專利名稱：可完全溶解于葡萄酒中的新的甘露糖蛋白及其在對葡萄酒加以穩(wěn)定的過程中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的甘露糖蛋白、它的制備方法及其在對葡萄酒加以穩(wěn)定的過程中的用途。
背景技術(shù)：
酒石酸鹽、酒石酸氫鉀(KHT)、酒石酸鈣(CaT)的存在以及蛋白質(zhì)渾濁的發(fā)生是造成葡萄酒不穩(wěn)定的主要原因。
酒石酸是葡萄漿果發(fā)育過程中產(chǎn)生的主要有機酸。在加工漿果的過程中，酒石酸以鉀鹽和鈣鹽的形式溶解進(jìn)葡萄汁。在發(fā)酵過程中，酒石酸鹽的溶解度隨著(糖發(fā)酵所致的)乙醇濃度的增加而下降。
在新釀的葡萄酒中，酒石酸氫鉀(KHT)的濃度總是過飽和，并自發(fā)地結(jié)晶。在將葡萄酒裝瓶之后，由于結(jié)晶的不可預(yù)測的性質(zhì)，KHT不穩(wěn)定性可能會成為商業(yè)性的問題。此外，消費者通常將葡萄酒瓶中存在晶體看作是葡萄酒質(zhì)量差的象征。可以在將葡萄酒裝瓶之前使用物理處理以防酒石酸鹽結(jié)晶。這些處理包括通過將葡萄酒冷卻至-4℃來促進(jìn)結(jié)晶，或通過電滲析或使用離子交換樹脂來消除鉀離子和酒石酸離子。然而，這些費時且耗能的方法被推測會改變葡萄酒的膠體平衡。
替代物理處理的方法是使用可以防止KHT晶體成核和/或生長的添加劑。
羧甲基纖維素和偏酒石酸屬于可抑制KHT晶體生長的添加劑。但不幸地，羧甲基纖維素并不被葡萄酒界接受，原因是它可能會對處理過的葡萄酒產(chǎn)生不良的感官(organoleptic)影響。另一方面，偏酒石酸在葡萄酒的pH下以及儲存葡萄酒的溫度下不穩(wěn)定。偏酒石酸會隨時間水解，并且它的保護(hù)作用也會隨時間消失。因此，它的用途被限制在快速消費的低質(zhì)量葡萄酒。另一缺陷在于，理想而言，添加劑應(yīng)當(dāng)是葡萄酒的天然組分。而這顯然并非可采用偏酒石酸或羧甲基纖維素的情況。
葡萄酒不穩(wěn)定的另一個原因是不穩(wěn)定的葡萄酒類蛋白質(zhì)的聚集，這會導(dǎo)致蛋白質(zhì)渾濁的形成，其作用于降低感覺的葡萄酒質(zhì)量。目前，使用斑脫土(bentonite)來從葡萄酒中去除蛋白質(zhì)渾濁的形成。然而，這種處理會對葡萄酒的感官特性產(chǎn)生不良影響。此外，這樣的處理需要釀葡萄酒者付出額外的勞動，并由于被斑脫土吸收而導(dǎo)致葡萄酒的損失。
可以抑制蛋白質(zhì)渾濁形成并對KHT晶體的成核和生長速率具有活性的天然添加劑相對于化學(xué)添加劑而言是優(yōu)選的。
天然添加劑的例子是甘露糖蛋白。甘露糖蛋白以及葡聚糖是酵母細(xì)胞壁的主要成分(Lipke P.N.等，J.Bacteriol.(1998)180(15)3735-3740)。主要通過兩類方法從酵母細(xì)胞獲得甘露糖蛋白物理方法和酶促方法。獲得甘露糖蛋白的最常用的物理方法描述于Peat S.等，J.Chem.Soc.London(1961)28-35中，在該方法中，在檸檬酸鹽緩沖液中將酵母在138℃下高壓滅菌2小時，在去除細(xì)胞壁之后，通過添加乙醇使產(chǎn)物沉淀，通過滲析進(jìn)一步純化，然后通過冷凍干燥將其分離。由酵母獲得甘露糖蛋白的酶促方法描述于WO 96/13571和WO 97/49794中，該方法主要包括用β-葡聚糖酶制劑處理已分離的酵母細(xì)胞壁，然后通過超濾分離產(chǎn)物。
通過已知方法制備的(例如通過高壓滅菌獲得的)甘露糖蛋白具有如下缺點它一旦被加入葡萄酒中即產(chǎn)生不期望看到的渾濁度，并且有時會產(chǎn)生副產(chǎn)物沉淀。此外，所述甘露糖蛋白防止KHT晶體成核和/或生長或防止蛋白質(zhì)渾濁形成的效果并不總是令人滿意。
