專利名稱：免疫結(jié)合劑的溶解性優(yōu)化的制作方法
免疫結(jié)合劑的溶解性優(yōu)化相關(guān)申請本申請要求于2008年6月25日提交的、名稱為“SolubilityOptimization of Immunobinders” 的 US 61/075，692 的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
已證明抗體在癌癥、自身免疫疾病和其他病癥的治療中是非常有效和成功的治療 劑。盡管一般已在臨床上使用全長抗體，但存在使用抗體片段可以提供的許多優(yōu)點，例如增 加組織穿透力、與增加其他效應(yīng)子功能的能力結(jié)合的Fc效應(yīng)子功能的不存在、和由較短的 全身體內(nèi)半衰期導(dǎo)致的較少全身性副作用的可能性?？贵w片段的藥代動力學(xué)性質(zhì)表明，它 們可能特別良好地適合于局部治療方法。此外，抗體片段在特定表達(dá)系統(tǒng)中可以比全長抗 體更容易產(chǎn)生。一個類型的抗體片段是單鏈抗體(scFv)，其由經(jīng)由接頭序列綴合的輕鏈可變結(jié)構(gòu) 域與重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh)組成。因此，scFv缺乏所有抗體恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，并且先前的 可變/恒定結(jié)構(gòu)域界面的氨基酸殘基(界面殘基)變成溶劑暴露的。scFv可以通過已建立 的重組改造技術(shù)由全長抗體(例如IgG分子)制備。然而，全長抗體轉(zhuǎn)變成scFv通常導(dǎo)致 蛋白質(zhì)的弱穩(wěn)定性和溶解性、低產(chǎn)量和高聚集趨勢，這增加免疫原性危險。因此，已嘗試改善scFv的性質(zhì)例如溶解性。例如，Nieba, L.等人(Prot. Eng. (1997) 10 =435-444)選擇已知為界面殘基的3個氨基酸殘基且使其突變。他們觀察到突變 的scFv在細(xì)菌中周質(zhì)表達(dá)增加，以及熱誘導(dǎo)聚集速率減小，盡管熱力學(xué)穩(wěn)定性和溶解性未 顯著改變。此外，在他們的公開物中，他們明確地陳述，他們未觀察到改造的scFv的天然蛋 白質(zhì)狀態(tài)的任何溶解性的提高，如通過PEG沉淀法所測定的。其中對scFv內(nèi)的特定氨基酸 殘基進(jìn)行定點誘變的其他研究也已得到報告(參見例如，Tan，P. H.等人(1988)Biophys. J. 75:1473-1482 ；Worn，Α.和 Pluckthun, Α. (1998)Biochem. 37 :13120-13127 ；Worn，Α.和 Pluckthun，A. (1999) Biochem. 38 :8739-8750)。在這些各種研究中，選擇用于誘變的氨基酸 殘基基于其在scFv結(jié)構(gòu)內(nèi)的已知位置(例如，來自分子建模研究)進(jìn)行選擇。在另一種方法中，將來自表達(dá)極弱的scFv的互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)移植到已證實具有 有利性質(zhì)的 scFv 的構(gòu)架區(qū)內(nèi)(Jung, S.和 Pluckthun, Α. (1997)Prot. Eng. 10 :959-966)。 所得到的scFv顯示改善的可溶性表達(dá)和熱力學(xué)穩(wěn)定性。改造scFv以改善溶解性和其他功能性質(zhì)中的進(jìn)展在例如Worn，A.和Pluckthun， A. O001)J.Mol. Biol. 305 :989-1010中綜述。然而，仍需要允許合理設(shè)計免疫結(jié)合劑 (immunobinder)，特別是具有優(yōu)良溶解性的scFv的新方法。此外，仍需要改造scFv和其他 類型的抗體從而賦予改善的溶解性一尤其是天然蛋白質(zhì)的溶解性的方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了在可變重鏈區(qū)VH中包含溶解性增強(qiáng)基序的免疫結(jié)合劑以及改造免 疫結(jié)合劑例如scFv抗體以賦予改善的溶解性的方法。在特定的實施方案中，本發(fā)明的方法 包括用賦予改善的溶解性的優(yōu)選氨基酸殘基置換免疫結(jié)合劑的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可 變區(qū)的序列內(nèi)的對于溶解性潛在有問題的氨基酸。例如，在某些優(yōu)選實施方案中，用親水性殘基置換疏水性殘基。優(yōu)選地，提供的免疫結(jié)合劑，在本發(fā)明的改造方法中使用的或由本發(fā)明的改造方 法產(chǎn)生的免疫結(jié)合劑是scFv，但其他免疫結(jié)合劑例如全長免疫球蛋白、Fab片段、單結(jié)構(gòu)域 抗體(例如Dab)和納米抗體(Nanobody)也可以根據(jù)所述方法進(jìn)行改造。本發(fā)明還包括 根據(jù)改造方法制備的免疫結(jié)合劑，以及包含所述免疫結(jié)合劑和藥學(xué)上可接受的載體的組合 物。在一個方面，本發(fā)明提供了免疫結(jié)合劑，所述免疫結(jié)合劑在重鏈氨基酸位置12、 103和144 (AHo編號)中包含下列溶解性增強(qiáng)基序之一(a)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸⑶；(b)重鏈氨基酸位置103處的絲氨酸⑶；和(c)重鏈氨基酸位置144處的蘇氨酸⑴；或(al)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸⑶；(bl)重鏈氨基酸位置103處的蘇氨酸⑴；和(cl)重鏈氨基酸位置144處的絲氨酸⑶；或(a2)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸⑶；(b2)重鏈氨基酸位置103處的蘇氨酸⑴；和(c2)重鏈氨基酸位置144處的蘇氨酸(T)；或(a3)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸(S)；(b3)重鏈氨基酸位置103處的絲氨酸⑶；和(c3)重鏈氨基酸位置144處的絲氨酸⑶。