專利名稱：：結合egfr的抗原結合分子，編碼它的載體，及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及抗原結合分子(ABMs)。在特別的實施方案中，本發(fā)明涉及重組單克隆抗體，包括特異于人表皮生長因子受體(EGFR)的嵌合的、靈長類化(primatized)或人源化的抗體。此外，本發(fā)明涉及編碼這些ABMs的核酸分子，和包括這些核酸分子的載體和宿主細胞。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的ABMs的方法，和將這些ABMs用在治療疾病中的方法。此外，本發(fā)明涉及具有修飾的糖基化作用和具有改善的治療特性的ABMs，包括具有增加的Fc受體結合和增加的效應子功能的抗體。
背景技術：
：EGFR和抗-EGFR抗體人表皮生長因子受體(也已知為HER-1或Erb-Bl，并且在本文中稱作"EGFR")是170kDa的跨膜受體，其由c-e^B原癌基因編碼，并且顯示固有的酪氨酸激酶活性(Modjtahedi"a/.,&C朋cct"73:228-235(1996);Herbst和Shin,Ca"cer94:1593-1611(2002》。SwissProt數(shù)據(jù)庫登錄號P00533提供了EGFR的序列。還存在EGFR的同種型和變體(例如，可變RNA轉錄物，截短形式，多態(tài)性等)，包括但不限于Swi伝prot數(shù)據(jù)庫登錄號P00533-l，P00533-2，P00533-3，和P00533-4確定的那些。已知EGFR結合包括以下各項的配體表皮生長因子(EGF)，轉化生長因子-a(TGf-a)，雙調(diào)蛋白，肝素結合EGF(hb-EGF)，卩動物纖維素，和epiregulin(Herbst和Shin，Cancer94:1593-1611(2002);Mendelsohn和Baselga，O"cogeweJP:6550-6565(2000))。EGFR經(jīng)由酪氨酸激酶介導的信號轉導途徑調(diào)節(jié)許多細胞過程，包括但不限于激活控制細胞增殖、分化、細胞存活、程序性細胞死亡、血管發(fā)生、有絲分裂發(fā)生和轉移的信號轉導途徑(Atalay"a/.,j朋.0wcoZogy14:1346-1363(2003);Tsao和Herbst，Szgw/4:4-9(2003);Herbst和Shin，Cowcer94:1593-1611(2002);ModjtahediefaZ,，5a:■/Ca"cer73:228-235(1996))。EGFR的過表達已經(jīng)在許多人類惡性病癥中報道，包括膀胱癌、腦癌、頭和頸癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌和腎癌。(Atalay"乂朋.Owco/ogy14:1346-1363(2003);Herbst禾卩Shin，Cancer94:1593-1611(2002)Modjtahediefa/.，5:Oz"ce/"73:228-235(1996))。在這些病癥的許多中，EGFR的過表達與患者的差的預后相關或關聯(lián)。(Herbst和Shin，94:1593-1611(2002)Modjtahedi"a/"5;:7C口"cer73:228-235(1996))。EGFR也在正常組織的細胞中表達，特別是皮膚、肝臟和胃腸道的上皮組織，盡管通常水平比在惡性細胞中低(Herbst和Shin，Ca醇94:1593-1611(2002))。未綴合的單克隆抗體(mAbs)可以是用于治療癌癥的藥，如由美國食品和藥物管理局(U.S.FoodandDrugAdministration)所批準的下列藥物所證明用于治療晚期乳腺癌的曲妥單抗(Herc印tinTM;GenentechInc,)(Grillo國Lopez，A.畫J.,"aZ.，Semz'".Owco/.26:66-73(1999);Goldenberg,M.M.，C"w.7%ct:27:309-18(1999))，用于治療CD20陽性B細胞，低級或濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤的利妥昔單抗(Rituxan1^IDECPharmaceuticals,SanDiego,CA，和GenentechInc.,SanFrancisco,CA),用于治療復發(fā)性急性骨髓白血病的吉姆單抗(Mylotarg1^，Celltech/Wyeth-Ayerst)，和用于治療B細胞慢性淋巴細胞白血病的阿侖單抗(CAMPATH,MilleniumPharmaceuticals/ScheringAG)。這些產(chǎn)品的成功不僅依賴于它們的功效，還依賴于它們突出的安全模式(Grillo-Lopez，A,J.,0"co/.26:66-73(1999);Goldenberg,M.M.，Cft".7%欲":309-18(1999))。盡管在這些藥物上所取得的成就，目前在獲得更高特異性抗體活性方面存在巨大的興趣，所述特異性活性比典型地由未綴合的mAb療法所提供的要高。許多研究的結果顯示Fc-受體依賴性機制相當大地有利于對針對腫瘤的細胞毒性抗體的作用，并且指示針對腫瘤的最佳抗體將優(yōu)先結合激活Fc受體，并且與抑制性配偶體FcyRIIB結合程度最小。(Clynes，R.A.,wo/.，Me必cz'"eW力:443446(2000);Kalergis，A.M.，和Ravetch，J.V.,/200680004310.4說明書第3/131頁fi^.MW"5(7":1653-1659(2002年6月)。例如，至少一項研究的結果顯示FcyRina受體中的多態(tài)性特別地與抗體療法的功效緊密相關(Cartron,G，w。/.,j8/oW卯:754-757(2002年2月))。該研究顯示對于FcyRIIIa是純合的患者，與對于FcYRIIIa是雜合的患者相比，具有更好的針對利妥昔單抗的應答。作者得出結論為更優(yōu)的應答是由于抗體與FcyRIIIa的更好的體內(nèi)結合，其導致了針對淋巴瘤細胞的更好的ADCC活性(Cartron，G.，w祝ood卯印:754-757(2002年2月))。已經(jīng)報道了靶向EGFR和阻斷EGFR信號傳導途徑的各種策略。小分子酪氨酸激酶抑制劑如gefitinib，erlotinib和CI-1033在胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域內(nèi)阻斷EGFR的自磷酸化，由此抑制下游信號傳導事件(Tsao和Herbst,5Vg7w/4:4-9(2003))。另一方面，單克隆抗體，靶向EGFR的胞外部分，導致阻斷配體結合并由此抑制下游事件如細胞增殖(Tsao和Herbst,57g"o/4:4-9(2003))。己經(jīng)產(chǎn)生了幾種鼠單克隆抗體，其獲得這種體外阻斷并且已經(jīng)在小鼠異種移植模型中評估它們影響腫瘤生長的能力(Masui,^Oz"cer46:5592-5598(1986);Masui，efa〖"C。wcer44:1002-1007(1984);Goldstein,"a/.，C7z".Owcw/ay,1:1311-1318(1995))。例如，EMD55900(EMDPharmaceuticals)是針對人表皮樣癌細胞系A431產(chǎn)生的鼠抗-EGFR單克隆抗體，并且在喉或下咽部晚期鱗狀細胞癌患者的臨床研究中檢驗(Bierefa/,,五wr.4rc^.Oto/u'"o^ry"go匸252:433-9(1995))。另夕卜，結合EGFR胞外結構域的大鼠單克隆抗體ICR16，ICR62，和ICR80己經(jīng)顯示有效抑制EGF和TGF-a受體的結合(Modjtahedi"aZ.，Ca"c"75:310-316(1998))。鼠單克隆抗體425是另一種針對人A431癌細胞系產(chǎn)生的Mab并且發(fā)現(xiàn)在人表皮生長因子受體的外部結構域上與多肽表位結合。(MurthyeM/.，JrcA.歷ocA柳.歷o//^.2520:549560(1987)。在治療性治療中使用鼠抗體的潛在問題是非人單克隆抗體可以被人宿主識別為外源蛋白；因此，重復注射這些外源抗體可導致誘導免疫反應，導致有害的過敏反應。對于基于鼠的單克隆抗體，這經(jīng)常被稱為人抗小鼠抗體應答，或"HAMA"應答，或人抗大鼠抗體，或"HARA"應答。此外，這些"異源"抗體可以被宿主的免疫系統(tǒng)所攻擊從而使它們，在達到它們的靶位點前被有效地中和。另外，非人單克隆抗體(例如，鼠單克隆抗體)典型地缺乏人效應子功能度，即它們不能，特別是通過抗體依賴性細胞毒性或Fc-受體介導的吞噬作用來介導補體依賴性的裂解或溶解人靶標細胞。已經(jīng)開發(fā)了嵌合抗體作為"綴合"抗體的替換物，所述嵌合抗休包含來自兩種或多種不同物種(例如，小鼠和人類)的抗體的部分。例如美國專利No.5，891，996(MateodeAcostadelRio"a/.)討論了小鼠/人嵌合抗體，R3，針對EGFR，并且美國專利No.5,558,864討論了產(chǎn)生嵌合和人源化形式的鼠抗-EGFRMAb425。此外，MC-C225(Erbitux;ImClone)是嵌合小鼠/人抗-EGFR單克隆抗體(基于小鼠M225單克隆抗體，其在人臨床試驗中導致HAMA應答)，其已經(jīng)報道在各種人異種移植模型中顯示抗腫瘤功效。(Herbst和Shin,C。"cer94:1593-1611(2002))。IMC-C225的功效己經(jīng)歸因于幾個機制，包括抑制通過EGFR信號傳導途徑調(diào)節(jié)的細胞事件，和可能通過增加的抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)活性(Herbst和Shin，Owcer94:1593-1611(2002))。MC-C225也用于臨床試驗中，包括與放射療法和化學療法聯(lián)合(Herbst和Shin，Ca"cer94:1593-1611(2002))。最近，Abgenix，Inc.(Fremont,CA)開發(fā)了用于癌癥治療的ABX-EGF。ABX-EGF是一種完全人的抗-EGFR單克隆抗體。(Yangefa/.,CWr.Zev.0"co/,/7/謹toZ.處17-23(2001》?？贵w糖基化寡糖成分可以顯著地影響與治療性糖蛋白的功效有關的性質，包括物理穩(wěn)定性，對蛋白酶攻擊的抗性，與免疫系統(tǒng)的相互作用，藥物代謝動力學，和特異性生物活性。這些性質可以不僅依賴于寡糖的存在或缺乏，還依賴于寡糖的特定結構。可以在寡糖結構和糖蛋白功能之間進行--些總結。例如，某些寡糖結構通過與特異性糖結合蛋白相互作用介導糖蛋白從血流中快速清除，而其它的可以被抗體結合并且觸發(fā)不需要的免疫反應。(Jenkins"aZ.