EP-A-1094117描述了制備可溶性甘露糖蛋白的方法，所述方法減輕了在甘露糖蛋白制備中存在的由副產(chǎn)物引起的渾濁度問題。在此方法中，酵母細(xì)胞壁在自溶之后被分離，隨后在95-100℃下進(jìn)行選擇性水解15-30小時，從而將甘露糖蛋白和其它雜質(zhì)溶解。需要數(shù)個步驟來純化已溶解的甘露糖蛋白，包括超濾，然后在0-6℃下保持?jǐn)?shù)小時，以及通過澄清離心機(clarification centrifuge)分離膠體副產(chǎn)物。此方法很復(fù)雜，并不真正適合以商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)甘露糖蛋白。
因此，需要新的(可溶性)甘露糖蛋白(或其制劑)，所述甘露糖蛋白在加入葡萄酒中后不存在副產(chǎn)物引起的渾濁和/或副產(chǎn)物沉淀的問題。此甘露糖蛋白可以呈現(xiàn)抑制KHT晶體形成或蛋白質(zhì)渾濁形成的改善的活性。還需要制備所述新的甘露糖蛋白的更有效的方法。
發(fā)明詳述在第一方面，本發(fā)明提供了甘露糖蛋白的制備方法，所述方法包括a)對酵母細(xì)胞的懸浮液進(jìn)行酶促水解，以使所述酵母細(xì)胞降解，并使甘露糖蛋白和其它酵母組分從已降解的細(xì)胞中溶解并釋放；b)回收已溶解的甘露糖蛋白；以及可選地c)用pH至少為9的堿性溶液處理被回收的甘露糖蛋白。
在本文中，“甘露糖蛋白”定義了下述產(chǎn)物，所述產(chǎn)物是用本發(fā)明的方法從酵母得到的，并可以通過標(biāo)準(zhǔn)分析方法(例如氨基酸分析、碳水化合物分析等)將該產(chǎn)物確認(rèn)為蛋白質(zhì)部分與包含主要由甘露糖構(gòu)成的聚合物的碳水化合物部分的組合。碳水化合物部分和蛋白質(zhì)部分不需要彼此共價鍵合。
在本發(fā)明的步驟a)中，對酵母細(xì)胞的懸浮液進(jìn)行酶促水解，以使所述酵母細(xì)胞降解，并使甘露糖蛋白和其它酵母組分從已降解的細(xì)胞中溶解并釋放。
任何類型的酵母可以用于本發(fā)明的方法。具體地，可以適宜地使用屬于Saccaromyces、Kluyveromyces或Candida屬的酵母菌株。優(yōu)選屬于Saccaromyces屬的酵母菌株，例如Saccaromyces cerevisiae的菌株。
本發(fā)明的方法可以以酵母細(xì)胞在水性液體中的懸浮液(例如所述酵母細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)液)開始。形成發(fā)酵細(xì)胞懸浮液的合適發(fā)酵方法在本領(lǐng)域中是已知的。在有些情況下，在將發(fā)酵培養(yǎng)液用于本方法之前，可以例如通過離心或過濾將其濃縮。例如，可以使用膏狀酵母(被濃縮至15-27％(w/w)干物質(zhì)含量的面包酵母)。
在步驟a)中，通過使酵母細(xì)胞懸浮液經(jīng)歷天然酵母酶和/或添加的外源酶的作用，可以進(jìn)行對所述懸浮液的酶促水解。
用于進(jìn)行酶促水解的條件取決于所用酶的類型，并可被本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定。通常，酶促水解在4-10的pH和40-70℃的溫度下進(jìn)行。通常，酶促水解進(jìn)行的時間為1-24小時。
可選地，在添加任何外源酶之前，將天然酵母酶滅活。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道如果將天然酵母酶滅活。滅活可以例如通過pH處理或熱激來進(jìn)行，優(yōu)選熱激方法。適宜地，熱激可以通過在80-97℃的溫度下處理酵母細(xì)胞懸浮液5-10分鐘進(jìn)行。一旦天然酵母酶已滅活，即可將外源酶加入酵母細(xì)胞懸浮液，以進(jìn)行酶促水解。為了此目的，優(yōu)選使用蛋白酶，更優(yōu)選使用內(nèi)切蛋白酶?？蛇x地，使用酶將RNA轉(zhuǎn)化為5’-核糖核苷酸，例如用5’-Fdase，可選地，還可以在用上述酶進(jìn)行處理的同時或之后使用脫氨酶(例如腺苷酸脫氨酶)。