在另一個方面，本發(fā)明提供了改造免疫結(jié)合劑的方法，免疫結(jié)合劑包含(i)重鏈 可變區(qū)或其片段，其中重鏈可變區(qū)包含Vh構(gòu)架殘基和/或(ii)輕鏈可變區(qū)或其片段，其中 輕鏈可變區(qū)包含\構(gòu)架殘基，所述方法包括A)選擇Vh構(gòu)架殘基、\構(gòu)架殘基或Vh和\構(gòu)架殘基中的至少兩個氨基酸位置以 用于突變；和B)突變選擇用于突變的所述至少兩個氨基酸位置，其中，如果選擇用于突變的所述至少兩個氨基酸位置在Vh構(gòu)架殘基中，那么置換 在選自12、103和144(根據(jù)AHo編號約定)的一個或多個重鏈氨基酸位置上，和/或其中，如果選擇用于突變的一個或多個氨基酸位置在\構(gòu)架殘基中，那么置換在 選自15、52和147(根據(jù)AHo編號約定；在使用Kabat編號的情況下，氨基酸位置15、44和 106)的輕鏈氨基酸位置上。在下文中進(jìn)一步詳細(xì)描述選擇用于突變的所述至少兩個氨基酸位置以及在選擇 的位置處插入的氨基酸殘基。下文中所示的氨基酸位置編號使用AHo編號系統(tǒng)；使用Kabat 編號系統(tǒng)的相應(yīng)位置在本文中進(jìn)一步描述，并且AHo和Kabat編號系統(tǒng)的轉(zhuǎn)換表在下文的 發(fā)明詳述中闡述。使用標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫代碼闡述氨基酸殘基。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在指定的位置上指定的突變的存在增加了免疫結(jié)合劑的總體溶 解性而不對蛋白質(zhì)的其他功能性質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響。例如，在scFv的VH中3個增強(qiáng)溶解性 的突變V12S、L144S和V103T組合的情況下，發(fā)現(xiàn)所述置換占整個scFv的溶解性的約60%。 這與現(xiàn)有技術(shù)中陳述的增加免疫結(jié)合劑的表達(dá)產(chǎn)量的嘗試不同。例如，US 6，815，540描述通過減少鏈內(nèi)結(jié)構(gòu)域間界面區(qū)域中的疏水性對免疫結(jié)合劑進(jìn)行改進(jìn)。為了所述目的，鑒定 了重鏈可變構(gòu)架中的16個位置，所述位置可單獨地用選自10個氨基酸的一個或多個氨基 酸置換。發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的突變體的表達(dá)產(chǎn)量增加。此外，相同的研究組于1999年，即所提及的 美國專利的優(yōu)先權(quán)日期后3年，發(fā)表了論文(參見Jung，S.，Honegger, A.和Pluckthun， Α. (1997)Prot. Eng. 10 :959-966)，該論文陳述，已在幾個研究中報導(dǎo)用更加親水的殘基置 換疏水性表面殘基提高了產(chǎn)量。根據(jù)該作者，產(chǎn)量的增加歸因于正確折疊與錯誤折疊材料 的聚集之間的改善的動力學(xué)分配，同時天然蛋白質(zhì)的溶解性不受影響，其熱力學(xué)穩(wěn)定性也 未受到顯著影響。因此，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說很顯然的是，PlUckthim等人所提及的溶 解性參數(shù)只涉及可溶性表達(dá)而非天然蛋白質(zhì)的總體溶解性。附圖概述當(dāng)考慮本文的下列詳細(xì)描述時，本發(fā)明將得到更好的理解，并且除上文所述的那 些外的目的將變得顯然。此類描述參考附圖，其中

圖1描述了野生型ESBA105 (E105)和其溶解性變體的PEG沉淀溶解性曲線。圖2描述了野生型ESBA105(E105)及其溶解性變體的熱變性曲線圖，如在廣泛溫 度范圍Q5-96°C )下的熱攻擊后測量的。圖3描述了 SDS-PAGE凝膠，其顯示了在熱脅迫條件下溫育2周后各種ESBA105溶 解性突變體的降解行為。圖4描述了 EP43max和其優(yōu)化的變體的熱變性曲線，如通過FIlR分析測定的。圖5描述了 578min-max和578min_max_DHP的熱穩(wěn)定性，如通過FT-IR測量的。圖6a和6b說明了通過硫酸銨沉淀測量的578min_max和578min_max_DHP的溶解性。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于增加免疫結(jié)合劑的溶解性的方法。更具體地，本發(fā)明公開了通過 在免疫結(jié)合劑中引入改善免疫結(jié)合劑的溶解性的氨基酸置換來優(yōu)化免疫結(jié)合劑的方法。本 發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的經(jīng)改造的免疫結(jié)合劑例如scFv。為了可更容易地理解本發(fā)明，首先定義某些術(shù)語。除非另外指出，本文中使用的所 有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員通常理解的意義相同的意義。雖然 與本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本發(fā)明的實踐或試驗中，但下 面描述了適當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧?。本文中提及的所有公開物、專利申請、專利和其他參考資料以 它們的全文通過引用合并入本文。在矛盾的情況下，以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。此外， 材料、方法和實施例只是舉例說明性的而非限定性的。本文中使用的術(shù)語“抗體”是免疫球蛋白的同義詞。根據(jù)本發(fā)明的抗體可以是 完整的免疫球蛋白或其片段，其包括免疫球蛋白的至少一個可變結(jié)構(gòu)域，例如單個可變結(jié) 構(gòu)域，F(xiàn)v (Skerra A.和 Pluckthun，Α. (1988) Science 240 :1038-41)、scFv (Bird, R. Ε.等 人(1988) Science 242 :423-26 ；Huston, J. S.等人(1988 ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 5879-83), Fab, (Fab' ) 2、或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他片段。本文中使用的術(shù)語“抗體構(gòu)架(antibody framework) ”或“構(gòu)架”是指可變結(jié)構(gòu) 域VL或VH的一部分，其用作該可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合環(huán)的支架(Kabat，E.A.等人，(1991) Sequences of proteins ofimmunological interest. NIH Publication 91—3242)。