，iVarMre5zotec/ino/.14:975-81(1996))。哺乳動物細胞是用于產(chǎn)生治療性糖蛋白的優(yōu)選宿主，由于它們具有以對于人應用的最相容的形式使蛋白質糖基化的能力。(Cummingwo/.，G7戸6油gy7:115-30(1991);Jenkins"a/.，^rwre腸tec/wo/.14:975-81(1996))。細菌極少使蛋白質糖基化，并且類似的其它類型的常見宿主，諸如酵母，絲狀真菌，昆蟲和植物細胞，產(chǎn)生糖基化模式，所述糖基化模式與從血流中快速清除、不理想的免疫相互作用有關，并且在一些特別的情形中，減少生物學活性。在哺乳動物細胞中，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞是過去的20年間最常用的細胞。除了給出適合的糖基化模式之外，這些細胞容許持續(xù)的產(chǎn)生遺傳穩(wěn)定的、高生產(chǎn)性的克隆細胞系。使用無血清培養(yǎng)基，它們可以在簡單生物反應器中被培養(yǎng)到高密度，并且容許開發(fā)安全和可再現(xiàn)的生物工藝。其它常用的動物細胞包括幼倉鼠腎(BHK)細胞，NS0-和SP2/0-小鼠骨髓瘤細胞。最近，還已經(jīng)測試了來自轉基因動物的生產(chǎn)。(JenkinsWa^,A^we歷otec/zwo/.14:975-81(1996))。所有的抗體在重鏈恒定區(qū)的保守位置包含糖結構，其中每種同種型都具有N-聯(lián)的糖結構的獨特陣列，其可變地影響蛋白質組裝，分泌或功能活性。(Wright,A.，和Morrison，S.L.,rre"血所ofec/7.":26-32(1997))。連接的N-聯(lián)糖的結構取決于加工的程度而相當大地變化，并且可以包括高-甘露糖，多支鏈以及雙觸角的復合物寡糖。(Wright，A.，和Morrison,S.L.，7>幼必及'otec/7.":26-32(1997))。典型地，存在在特定糖基化位點連接的核心寡糖結構的不均勻加工從而使均一的單克隆抗體作為多種糖形存在。類似地，己經(jīng)顯示在抗體糖基化中的主要不同發(fā)生在不同細胞系之間，并且甚至在不同培養(yǎng)條件下，觀察到對于給定細胞系的微小差異。(Lifely，M.Kefa/"G7—zo/ogy5,13-22(1995》。獲得潛能的大的增加，同時維^簡單的生產(chǎn)過程并潛在地避免明顯的、不理想的副作用的一種方式是通過改造它們的寡糖成分增加單克隆抗體的天然的、細胞介導的效應子功能，如在Umafia，P."a/.，A^wre5z'otec/7"o/.〃:176-180(1999)和美國專利號6,602,684中所述，將它們?nèi)績?nèi)容并入作為參考。IgGl型抗體，在癌癥的免疫療法中最常用的抗體是在每個CH2結構域的Asn297具有保守的N-聯(lián)糖基化位點的糖蛋白。與Asn297連接的兩個復合雙觸角寡糖隱藏在CH2結構域之間，形成了與多肽主鏈的廣泛接觸，并且它們的存在對于抗體介導效應子功能諸如抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)是必要的(Lifely，M.R.，efG7yco6zoZogy5:813-822(1995);Jefferis，R.,ZwwMrto/及ev763:59-76(1998);Wright,A,andMorrison,S.L.，7Vewfc歷ofec/z加/.75:26-32(1997))。Umaiia等先前顯示，p(l，4)-N-乙酰葡糖胺轉移酶in("GnTm")，一種催化分叉(bisected)寡糖形成的糖基轉移酶，在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中的過量表達，顯著增加了由改造的CHO細胞產(chǎn)生的抗-成神經(jīng)細胞瘤嵌合單克隆抗體(chCE7)的體外ADCC活性。(見Umafia，P.effl/.,A^wre5z'otec/mo/.〃:176-180(1999);和國際公開號WO99/54342，將其全部內(nèi)容并入作為參考)?？贵wchCE7屬于未綴合的mAbs的大類，其具有高腫瘤親和性和特異性，但是當在缺乏GnTin酶的標準工業(yè)化細胞系中生產(chǎn)時，效力過低而無法進行臨床應用(Uman^P.，efa/.，5zotec/z"o/./7:176-180(1999))。該研究首先顯示ADCC活性的大量增加可以通過將產(chǎn)生抗體的細胞改造為表達GnTIH而獲得，其也導致了恒定區(qū)(Fc)-關聯(lián)的、分叉的寡糖的比例增加到在天然存在的抗體中發(fā)現(xiàn)的水平以上，所述寡糖包括分叉的、非巖藻糖基化的寡糖。仍舊存在對于靶向EGFR的增強的治療方法，以治療靈長類動物的細胞增殖病癥的需要，所述靈長類動物包括，但不限于，人，其中所述病癥其特征在于EGFR表達，特別是異常表達(例如，過表達)，包括但不限于膀胱癌，腦癌，頭和頸癌，胰腺癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，結腸癌，前列腺癌，和腎癌。發(fā)明概述認識到抗原結合分子(ABMs)的巨大治療潛能，本發(fā)明人開發(fā)了生產(chǎn)這些ABMs的方法，所述ABMs具有大鼠ICR62抗體的結合特異性(例如，結合相同表位)并且已經(jīng)進行了糖基改造(glycoengineered)以增加Fc受體結合親和性和效應子功能。特別地，該方法包括產(chǎn)生重組的、嵌合抗體或其嵌合片段。這些ABMs的功效還通過改變抗體Fc區(qū)域的糖基化模式而增加。因此，在一方面，本發(fā)明涉及一種分離的多核苷酸，其包括(a)選自由下列各項組成的組的序列SEQIDNO:54，SEQIDNO:56,SEQIDNO:58，SEQIDNO:60,SEQDDNO:62，SEQIDNO:64，SEQIDNO:66，SEQIDNO:68，SEQIDNO:70，SEQIDNO:72，SEQIDNO:74，SEQIDNO:122，和SEQIDNO:124;(b)選自由下列各項組成的組的序列SEQIDNO:76,SEQIDNO:78，SEQIDNO:80，SEQIDNO:82，SEQIDNO:84，SEQIDNO:86，SEQIDNO:88，SEQIDNp:卯，SEQIDNO:92，SEQIDNO:94，SEQIDNO:96，SEQIDNO:98，SEQIDNO:100，SEQIDNO:102,SEQIDNO:104,SEQIDNO:106，和SEQIDNO:126;和(c)SEQIDNO:108。另一方面，本發(fā)明涉及一種分離的多核苷酸，其包括(a)選自由下列各項組成的組的序列SEQIDNO:112和SEQIDNO:114;(b)選自由下列各項組成的組的序列SEQEDNO:116和SEQIDNO:118;和(c)SEQIDNO:l19。在一個實施方案中，這些多核苷酸的任何一個編碼融合多肽。在另一方面，本發(fā)明涉及一種分離的多核苷酸，其包括選自山下列各項組成的組的序列SEQEDNo:2;SEQIDNo:4;SEQIDNo:6;SEQIDNo:8;SEQIDNo:10;SEQIDNo:12;SEQIDNo:14;SEQIDNo:16;SEQIDNo:18;SEQIDNo:20;SEQIDNo:22;SEQIDNo:24;SEQIDNo:26;SEQIDNo:28;SEQIDNo:30;SEQIDNo32;SEQIDNo:34;SEQIDNo:36;SEQIDNo:38;SEQIDNo:40和SEQIDNO:120。另一方面，本發(fā)明涉及-—種分離的多核苷酸，其包括選自由下列'各項組成的組的序列SEQIDNo:44;SEQIDNo:46;SEQIDNo:50;和SEQIDNo.:52。在一個實施方案中，這些多核苷酸編碼融合多肽。本發(fā)明進一步涉及一種分離的多核苷酸，其包括與選自由下列各項組成的組的序列具有至少80%，85%,卯％，95°/。，或99%同一性的序列SEQIDNo:2;SEQIDNo:4;SEQDONo:6;SEQIDNo:8;SEQIDNo:10;SEQIDNo:12;SEQIDNo:14;SfiQIDNo:16;SEQIDNo:18;SEQIDNo:20;SEQIDNo:22;SEQIDNo:24;SEQIDNo:26;SEQIDNo:28;SEQIDNo:30;SEQIDNo32;SEQIDNo:34;SEQIDNo:36;SEQIDNo:38;SEQIDNo:40和SEQIDNo:120，其中所述分離的多核苷酸編碼融合多肽。在另一方面，本發(fā)明涉及一種分離的多核苷酸，其包括與選自由下列各項組成的組的序列具有至少80%同一性的序列SEQIDNo:44;SEQIDNo:46;SEQIDNo:50;和SEQIDNo.:52，其中所述分離的多核苷酸編碼融合多肽。本發(fā)明還涉及一種分離的多核苷酸，其編碼具有SEQIDNo.:l的序列的嵌合多肽。在一個實施方案中，所述多核苷酸包括編碼具有SEQIDNo.:l的序列的多肽的序列；和來自除大鼠以外的物種的序列，所述序列編碼具有抗體Fc區(qū)域序列的多肽，或其片段。本發(fā)明還涉及一種分離的多核苷酸，其編碼具有選自由下列各項組成的組的序列的嵌合多肽SEQIDNo:3;SEQIDNo:5;SEQIDNo:7;SEQIDNo:9;SEQIDNo:ll;SEQIDNo:13;SEQIDNo:15;SEQIDNo:17;SEQEDNo:19;SEQIDNo:21;SEQIDNo:23;SEQIDNo:25;SEQIDNo:27;SEQIDNo:29;SEQIDNo:31;SEQIDNo33;SEQIDNo:35;SEQIDNo:37;SEQIDNo:39;和SEQIDNo:121。在一個實施方案中，所述多核苷酸包括編碼具有選自由下列各項組成的組的序列的多肽的序列SEQIDNo:3;SEQIDNo:5;SEQIDNo:7;SEQIDNo:9;SEQIDNo:ll;SEQIDNo:13;SEQIDNo:15;SEQIDNo:17;SEQIDNo:19;SEQIDNo:21;SEQIDNo:23;SEQIDNo:25;SEQIDNo:27;SEQIDNo:29;SEQIDNo:31;SEQIDNo33;SEQIDNo:35;SEQIDNo:37;SEQIDNo:39;和SEQIDNo:121;和來自除大鼠以外的物種的序列，所述序列編碼具有抗體Fc區(qū)域序列的多肽，或其片段。在還有的另一方面，本發(fā)明涉及一種分離的多核苷酸，其編碼具有SEQIDNo.:43的序列的嵌合多&。在一個實施方案中，所述多核苷酸包括編碼具有SEQIDNo.:43的序列的多肽的序列；和來自除大鼠以外的物種的序列，所述序列編碼具有抗體Fc區(qū)域序列的多肽，或其片段。在還有的另一方面，本發(fā)明涉及一種分離的多核苷酸，其編碼具有選自由下列各項組成的組的序列的嵌合多肽SEQIDNo:45;SEQIDNo:49;和SEQIDNo.:51。