在一種優(yōu)選實施方式中，通過使酵母細(xì)胞懸浮液自溶進(jìn)行酶促水解。自溶是下述過程，其中，通過(部分地)破壞和/或分裂酵母細(xì)胞壁而打開酵母細(xì)胞之后，在介質(zhì)中釋放出的活性天然酵母酶至少部分地進(jìn)行對酵母細(xì)胞和聚合酵母物質(zhì)的降解。
自溶可按照本領(lǐng)域中已知的方法(例如，Conway J.等，Can.J.Microbiol.(2001)4718-24)進(jìn)行。
典型地，通過機械、化學(xué)或酶促處理(部分地)破壞和/或分裂酵母細(xì)胞壁而打開酵母細(xì)胞，由此引發(fā)酵母細(xì)胞的自溶。優(yōu)選地，以酶促方式實現(xiàn)通過(部分地)破壞和/或分裂微生物細(xì)胞壁打開酵母細(xì)胞?？梢允褂脭?shù)種酶，但優(yōu)選使用蛋白酶，更優(yōu)選內(nèi)切蛋白酶。通常，用于打開酵母細(xì)胞和以酶促方式破壞和/或分裂微生物細(xì)胞壁的條件將與在微生物自溶過程中所用的條件相符合。當(dāng)用酶來通過(部分地)破壞和/或分裂酵母細(xì)胞壁而打開酵母細(xì)胞時，所述酶還作用于酵母細(xì)胞和聚合酵母物質(zhì)的降解。
在步驟b)之前，通常例如用前述方法將步驟a)中所用的(多種)酶滅活。
在本發(fā)明的方法的步驟b)中，從已降解的酵母細(xì)胞溶解并釋放的甘露糖蛋白被回收。優(yōu)選地，在步驟b)中，在回收甘露糖蛋白之前，通常通過固-液分離方法，優(yōu)選通過離心或過濾，去除例如從酵母細(xì)胞壁得到的不溶性物質(zhì)?？梢酝ㄟ^任何合適的方法回收甘露糖蛋白。優(yōu)選地，通過超濾(UF)來回收甘露糖蛋白。當(dāng)用UF來回收甘露糖蛋白時，可以使用分子量分離點為100kD或更低、優(yōu)選3-50kD、更優(yōu)選3-10kD的過濾器。甘露糖蛋白保留在超濾步驟所得的滯留物中。如果在超濾之前未去除不溶性材料，則包含甘露糖蛋白的滯留物和不溶性材料可重新懸浮(于溶液中)，因此優(yōu)選去除不溶性材料。
可選地，在步驟b)之后但在步驟c)之前，可以使用Fdase處理回收的甘露糖蛋白，以去除一部分RNA殘余物。
在本發(fā)明的方法的步驟c)中，用pH至少為9的堿性溶液處理回收的甘露糖蛋白。優(yōu)選地，所述處理在至少10、優(yōu)選10-13、更優(yōu)選11-13的pH下進(jìn)行。通常，步驟c)中的處理在室溫(例如20℃)至120℃、更優(yōu)選室溫(例如20℃)至100℃的溫度下進(jìn)行。通常，所述處理進(jìn)行的時間為1小時至1星期，這取決于溫度。通常，較高的pH需要較低的反應(yīng)溫度，而較高的反應(yīng)溫度需要較短的反應(yīng)時間。因此，在pH12和室溫下進(jìn)行1個星期的處理以及在pH12和70℃下進(jìn)行2小時的處理或者在pH10和70℃下進(jìn)行24小時的處理，均落在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？梢允褂萌魏魏线m的食品級的堿來進(jìn)行該pH處理。合適的堿的例子是氫氧化鈉或氫氧化鉀、碳酸鈉或碳酸鉀、磷酸鈉或磷酸鉀、氫氧化銨。優(yōu)選氫氧化鈉或氫氧化鉀。
優(yōu)選地，步驟c)中的處理在下述溫度、持續(xù)時間和pH條件下進(jìn)行，所述溫度、持續(xù)時間和pH條件使得與處理前的甘露糖蛋白在相同條件下測定的31P-NMR譜相比，步驟c)中得到的產(chǎn)物的31P-NMR(在27℃下，在pH為8的D2O中測定，并使用甘油磷酰膽堿(GPC)作為內(nèi)標(biāo)(取GPC的化學(xué)位移值為0.43))表明，在4.5與5.5ppm之間出現(xiàn)由磷酸甘露糖單酯所產(chǎn)生的一個或更多個峰或所述峰的強度增加，在-1與-2ppm之間由磷酸甘露糖二酯所產(chǎn)生的一個或更多個峰消失或強度減小。優(yōu)選地，用堿性溶液進(jìn)行的處理在如下條件下進(jìn)行，所述條件使得在所述31P-NMR譜中，在-1與-2ppm之間由磷酸甘露糖二酯所產(chǎn)生的一個或更多個峰的面積與在4.5與5.5ppm之間由磷酸甘露糖單酯所產(chǎn)生的一個或更多個峰的面積之比為至少90∶10，優(yōu)選至少75∶25，更優(yōu)選至少50∶50，甚至更優(yōu)選至少25∶75，甚至更優(yōu)選至少10∶90，最優(yōu)選約0∶100。