本文中使用的“抗體⑶R”或“⑶R”是指抗體的互補(bǔ)決定區(qū)，其如Kabat Ε. A.等人， (1991)Sequences of proteins of immunologicalinterest. NIH Publication 91-3242) 定義的由抗原結(jié)合環(huán)組成?？贵wFv片段的兩個可變結(jié)構(gòu)域中的每一個包含例如3個CDR。術(shù)語“單鏈抗體”或“scFv”意指包含通過接頭連接的抗體重鏈可變區(qū)(Vh)和 抗體輕鏈可變區(qū)的分子。此類scFv分子可具有一般結(jié)構(gòu)=NH2-V^接頭-Vh-COOH或 NH2-Vh-接頭-Vl-C00H。如本文中所使用的，“同一性”是指兩個多肽、分子之間或兩個核酸之間匹配的序 列。當(dāng)兩個進(jìn)行比較的序列中的位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據(jù)(例如，如 果兩個DNA分子的每一個中的位置都被腺嘌呤占據(jù)，或兩個多肽的每一個中的位置都被賴 氨酸占據(jù))時，各個分子在該位置上是同一的。兩個序列之間的“百分?jǐn)?shù)同一性”是由這兩 個序列共有的匹配位置的數(shù)目除以進(jìn)行比較的位置的數(shù)目再乘以100的函數(shù)。例如，如果 兩個序列的10個位置中有6個匹配，那么這兩個序列具有60%的同一性。例如，DNA序列 CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(總共6個位置中有3個位置匹配)。通常，在將兩個 序列比對以產(chǎn)生最大同一性時進(jìn)行比較。這樣的比對可通過使用，例如，通過計算機(jī)程序例 如Align程序(DNAstar, Inc.)方便地進(jìn)行的Needleman等(I97O)J. Mol. Biol. 48 :443-453 的方法來提供?！跋嗨频摹毙蛄惺钱?dāng)比對時共有相同和相似氨基酸殘基的序列，其中相似的殘基是 進(jìn)行比對的參照序列中的相應(yīng)氨基酸殘基的保守置換。在這點上，參照序列中的殘基的“保 守置換”是用在物理或功能上與相應(yīng)的參照殘基相似(例如具有相似大小、形狀、電荷、化 學(xué)性質(zhì)，包括形成共價鍵或氫鍵的能力等)的殘基進(jìn)行的置換。因此，“經(jīng)保守置換修飾的” 序列是與參照序列或野生型序列相異在于存在一個或多個保守置換的序列。兩個序列之間 的“百分?jǐn)?shù)相似性”是包含由兩個序列共有的匹配殘基或保守置換的位置的數(shù)目除以進(jìn)行 比較的位置的數(shù)目再乘以因子100的函數(shù)。例如，如果兩個序列的10個位置中有6個匹配 以及10個位置中有2個包含保守置換，那么這兩個序列具有80%的正相似性。本文中使用的“氨基酸共有序列”是指可使用至少兩個，優(yōu)選更多的進(jìn)行比對的氨 基酸序列的矩陣產(chǎn)生的氨基酸序列(允許在比對中出現(xiàn)缺口)，其使得可能確定各位置上 出現(xiàn)頻率最高的氨基酸殘基。共有序列是包含在各位置上出現(xiàn)頻率最高的氨基酸的序列。 如果兩個或更多個氨基酸等同地出現(xiàn)在單個位置上，那么共有序列包括兩個或所有此類氨 基酸?？稍诓煌缴戏治龅鞍踪|(zhì)的氨基酸序列。例如，可在單個殘基水平、多個殘基水 平、具有缺口的多個殘基水平等上展示保守性或變異性。殘基可展示相同殘基的保守性或 可在種類水平上保守。氨基酸種類的實例包括具有下列的氨基酸種類極性的但不帶電荷 的側(cè)鏈或R基團(tuán)(絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)；帶正電荷的R基團(tuán)(賴氨酸、精 氨酸和組氨酸)；帶負(fù)電荷的R基團(tuán)(谷氨酸和天冬氨酸)；疏水R基團(tuán)(丙氨酸、異亮氨 酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸和酪氨酸)；以及特殊氨基酸種類(半胱氨 酸、甘氨酸和脯氨酸)。其他種類對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的并且可使用結(jié)構(gòu)測定法 或其他數(shù)據(jù)來定義以估量可置換性。在該意義上，可置換的氨基酸可以指可在該位置上進(jìn) 行置換并且保持功能保守性的任何氨基酸。然而，將認(rèn)識到，相同種類的氨基酸在它們的生物物理性質(zhì)上可具有一定程度的不同。例如，將認(rèn)識到，某些疏水性R基團(tuán)(例如，丙氨酸、絲氨酸或蘇氨酸)比其他疏水 性R基團(tuán)(例如，纈氨酸或亮氨酸)更加親水(即，具有更高的親水性或更低的疏水性)。 相對親水性或疏水性可使用本領(lǐng)域公知的方法(參見，例如，Rose等人，Science, 229 834-838(1985)和 Cornette 等人，J Mol. Biol, 195 :659-685(1987))來測定。如本文中所使用的，當(dāng)一個氨基酸序列(例如，第一 ￥11或八序列)與一個或多個 另外的氨基酸序列(例如，數(shù)據(jù)庫中的一個或多個VH或VL序列)比對時，可將一個序列 (例如，第一 Vh或\序列)中的氨基酸位置與一個或多個另外的氨基酸序列中的“相應(yīng)位 置”相比較。如本文中所使用的，“相應(yīng)位置”表示當(dāng)對序列進(jìn)行最優(yōu)比對時，即當(dāng)序列進(jìn)行 比對以獲得最高百分?jǐn)?shù)同一性或百分?jǐn)?shù)相似性時進(jìn)行比較的序列中的等同位置。如本文中所使用的，術(shù)語“抗體數(shù)據(jù)庫”是指兩個或更多個抗體氨基酸序列(“多 個”序列)的集合，通常是指數(shù)十個、數(shù)百個或甚至數(shù)千個抗體氨基酸序列的集合?？贵w數(shù) 據(jù)庫可存儲例如抗體Vh區(qū)、抗體\區(qū)或兩者的集合的氨基酸序列，或可存儲由Vh和\區(qū)域 組成的scFv序列的集合。優(yōu)選，可將數(shù)據(jù)庫存儲在可檢索的、固定的介質(zhì)中，例如計算機(jī)上 可檢索的計算機(jī)程序中。在一個實施方案中，抗體數(shù)據(jù)庫是包含或由種系抗體序列組成的 數(shù)據(jù)庫。在另一個實施方案中，抗體數(shù)據(jù)庫是包含或由成熟(即，表達(dá)的)抗體序列組成的 數(shù)據(jù)庫(例如，成熟抗體序列的Kabat數(shù)據(jù)庫，例如KBD數(shù)據(jù)庫)。在另一個實施方案中，抗 體數(shù)據(jù)庫包含或由功能性選擇的序列(例如，根據(jù)QC測定選擇的序列)組成。