在一個實施方案中，所述多核苷酸包括編碼具有選自由下列各項組成的組的序列的多肽的序列SEQIDNo:45;SEQIDNo:49;和SEQIDNo.:51，和來自除大鼠以外的物種的序列，所述序列編碼具有抗體輕鏈恒定區(qū)(CL)的序列的多肽，或其片段。本發(fā)明還涉及一種分離的多核苷酸，其包括編碼具有ICR62抗體的VH區(qū)域的多肽或其功能變體的序列；和來自除大鼠以外的物種的序列，該序列編碼具有抗體Fc區(qū)域的序列的多肽，或其片段。另一方面，本發(fā)明涉及一種分離的多核苷酸，其包括編碼具有ICR62抗體的VL區(qū)域的多肽或其功能變體的序列，和來自除大鼠以外的物種的序列，該序列編碼具有抗體CL區(qū)域的序列的多肽，或其片段。本發(fā)明進一步涉及包括以上所述的任一分離的多核苷酸的表達載體，并且涉及包括這樣的表達載體的宿主細胞。在另一方面，本發(fā)明涉及包含任一上述分離的多核苷酸的宿主細胞。一方面，本發(fā)明涉及分離的多肽，其包括(a)選自由下列各項組成的組的序列SEQIDNO:53SEQIDNO:55,SEQIDNO:57,SEQIDNO:59,SEQIDNO:61,SEQIDNO:63，SEQIDNO:65，SEQIDNO:67，SEQIDNO:69，SEQIDNO:71，SEQIDNO:73,SEQIDNO:123，和SEQIDNO:125;(b)選自由下列各項組成的組的序列犯QIDNO:75,SEQIDNO:77,SEQIDNO:79'SEQIDNO:81，SEQIDNO:83，SEQIDNO:85，SEQIDNO:87,SEQIDNO:89，SEQIDNO:91，SEQEDNO:93,SEQIDNO:95，SEQIDNO:97,SEQIDNO:99,SEQIDNO:lOl,SEQIDNO:103，SEQIDNO:105，和SEQIDNO:127;和(c)SEQIDNO:107.其中所述多肽是融合多肽。另一方面，本發(fā)明涉及分離的多肽，其包括(a)選自由下列各項組成的組的序列SEQIDNO:lll和SEQIDNO:113;(b)SEQIDNO:115;禾口(c)SEQIDNO:117，其中所述多肽是融合多肽。本發(fā)明還涉及嵌合多肽，其包告SEQIDNO.:l或其變體的序列。本發(fā)明進一步涉及嵌合多肽，其包含SEQIDNO.:43或其變體的序列。在一個實施方案中，任一這些多肽另外包括人Fc區(qū)域和域人CL區(qū)域。本發(fā)明還涉及包括選自由下列各項組成的組的序列的嵌合多肽SEQIDNo:3;SEQIDNo:5;SEQIDNo:7;SEQEDNo:9;SEQIDNo:ll;SEQIDNo:13;SEQIDNo:15;SEQIDNo:17;SEQIDNo:19;SEQIDNo:21;SEQIDNo:23;SEQIDNo:25;SEQIDNo:27;SEQIDNo:29;SEQIDNo:31;SEQIDNo33;SEQIDNo:35;SEQIDNo:37;SEQIDNo:39;和SEQIDNo:121,或其變體。本發(fā)明進一步涉及包括選自由下列各項組成的組的序列的嵌合多肽SEQIDNo:45;SEQIDNo:49;和SEQIDNo.:51，或其變體。在一個實施方案中，任一這些多肽另外包括人Fc區(qū)域和/或人CL區(qū)域。在一個實施方案中，人Fc區(qū)域包括IgGl。在另一方面，本發(fā)明涉及一種多肽，其包括來源于ICR62抗體的序列和來源于異源多肽的序列，并且涉及包括該多肽的抗原結合分子。在--個實施方案中，所述抗原結合分子是抗體。在一個優(yōu)選實施方案中，抗體是嵌合的。在另一個優(yōu)選實施方案中，抗體被人源化或靈長類化。另一方面，本發(fā)明涉及ABM，其能夠與大鼠ICR62抗體競爭結合EGFR并且是嵌合的。在一個實施方案中，ABM是抗體或其片段。在另一個實施方案中，ABM是包括VH區(qū)域的重組抗體，所述VH區(qū)域具有選自由下列各項組成的組的氨基酸序列SEQIDNO.:1;SEQIDNo:3;SEQIDNo:5;SEQIDNo:7;SEQIDNo:9;SEQIDNo:ll;SEQIDNo:13;SEQIDNo:15;SEQIDNo:17;SEQIDNo:19;SEQIDNo:21;SEQIDNo:23;SEQIDNo:25;SEQIDNo:27;SEQIDNo:29;SEQIDNo:31;SEQIDNo33;SEQIDNo:35;SEQIDNo:37;SEQIDNo:39;和SEQIDNo:121。在另一實施方案中，ABM是包括VL區(qū)域的重組抗體，所述VL區(qū)域具有選自由下列各項組成的組的氨基酸序列SEQIDNO:43,SEQIDNo:45;SEQIDNo:49;和SEQIDNo.:51。在另一實施方案中，ABM是被靈長類化的重組抗體。在還有的另一個實施方案中，ABM是人源化的重組抗體。在另—個實施方案中，ABM是包括人Fc區(qū)域的重組抗體。在另一個實施方案中，以上討論的任何ABMs可以與諸如毒素或放射性標記的部分綴合。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的ABM，所述ABM具有修飾的寡糖。在--個實施方案中，與未修飾的寡糖相比，修飾的寡糖具有減少的巖藻糖基化。在其它的實施方案中，修飾的寡糖是雜合的或復合的。在另一個實施方案中，ABM在所述分子的Fc區(qū)域中具有增加比例的非巖藻糖基化的寡糖或分叉的非巖藻糖基化的寡糖。在一個實施方案中，分叉的、非巖藻糖基化的寡糖是雜合的。在另一個實施方案中，該分叉的、非巖藻糖基化的寡糖是復合的。在一個實施方案中，在所述多肽的Fc區(qū)域中，寡糖的至少20%是非巖藻糖基化的或分叉的、非巖藻糖基化的。在更優(yōu)選的實施方案屮，寡糖的至少30%,35%,40%，45%,50%,55%，60%,65%，70%或75%或更多是非巖藻糖基化的或分叉的、非巖藻糖基化的。本發(fā)明還涉及編碼上述討論的ABMs的任一種的多核苷酸，并涉及包括這樣的多核苷酸的表達載體和細胞。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)ABM的方法，其能夠與大鼠ICR62抗體競爭結合EGFR，并且其中所述ABM是嵌合的所述方法包括(a)在容許編碼所述ABM的所述多核苷酸表達的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細胞，所述宿主細胞包含編碼本發(fā)明ABM的多核苷酸；和(b)從獲得的培養(yǎng)物中回收所述ABM。在另一個方面，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明的ABM的藥物組合物。意欲該藥物組合物還可以包含藥用載體，輔劑或其組合。在另一方面，本發(fā)明涉及治療其特征在于EGFR表達(例如EGFR的異?；蜻^表達)的病癥的方法。該方法包括將治療有效量的本發(fā)明的ABM施用于受試者，優(yōu)選哺乳動物受試者，并且更優(yōu)選需要其的人。在一個優(yōu)選實施方案中，該疾病通過施用ABM來治療，所述ABM是嵌合的(例如，人源化)抗體，或抗體的嵌合片段。在一個實施方案中，將ABM以約1.0mg/kg至約15.0mg/kg的量施用。在另一個實施方案中，將ABM以約1.5mg/kg至約12.0mg/kg的量施用。在另一個實施方案中，將ABM以約1.5mg/kg至約4.5mg/kg的量施用。在另一個實施方案中，將ABM以約4.5mg/kg至約12.0mg/kg的量施用。在另一個實施方案中，將ABM以約1.5,約4.5，和約12.0mg/kg的量施用。在還有的另一方面，本發(fā)明涉及宿主細胞，所述宿主細胞被改造從而以足以修飾由該宿主細胞產(chǎn)生的ABM的Fc區(qū)域中寡糖的量，表達編碼具有GnTm活性的多肽的至少一種核酸，其中所述ABM能夠與大鼠ICR62抗體競爭結合EGFR，并且其中ABM是嵌合的。在一個實施方案中，具有GnTIII活性的多肽是融合多肽。在另一個實施方案中，由宿主細胞產(chǎn)生的ABM是抗體或抗體片段。在一個實施方案中，抗體或抗體片段被人源化。在另一個實施方案中，該ABM包括與人IgG的Fc區(qū)域等價的區(qū)域。本發(fā)明還涉及一種分離的多核苷酸，其包括大鼠ICR62抗體的至少—個(例如，一個，兩個，三個，四個，五個，或六個)互補決定區(qū)，或包含所述互補決定區(qū)的至少特異性決定殘基的其變體或截短形式，其中所述分離的多核苷酸編碼融合多肽。優(yōu)選地，這些分離的多核苷酸編碼作為抗原結合分子的融合多肽。在一個實施方案中，所述多核苷酸包括大鼠ICR62抗體的三個互補決定區(qū)，或包含對每個所述三個互補決定區(qū)的至少特異性決定殘基的其變體或截短形式。在另一個實施方案中，所述多核苷酸編碼嵌合(例如，人源化)抗體的輕或重鏈的整個可變區(qū)。本發(fā)明進一步涉及由這些多核苷酸編碼的多肽。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及抗原結合分子，其包括大鼠ICR62抗體的至少一個(例如，一個，兩個，三個，四個，五個，或六個)互補決定區(qū)，或包含所述互補決定區(qū)的至少特異性決定殘基的其變體或截短形式，并且包括來源于異源多肽的序列。在一個實施方案中，抗原結合分子包括大鼠ICR62抗體的三個互補決定區(qū)，或包含對每個所述三個互補決定區(qū)的至少特異性決定殘基的其變體或截短形式。另一方面，抗原結合分子包括抗體輕或重鏈的可變區(qū)。在一個特別有用的實施方案中，抗原結合分子是嵌合的，例如人源化抗體。本發(fā)明還涉及制備該抗原結合分子的方法，及其在治療疾病中的應用，包括惡性腫瘤如膀胱癌，腦癌，頭和頸癌，胰腺癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，結腸癌，前列腺癌，皮膚癌，和腎癌。本發(fā)明的宿主細胞可以選自下組，包括但不限于HEK293-EBNA細胞,CHO細胞,BHK細胞,NSO細胞，SP2/0細胞,YO骨髓瘤細胞，P3X63小鼠骨髓瘤細胞，PER細胞，PER.C6細胞或雜交瘤細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明的宿主細胞另外包括轉染的多核苷酸，其包括編碼大鼠ICR62抗體的VL區(qū)域或其變體的多核苷酸，和編碼等價于人免疫球蛋白的Fc區(qū)域的區(qū)域的序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明的宿主細胞另外包括轉染的多核苷酸，其包括編碼大鼠ICR62抗體的VH區(qū)域或其變體的多核苷酸，和編碼等價于人免疫球蛋白的Fc區(qū)域的區(qū)域的序列。