的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交。8.權(quán)利要求l的多肽，所述多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴緊條件下與(i)SEQIDNO:l的核苷酸496至558,(ii)SEQIDNO:l的核香酸1至558中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交。9.權(quán)利要求l的多肽，其中所述多肽是變體，其包含保守取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的氨基酸1至21。10.分離的多核苷酸，其包含編碼權(quán)利要求l-9任一項的多肽的核苷酸序列。11.權(quán)利要求10的分離的多核苷酸，其在SEQIDNO:l的成熟多肽編碼序列中具有至少一個突變，其中所述突變的核香酸序列編碼由SEQIDNO:2的氨基酸1至21組成的多肽。12.核酸構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求10的多核苦酸，所述多核香酸與一個或多個在表達宿主中指導所述多肽產(chǎn)生的調(diào)控序列可操作地連接。13.重組表達載體，其包含權(quán)利要求12的核酸構(gòu)建體。14.重組宿主細胞，其包含權(quán)利要求12的核酸構(gòu)建體。15.用于產(chǎn)生權(quán)利要求l-10任一項的多肽的方法，其包括(a)在有益于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細胞，所述細胞以其野生型形式能夠產(chǎn)生所述多肽；或在有益于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)包含核酸構(gòu)建體的宿主細胞，所述核酸構(gòu)建體包含編碼所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。16.分離的多核苷酸，其通過如下獲得(a)在中-高嚴緊條件下，將DNA群體與(i)SEQIDNO:l的核芬酸496至558,(ii)SEQIDNO:l的核普酸1至558中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；和(b)分離雜交的多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有抗微生物活性的多肽。17.根據(jù)權(quán)利要求16的分離的多核苷酸，其通過如下獲得(a)在高嚴緊條件下，將DNA群體與(i)SEQIDNO:1的核苦酸496至558,(ii)SEQIDNO:1的核苷酸1至558中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；和(b)分離雜交的多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有抗微生物活性的多肽。18.用于產(chǎn)生具有突變核苷酸序列的多核苷酸的方法，其包括(a)將至少一種突變引入SEQIDNO:l的成熟多肽編碼序列，其中所述突變的核苷酸序列編碼由SEQIDNO:2的氨基酸1至21組成的多肽；和(b)回收包含所述突變核苷酸序列的多核苷酸。19.由權(quán)利要求18的方法產(chǎn)生的突變的多核香酸。20.用于產(chǎn)生多肽的方法，其包括(a)在有益于所述多肽產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)包含編碼所述多肽的權(quán)利要求19的突變多核苷酸的細胞；和(b)回收所述多肽。21.用于產(chǎn)生權(quán)利要求l-10任一項的多肽的方法，其包括(a)在有益于所述多肽產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)包含多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞，所述多核苷酸編碼本發(fā)明的具有抗微生物活性的多肽；和(b)回收所述多肽。22.轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細胞，其已經(jīng)用編碼權(quán)利要求l-10任一項的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化。23.組合物，其包含如權(quán)利要求l-10任一項所限定的抗微生物多肽和可藥用媒介物。24.用于殺死或抑制微生物細胞生長的方法，其包括將所述微生物細胞與權(quán)利要求1-10任一項所限定的抗微生物多肽接觸。25.權(quán)利要求l-10任一項所限定的抗微生物多肽，其用作藥物，或抗微生物的獸用或人用治療劑或預防劑。26.權(quán)利要求l-10任一項所限定的抗微生物多肽在制備獸用或人用治療劑中的用途，所述治療劑用于治療微生物感染或用于預防用途。27.權(quán)利要求l-10任一項所限定的至少一種抗微生物多肽在動物飼料中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及具有抗微生物活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細胞，以及用于產(chǎn)生和使用多肽的方法。文檔編號C07K14/435GK101248085SQ200680030707公開日2008年8月20日申請日期2006年8月22日優(yōu)先權(quán)日2005年8月26日發(fā)明者尼古拉杰·斯波德斯伯格申請人:諾維信公司