術(shù)語“免疫結(jié)合劑”是指分子，所述分子包含抗體的全部或部分抗原結(jié)合位置，例 如重鏈和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的全部或一部分，這樣免疫結(jié)合劑能夠特異性識別靶抗原。 免疫結(jié)合劑的非限定性實例包括全長免疫球蛋白分子和scFv，以及抗體片段，包括但不限 于(i)Fab片段，由\、VH、Cl和ChI結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)F(ab' )2片段，包含通 過鉸鏈區(qū)上的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段，(iii)Fab'片段，其基本上是具有 鉸鏈區(qū)的一部分的 Fab (參見，F(xiàn)UNDAMENTALIMMUNOLOGY(Paul 編輯，3. sup. rd ed. 1993)； (iv)由Vh和ChI結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(ν)包含抗體的單臂的\和Vh結(jié)構(gòu)域的Fv片 段；(vi)單結(jié)構(gòu)域抗體例如Dab片段(Ward等人，(1989)Nature 341 :544-546)，其由Vh 或 Vl 結(jié)構(gòu)域組成，Camelid(參見 Hamers-Casterman，等人，Nature 363 :446-448(1993) 和 Dumoulin 等人，Protein Sciencell :500-515(2002))或 Shark 抗體(例如，shark Ig-NARs Nanobodie S )；和(Vii)納米抗體(Nanobody)，包含單個可變結(jié)構(gòu)域和兩個 恒定結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)。如本文中所使用的，術(shù)語“功能性質(zhì)”是例如為了提高多肽的生產(chǎn)性質(zhì)或治療功 效，其提高(例如相對于常規(guī)多肽)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是期望的和/或有利的多肽 (例如，免疫結(jié)合劑)的性質(zhì)。在一個實施方案中，功能性質(zhì)是穩(wěn)定性(例如，熱穩(wěn)定性)。 在另一個實施方案中，功能性質(zhì)是溶解性(例如，在細(xì)胞條件下)。在另一個實施方案中，功 能性質(zhì)是聚集行為。在另一個實施方案中，功能性質(zhì)是蛋白質(zhì)表達(dá)(例如，在原核細(xì)胞中)。 在另一個實施方案中，功能性質(zhì)是在相應(yīng)的純化方法中內(nèi)含體溶解后的重折疊效率。在某 些實施方案中，抗原結(jié)合親和力不是期望提高的功能性質(zhì)。在另一個實施方案中，功能性質(zhì) 的提高或改善不牽涉抗原結(jié)合親和力的顯著改變。術(shù)語“溶解性”，如本文中所使用的，是指天然蛋白質(zhì)，即單體、非聚集的和 功能性免疫結(jié)合劑的溶解性?！霸黾拥娜芙庑浴币庵柑烊坏鞍踪|(zhì)的溶解性的提高，其優(yōu)選通過下列方法中的至少一個方法測定PEG沉淀法、硫酸銨沉淀法、重折疊得率 或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他測定溶解性的方法。PEG沉淀法是如Atha等人 在〃 Mechanism ofPrecipitation of Proteins by Polyethylene Glycols" , JBC,256 12108-12117(1981)中描述的方法?？梢岳缛缦逻M(jìn)行硫酸銨沉淀法制備20mg/ml蛋白 質(zhì)溶液的10 μ 1等分，向每一個所述等分中加入10 μ 1不同飽和度(例如35% ,33^^31%、 ^^^25^^20^^0 15%)的(NH4)2SO4溶液，然后渦旋5秒并在室溫下溫育30分鐘。在以 6000rpm于4°C離心30分鐘后，測定上清液中的蛋白質(zhì)濃度。在該方法中，不同蛋白質(zhì)的比 較物(comparator)是V50值，其是50%的蛋白質(zhì)沉淀時所處的(NH4) 2S04飽和度的百分?jǐn)?shù)。 根據(jù)上清液中測定的可溶性蛋白質(zhì)對應(yīng)用的(NH4)2SO4飽和度的百分?jǐn)?shù)的曲線測定V50。重 折疊得率相應(yīng)于在相應(yīng)制造/純化方法中從溶解的內(nèi)含體獲得的正確折疊的蛋白質(zhì)的百 分?jǐn)?shù)。本文中使用的術(shù)語溶解性不是指可溶性表達(dá)。具有提高的溶解性的免疫結(jié)合劑在第一方面，提供免疫結(jié)合劑，其在重鏈氨基酸位置12、103和144 (AHo編號)中 包含下列溶解性增強(qiáng)基序之一(a)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸(S)；(b)重鏈氨基酸位置103處的絲氨酸⑶；和(c)重鏈氨基酸位置144處的蘇氨酸⑴；或(al)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸(S)；(bl)重鏈氨基酸位置103處的蘇氨酸(T)；和(cl)重鏈氨基酸位置144處的絲氨酸⑶；或(a2)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸(S)；(b2)重鏈氨基酸位置103處的蘇氨酸⑴；和(c2)重鏈氨基酸位置144處的蘇氨酸⑴；或(a3)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸(S)；(b3)重鏈氨基酸位置103處的絲氨酸⑶；和(c3)重鏈氨基酸位置144處的絲氨酸⑶；或令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在指定位置上指定的氨基酸的存在增加了完整免疫結(jié)合劑的總 體溶解性。例如，在scFv的VH中3個溶解性增強(qiáng)突變V12S、L144S和V103T組合的情況下， 發(fā)現(xiàn)所述置換占完整scFv的溶解性的大約60%。因為疏水斑塊在所有免疫結(jié)合劑的可變 結(jié)構(gòu)域中是保守的，因此一個或多個指定位置上的置換可用于提高任何免疫結(jié)合劑的溶解 性。免疫結(jié)合劑優(yōu)選是scFv抗體、全長免疫球蛋白、Fab片段、Dab或納米抗體。在優(yōu)選實施方案中，免疫結(jié)合劑還包含選自下列的一個或多個氨基酸(a)輕鏈 氨基酸位置31處的天冬氨酸(D)、(b)輕鏈氨基酸位置83處的谷氨酸(E)、(c)重鏈氨基 酸位置43處的精氨酸(R)、(d)重鏈氨基酸位置67處的亮氨酸(L)和(e)重鏈氨基酸位置 78處的丙氨酸(A)。一個或多個指定的氨基酸在相應(yīng)位置上的存在賦予免疫結(jié)合劑增強(qiáng)的 穩(wěn)定性。本文中指定的氨基酸可存在于天然發(fā)生的免疫結(jié)合劑或其衍生物中，或免疫結(jié)合 劑可被改造而摻入一個或多個上述氨基酸。