在另一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)ABM的宿主細胞，由于其寡糖的修飾所述ABM顯示增加的Fc受體結合親和性和/或增加的效應子功能。在一個實施方案中，所述增加的結合親和性是對于Fc受體，特別是FcYRIIIA受體。這里考慮的效應子功能可以選自包括但不限于以下各項的組增加的Fc-介導的細胞毒性;增加的與NK細胞的結合;增加的與巨噬細胞的結合；增加的與多形核細胞的結合；增加的與單核細胞的結合；增加的定向信號傳導誘導程序性細胞死亡增加的樹突細胞成熟；和增加的T細胞引發(fā)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的宿主細胞包括至少一種核酸，所述核酸編碼具有GnTin活性的多肽，可操作地連接于組成型啟動子元件。在另一方面，本發(fā)明涉及在宿主細胞中生產(chǎn)ABM的方法，該方法包括(a)在容許所述ABM產(chǎn)生，并容許對存在于所述ABM的Fc區(qū)域上的寡糖進行修飾的條件下，培養(yǎng)宿主細胞，所述宿主細胞被改造從而表達編碼具有GnTIII活性的融合多肽的至少一種核酸和(b)分離所述ABM;其中所述ABM能夠與大鼠ICR62抗體競爭結合EGFR并且其中所述ABM是嵌合的(例如，人源化的)。在一個實施方案中，具有GnTIII活性的多肽是融合多肽，優(yōu)選含有GnTIII的催化結構域和異源高爾基體定居(resident)多肽的高爾基體定位結構域，所述定位結構域選自由下列組成的組甘露糖苷酶II的定位結構域，j3(l，2)-N-乙酰葡糖胺轉移酶I("GnTI")的定位結構域，甘露糖苷酶I的定位結構域，P(l,2)-N-乙酰葡糖胺轉移酶II("GnTII")的定位結構域，和dl-6核心巖藻糖基轉移酶的定位結構域。優(yōu)選地，該高爾基體定位結構域來自甘露糖苷酶II或GnTI。在另一個方面，本發(fā)明涉及修飾由宿主細胞產(chǎn)生的抗-EGFRABM的糖基化模式的方法，所述方法包括向該宿主細胞引入至少一個本發(fā)明的核酸或表達載體。在一個實施方率中，該ABM是抗體或其片段；優(yōu)選地包括IgG的Fc區(qū)域。或者，多肽是融合蛋白質，其包括等價于人IgG的Fc區(qū)域的區(qū)域。在一個方面，本發(fā)明涉及重組的、嵌合抗體，或其片段，其能夠與大鼠ICR62抗體競爭結合EGFR并具有減少的巖藻糖基化。在另一個方面，本發(fā)明涉及通過使用融合多肽，來改進本發(fā)明的重組抗體或其片段的糖基化的方法，所述融合多肽具有GnTIII活性并包括異源高爾基體定居多肽的高爾基體定位結合域。在一個實施方案中，本發(fā)明的融合多肽包括GnTffl的催化結構域。在另一個實施方案中，高爾基體定位結構域選自由下列組成的組甘露糖苷酶II的定位結構域，GnTI的定位結構域，甘露糖苷酶I的定位結構域，GnTII的定位結構域，和od-6核心巖藻糖基轉移酶的定位結構域。優(yōu)選地，該高爾基體定位結構域來自甘露糖苷酶II或GnTI。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法涉及產(chǎn)生具有修飾的寡糖的重組的、嵌合的抗體或其片段，其中所述修飾的寡糖與未修飾的寡糖相比具有減少的巖藻糖基化。按照本發(fā)明，這些修飾的寡糖可以是雜合的或復合的。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法涉及產(chǎn)生重組的、嵌合的(例如人源化的)抗體或其片段，其在所述多肽的Fc區(qū)域中具有增加比例的分叉的、非巖藻糖基化的寡糖。在一個實施方案中，分叉的、非巖藻糖基化的寡糖是雜合的。在另一個實施方案中，分叉的、非巖藻糖基化的寡糖是復合的。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法涉及產(chǎn)生重組的、嵌合的抗體或其片段，其在所述多肽的Fc區(qū)域中具有至少20y。的寡糖，所述寡糖是分叉的、非巖藻糖基化的。在優(yōu)選的實施方案中，在所述多肽的Fc區(qū)域中至少30%的寡糖是分叉的、非巖藻糖基化的。在另一個優(yōu)選的實施方案中，其中在所述多肽的Fc區(qū)域中，至少35%的寡糖是分叉的、非巖藻糖基化的。在另一個方面，本發(fā)明涉及重組的、嵌合的抗體或其片段，其由于其寡糖的修飾而顯示增加的Fc受體結合親和性和/或增加的效應子功能。在—個實施方案中，增加的結合親和性針對Fc激活受體。在另一個實施方案中，F(xiàn)c受體是Fcy激活受體，特別地FcyRIIIA受體。本文考慮的效應子功能可以選自這樣的組，所述組包括，但不限于增加的Fc-介導的細胞的細胞毒性；增加的與NK細胞的結合；增加的與巨噬細胞的結合；增加的與多形核細胞的結合；增加的與單核細胞的結合；增加的定向信號傳導誘導程序性細胞死亡；增加的樹突細胞成熟和增加的T細胞引發(fā)。在另一個方面，本發(fā)明涉及重組的、嵌合的(例如，人源化的)抗體片段，其具有大鼠ICR62抗體的結合特異性并包含F(xiàn)c區(qū)域，所述抗體片段被進行了改造從而具有由本發(fā)明的方法的任一個所產(chǎn)生的增加的效應子功能。在另一個方面，本發(fā)明涉及融合蛋白，其包括具有選自由下列各項組成的組的序列的多肽SEQIDNO.:1;SEQIDNo:3;SEQIDNo:5;SEQIDNo:7;SEQEDNo:9;SEQIDNo:ll;SEQIDNo:13;SEQIDNo:15;SEQIDNo:17;SEQIDNo:19;SEQIDNo:21;SEQIDNo:23;SEQIDNo:25;SEQIDNo:27;SEQIDNo:29;SEQIDNo:31;SEQIDNo33;SEQIDNo:35;SEQIDNo:37;SEQEDNo:39;和SEQIDNo:121，和等價于免疫球蛋白的Fc區(qū)域的區(qū)域，并且所述融合蛋白被改造從而具有由本發(fā)明的任一方法所產(chǎn)生的增加的效應子功能。在另一個方面，本發(fā)明涉及融合蛋白，其包括具有選自由下列各項組成的組的序列的多肽SEQIDNO:43，SEQIDNo:45;SEQIDNo:49;和SEQIDNo.:51，和等價于免疫球蛋白的Fc區(qū)域的區(qū)域，并且所述融合蛋白被改造從而具有由本發(fā)明的任一方法所產(chǎn)生的增加的效應子功能。一方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包括由本發(fā)明的任一方法所產(chǎn)生的重組的、嵌合的(例如，人源化的)抗體，和藥用載體。在另一個方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包括由本發(fā)明的任一方法所產(chǎn)生的重組的、嵌合的(例如，人源化的)抗體片段，和藥用載體。在另一個方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包括由本發(fā)明的任一方法所產(chǎn)生的融合蛋白和藥用載體。在另一方面，本發(fā)明涉及體內(nèi)或體外靶向表達EGFR的細胞的方法。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及靶向受試者中表達EGFR的細胞的方法，該方法包括向受試者施用包含本發(fā)明的ABM的組合物。在還有的另一方面，本發(fā)明涉及一種體內(nèi)或體外檢測樣品中EGFR存在的方法，例如用于診斷與EGFR表達相關的病癥。在一個實施方案中，該檢測是如下進行的在允許ABM和EGFR之間形成復合物的條件下，將待測樣品任選地與對照樣品一起與本發(fā)明的ABM接觸。然后檢測復合物形成(例如通過ELISA或本領域己知的其它方法)。當與試驗樣品一起使用對照樣品時，當比較試驗和對照樣品時在ABM-EGFR復合物形成方面的任何統(tǒng)計學顯著差異指示在試驗樣品中EGFR的存在。本發(fā)明進一步涉及治療與EGFR表達相關的病癥的方法，特別是其中EGFR被表達的細胞增殖病癥，并且更具體地，其中EGFR被異常表達(例如，過表達)的病癥，包括膀胱癌，腦癌，頭和頸癌，胰腺癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，結腸癌，前列腺癌，皮膚癌和腎癌，該方法包括向需要其的人受試者施用治療有效量的通過本發(fā)明任一方法制備的重組、嵌合(例如人源化)抗體或其片段。附圖簡述圖1顯示當與人源化ICR62構建體I-HHC(重鏈)和I-KB(輕鏈)聯(lián)合時，單個重鏈和輕鏈嵌合大鼠-人ICR62多肽鏈的功能活性。rVL表示嵌合輕鏈，并且rVH表示嵌合重鏈。"r"名稱表示可變結構域是來自原始大鼠抗體。圖2顯示人源化ICR62抗體的結合活性，所述人源化ICR62抗體包含以各種構型配對的重鏈可變區(qū)構建體I-HHC,I-HHA和I-HLA和人源化輕鏈可變區(qū)構建體I-KA和I-KB。圖3顯示人源化ICR62抗體的結合活性，所述人源化ICR62抗體包含以各種構型配對的重鏈可變區(qū)構建體I-HLB，I-HLC和I-HLA和人源化輕鏈可變區(qū)構建體I-KA和I-KC。圖4顯示與嵌合大鼠-人ICR62抗體相比，人源化ICR62抗體的結合活性，所述人源化ICR62抗體包含重鏈可變區(qū)構建體I-HLA2,I-HLA3和I-HLA4和人源化輕鏈可變區(qū)構建體I-KC。圖5顯示與嵌合大鼠-人ICR62抗體相比，人源化ICR62抗體的結合活性，所述人源化ICR62抗體包含重鏈可變區(qū)構建體I-HLA1，f-HLA3，I-HLA5和I-HLA6和人源化輕鏈可變區(qū)構建體I-KC。圖6顯示與嵌合大鼠-人ICR62抗體相比，人源化ICR62抗休的結合活性，所述人源化ICR62抗體包含重鏈可變區(qū)構建體I-HLA7,I-HLA6，和I-HHB和人源化輕鏈可變區(qū)構建體I-KC。圖7顯示與嵌合大鼠-人ICR62抗體相比，人源化ICR62抗體的結合活性，所述人源化ICR62抗體包含'重鏈可變區(qū)構建體I-HHF,I-HLA9,和I-HLA8和人源化輕鏈可變區(qū)構建體I-KC。圖8顯示人源化抗體的結合活性，所述人源化抗體包含重鏈可變區(qū)構建體I-HHB，I-HHD,I-HHGI-HHF,I-HLA7，和I-HLA9和人源化輕鏈可變區(qū)構建體I-KC。圖9顯示嵌合ICR62抗體的各種糖形以及人源化變體I-HLA4的抗體介導的細胞毒作用(ADCC)的比較。"Gr是指通過與GnTIII共表達，抗體的糖基改造。"G2"是指通過與GnTIII和ManlI共表達，抗體的糖基改造。"WT是指未進行糖基改造的抗體。人源化重鏈構建體與I-KC輕鏈構建體配對。圖10顯示非糖基改造形式(WT)和G2糖形(glycoform)(即，通過與GnTffl和ManII共表達的糖基改造)的人源化ICR62抗體構建體I-HHB和I-HLA7的ADCC比較。