因此，最優(yōu)選地，反應(yīng)優(yōu)選在如下條件下進(jìn)行，所述條件使得在-1與-2ppm之間由磷酸甘露糖二酯所產(chǎn)生的所述一個或更多個峰(幾乎)完全消失，并被在4.5與5.5ppm之間由磷酸甘露糖單酯所產(chǎn)生的一個或更多個峰取代。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以例如通過二維NMR(例如通過31P-1H相關(guān)波譜法，參見例如Chary K.V.R.等，J.Magn.Reson.Series B(1993)10281-83)來區(qū)分由磷酸甘露糖的磷酸單酯和磷酸二酯所產(chǎn)生的峰與由屬于其它化合物(例如RNA、單-、寡-和多核糖核苷酸)的其它磷酸單酯和磷酸二酯所產(chǎn)生的峰。
在一種優(yōu)選實施方式中，步驟c)中的處理在下述溫度、持續(xù)時間和pH條件下進(jìn)行，所述溫度、持續(xù)時間和pH條件使得RNA、寡-和多核糖核苷酸導(dǎo)致的雜質(zhì)至少部分、優(yōu)選至少50％、甚至更優(yōu)選全部被降解為單核糖核苷酸。此降解可通過31P-NMR驗證。在與上述相同的條件下測定的尤RNA、寡-和多核糖核苷酸導(dǎo)致的磷酸二酯的31P-NMR包括在約0ppm處的一個或更多個峰，而單核糖核苷酸導(dǎo)致的磷酸單酯的31P-NMR包括在約5ppm、通常約4-5ppm(略高于磷酸甘露糖單酯的區(qū)域)處的一個或更多個峰。
可選地，一旦已完成堿性處理，即可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的食品級的酸來中和反應(yīng)混合物。
優(yōu)選地，本發(fā)明的方法還包括步驟d)通過超濾純化經(jīng)處理的甘露糖蛋白。
典型地，通過對在步驟c)中得到的經(jīng)處理的甘露糖蛋白進(jìn)行一個或更多個超濾步驟來進(jìn)行步驟d)?？梢允褂镁哂腥缟纤龇肿恿糠蛛x點的超濾膜。
在步驟c)的處理過程中，可能形成一些不溶物。在此情況下，可以在步驟c)之后且步驟d)之前和/或步驟d)之后，通過常用的固-液分離方法(例如過濾或離心)除去這些不溶物。
步驟c)或d)后所得的甘露糖蛋白通常作為溶液獲得，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將其進(jìn)一步濃縮和/或干燥，例如通過在真空下濃縮甘露糖蛋白溶液以及對經(jīng)濃縮的溶液進(jìn)行噴霧干燥或冷凍干燥來進(jìn)行。
在第二方面，本發(fā)明提供了可由第一方面的方法獲得的甘露糖蛋白。
本發(fā)明的甘露糖蛋白的分子量優(yōu)選至多100kDa，更優(yōu)選1-50kDa，甚至更優(yōu)選3-30kDa之間的分子量。本發(fā)明的甘露糖蛋白優(yōu)選通過以下方式表征基于甘露糖蛋白干物質(zhì)的碳水化合物含量為至少50％(w/w)，基于碳水化合物總量的碳水化合物含量為70％(w/w)，由甘露糖寡聚物或多聚物形式的甘露糖殘基組成。
如上所述測定的本發(fā)明的甘露糖蛋白的31P-NMR優(yōu)選包括在-1與-2ppm之間由磷酸甘露糖二酯所產(chǎn)生的一個或更多個峰和/或在4.5與5.5ppm之間由磷酸甘露糖單酯所產(chǎn)生的一個或更多個峰。更優(yōu)選地，在所述31P-NMR譜中，在-1與-2ppm之間由磷酸甘露糖二酯所產(chǎn)生的一個或更多個峰的面積與在4.5與5.5ppm之間由磷酸甘露糖單酯所產(chǎn)生的一個或更多個峰的面積之比為至少90∶10，優(yōu)選至少75∶25，更優(yōu)選至少50∶50，甚至更優(yōu)選至少25∶75，甚至更優(yōu)選至少10∶90，最優(yōu)選約0∶100。