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在優(yōu)選實施方案中，本文中公開的免疫結(jié)合劑特異性結(jié)合人TNF α或人VEGF。具有提高的溶解性的免疫結(jié)合劑的改造如實施例中詳細(xì)描述的，本文中描述的基于序列的方法已成功用于鑒定賦予提高 的溶解性的特定氨基酸殘基置換。實施例列出了在免疫結(jié)合劑(例如，scFv)的VH區(qū)內(nèi)和 任選地VL區(qū)中在確定的氨基酸位置處的示例性和優(yōu)選氨基酸置換。示例性置換包括氨基 酸位置處有問題的氨基酸殘基(例如，暴露于溶劑的疏水性殘基)的置換(更親水并且在 數(shù)據(jù)庫(例如，成熟抗體(KDB)數(shù)據(jù)庫)中以更高的頻率發(fā)生)。特別優(yōu)選的置換是比有問 題的殘基更親水的最頻繁發(fā)生的殘基。在其他實施方案中，更加親水的氨基酸選自丙氨酸 (A)、絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)。因此，本發(fā)明提供了其中將一個或多個特定氨基酸置換引入免疫結(jié)合劑例如scFv 抗體內(nèi)的改造方法。此種置換可以使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法例如定點誘變、PCR介導(dǎo)的誘 變等來進(jìn)行。如實施例中所示，下列氨基酸位置已被鑒定為有問題的氨基酸(即，所謂的“疏水 斑塊”)以用于在指定的Vh或\序列中進(jìn)行改造Vh 氨基酸位置 2、4、5、12、103 和 144 ；和Vl 氨基酸位置15,52和147。使用的編號是AHo編號系統(tǒng)；將AHo編號轉(zhuǎn)換成Kabat系統(tǒng)編號的轉(zhuǎn)換表示于表 1禾口 2中。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，VH位置12、103、144(根據(jù)AHo編號系統(tǒng))中的兩個或更多個位 置處的置換影響整個免疫結(jié)合劑的總體溶解性。因為疏水斑塊在所有免疫結(jié)合劑的可變結(jié) 構(gòu)域中是保守的，因此至少兩個在指定的位置處的置換可用于提高任何免疫結(jié)合劑的溶解 性。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了改造免疫結(jié)合劑例如scFv抗體的方法，其中在 一個或多個上述鑒定的氨基酸位置處產(chǎn)生至少兩個氨基酸置換，從而產(chǎn)生免疫結(jié)合劑的變 異(即，突變)形式。因此，在另一個方面，本發(fā)明提供了改造免疫結(jié)合劑的方法，所述方法包括A)在Vh區(qū)、八區(qū)或Vh和\區(qū)內(nèi)選擇至少兩個氨基酸位置用于突變；和B)突變選擇用于突變的至少兩個氨基酸位置，其中如果選擇用于突變的所述至少兩個氨基酸位置位于中，那么置換是選自 12、103和144(根據(jù)AHo編號約定；在使用Kabat編號的情況下，氨基酸位置11、89和108) 的至少兩個重鏈氨基酸位置，和/或其中如果選擇用于突變的一個或多個氨基酸位置在&區(qū)中，那么置換在選自15、 52和147(根據(jù)AHo編號約定；在使用Kabat編號的情況下，氨基酸位置15、44和106)的 輕鏈氨基酸位置處。在某些實施方案中，氨基酸位置被疏水性氨基酸(例如，亮氨酸(L)或纈氨酸(V)) 占據(jù)。在一個實施方案中，重鏈氨基酸位置12處的氨基酸是纈氨酸(V)。在另一個實施方 案中，重鏈氨基酸位置103處的氨基酸是纈氨酸(V)。在另一個實施方案中，重鏈氨基酸位 置144處的氨基酸是亮氨酸(L)。在另一個實施方案中，輕鏈氨基酸位置15處的氨基酸是 纈氨酸(V)。在另一個實施方案中，輕鏈氨基酸位置52處的氨基酸是苯丙氨酸(F)。在另一個實施方案中，輕鏈氨基酸位置147處的氨基酸是纈氨酸(V)。優(yōu)選，突變是用更親水的氨基酸置換選擇的氨基酸位置處的氨基酸。在其他實施 方案中，更親水的氨基酸選自絲氨酸( 或蘇氨酸(T)。在某些實施方案中，所述方法包括a)在免疫結(jié)合劑中選擇至少兩個氨基酸位置 用于突變；和b)突變選擇用于突變的至少兩個氨基酸位置，其中突變包括選自下列的至少 兩個置換(i)重鏈氨基酸位置12 (使用AHo編號)(在使用Kabat編號的情況下，位置11) 處的絲氨酸⑶；(ii)重鏈氨基酸位置103 (使用AHo編號)(在使用Kabat編號的情況下，位置89) 處的絲氨酸⑶或蘇氨酸⑴；和(iii)重鏈氨基酸位置144(使用AHo編號)(在使用Kabat編號的情況下，位置 108)處的絲氨酸(S)或蘇氨酸(T)。在非常優(yōu)選的實施方案中，重鏈氨基酸位置12、103和144中的至少一個是蘇氨酸 ⑴。在其他實施方案中，突變包括在輕鏈氨基酸位置15 (使用AHo或Kabat編號)處 使用蘇氨酸(T)的置換和/或在輕鏈氨基酸位置147 (使用AHo編號)(在使用Kabat編號 約定的情況下，位置106)處使用丙氨酸(A)的置換。在其他實施方案中，突變導(dǎo)致溶解性增加至少2倍(例如，溶解性增加2倍、2. 5 倍、3倍、3. 5倍、4倍或更多倍)。在另一個實施方案中，免疫結(jié)合劑的熱穩(wěn)定性、重折疊、表達(dá)產(chǎn)量、聚集和/或結(jié) 合活性未受到突變的不利影響。在某些實施方案中，突變還包括一個或多個選自下列的在氨基酸位置(AHo編號 約定)處的穩(wěn)定性突變(a)輕鏈氨基酸位置31處的天冬氨酸(D) ； (b)輕鏈氨基酸位置83 處的谷氨酸(E) ； (c)重鏈氨基酸位置43處的精氨酸(I ) ； (d)重鏈氨基酸位置67處的亮氨 酸(L)；和(e)重鏈氨基酸位置78處的丙氨酸(A)。已證明此類突變對免疫結(jié)合劑的穩(wěn)定 性具有影響。在另一個方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的方法制備的免疫結(jié)合劑。在某些示例性實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法改造的免疫結(jié)合劑是本領(lǐng)域公認(rèn)的 免疫結(jié)合劑(其結(jié)合具有治療重要性的靶抗原)或包含來源于具有治療重要性的免疫結(jié) 合劑的可變區(qū)(VL和/或VH區(qū))或一個或多個CDR(例如，CDRLU CDRL2、CDRL3、CDRHU CDRH2和/或CDRH3)的免疫結(jié)合劑。