將相同的抗體施加于兩種不同靶細胞系在圖A中，使用靶細胞系LN229;在圖B中，使用細胞系A431。將人源化重鏈構建體與I-KC輕鏈構建體配對。圖IIA和11B顯示非糖基改造形式(WT)和G2糖形的嵌合ICR62和人源化ICR62抗體構建體I-HHB和I-HLA7的ADCC的比較。使用靶細胞系A431。將人源化重鏈構建體與I-KC輕鏈構建體配對。圖12顯示對于G2糖形的嵌合ICR62和人源化ICR62抗休構建體I-HHB和I-HLA7的72hADCC的比較。將人源化重鏈構建體與I-KC輕鏈構建體配對。圖13人源化ICR62重鏈可變區(qū)構建體與大鼠ICR62序列比較的氨基酸序列比對。點表示在給定構建體內(nèi)在給定位置上氨基酸殘基的同一性。圖14顯示使用CHO細胞的FcgammaRIHa-Fc結合測定，所述CHO細胞顯示重組人FcgammaRIIIa。將糖基改造的I-HHB/KC人源化抗-EGFRIgGl抗體與非糖基改造的(Wt)抗體比較。圖15顯示對于糖基改造的人源化抗-EGFRIgGl抗體，I-HHB/KC的MALD/TOF-MS寡糖曲線。通過在產(chǎn)生抗體的細胞中過表達編碼具有GnTIII和Golgi甘露糖苷酶II活性的酶的基因而實現(xiàn)糖基改造，獲得超過70%的非巖藻糖基化Fc-Asn297-連接的寡糖。圖16顯示抗-EGFR精確曲線(n=6在校準范圍內(nèi)平行測定(replicateacross)),用于測定在1%猴血清基質(猴血清庫CMS25/31/33，由HLS提供)中的抗-EGFR。圖17顯示代表性抗-EGFR校準曲線，用于測定在1%猴血清基質中的抗-EGFR。圖18顯示在將抗-EGFR每周靜脈給藥于雄性獼猴的第1天時抗-EGFR的血清濃度。圖19顯示在將抗-EGFR每周靜脈給藥于雌性獼猴的第1天時抗-EGFR的血清濃度。圖20顯示血清抗-EGFR濃度-時間曲線下面積(AUC股)和每周將抗-EGFR靜脈給藥于獼猴的第1天的劑量水平之間的關系。圖21顯示在每周靜脈內(nèi)給藥抗-EGFR于雄性獼猴期間抗-EGFR的血清濃度。圖22顯示在每周靜脈內(nèi)給藥抗-EGFR于雌性獼猴期間抗-EGFR的血清濃度。圖23顯示來自Fc-改造(糖基改造)的抗-EGFR抗體的寡糖的MALDI/TOF-MS曲線，該抗體用于本文以下實施例中所述的體內(nèi)猴研究中。圖24顯示與在人A431表皮樣癌細胞表面上表達的EGFR的結合。用于結合研究的抗體是Fc-改造的抗-EGFR抗體(I-HHB構建體)，其用于本文以下實施例中所述的體內(nèi)猴研究中。圖25顯示與在猴COS-7腎細胞的表面上表達的EGFR的結合。所用的抗體是抗-EGFR抗體(I-HHB重鏈；I-KC輕鏈)。為了參考，顯示了與低人EGFR-表達細胞，MCF-7乳腺癌細胞的結合。圖26顯示Fc-FcgammaRIIIa結合，使用完整的細胞(被改造而在它們的表面上表達人FcgRIIIa的CHO細胞)。所用抗體是Fc-改造的(糖基改造的)抗-EGFR抗體，其用于本文以下實施例中所述的體內(nèi)猴研究中。為了比較，顯示對非-Fc-改造(未修飾的)對照IgGl抗體的結合。圖27顯示通過Fc-改造(糖基改造)的抗-EGFR抗體的ADCC。靶細胞是A549人肺癌細胞。為了比較，顯示非-Fc改造(未修飾)形式的抗體的ADCC活性。圖28顯示通過Fc-改造(糖基改造的)的抗-EGFR抗體介導的ADCC。靶細胞是CYNOM-K1獼猴角質形成細胞系。為了比較，顯示非-Fc改造(未修飾)形式的抗體的ADCC活性。圖29顯示基于與重鏈I-HHD構建體配對的I-KC構建體的各種輕鏈構建體變體的EGFR靶結合。發(fā)明詳述本文所用的術語如本領域通常所用的，除非如下另外指出。用于本文時，術語貧佯意欲包括整個抗體分子，以及具有Fc區(qū)域并保留結合特異性的抗體片段，和融合蛋白，所述融合蛋白包括等價于免疫球蛋白的Fc區(qū)域的區(qū)域并保留結合特異性，所述整個抗體分子包括單克隆抗體，多克隆抗體和多特異性(例如，二特異性)的抗體。還包括保留結合特異性的抗體片段，包括但不限于VH片段，VL片段，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)(ab')2片段,scFv片段，F(xiàn)v片段，小抗體(minibodies)，二抗體，三鏈抗體，和四鏈抗體(參見，例如Hudson和Souriau，AtoweMerf.9:129-134(2003))。還包括人源化，靈長類化和嵌合的抗體。用于本文時，術語&g—凝意欲指IgG重鏈的C-末端區(qū)域。盡管IgG重鏈的Fc區(qū)域的范圍可以輕微變化，人IgG重鏈Fc區(qū)域通常定義為從位點Cys226的氨基酸殘基延伸到羧基末端的一段序列。用于本文時，術語"爭份f^度擘歪A游Fc區(qū)磁^^弒"意欲包括免疫球蛋白的Fc區(qū)域的天然存在的等位基因變體以及具有改變的變體，所述改變產(chǎn)生替換，插入，或缺失，但是基本不會減少免疫球蛋白介導效應子功能(諸如抗體依賴性的細胞毒作用)的能力。例如，在免疫球蛋白的Fc區(qū)域的N-末端或C末端可以缺失一個或多個氨基酸，而基本不喪失生物學功能。可以按照本領域已知的一般規(guī)則來選擇這些變體從而對活性具有最小的影響。(見，例如Bowie，J.U.etal.，Science247:1306-10(1990)。用于本文時，術語5G/W是指人表皮生長因子受體(也稱為HER-1或Erb-Bl)(Ulrich，A."a/.,Waft/re309:418-425(1984);SwissProtAccession弁P00533;二級登記號000688，000732,P06268,Q14225,Q92795,Q9BZS2，Q9GZX1,Q9H2C9,Q9H3C9，Q9UMD7，Q9UMD8,Q9UMG5)，以及其天然存在的同種型和變體。這些同種型和變體包括但不限于，EGFRvIII變體，可變剪接產(chǎn)物(例如，SwissProt登記號P00533-1,P00533-2，P00533-3,P00533-4識別的)，變體GLN-98，ARG-266，Lys-521，ILE-674,GLY-962,和PRO-988(Livingston,R丄"fl/.，NIEHS-SNPs,環(huán)境基因組計劃，NIEHSES15478，基因組科學部，西雅圖，WA(2004)),和通過下列登記號識別的其它變體NM_005228.3，NM—201282.1,NM—201283.1,NM—201284.1(REFSEQmRNAs);AF125253.1，AF277897.1，AF288738.1，AI217671.1，AK127817.1,AL598260.1,AU137334.1,AW163038.1,AW295229,1，BC057802.1,CB160831.1，K03193.1,U48722.1,U95089.1,X00588.1，X00663.1;H54484S1，H54484S3，H54484S2(MIPSassembly);DT.453606,DT.86855651,DT.95165593,DT.97822681,DT.95165600,DT.100752430,DT.91654361,DT.92034460,DT.92446349,DT.97784849,DT.101978019,DT.418647,DT.86842167,DT.91803457,DT.92446350,DT.95153003,DT.95254161,DT.97816654,DT.87014330,DT.87079224(DOTSAssembly)-用于本文時，術語五G^厫伴是指結合和/或激活EGFR的多肽。術語包括EGFR配體的膜結合的前體形式，以及EGFR配體的蛋白裂解加工的可溶性形式。用于本文時，術語五G^R游厫體紫薪是指EGFR配體結合介導的信號轉導(例如，通過EGFR受體的胞內(nèi)激酶結構域磷酸化EGFR或底物多肽內(nèi)酪氨酸殘基導致)。用于本文時，術語疾病或餘征在f5GF及或fiGF及配體W泉?；罨騘T^^y^i^^與丑C/^;^達^r關^^^j忘是指可以涉及或可以不涉及惡性腫瘤或癌癥的病癥，其中EGFR和/或EGFR配體的異?；罨?或生產(chǎn)在受試者的細胞或組織中發(fā)生，所述受試者患有或傾向于所述疾病或病癥。用于本文時，與表達EGFR的細胞連同使用的術語過表達、過表達的(overexpressed)和過表達的(overexpressing)是指與相同組織類型的正常細胞相比，在其表面上具有可測量程度的更高水平的EGFR的細胞。該過表達可以由基因擴增或增加的轉錄或翻譯而導致。EGFR表達(和，因此，過表達)可以在診斷或預后測定中通過本領域己知的技術評估存在于細胞表面上或細胞裂解物中的EGFR水平來測定例如，經(jīng)由免疫組織化學測定，免疫熒光測定，免疫酶測定，ELISA，流式細胞術，放射免疫測定法，蛋白質印跡，配體結合，激酶活性等。(一般參見，CellBiology:ALaboratoryHandbook,Celis，J.,ed"AcademicPress(2ded.，1998);CurrentProtocolsinProteinScience,Coligan,J.E.a/.，eds.，JohnWiley&Sons(1995-2003);還參見，Sumitomo"a/"C/z".Qwc^10:794-801(2004)(描述蛋白質印跡，'流式細胞術和免疫組織化學)，將它們的全部內(nèi)容結合于此作為參考))。備選地，或另外地，例如通過原位雜交中的熒光、DNA印跡法、或PCR技術，可以測量細胞中編碼EGFR的核酸分子的水平。將正常細胞中的EGFR水平與受細胞增殖病癥(例如癌癥)影響的細胞的水平比較，以確定EGFR是否過表達。用于本文時，在其最廣義上講，術語i^^翁合分f指特異性結合抗原決定簇的分子。更具體地，結合五G^及^^"j^碧合分7是特異性結合170kDa的跨膜受體的分子，所述170kDa的跨膜受體典型地稱為表皮生長因子受體(EGFR)，但也稱為HER-1或ErbBl。所謂"特異性結合"指結合對于抗原是選擇性的并且可以與不需要的或非特異性相互作用區(qū)別開。用于本文時，當用在涉及多肽諸如ABMs中時，術語激合麟卩薪^脫指這樣的多肽，所述多肽包括來自兩個或更多異種多肽的氨基酸序列，諸如來自不同物種的抗體的部分。例如，對于嵌合ABMs而言，非抗原結合成分可以來自廣泛種類的物種，包括靈長類動物諸如黑猩猩和人。最優(yōu)選嵌合ABM的恒定區(qū)與天然人抗體的恒定區(qū)基本相同；最優(yōu)選嵌合抗體的可變區(qū)與重組抗-EGFR抗體的可變區(qū)基本相同，所述重組抗-EGFR抗體具有鼠可變區(qū)的氨基酸序列。人源化的抗體是融合或嵌合抗體的特別優(yōu)選的形式。