十分令人驚訝地，當(dāng)以有效量將可由本發(fā)明的方法獲得的甘露糖蛋白添加至葡萄酒中時，可僅引起最小程度的可見渾濁和/或副產(chǎn)物沉淀。當(dāng)以有效量添加至葡萄酒中時，甚至在高甘露糖蛋白濃度(例如800mg/l)下，本發(fā)明(例如在步驟c)中獲得)的甘露糖蛋白可以完全不產(chǎn)生渾濁或副產(chǎn)物沉淀。這些結(jié)果與用已知方法制備的甘露糖蛋白獲得的結(jié)果大不相同。例如，當(dāng)用上述Peat等的方法獲得的甘露糖蛋白被加入葡萄酒中時，會形成渾濁以及不想要的沉淀。
已觀察到，甘露糖蛋白在葡萄酒中提高的溶解度以及可選增加的作為葡萄酒穩(wěn)定劑的活性與本發(fā)明的甘露糖蛋白按照上述方法測定的31P-NMR譜中在4.5與5.5ppm之間由磷酸甘露糖單酯所產(chǎn)生的峰的面積增大相關(guān)。
本發(fā)明的甘露糖蛋白在葡萄酒中的溶解度提高，使此甘露糖蛋白特別適合作為添加劑用于對葡萄酒加以穩(wěn)定的過程中。
本發(fā)明的甘露糖蛋白可以作為單獨葡萄酒添加劑或以組合物的形式使用。因此，本發(fā)明的第三方面提供了包含第二方面的甘露糖蛋白和一種或更多種葡萄酒添加劑的組合物。葡萄酒添加劑的例子是偏酒石酸或阿拉伯膠。優(yōu)選的組合物包含根據(jù)本發(fā)明的甘露糖蛋白和阿拉伯膠。
本發(fā)明的第四方面提供了第二方面的甘露糖蛋白或第三方面的組合物在對葡萄酒加以穩(wěn)定的過程中的用途。
具體地，本發(fā)明提供了通過防止和/或延遲酒石酸鹽結(jié)晶以穩(wěn)定葡萄酒的方法，其中本發(fā)明的甘露糖蛋白或本發(fā)明的組合物被加入葡萄酒中或用于制造葡萄酒的葡萄汁中。優(yōu)選地，在成熟(ageing)期間(即發(fā)酵后且裝瓶前)將甘露糖蛋白或其組合物加入葡萄酒中。本發(fā)明非常適用于白葡萄酒、玫瑰葡萄酒，但同樣適用于紅葡萄酒。
本發(fā)明的甘露糖蛋白以足以獲得穩(wěn)定效果的量添加。所述穩(wěn)定效果相當(dāng)于或優(yōu)于以相同量使用的已知甘露糖蛋白所達(dá)到的穩(wěn)定效果。通常，本發(fā)明的甘露糖蛋白可以以每升葡萄酒10-1000mg的濃度添加至葡萄酒中。添加甘露糖蛋白至每升葡萄酒10-400mg的最終濃度，即可得到良好結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，添加的量還將取決于例如其它葡萄酒穩(wěn)定劑的添加或存在，以及添加之前葡萄酒中的KHT的過飽和度。
可以通過以下方法對葡萄酒中的KHT的成核和晶體生長進(jìn)行測定和定量(Moutounet等Actualités OEnologiques 1999 Vieme SymposiumInternational d’Oenologie de Bordeaux(Lonvaud-Funel ed.))。
對晶體成核加以指示的第一種方法測定當(dāng)在-4℃下儲存時在葡萄酒中出現(xiàn)晶體的時間。每天進(jìn)行目測，以天數(shù)表示檢測到晶體出現(xiàn)所需的時間(Tcrys)。
對晶體生長加以指示的第二種方法測定葡萄酒的酒石酸不穩(wěn)定度(DTI)。在-4℃下攪拌葡萄酒，并測定初始電導(dǎo)率。隨后，加入經(jīng)校正的KHT晶體，然后測定達(dá)到穩(wěn)定值之后的電導(dǎo)率。DTI被定義為初始電導(dǎo)率減少的百分比。
第三種方法測定溶解的酒石酸的真實濃度。將精確體積的葡萄酒轉(zhuǎn)移到玻璃小瓶中，并且與相同精確體積的包含濃度精確已知的馬來酸的D2O混合。在完全松弛的條件下進(jìn)行1H HMR，比較內(nèi)標(biāo)(馬來酸)的積分(integral)與酒石酸的積分。以此方式，可以以非常高的精度和準(zhǔn)確度確定溶解的酒石酸的濃度。