例如，目前由FDA或其他管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的免疫結(jié)合劑 可以根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行改造。更具體而言，這些示例性免疫結(jié)合劑包括但不限于，抗 CD3 抗體例如莫羅單抗(Orthoclone 0KT3 Johnson&Johnson, Brunswick, NJ;參見 Arakawa 等人 J. Biochem，(1996) 120 :657-662 ；Kung 和 Goldstein 等人，Science (1979)， 206 =347-349)、抗 CDll 抗體例如依法珠單抗(Raptiva , Genentech, South San Francisco, CA)、抗 CD20 抗體例如利妥昔單抗(Ri tUXan /Mabthera , Genentech， South San Francisco，CA)、托西莫單抗(Bexxar ,GlaxoSmithKline,London)或替伊莫 單抗(Zeval in , Biogen I dec, Cambridge ΜΑ)(參見美國專利 5，736，137 ；6, 455, 043 ； 和 6，682，734)、抗0)25(11^21^)抗體例如達(dá)克珠單抗(Zenapax , Roche，Basel，Switzerland)或巴利昔單抗(Simulect , Novartis, Basel, Switzerland)、抗 CD33 抗體例如吉妥珠單抗(Mylotarg ，Wyeth，Madison, NJ-參見美國專利5，714，350和 6，350, 861)、抗 CD52 抗體例如阿侖珠單抗(Campath , Millennium Pharmacueticals, Cambridge, ΜΑ)、抗 GpIIb/glla 抗體例如阿昔單抗(ReoPro ，Centocor，Horsham, PA)、 抗TNF α抗體例如英利昔單抗(Remi cade ,Centocor，Horsham, PA)或阿達(dá)木單抗 (Humi ra , Abbott, AbbottPark，IL-參見美國專利 6，258，562)、抗 IgE 抗體例如奧馬 珠單抗(Xolair , Genentech，South San Francisco，CA)、抗 RSV 抗體例如帕利珠單抗 (Synag iS ，Medimmune，Gaithersburg, MD-參見美國專利 5,824，307)、抗 EpCAM 抗體 例如依決洛單抗(Panorex ,Centocor)、抗EGFR抗體例如西妥昔單抗(Erbitux , ImcloneSystems, New York, NY)或中白木單抗(VeCt ibix , Amgen, ThousandOaks, CA)、 抗HER2/neu抗體例如曲妥珠單抗(Hercept in , Genentech)、抗α 4整聯(lián)蛋白抗體例 如那他珠單抗(Tysabri ,Biogenidec)、抗C5抗體例如依庫珠單抗(Soliris , AlexionPharmaceuticals, Chesire, CT)和抗 VEGF 抗體例如貝伐珠單抗(Avast in , Genentech-參見美國專利 6,884,879)或雷珠單抗(Lucent i S , Genentech)。在某些示例性實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法改造的免疫結(jié)合劑是上述本領(lǐng)域公 認(rèn)的免疫結(jié)合劑。在優(yōu)選實施方案中，免疫結(jié)合劑是scFv抗體。在其他實施方案中，免疫 結(jié)合劑是例如全長免疫球蛋白、Dab、納米抗體或Fab片段。盡管描述了前述內(nèi)容，但在多種實施方案中，某些免疫結(jié)合劑被排除用于本發(fā)明 的改造方法和/或被排除成為通過改造方法產(chǎn)生的免疫結(jié)合劑組合物。例如，在多種實施 方案中，存在附帶條件，即免疫結(jié)合劑不是PCT公開號WO 2006/131013和WO 2008/006235 中公開的任何scFv抗體或其變體，例如，PCT公開號WO 2006/131013和W02008/006235中 公開的ESBA105或其變體，所述專利各自的內(nèi)容明確地通過引用合并入本文。優(yōu)選，本文中公開的、用于本文中公開的方法的或通過本文中公開的方法產(chǎn)生的 免疫結(jié)合劑分別是scFv抗體，但也包括其他免疫結(jié)合劑，例如全長免疫球蛋白、Fab片段或 本文中描述的任何其他類型的免疫結(jié)合劑(例如Dab或納米抗體)。在優(yōu)選實施方案中，本文中公開的、用于本文中公開的方法的或通過本文中公開 的方法產(chǎn)生的免疫結(jié)合劑分別特異性結(jié)合人TNF α或人VEGF。本發(fā)明還包括包含本文中公開的免疫結(jié)合劑和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。scFv組合物和制劑本發(fā)明的另一個方面涉及按照本發(fā)明的方法制備的scFv組合物。因此，本發(fā)明提 供了經(jīng)改造的scFv組合物，其中與原始的目的scFv相比，已將一個或多個溶解性增強(qiáng)突變 導(dǎo)入氨基酸序列，其中突變已被導(dǎo)入疏水氨基酸殘基的位置。在一個實施方案中，scFv已 進(jìn)行了改造，從而包含一個突變的氨基酸位置(例如，一個構(gòu)架位置)。在其他實施方案中， scFv已進(jìn)行了改造，從而包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10個突變的氨基酸位置(例如， 構(gòu)架位置)。在某些實施方案中，突變還包括于2008年6月25日提交的、名稱為“Methods of Modifying Antibodies, and Modified Antibodieswith Improved Functional Properties”的 PCT 申請 PCT/CH2008/000285 或 2008 年 3 月 12 日提交的、名稱為“MethodsofModifying Antibodies, and Modified Antibodies with ImprovedFunctional !Properties”的美國臨時申請?zhí)栂盗刑?1/069，056(兩者通過引用合并入本文)中所述的 一個或多個穩(wěn)定性突變。例如，免疫結(jié)合劑還可包含選自下列的在氨基酸位置(AHo編號約 定)處的置換(a)輕鏈氨基酸位置31處的天冬氨酸(D) ； (b)輕鏈氨基酸位置83處的谷氨 酸(E) ； (c)重鏈氨基酸位置43處的精氨酸(R) ； (d)重鏈氨基酸位置67處的亮氨酸(L)； 和(e)重鏈氨基酸位置78處的丙氨酸(A)。