用于本文時，^#(^77//薪絲游多激旨這樣的多肽，所述多肽能夠催化以P-14連接將N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)殘基添加到N-聯(lián)寡糖中的三甘露糖基核心的P連接的甘露糖苷上。這包括融合多肽，所述多肽顯示類似于但不必須相同于P(l，4》N-乙酰葡糖胺轉移酶III的活性的酶活性，如在特別的生物測定中所測量的，具有或不具有劑量依賴性，按照國際生化和分子生物學命名委員會(NC-IUBMB)，其也被稱為P-l,4-甘露糖基-糖蛋白4-e-N-乙酰基葡糖胺基-轉移酶(EC2.4丄144)。在其中確實存在劑量依賴性的情形中，其不需要與GnTin的劑量依賴性相同，但是與GnTin活性相比，基本類似于在給定活性中的劑量依賴(即，相對于GnTIII，候選多肽將顯示更大的活性或不超過約25倍更少，并且優(yōu)選地，不超過約10倍更少的活性，并且最優(yōu)選地，不超過約三倍更少的活性)。用于本文時，術語變體(或^t/A熟指通過使用，例如重組DNA技術產(chǎn)生的氨基酸插入，缺失，和替換而與本發(fā)明特別陳述的多肽區(qū)別開的多肽。本發(fā)明的ABMs的變體包括嵌合的、靈長類化或人源化的抗原結合分子，其中氨基酸殘基的一個或數(shù)個通過以這樣的方式替換，添加和/或缺失進行修飾，所述方式基本上不影響抗原(例如，EGFR)結合親和性。可以通過將特定多肽的序列與同源肽的序列進行比較并使在高同源性的區(qū)域(保守區(qū)域)中所作的氨基酸序列變化的數(shù)量最少化，或通過用共有序列來替代氨基酸來發(fā)現(xiàn)確定哪種氨基酸可以被取代，添加，或缺失而不會破壞ra標活性的指導?；蛘撸幋a這些相同或類似多肽的重組變體可以通過使用在遺傳密碼中的"豐余性"來合成或選擇。各種密碼子替換，諸如產(chǎn)生各種限制性位點的沉默改變可以被引入從而優(yōu)化克隆到質?；虿《据d體中，或在特定原核或真核系統(tǒng)中的表達。在多核苷酸序列中的突變可以反映在多肽或被加入多肽的其它肽的結構域中從而修飾多肽的任何部分的特性，從而改變特性諸如配體結合親和性，鏈間親和性，或降解/更新率。優(yōu)選地，氨基酸"替換"是用具有相似結構和/或化學性質的另一個氨基酸取代一個氨基酸的結果，即保守性氨基酸取代。"保守性"氨基酸替換可以在涉及的殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性性質的相似性基礎上進行。例如，非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲硫氨酸；極性中性氨基酸包括甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，和谷氨酰胺；帶正電荷(堿性)的氨基酸包括精氨酸，賴氨酸和組氨酸；并且?guī)ж撾姾傻?酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。"插入"或"缺失"優(yōu)選地在約l到20個氨基酸的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在1一10個氨基酸范圍內(nèi)。容許的變化可以使用重組DNA技術和測定得到的重組變體的活性，通過系統(tǒng)性在多肽分子中進行氨基酸插入，缺失或替換來實驗性地進行確定。用于本文時，術語乂i^眾用于指來自非人抗原結合分子，例如，鼠抗體的抗原結合分子，其保持或基本保持母體分子的抗原結合特性，伹是在人中具有更少的免疫原性。這可以通過各種方法來實現(xiàn)，所述方法包括(a)將整個非人的可變結構域移植到人恒定區(qū)上從而產(chǎn)生嵌合抗體，(b)僅將'非人CDRs移植到人構架和恒定區(qū)上，保留或不保留關鍵的構架殘基(例如，對于保持良好的抗原結合親和性或抗體功能是重要的那些)，或(c)移植整個非人的可變結構域，但是通過表面殘基的取代用人樣切片來"遮蔽"它們。這些方法公開于Jonesetal.,Morrisonetal.，Mrf/./4cad5W.，81:6851-6855(l訴4);Morrison和Oi，爿rfuJ加畫o/"44:65-92(1988);Verhoeyenetal,，Science,239:1534-1536(1988);Padlan,Afofec./mmw.，28:489"498(1991);Padlan,Mofec.T;wmm".，31(3):169-217(1994),將它們?nèi)坎⑷氡疚淖鳛閰⒖?。在抗體的重鏈和輕鏈可變結構域中的每一個通常存在3個互補決定區(qū)，或CDRs，(CDR1，CDR2和CDR3),其側鄰抗體的重鏈和輕鏈可變結構域的每個中的四個構架亞區(qū)域(即，F(xiàn)R1,FR2，F(xiàn)R3，和FR4):FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。人源化抗體的討論可以，見于特別是美國專利號6，632，927，和公開的美國申請?zhí)?003/0175269中，將它們兩者全文并入本文作為參考。類似地，用于本文時，術語靈長類化用于指來自非靈長類動物抗原結合分子，例如，鼠抗體，的抗原結合分子，其保留或基本保留母體分子的抗原結合性質，但是在靈長類動物中具有更少的免疫原性。在本領域使用和/或接受的術語存在兩個或多個定義的情形中，用于本文時的術語的定義傾向于包括所有的這些含義，除非明確地以相反的意思指出。具體的實例是使用術語"互補決定區(qū)"("CDR")來描述在重鏈和輕鏈多肽的可變區(qū)中發(fā)現(xiàn)的非連續(xù)抗原結合位點。這種特別的區(qū)域己經(jīng)在Kabatetal.，U.S.Dept.ofHealthandHumanServices,"SequencesofProteinsofImmunologicalInterest"(1983)和Chothiaetal.，/Afo/.5zo/.196:901-917(1987)中進行了描述，將它們并入本文作為參考，其中當針對彼此比較時，所述定義包括氨基酸殘基的重疊或子集。但是，將任一定義用于指抗體或其變體的CDR的應用傾向于在本文所限定和使用的術語的范圍內(nèi)。涵蓋如上面引用的參考文獻的每個所定義的CDRs的適合的氨基酸殘基在下面的表I中提出作為比較。涵蓋特定CDR的精確殘基數(shù)目將根據(jù)CDR的序列和大小而變化。假定抗體的可變區(qū)氨基酸序列，本領域技術人員可以常規(guī)確定那一種殘基包含特定的CDR。表l.CDR定義<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表1中的所有的CDR定義的編號是按照Kabat等(見下)的編號方式進行的"AbM"是指OxfordMolecular's"AbM"抗體建模軟件定義的CDRs.Kabat等還定義了用于可變結構域序列的編號系統(tǒng)，其可應用于任何抗體。本領域普通技術人員之一可以明確地將這種"Kabat編號"系統(tǒng)賦予任何可變結構域序列，而不依賴于超出序列本身之外的任何實驗數(shù)據(jù)。用于本文時，"Kabat編號"指由Kabatetal.,U.S.Dept.ofHealthandHumanServices,"SequenceofProteinsofImmunologicalInterest"(1983)提出的編號系統(tǒng)。除非另外指出，對于在ABM中特定氨基酸殘基位點的編號的參考是按照Kabat編號系統(tǒng)進行的。序列表的序列(即，SEQIDNO:l到SEQIDNO:127)不是按照Kabat編號系統(tǒng)進行編號的。然而，如上所述，基于本文提供的序列的編號，確定序列表中任何可變區(qū)序列的Kabat編號方案完全在本領域技術人員的常規(guī)技術范圍內(nèi)。至于具有與本發(fā)明的參比核苷酸序列存在至少，例如95%"同一性"的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，意指多核苷酸的核苷酸序列與參比序列相同，除了多核苷酸序列可以包括參比核苷酸序列的每ioo個核苷酸中多到5個的點突變以外。換言之，為了獲得具有與參比核苷酸序列有至少95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸，在參比序列中多到5%的核苷酸可以缺失或被另一個核苷酸所替換，或在參比序列中多到5%的總核苷酸數(shù)目的核苷酸可以插入?yún)⒈刃蛄兄?。作為實踐的問題，可以使用已知的計算機程序來常規(guī)確定是否任何特定的核酸分子或多肽與本發(fā)明的核苷酸序列或多肽序列具有至少80%，85%,卯％，95%,96%，97°/。，98%或99°/。的同一性。確定在査詢序列(本發(fā)明的序列)和目標序列之間的最佳全面匹配的優(yōu)選方法,也被稱為全域序列比對(globalsequencealignment),可以使用基于Brutlag等,Cow/.Z/;.5z'cwd.6:237-245(19卯)的算法的FASTDB計算機程序進行確定。在序列比對中，查詢序列和目標序列都是DNA序列。RNA序列可以通過將U's轉化為rs進行比較。所述全域序列比對的結果以百分比同一性表示。用在DNA序列的FASTOB比對中計算百分比同一性的優(yōu)選參數(shù)是矩陣=單式，k-元組，不匹配罰分=1，合并罰分(JoiningPenalty)=30,隨機組長度=0,截斷值評分-1，空隙罰分=5，空隙大小罰分0.05，窗口大小=500或目標核苷酸序列的長度，無論哪一個更短。如果目標序列比查詢序列更短是因為5'或3'缺失，而不是因為內(nèi)部缺失，應當對結果進行手工校正。這是因為當計算百分比同一性時，該FASTDB程序并不說明目標序列的5'和3'截短。對于相對于査詢序列，在5'或3'末端被截短的目標序列，通過將不匹SS/比對的在目標序列的5'和3'的查詢序列的堿基的數(shù)量計算為查詢序列的總堿基百分比來對—ff分比同一性進行校正。通過FASTDB序列排列的結果來確定是否核苷酸匹配/比對。接著，將該百分比從使用指定參數(shù)通過上述FASTDB程序進行計算的百分比同一性中減去來達到最終的百分比同一性評分。這種校正評分用于本發(fā)明的目的。如通過FASTDB比對展示，僅有不與查詢序列匹配/比對的，在目標序列的5'和3'堿基外側的堿基出于手工調(diào)整百分比同一性評分的目的進行計算。例如，將卯個堿基的目標序列與100個堿基的查詢序列進行比對來確定百分比同一性。該缺失發(fā)生在目標序列的5'末端，并且因此，F(xiàn)ASTDB比對沒有顯示在5'末端首先的10個堿基的匹!S/比對。這10個未配對堿基代表序列的10%(未匹配的在5'和3'末端堿基的數(shù)量/與查詢序列的堿基總數(shù))，因此將10%從通過FASTDB程序計算的百分比同一性評分中減去。