本發(fā)明還提供了通過防止和/或減少蛋白質(zhì)渾濁形成來對葡萄酒加以穩(wěn)定的方法，其中本發(fā)明的甘露糖蛋白或本發(fā)明的組合物被加入葡萄酒中或用于制造葡萄酒的葡萄汁中。而且，在此情況下，本發(fā)明的甘露糖蛋白以足以達(dá)到穩(wěn)定效果的量添加。按照以下方法，可以測定在葡萄酒中添加本發(fā)明的甘露糖蛋白之后與蛋白質(zhì)渾濁形成有關(guān)的葡萄酒穩(wěn)定性。在80℃下加熱葡萄酒樣品6小時，然后冷卻至4℃。在不穩(wěn)定蛋白質(zhì)引起渾濁之后進(jìn)行濁度測定(860nm)或吸光度測定(540nm)。
與酒石酸鹽結(jié)晶相關(guān)的不穩(wěn)定的葡萄酒的Tcrys可在0.5與15天之間變化。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，通過以適合防止和/或延遲酒石酸鹽結(jié)晶的濃度，在葡萄酒中或在制造葡萄酒的發(fā)酵中所用的葡萄汁中添加第二方面的甘露糖蛋白，可以獲得經(jīng)過穩(wěn)定的葡萄酒。所述經(jīng)過穩(wěn)定的葡萄酒的特征是如上述第一種方法測定的Tcrys(經(jīng)過穩(wěn)定的葡萄酒)/Tcrys(不穩(wěn)定的葡萄酒)為至少2，優(yōu)選至少5，更優(yōu)選至少10，甚至更優(yōu)選20-40。
如果需要，本發(fā)明的一個方面的優(yōu)選特征可以同樣地應(yīng)用于另一個方面。
通過以下實施例描述本發(fā)明，但這些實施例無意于限制本發(fā)明。
實施例通過用Kjeldahal方法測定總氮量并將所得值乘以因子6.25，可以確定本發(fā)明的甘露糖蛋白中的蛋白質(zhì)的量。
可以根據(jù)公知的蒽酮比色法確定本發(fā)明的甘露糖蛋白中的碳水化合物的量(基于甘露糖蛋白干物質(zhì))。
可以使用離子交換色譜測定本發(fā)明的甘露糖蛋白中的甘露糖的量。在用4N的TFA在100℃下水解甘露糖蛋白4小時之后，對水解產(chǎn)物進(jìn)行分析，所述分析以純甘露糖為標(biāo)準(zhǔn)，使用在注射閥前面裝備有內(nèi)嵌預(yù)處理Amino TrapTM柱(Dionex-USA)、Borate Trap柱(Dionex-USA)的CarboPacTMPA10陰離子交換柱(Dionex-USA)，并使用升高梯度的NaOH。通過使用脈沖電流滴定檢測來進(jìn)行甘露糖的檢測。
可根據(jù)公知的AES-ICP方法(帶電感耦合等離子輔助的原子發(fā)射光譜)來測定甘露糖蛋白中磷的量。
實施例1通過自溶酵母提取過程由酵母制備甘露糖蛋白將2L源自Saccharomyces cerevisiae的膏狀酵母加熱至51℃。然后，添加3.0ml Pescalase(可從荷蘭的DSM Food Specialties購得的絲氨酸蛋白酶)，并將混合物在pH5.1以及51.5℃下培養(yǎng)24小時。接著，在65℃下加熱自溶產(chǎn)物1小時，以使所有酶滅活。通過離心將提取物(可溶性部分)與不溶性細(xì)胞壁分離。
通過在分子量分離點為10kDa的過濾器上進(jìn)行超濾，將可溶性部分中存在的高分子量甘露糖蛋白與其它可溶物分離。將甘露糖蛋白回收于超濾滯留物部分中。
關(guān)于甘露糖蛋白(MP-0)回收的數(shù)據(jù)示于表1。
表1

在前面提到的條件下測定的MP-0的31P-NMR包括從δ+0.14至δ-0.14的寬信號(多核苷酸)以及在δ-1.33和δ-1.40處的兩個尖信號(甘露糖磷酸二酯)。
實施例2對實施例1中所得的甘露糖蛋白的堿性處理將實施例1的方法所得的粗制甘露糖蛋白制備成濃度為20g/l的溶液。用4M的氫氧化鈉溶液將該溶液的pH調(diào)節(jié)至12.0，并將其在室溫下保存1星期。在此期間兩次將pH調(diào)成12.0。1星期后，用4M的鹽酸溶液中和所述溶液。最后，通過使用分離點為10kD的膜進(jìn)行超濾去除鹽和降解產(chǎn)物。將滯留物(MP-1)冷凍干燥。
MP-1的31P-NMR包括在δ+5.13和δ+5.01處的兩個尖信號(甘露糖磷酸單酯)。