一個或多個在指定位置處的突變對整個免疫結(jié) 合劑的總體溶解性具有影響。在其他實施方案中，突變還包括下列穩(wěn)定性突變(AHo編號約 定)(a)輕鏈氨基酸位置31處的天冬氨酸⑶；(b)輕鏈氨基酸位置83處的谷氨酸(E)； (c)重鏈氨基酸位置43處的精氨酸(R) ； (d)重鏈氨基酸位置67處的亮氨酸(L)；和(e)重 鏈氨基酸位置78處的丙氨酸(A)。本發(fā)明的另一個方面涉及本發(fā)明的SCFv組合物的藥物制劑。此類制劑通常包含 scFv組合物和藥學(xué)上可接受的載體。如本文中所使用的，“藥學(xué)上可接受的載體”包括生理 上相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。優(yōu) 選，載體適合于例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、胃腸外、脊柱、表皮施用(例如，通過注射或輸注)、 或局部施用(例如，至眼或皮膚)。取決于施用途徑，可將scFv包被在材料中以保護(hù)化合物 免受酸的作用和可使化合物失活的其他天然條件的損害。本發(fā)明的藥物化合物可包括一種或多種藥學(xué)上可接受的鹽?！八帉W(xué)上可接受的鹽” 是指保持親本化合物期望的生物學(xué)活性并且不提供任何不想要的毒理學(xué)效應(yīng)的鹽(參見 例如，Berge，S. Μ.等人(1977) J. Pharm. Sci. 66 :1-19)。此類鹽的實例包括酸加成鹽和堿加 成鹽。酸加成鹽包括從無毒無機(jī)酸例如鹽酸、硝酸、磷酸(phosphoric)、硫酸(sulfuric)、 氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸(phosphorous)等衍生的鹽，以及從無毒有機(jī)酸例如脂肪族一羧酸 和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸等衍生的鹽。堿 加成鹽包括從堿土金屬例如鈉、鉀、鎂、鈣等衍生的鹽，以及從無毒有機(jī)胺例如N，N' - 二芐 基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等衍生的鹽。本發(fā)明的藥物組合物還可包含藥學(xué)上可接受的抗氧化劑。藥學(xué)上可接受的抗氧 化劑的實例包括(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸 鈉(sodium metabisulfite)、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑例如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁 羥基茴香醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α -生育酚等；和(3)金屬螯合 劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等?？捎糜诒景l(fā)明的藥物組合物的適當(dāng)?shù)乃院头撬暂d體的實例包括水、乙醇、多 元醇(例如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等)和其適當(dāng)?shù)幕旌衔?，植物油例如橄欖油，和可注?的有機(jī)酯例如油酸乙酯?？梢岳缤ㄟ^使用包衣材料例如卵磷脂、在分散體的情況下通過 維持需要的顆粒大小和通過使用表面活性劑維持恰當(dāng)?shù)牧鲃有?。此類組合物還可包含佐劑例如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑。可通過滅菌方法 (同上)和通過包含各種抗菌劑和抗真菌劑例如對羥基苯甲酸酯(paraben)、氯丁醇、苯酚、 山梨酸等來確保防止微生物的存在。也可期望將等滲劑例如糖、氯化鈉等包含入組合物。 此外，可通過包含延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠來獲得可注射藥物形式的延長吸 收。藥學(xué)上可接受的載體包括無菌水溶液或分散體以及用于臨時制備無菌注射液或
13分散體的無菌粉劑。此類介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)的用途在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。除非 任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容，否則預(yù)期其在本發(fā)明的藥物組合物中的用途。 還可將補(bǔ)充的活性化合物摻入組合物。治療性組合物通常必須是無菌的并且在生產(chǎn)和貯存的條件下是穩(wěn)定的?？蓪⒔M合 物配制為溶液、微乳劑、脂質(zhì)體或適合高藥物濃度的其他有序結(jié)構(gòu)。載體可以是包含例如 水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇和液體聚乙二醇等)和其適當(dāng)?shù)幕旌衔锏娜軇┗蚍?散介質(zhì)。可以例如通過使用包衣例如卵磷脂、在分散體的情況下通過維持需要的顆粒大小 和通過使用表面活性劑來維持恰當(dāng)?shù)牧鲃有浴Ｔ谠S多情況下，優(yōu)選在組合物中包含等滲劑， 例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨糖醇或氯化鈉。可通過在組合物中包含延遲吸收的試劑例 如單硬脂酸鹽和明膠來獲得可注射組合物的延長的吸收。無菌注射液可通過將活性化合物以需要的量與上面例舉的成分的一種或組合一 起摻入適當(dāng)?shù)娜軇┲?，然后進(jìn)行滅菌微過濾(如果需要的話)來制備。通常，通過將活性化 合物摻入包含基本分散介質(zhì)和需要的來自上面列舉的成分的其他成分的無菌媒介物來制 備分散體。在用于制備無菌注射液的無菌粉劑的情況下，制備的優(yōu)選方法是從之前無菌過 濾的溶液產(chǎn)生包含活性成分和任何額外的期望的成分的粉劑的真空干燥和冷凍干燥(凍 干法(Iyophilization)) ο可與載體材料組合從而產(chǎn)生單個劑型的活性成分的量將隨正在治療的受試者以 及施用的特定模式的變化而變化?？膳c載體材料組合從而產(chǎn)生單個劑型的活性成分的量 通常是產(chǎn)生治療效果的組合物的量。一般地，除百分之百外，該量將在大約0. 01 %至大約 99 %的活性成分，優(yōu)選大約0. 1 %至大約70 %，最優(yōu)選大約1 %至大約30 %的活性成分的范 圍內(nèi)(與藥學(xué)上可接受的載體組合)。調(diào)整給藥方案以提供最佳的期望的應(yīng)答(例如，治療應(yīng)答)。