如果剩余的90個堿基完全匹配，最終的百分比同一性將是90%。在另一個實例中，將卯個堿基的目標序列與100個堿基的查詢序列進行比較。這次，缺失是內(nèi)部缺失從而使在目標序列的5'或3'上不存在與査詢序列不匹配/比對的堿基。在該情形中，通過FASTDB計算的百分比同一性沒有進行手工校正。再一次，只對在不與査詢序列匹配/比對的目標序列的5'和3'堿基進行手工校正。出于本發(fā)明的目的，沒有進行其它的手工校正。至于具有與本發(fā)明的查詢氨基酸序列有至少例如95%"同一性"的氨基酸序列的多肽而言，意指目標多肽的氨基酸序列與查詢序列相同，除了目標多肽序列可以在査詢氨基酸，列的每100個氨基酸中包括多到5個氨基酸改變以外。換言之，為了獲得具有與查詢氨基酸序列有至少95%同一性的氨基酸序列的多肽，在目標序列中多到5%的氨基酸殘基可以被插入，缺失，或被另一個氨基酸替換。參比序列的這些改變可以發(fā)生在參比氨基酸序列的氨基或羧塞末端位點，或在那些末端位點之間的任何地方，其單獨散在參比序列的殘基中或在參比序列的一個或多個連續(xù)組中。作為實踐的問題，可以使用已知的計算機程序來常規(guī)確定是否任何特定的多肽與參比多肽具有至少80%，85°/。，90%,95%，96%,97%,98°/0或99%的同一性。確定在査詢序列(本發(fā)明的序列)和目標序列之間的最佳全面匹配的優(yōu)選方法，也被稱為全域序列比對，可以使用基于Brutlag等,Co加;.y4p/.所ojc!'.6:237-245(19卯)的算法的FASTDB計算機程序進行確定。在序列比對中，査詢序列和目標序列都是核苷酸序列或都是氨基酸序列。所述全域序列比對的結果以百分比同一性表示。用在FASTDB氨基酸比對中的優(yōu)選參數(shù)是矩陣-PAMO，k-元組-2，不匹配罰分=1，合并罰分(JoiningPenalty"20，隨機組長度=0，截斷值評分=1，窗口大小-序列長度，空隙罰分=5，空隙大小罰分0.05，窗口大小=500或目標氨基酸序列的長度，無論哪一個更短。如果目標序列比査詢序列更短是因為N端或C端缺失，而不是因為內(nèi)部缺失，必須對結果進行手工校正。這是因為當計算全域百分比同一性時，該FASTDB程序并不說明目標序列的N端和C端截短。對于相對于査詢序列，在N端和C端被截短的目標序列，通過將與相應的目標殘基不匹配/比對的在目標序列的N端和C端的査詢序列的殘基的數(shù)量計算為査詢序列的總堿基百分比來對百分比同一性進行校正。通過FASTDB序列比對的結果來確定是否殘基是匹配/比對的。接著，將該百分比從使用指定參數(shù)通過上述FASTOB程序進行計算的百分比同一性中減去來達到最終的百分比同一性評分。這種最終百分比同一性評分用于本發(fā)明的目的。出于手工調(diào)整百分比同一性評分的目的，僅考慮不與査詢序列匹配/比對的，在目標序列的N端和C端的殘基。g卩，僅是在目標序列的最遠N和C端殘基外側的查詢殘基位點。例如，將卯個氨基酸殘基的目標序列與100個殘基的査詢序列進行比對來確定百分比同一性。該缺失發(fā)生在目標序列的N端，并且因此，F(xiàn)ASTDB比對沒有顯示在N端前10個殘基的匹配/比對。這10個未配對殘基代表序列的10。/"未匹配的在N端和C端殘基的數(shù)量/查詢序列的殘基.總數(shù))，因此將10。/c從通過FASTDB程序計算的百分比同一性評分中減去。如果剩余的卯個殘基完全匹配，最終的百分比同一性將是卯％。在另一個實例中，將90個殘基的目標序列與100個殘基的查詢序列進行比較。這次，缺失是內(nèi)部缺失從而使在目標序列的N端或C端上不存在與奄詢序列不匹配/比對的殘基。在該情形中，通過FASTDB計算的百分比同一性沒有進行手工校正。再一次，如通過FASTDB比對所顯示的，只對在不與查詢序列匹配/比對的目標序列的N端和C端末端殘基外側的殘基位點進行手工校正。出于本發(fā)明的目的，沒有進行其它的手工校正。用于本文時，"^)^箱姿斧7T雜《r"于本發(fā)明的核酸序列的核酸指在這樣的條件下進行雜交的多核苷酸，所述條件為在包括以下各項的溶液中于42'C進行過夜溫育，500/。的甲酰胺，5xSSC(750mMNaCl,75mM擰檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5xDenhardt's溶液，10°/。硫酸葡聚糖，和20jxg/ml的變性、已剪切的鮭精DNA，隨后于約65。C在0.1xSSC中洗滌濾器。用于本文時，術語高^T基沐定泣^^滅旨負責將多肽錨定在高爾基復合體的位置中的高爾基體定居多肽的氨基酸序列。通常，定位結構域包括酶的氨基末端"尾"。用于本文時，術語^"應f勸yf魏可歸因于抗體的Fc區(qū)域(天然序列Fc區(qū)域或氨基酸序列變體Fc區(qū)域)的那些生物學活性?？贵w效應子功能的實例包括，但不限于，F(xiàn)c受體結合親和性，抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)，抗體依賴性細胞吞噬作用(ADqP)，細胞因子分泌，免疫復合物介導的抗原呈遞細胞的抗原吸收，細胞表面受體的下調(diào)等。用于本文時，術語汰澄，拔汰遭，遂療^^適^7^^基眾^^遭被認為包括天然存在或重組多肽或其片段的糖基化模式的任何操作。糖基化改造包括細胞的糖基化作用的代謝改造，所述代謝改造包括對寡糖合成途徑進行遺傳操作從而獲得改變的在細胞中表達的糖蛋白的糖基化。此外，糖基化改造包括突變和細胞環(huán)境對糖基化的影響。在一個實施方案中，糖基化改造是糖基轉移酶活性的改變。在一個具體實施方案中，改造導致改變的葡糖胺基轉移酶活性和/或巖藻糖基轉移酶活性。用于本文時，術語德^"4^^包括任何種類的細胞系統(tǒng)，其可以被進行改造從而生產(chǎn)本發(fā)明的多肽和抗原結合分子。在一個實施方案中，對宿主細胞進行改造從而容許產(chǎn)生具有修飾的糖形的抗原結合分子。在一個優(yōu)選的實施方案中，抗原結合分子是抗體，抗體片段，或融合蛋白。在某些實施方案中，還對宿主細胞進行操作從而使其表達增加水平的一種或多種具有GnTHI活性的多肽。宿主細胞包括培養(yǎng)的細胞，例如，哺乳動物培養(yǎng)細胞，諸如CHO細胞，HEK293-EBNA細胞，BHK細胞，NS0細胞，SP2/0細胞,YO骨髓瘤細胞,P3X63小鼠骨髓瘤細胞，PER細胞，PER.C6細胞或雜交瘤細胞，酵母細胞，昆蟲細胞，和植物細胞，僅舉幾個例子，但是還包括被包含在轉基因動物，轉基因植物或培養(yǎng)的植物或動物組織中的細胞。用于本文時，術語Fc-々導^^y虜毒絲包括抗體依賴性細胞毒作用和由包含人Fc-區(qū)域的可溶Fc-融合蛋白介導的細胞的細胞毒性。這是一祌導致"人免疫效應細胞"裂解"抗體靶向細胞"的免疫機制，其中乂^i^^^^^^i^是在它們的表面上展示Fc受體的白細胞群，通過所述Fc受體它們結合于抗體或Fc-融合蛋白的Fc-區(qū)域并且執(zhí)行效應子功能。這樣的群可以包括，但不限于，外周血單核細胞(PBMC)和/或天然殺傷(NK)細胞。貧沐教萄欲^f是由抗體或Fc融合蛋白結合的細胞?？贵w或Fc融合蛋白通過對于Fc區(qū)域來講為N端的蛋白部分來結合于靶細胞。用于本文時，將術語潛勿游Fc-介導游潘應游潘虜毒絲定義為通過上述定義的Fc-介導的細胞的細胞毒性的機制，在圍繞耙細胞的培養(yǎng)基中，以給定濃度的抗體，或給定濃度的Fc-融合蛋白，在給定時間內(nèi)裂解的"抗體-靶向細胞"的數(shù)量的增加，和/或將其定義為通過Fc介導的細胞的細胞毒性的機制，在給定的時間內(nèi)，獲得給定數(shù)量的"抗體耙向細胞"的裂解所需要的在圍繞靶細胞的培養(yǎng)基中抗體濃度，或Fc-融合蛋白的濃度的減少。Fc-介導的細胞的細胞毒性的增加涉及由相同的抗體，或Fc-融合蛋白介導的細胞的細胞毒性，所述抗體或Fc-融合蛋白使用本領域那些技術人員己知的相同的標準產(chǎn)生，純化，配制和貯存方法由相同類型的宿主細胞產(chǎn)生，若非不是由通過本文所述的方法進行了改造從而表達糖基轉移酶GriTIII的宿主細胞產(chǎn)生。所謂貞萄^Jl^7;^貧沐宛教絲i^游毒作)^^DCq)^貧伴,意指如本文所定義的術語的抗體，所述抗體如通過本領域那些普通技術人員已知的任何適合方法所確定的具有增加的ADCC。一種被接受的體外ADCC測定如下1)該測定使用己知表達靶抗原的靶細胞，所述靶抗原由抗體的抗原結合區(qū)域所識別；2)該測定使用分離自隨機選擇的健康供體的血液的人外周血單核細胞(PBMCs)，來作為效應細胞；3)該測定按照下列方法進行i)使用標準的密度離心方法來分離PBMCs并將其以5x106細胞/ml懸浮在RPMI細胞培養(yǎng)基中；ii)通過標準的組織培養(yǎng)方法培養(yǎng)靶細胞，在生存力大于90%的指數(shù)生長階段來收集細胞，在RPMI細胞培養(yǎng)基中將其進行洗滌，用100微居的s'Cr將其進行標記，并用細胞培養(yǎng)基將其洗滌兩次，并以105細胞/ml的密度將其重懸于細胞培養(yǎng)基中；iii)將100微升的上述最終耙細胞混懸液轉移到96孔微量滴定板的每孔中-,iv)將抗體從4000ng/ml妾lj0.04ng/ml在細胞培養(yǎng)基中進行系列稀釋，將50微升的得到的抗體溶液加入96孔微量滴定板中的靶細胞，以三次重復測試各個抗體濃度，所述抗體濃度覆蓋整個的上述范圍的抗體濃度；v)對于最大釋放(MR)對照，在包含標記的靶細胞的板中的3個另外的孔接受50微升的2%(V/V)的非離子去污劑(Nonidet，Sigma,St.Louis)的水溶液，取代抗體溶液(上述的第iv點)；vi)對于自發(fā)釋放(SR)對照而言，在包含標記的靶細胞的板中的3個另外的孔接受50微升的RPMI細胞培養(yǎng)基，取代抗體溶液(上述的第iv點)；vii)接著將96孔微量滴定板以50xg離心1分鐘并在4'C溫育1小時；viii)將50微升的PBMC混懸液(上述第i點)加入每個孔中從而產(chǎn)生25:1的效應物耙細胞比率，并將板置于溫箱中于37'C在5Y。C02氣氛下達4小時。ix)從每個孔中收集無細胞的上清液，并使用Y射線計數(shù)器來量化實驗釋放的放射性(ER);x)按照式(ER-MR)/(MR-SR)x100來計算每個抗體濃度的特定裂解的百分比，其中ER是對于誶抗體濃度量化的平均放射性(見上述第ix點)，MR是對于MR對照而言(見上面的第v點)量化的平均放射性(見上而的第ix點)，并且SR是對于SR對照而言(見上面的第vi點)量化的平均放射性(見上面的第ix點)；4)將"增加的ADCC"定義為在上述測試的抗體濃度范圍內(nèi)觀察的特定裂解的最大百分比的增加，和/或在上面測試的抗體濃度范圍內(nèi)觀察到的獲得特定裂解的最大百分比的一半所需要的抗體的濃度的減少。