實施例3實施例1和2中所得的甘露糖蛋白對不穩(wěn)定葡萄酒中KHT結(jié)晶的影響通過標(biāo)準(zhǔn)熱提取及上述Peat等的方法得到分子量為3-100kD的甘露糖蛋白MP-2，并將其性能與MP-0和MP-1的性能進(jìn)行比較。
MP-2的31P-NMR包括從δ+0.14至δ-0.14的寬信號(多核苷酸)以及在δ-1.32和δ-1.38處的兩個尖信號(甘露糖磷酸二酯)。
以20g/l的濃度將MP-0、MP-1和甘露糖蛋白MP-2溶解在水中。在不穩(wěn)定的白葡萄酒中添加少量體積，以使最終濃度達(dá)到100、150、200、300、400和600mg/l。在-4℃下保存溶液。
由于當(dāng)加入葡萄酒中時MP-0和MP-2引起不想要的渾濁和沉淀，因此在以所需濃度向葡萄酒中添加MP-0和MP-2之后，將樣品在4℃下保存2小時。在此期間產(chǎn)生顯著沉淀，通過離心將其去除。將MP-0和MP-2的上層清液再次保持在-4℃。針對KHT晶體的出現(xiàn)，每天監(jiān)測全部溶液。
表2列出了以按照前述第一種方法測定的Tcrys表示的結(jié)果。
表2表明，在將在4℃下2小時形成的沉淀通過離心去除之后，MP-0并未再生成渾濁和沉淀。另一方面，在將首先形成的沉淀去除之后，MP-2仍生成大量沉淀。這清楚地表明，本發(fā)明的甘露糖蛋白比通過高壓滅菌制備的甘露糖蛋白更多地溶解于葡萄酒中。此外，表1清楚地表明，MP-1是唯一不需要去除渾濁和沉淀、并在甚至許多天后以高濃度保持完全溶于葡萄酒的甘露糖蛋白樣品。而且，與所有其它的產(chǎn)品相比，MP-1作為葡萄酒穩(wěn)定劑十分有效。MP-2也是有效的葡萄酒穩(wěn)定劑，當(dāng)將其加入葡萄酒中時會產(chǎn)生渾濁和副產(chǎn)物沉淀，這是不期望的副效應(yīng)。
表2

實施例4對用實施例2中所述的方法得到的甘露糖蛋白的表征首先用與實施例1中所述相同的方法得到粗制甘露糖蛋白，然后用與實施例2中所述相同的方法對其進(jìn)行處理，用碳水化合物、蛋白質(zhì)和磷的含量對所述甘露糖蛋白進(jìn)行表征。結(jié)果示于表3。
表3


以P2O5表示的磷的量相當(dāng)于0.77％(w/w，基于干物質(zhì))。
權(quán)利要求
1.甘露糖蛋白的制備方法，所述方法包括a)對酵母細(xì)胞的懸浮液進(jìn)行酶促水解，以使所述酵母細(xì)胞降解，并使甘露糖蛋白和其它酵母組分從已降解的酵母細(xì)胞中溶解并釋放；b)回收已溶解的甘露糖蛋白；以及可選地c)用pH至少為9的堿性溶液處理被回收的甘露糖蛋白。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中步驟a)中的所述酶促水解通過使所述酵母細(xì)胞的懸浮液自溶來進(jìn)行。
3.如權(quán)利要求1或2的方法，還包括d)通過超濾純化經(jīng)處理的甘露糖蛋白。
4.如權(quán)利要求1-3中任何一項的方法，其中通過超濾回收步驟b)中的所述已溶解的甘露糖蛋白。
5.如權(quán)利要求1-4中任何一項的方法，其中，在步驟b)中所述的回收已溶解的甘露糖蛋白之前，通過固-液分離方法，優(yōu)選通過離心或過濾，去除不溶性物質(zhì)。
6.如權(quán)利要求1-5中任何一項的方法，其中步驟c)中的所述處理在至少10、優(yōu)選10-13、更優(yōu)選11-13的pH下進(jìn)行。
7.如權(quán)利要求1-6中任何一項的方法，其中步驟c)中的所述處理在室溫至120℃、優(yōu)選室溫至100℃的溫度下進(jìn)行。
8.如權(quán)利要求1-7中任何一項的方法，其中所述處理的進(jìn)行時間為1小時至1星期。
9.如權(quán)利要求1-8中任何一項的方法，其中步驟c)中的所述處理在下述溫度、持續(xù)時間和pH條件下進(jìn)行，所述溫度、持續(xù)時間和pH條件使得與處理前的甘露糖蛋白在相同條件下測定的31P-NMR譜相比，步驟c)中得到的產(chǎn)物的31P-NMR表明，在4.5與5.5ppm之間出現(xiàn)由磷酸甘露糖單酯所產(chǎn)生的一個或更多個峰或所述峰的強度增加，在-1與-2ppm之間由磷酸甘露糖二酯所產(chǎn)生的一個或更多個峰消失或強度減小，所述測定在27℃下，在pH為8的D2O中進(jìn)行，并使用甘油磷酰膽堿(GPC)作為內(nèi)標(biāo)，其中GPC的化學(xué)位移值取為0.43。