例如，可施用單個大 丸劑，可在一段時間內(nèi)施用幾份分開的劑量或可根據(jù)治療狀況的緊急性的需要，按比例減 少或增加劑量。特別有利地以單位劑型(dosage unit form)配制胃腸外組合物以便施用和 保持劑量均一。本文中使用的單位劑型是指適合用作用于待治療的受試者的單份劑量的物 理上分開的單位；各單位包含經(jīng)計算與需要的藥物載體一起產(chǎn)生期望的治療效果的預(yù)先確 定量的活性化合物。本發(fā)明的單位劑型的規(guī)格(specification)受制于和直接取決于(a) 活性化合物的獨特特征和要獲得的具體治療效果，和(b)配制用于治療個體的敏感性的此 類活性化合物的領(lǐng)域中固有的限制?？贵w位置編號系統(tǒng)提供了用于鑒定抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)中的氨基酸殘基位置的兩個不同編號系 統(tǒng)的換算表。Kabat編號系統(tǒng)進(jìn)一步描述于Kabat等人(Kakit，E. Α.，等人(1991) kquences of Proteins of Immunologicallnterest,第5版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)。AHo 編號系統(tǒng)進(jìn)一步描述于 Honegger，A.和 Pluck thun, Α. (2001) J. Mol. Biol. 309 :657-670)。重鏈可變區(qū)編號表1 重鏈可變結(jié)構(gòu)域中殘基位置的換算表
權(quán)利要求
1.一種免疫結(jié)合劑，其包含重鏈氨基酸位置12、103和144 (AHo編號)中的下列溶解性 增強(qiáng)基序之一(a)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸(S)；(b)重鏈氨基酸位置103處的絲氨酸(S)；和(c)重鏈氨基酸位置144處的蘇氨酸(T)；或 (al)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸(S)； (bl)重鏈氨基酸位置103的蘇氨酸(T)；和 (cl)重鏈氨基酸位置144處的絲氨酸(S)；或 (a2)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸(S)； (b2)重鏈氨基酸位置103處的蘇氨酸(T)；和 (c2)重鏈氨基酸位置144處的蘇氨酸(T)；或 (a3)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸(S)； (b3)重鏈氨基酸位置103處的絲氨酸(S)；和 (c3)重鏈氨基酸位置144處的絲氨酸(S)。
2.權(quán)利要求1的免疫結(jié)合劑，其還包含(a)輕鏈氨基酸位置31處的天冬氨酸(D)；(b)輕鏈氨基酸位置83處的谷氨酸(E)；(c)重鏈氨基酸位置43處的精氨酸(R)；(d)重鏈氨基酸位置67處的亮氨酸(L)；和/或(e)重鏈氨基酸位置78處的丙氨酸(A)。
3.增強(qiáng)免疫結(jié)合劑的溶解性的方法，所述免疫結(jié)合劑包含重鏈可變(Vh)區(qū)或其片段， 所述方法包括A)在Vh區(qū)中選擇至少兩個氨基酸位置用于突變；和B)突變選擇用于突變的所述至少兩個氨基酸位置，其中所述至少兩個氨基酸位置選自由12、103和144(根據(jù)AHo編號約定)組成的重鏈 氨基酸位置，并且突變包括用親水性氨基酸置換所選擇的氨基酸位置處的氨基酸。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述親水性氨基酸是(a)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸⑶；(b)重鏈氨基酸位置103處的絲氨酸( 或蘇氨酸(T)；和/或(c)重鏈氨基酸位置144處的絲氨酸( 或蘇氨酸(T)。
5.權(quán)利要求3或4的方法，其中選擇用于突變的氨基酸位置處的氨基酸是疏水性氨基酸。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述疏水性氨基酸是亮氨酸(L)或纈氨酸(V)。
7.權(quán)利要求3至6的任一項的方法，其中(a)重鏈氨基酸位置12處的選擇用于突變的氨基酸是纈氨酸(V)；(b)重鏈氨基酸位置103處的選擇用于突變的氨基酸是纈氨酸(V)；和(c)重鏈氨基酸位置144處的選擇用于突變的氨基酸是亮氨酸(L)。
8.權(quán)利要求3至7的任一項的方法，其中免疫結(jié)合劑的熱穩(wěn)定性、重折疊、表達(dá)產(chǎn)量、聚 集和/或結(jié)合活性未受到突變的不利影響。
9.權(quán)利要求3至8的任一項的方法，其中所述突變導(dǎo)致溶解性增加至少2倍。
10.權(quán)利要求3至9的任一項的方法，其中所述突變還包括在選自下列的氨基酸位置 (AHo編號約定)處引入一個或多個突變的步驟(a)輕鏈氨基酸位置31處的天冬氨酸(D)；(b)輕鏈氨基酸位置83處的谷氨酸(E)；(c)重鏈氨基酸位置43處的精氨酸(R)；(d)重鏈氨基酸位置67處的亮氨酸(L)；和(e)重鏈氨基酸位置78處的丙氨酸(A)。
11.根據(jù)權(quán)利要求3至10的任一項的方法制備的免疫結(jié)合劑。
12.權(quán)利要求1、2或11的任一項的免疫結(jié)合劑，其為scFv抗體、全長免疫球蛋白、Fab 片段、Dab或納米抗體。
13.權(quán)利要求1、2、11或12的任一項的免疫結(jié)合劑，其中所述免疫結(jié)合劑特異性結(jié)合人 TNFa 或人 VEGF。
14.包含權(quán)利要求1、2、11、12或14的任一項的免疫結(jié)合劑和藥學(xué)上可接受的載體的組 合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了使用基于序列的分析和合理的策略來提高免疫結(jié)合劑，特別是單鏈抗體(scFv)的溶解性的方法。本發(fā)明提供了改造免疫結(jié)合劑，特別是scFv的方法，其中用通過分析選擇的穩(wěn)定scFv序列的數(shù)據(jù)庫而鑒定的親水性殘基進(jìn)行一個或多個置換。本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的改造方法制備的具有優(yōu)化的溶解性的免疫結(jié)合劑。
文檔編號C07K16/22GK102076715SQ200980123815
公開日2011年5月25日 申請日期2009年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月25日
發(fā)明者D·厄里什, L·波拉斯 申請人:艾斯巴技術(shù),愛爾康生物醫(yī)藥研究裝置有限責(zé)任公司