在ADCC中的增加涉及這樣的ADCC，其是在上述測定中測量的，由相同抗體介導的ADCC，所述抗體使用本領域那些技術人員已知的相同的標準產(chǎn)生，純化，配制和貯存方法由相同類型的宿主細胞產(chǎn)生，若非不是由被改造從而過量表達GnTIII的宿主細胞所產(chǎn)生。在一個方面，本發(fā)明涉及具有大鼠ICR62結合特異性(即，結合基本上相同旳表位)的抗原結合分子，并涉及它們的效應子功能可以通過改變糖基化來增加的發(fā)現(xiàn)。在一個實施方案中，抗原結合分子是嵌合抗體。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及嵌合抗體，或其片段，其包含SEQ1DNOs:53-108和/或SEQIDNO:s122-127任一的CDRs的一個或多個(例如，—個，兩個，三個，四個，五個，或六個)。具體地，在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及一種分離的多核苷酸，其包含:(a)選自由下列各項組成的組的序列SEQEDNO:54SEQIDNO:56，SEQIDNO:58，SEQIDNO:60,SEQIDNO:62，SEQIDNO:64，SEQIDNO:66，SEQIDNO:68，SEQIDNO:70,SEQIDNO:72,SEQIDNO:74，SEQIDNO:122,和SEQIDNO:124;(b)選自由下列各項組成的組的序列犯QIDNO:76,SEQIDNO:78,SEQIDNO:80，SEQIDNO:8i，SEQIDNO:84，SEQIDNO:86，SEQIDNO:88，SEQIDNO:卯，SEQIDNO:92,SEQIDNO:94,SEQIDNO:96,SEQIDNO:98，SEQIDNO:IOO，SEQIDNO:102，SEQIDNO:104，SEQIDNO:106'和SEQEDNO:126;和(c)SEQIDNO:108。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及一種分離的多核苷酸，其包括(a)選自由下列各項組成的組的序列SEQIDNO:112和SEQIDNO:114;(b)選自由下列各項組成的組的序列SEQIDNO:116和SEQIDNO:118;和(c)SEQIDNO:l19。在—個實施方案中，這些多核苷酸的任何一個編碼融合多肽。在另一個實施方案中，抗原結合分子包括由SEQIDNO:l或犯QIDNO:2編碼的大鼠ICR62抗體的VH結構域，或其變體；和非鼠多肽。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及抗原結合分子，其包括由SEQIDNO:43或SEQIDNO:44編碼的大鼠抗體的VL結構域，或其變體；和非鼠多肽。在另一個方面，本發(fā)明涉及抗原結合分子，其包括一個或多個(例如，—個，兩個，三個，四個，五個或六個)截短的ICR62的CDRs。這些截短的CDRs將至少包括，給定的CDR的特異性決定氨基酸殘基。所謂"特異性決定殘基"意為直接涉及與抗原的相互作用的那些殘基。通常，在給定的CDR中只有約1/5到1/3的殘基參與與抗原的結合。在特定的CDR中的特異性決定殘基可以通過，例如計算來自三維建模的原子間的接觸和按照全部內(nèi)容并入本文作為參考的Padlana/.,/^SSB/9(7力133-139(1995)所述方法在給定的殘基位點確定序列可變性來鑒別。因此，本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包括大鼠ICR62抗體的至少一個(例如，一個，兩個，三個，四個，五個或六個)互補決定區(qū)，或包含至少所述互補決定區(qū)的特異性決定殘基的其變體或截短形式，其中所述分離的多核苷酸編碼融合多肽。優(yōu)選地，這些分離的多核苷酸編碼作為抗原結合分子的融合多肽。在一個實施方案中，多核苷酸包括大鼠ICR62抗體的三個互補決定區(qū)，或包含至少所述三個互補決定區(qū)的每個的特異性決定殘基的其變體或其截短形式。在一個實施方案中，所述多核苷酸包括至少一個在以下表2-5中列出的CDR。在另一個實施方案中，多核苷酸編碼嵌合(例如，人源化)抗體的輕鏈或重鏈的整個可變區(qū)。本發(fā)明還涉及由這些多核苷酸編碼的多肽。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及抗原結合分子，其包括大鼠ICR62抗體的至少一個(例如，一個，兩個，三個，四個，五個或六個)互補決定區(qū)，或包含至少所述互補決定區(qū)的特異性決定殘基的其變體或截短形式，并包含來自異源多肽的序列。在一個實施方案中，抗原結合分子包括大鼠ICR62抗體的三個互補決定區(qū)，或其變體或截短形式，所述變體或截短形式包含至少所述三個互補決定區(qū)的每個的特異性決定殘基。在一個實施方案中，抗原結合分子包括至少一個在以下表2-5中列出的CDR。在另一個方面，抗原結合分子包括抗體的輕鏈或重鏈的可變區(qū)。在一個特別有用的實施方案中，抗原結合分子是嵌合的，例如人源化的抗體。本發(fā)明還涉及制備這些抗原結合分子的方法，和將其用在治療疾病中的應用，所述疾病特別是其中EGFR被表達、特別是其中與相同細胞類型的正常組織相比EGFR被異常表達(例如，過表達)的細胞增殖性病癥。這些病癥包括但不限于，膀胱癌，腦癌，頭和頸癌，胰腺癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，結腸癌，前列腺癌，皮膚癌，和腎癌。EGFR表達水平可以通過本領域己知的方法和本文所述的那些方法來測定(例如，經(jīng)由免疫組織化學測定，免疫熒光測定，免疫酶法測定，ELISA，流式細胞術，放射免疫測定，蛋白質印跡，配體結合，激酶活性等)。本發(fā)明還涉及一種體內(nèi)或體外靶向表達EGFR的細胞的方法。表達EGFR的細胞可以被靶向而用于治療目的(例如，治療通過中斷EGFR介導的信號傳導可治療的病癥，例如通過阻斷配體結合，或靶向表達EGFR的細胞以通過免疫系統(tǒng)破壞)。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種在受試者中耙向表達EGFR的細胞的方法，該方法包括向受試者施用包含本發(fā)明的ABM的組合物。表達EGFR的細胞也可以被靶向而用于診斷目的(例如，確定它們是否正?；虍惓５乇磉_EGFR)。因此，本發(fā)明還涉及體內(nèi)或體外檢測EGFR或表達EGFR的細胞的存在的方法。一種根據(jù)本發(fā)明的檢測EGFR表達的方法包括在允許ABM和EGFR之間形成復合物的條件下，將待測樣品任選地與對照樣品一起與本發(fā)明的ABM接觸。然后檢測復合物形成(例如，通過ELISA或本領域己知的其它方法)。當與試驗樣品一起使用對照樣品時，當比較試驗和對照樣品時在ABM-EGFR復合物形成方面的任何統(tǒng)計學顯著差異指示在試驗樣品中EGFR的存在。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>表4<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>己知幾種機制參與抗-EGFR抗體的治療功效，包括阻斷配體(例如,EGF，TGF-d，"c.)與EGFR結合和隨后信號傳導途徑的活化，抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)，和誘導生長停滯或終末分化。大鼠單克隆抗體ICR62(IgG2b)在PCT公開No.WO95/20045中討論，其通過參考完整地結合于此。它針對EGFR的C表位，并且顯示抑制配體結合，抑制表達EGFR的鱗狀細胞癌的體外生長，和誘導無胸腺小鼠中腫瘤異種移植物的消退(WO95/20045;Modjtahedi"a/.，&/73:228-235(1996))。作為完全嚙齒動物抗體，將ICR62大鼠單克隆抗體施用于人導致一些患者中的HARA反應，即使在單一劑量之后。(WO95/20045;Modjtahedi份■/C。"cw73:228-235(1996))巳經(jīng)描述了嵌合小鼠/人抗體。見，例如，Morrison,S,L.etal.,/WAS111:6851-6854(1984年11月)；歐洲專利公開號173494;Bow/to""fl,GL,atal.,Waft^312:642(1984年12月)；Neubeiger，M.S.etal.,A^"re314:268(1985年3月)；歐洲專利公開號125023;Tanetal.，//附/wk"o/.135:8564(1985年11月)；Sun，L.Ketal.，T/y6"Wo加a5(1):517(1986);Sahaganetal"■/Jm加"no/.137:1066-1074(1986)。通常見，Muron,A^"re312:597(1984年12月)；Dickson，JVievw5(3)(1985年3月)；Marx，Sc/e"ce229:455(1985年8月)；和Morrison,5Wence229:1202-1207(1985年9月)。IMC-C225(Erbitux,Imclone)是針對EGFR的嵌合單克隆抗體并且具有小鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)(見Herbst和Shin，C朋cw94:1593-1611(2002))。IMC-225的鼠部分來源于M225，其被發(fā)現(xiàn)結合EGFR并且抑制EGF-誘導的酪氨酸激酶依賴型磷酸化，以及在過表達EGFR的腫瘤細胞系中誘導程序性細胞死亡(Herbst和Shin，Omcer94:1593-1611(2002))。然而，M225在I期臨床試驗中在用所述抗體治療的患者中引發(fā)HAMA應答(Herbst和Shin，Owcer94:1593-1611(2002))。已經(jīng)在體內(nèi)或體外試驗IMC-225,并且已經(jīng)與放射性療法和化學療法聯(lián)合用于許多腫瘤類型，包括與差的預后相關的那些(Herbst和Shin，Cawcer94:1593-1611(2002))。然而，在臨床試驗中在施用IMC-225抗體的患者中IMC-225已經(jīng)與諸如變態(tài)反應和皮膚反應的毒性關聯(lián)(Herbst和Shin，Omcer94:1593-1611(2002))。在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的嵌合ABM是人源化的抗體。使非人的抗體人源化的方法是本領域已知的。.例如，本發(fā)明的人源化ABMs可以按照Winter的美國專利號5,225,539，Queenefg/的美國專利號6,180,370，Adairefa/的美國專利號6,632,927，或Foote的美國專利申請發(fā)明者埃克哈德·默斯納,巴勃羅·烏馬納申請人:格黎卡特生物技術股份公司