10.如權(quán)利要求9的方法，其中用堿性溶液進(jìn)行的所述處理在如下條件下進(jìn)行，所述條件使得在所述31P-NMR譜中，在-1與-2ppm之間由磷酸甘露糖二酯所產(chǎn)生的所述一個或更多個峰的面積與在4.5與5.5ppm之間由磷酸甘露糖單酯所產(chǎn)生的所述一個或更多個峰的面積之比為至少90∶10，優(yōu)選至少75∶25，更優(yōu)選至少50∶50，甚至更優(yōu)選至少25∶75，甚至更優(yōu)選至少10∶90，最優(yōu)選約0∶100。
11.如權(quán)利要求1-10中任何一項的方法，其中步驟c)中的所述處理在下述溫度、持續(xù)時間和pH條件下進(jìn)行，所述溫度、持續(xù)時間和pH條件使得RNA、寡-和多核糖核苷酸雜質(zhì)的至少部分、優(yōu)選至少50％、甚至更優(yōu)選全部被降解為單核苷酸。
12.可由權(quán)利要求1-11中任何一項的方法獲得的甘露糖蛋白。
13.如權(quán)利要求12的甘露糖蛋白，其中所述甘露糖蛋白的31P-NMR優(yōu)選包括在-1與-2ppm之間由磷酸甘露糖二酯所產(chǎn)生的一個或更多個峰和/或在4.5與5.5ppm之間由磷酸甘露糖單酯所產(chǎn)生的一個或更多個峰，更優(yōu)選地，在-1與-2ppm之間由磷酸甘露糖二酯所產(chǎn)生的所述一個或更多個峰的面積與在4.5與5.5ppm之間由磷酸甘露糖單酯所產(chǎn)生的所述一個或更多個峰的面積之比為至少90∶10，優(yōu)選至少75∶25，更優(yōu)選至少50∶50，甚至更優(yōu)選至少25∶75，甚至更優(yōu)選至少10∶90，最優(yōu)選約0∶100，所述測定在27℃下，在pH為8的D2O中進(jìn)行，并使用甘油磷酰膽堿(GPC)作為內(nèi)標(biāo)，其中GPC的化學(xué)位移值取為0.43。
14.包含權(quán)利要求12或13的甘露糖蛋白以及一種或更多種葡萄酒添加劑的組合物。
15.權(quán)利要求12或13的甘露糖蛋白或如權(quán)利要求14的組合物在對葡萄酒加以穩(wěn)定的過程中的用途。
16.通過防止或延遲酒石酸鹽結(jié)晶以對葡萄酒加以穩(wěn)定的方法，其中權(quán)利要求12或13的甘露糖蛋白或如權(quán)利要求14的組合物被加入葡萄酒中或用于制造葡萄酒的葡萄汁中。
17.通過防止或減少蛋白質(zhì)渾濁的形成以對葡萄酒加以穩(wěn)定的方法，其中權(quán)利要求12或13的甘露糖蛋白或如權(quán)利要求14的組合物被加入葡萄酒中或用于制造葡萄酒的葡萄汁中。
18.包含權(quán)利要求12或13的甘露糖蛋白的葡萄酒。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種新的甘露糖蛋白，所述甘露糖蛋白可由以下方法獲得，所述方法包括a)對酵母細(xì)胞的懸浮液進(jìn)行酶促水解，以使所述酵母細(xì)胞降解，并使甘露糖蛋白和其它酵母組分從已降解的細(xì)胞中溶解并釋放；b)回收已溶解的甘露糖蛋白；以及可選地c)用pH至少為9的堿性溶液處理被回收的甘露糖蛋白。所述新的甘露糖蛋白可以很好地溶于葡萄酒，并在防止酒石酸鹽沉淀或蛋白質(zhì)渾濁形成的對葡萄酒加以穩(wěn)定的過程中十分有效。
文檔編號C07K14/39GK101087872SQ200580044743
公開日2007年12月12日 申請日期2005年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月23日
發(fā)明者彼得·菲利普·蘭克豪斯特, 伯圖斯·諾丹姆 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司