專利名稱：：6－氨基己酸的生物化學(xué)合成的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及對(duì)6-氨基己酸(6-aminocaproicacid)進(jìn)行生物化學(xué)合成的新方法。6-氨基己酸在下文中也被稱為6-ACA?；衔?-氨基己酸(IUPAC名稱6-氨基-己酸，6-amino-hexanoicacid)是生產(chǎn)ε-己內(nèi)酰胺(下文中簡(jiǎn)稱為己內(nèi)酰胺)的可能的中間產(chǎn)物，這是生產(chǎn)尼龍-6的基礎(chǔ)。另一方面，6-氨基己酸還可通過己內(nèi)酰胺的水解形成。己內(nèi)酰胺是散裝化學(xué)物質(zhì)，其在世界范圍內(nèi)以非常大的規(guī)模被制造。用于對(duì)己內(nèi)酰胺進(jìn)行工業(yè)制造的基礎(chǔ)化學(xué)物質(zhì)通常是散裝化學(xué)物質(zhì)，例如，苯、環(huán)己烷、環(huán)己酮等，從它們可以制得環(huán)己酮肟，然后其再通過所謂的Beckmann重排轉(zhuǎn)化為己內(nèi)酰胺。但是，在回收尼龍-6地毯廢料時(shí)，例如，6-氨基己酸(以及在對(duì)尼龍-6的去聚合化步驟中形成的一些其它產(chǎn)物)可被用于通過環(huán)化反應(yīng)合成己內(nèi)酰胺。在對(duì)尼龍-6的工業(yè)回收中，生產(chǎn)己內(nèi)酰胺通常是最后的合成步驟。6-氨基己酸(6-ACA)因此適合用于合成己內(nèi)酰胺，以及隨后的對(duì)尼龍-6的生產(chǎn)。但是，6-ACA還可直接用作為生產(chǎn)尼龍-6的原材料。對(duì)于6-ACA和/或其酯類的環(huán)化而言，多種方法都是技術(shù)人員已知的。例如，可以參考US-A-6,194,572中描述的方法，其中，在反應(yīng)區(qū)域中，在不存在催化劑的情況下，用溫度在270至400℃范圍內(nèi)壓力在0.5至2MPa范圍內(nèi)的超熱蒸汽去處理6-ACA和/或其酯類。這些方法可連續(xù)操作，形成的己內(nèi)酰胺可通過在反應(yīng)混和物離開反應(yīng)區(qū)域之后立即在100至170℃范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行部分冷凝來(lái)分離。將6-ACA直接轉(zhuǎn)化為尼龍-6例如可以按照J(rèn)P4050232-A來(lái)進(jìn)行。在本專利申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)“生物化學(xué)合成”(在本專利申請(qǐng)上下文中，該術(shù)語(yǔ)可被替換為“生物轉(zhuǎn)化”)的含義不僅指除大量純粹的化學(xué)反應(yīng)步驟之外還包含一種或多種生物催化反應(yīng)的方法，該術(shù)語(yǔ)還包括使用合適的生產(chǎn)菌株的整個(gè)細(xì)胞來(lái)進(jìn)行的純粹的生物化學(xué)過程。此類純粹的生物化學(xué)過程在從合適的碳源開始的生物化學(xué)合成的情況下指發(fā)酵，在從已具有碳骨架(從其可獲得待合成的目標(biāo)分子)的中間產(chǎn)物開始的生物合成的情況下指前體發(fā)酵。這些方法可以在有氧或厭氧條件下進(jìn)行。生物化學(xué)合成可以在體內(nèi)或體外進(jìn)行。通常，體內(nèi)方法是用活細(xì)胞(術(shù)語(yǔ)“活細(xì)胞”還包括所謂的靜止細(xì)胞)進(jìn)行的方法；另一方面，體外方法通常使用細(xì)胞裂解物或(部分)純化的酶來(lái)進(jìn)行的。然而，在本文中提及的生物化學(xué)合成還可用滲透性(permeabilized)細(xì)胞來(lái)進(jìn)行；但是，對(duì)于用滲透性細(xì)胞進(jìn)行的方法來(lái)說，體內(nèi)和體外的區(qū)別沒有太多意義。本發(fā)明還涉及獲得用于合成6-氨基己酸的生物轉(zhuǎn)化過程的經(jīng)過遺傳工程改造的合適的宿主細(xì)胞的方法，還特別涉及迄今未知的用于從能得到6-氨基己酸的中間產(chǎn)物(即，6-氨基己-2-烯酸)，或從能轉(zhuǎn)化為其的化合物(即6-氨基-2-羥基己酸)對(duì)6-氨基己酸進(jìn)行前體發(fā)酵的方法。在本申請(qǐng)的上下文中，所述化合物6-氨基己-2-烯酸和6-氨基-2-羥基己酸(下文中將有解釋)將被分別稱為6-AHEA和6-AHHA。在對(duì)6-氨基己酸的前體發(fā)酵中，如下所述，可針對(duì)前體發(fā)酵將合適的中間產(chǎn)物制備為如下可獲得的形式它們以非限制性和非抑制性的濃度存在，例如，通過將其補(bǔ)料到其中進(jìn)行生物化學(xué)合成(即，轉(zhuǎn)化)的反應(yīng)容器中來(lái)進(jìn)行。本發(fā)明還特別涉及新穎的宿主細(xì)胞，它們具有針對(duì)6-氨基己-2-烯酸，即針對(duì)6-AHEA，的烯酸酯(enoate)還原酶活性。特別地，其還涉及具有針對(duì)6-AHEA的在空氣中穩(wěn)定的烯酸酯還原酶活性的新穎的宿主細(xì)胞。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“空氣中穩(wěn)定的(aerostable)”表示耐氧的。最后，如下文中所解釋的一樣，本發(fā)明涉及通過生物化學(xué)方法生產(chǎn)的新穎的化合物6-AHEA和6-ACA，以及從此類6-ACA生產(chǎn)的己內(nèi)酰胺，涉及尼龍-6和其它衍生物，它們是從此類通過生物化學(xué)方法生產(chǎn)的化合物或此類己內(nèi)酰胺生產(chǎn)的。通常，直到今天，已知的到6-ACA的途徑都是艱苦且麻煩的。通常，如果6-ACA不是從廢的尼龍-6材料生產(chǎn)的話，這些已知的途徑都需要相對(duì)昂貴的起始原料和反應(yīng)試劑(例如，丁二烯和氫氣)，以及相對(duì)嚴(yán)格的在多步驟和多反應(yīng)器方案中的溫度和壓力反應(yīng)條件，以及需要用到昂貴的催化體系。因此，人們需要替代性的到6-ACA的途徑，優(yōu)選地，從便宜很多的原材料起始的。本領(lǐng)域公知，來(lái)自農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的天然生長(zhǎng)的并且因此可更新的材料是可用于發(fā)酵或前體發(fā)酵的碳源(例如葡萄糖)(或其它合適的碳源或其混合物)的基礎(chǔ)。此類可更新的材料相對(duì)便宜而且可以大量獲得。通常，如果可更新的材料可用作為針對(duì)所有類型的化學(xué)材料的起始原料，會(huì)被認(rèn)為是非常有利的。本發(fā)明的目的之一是使得能夠通過生物化學(xué)合成(即，通過生物轉(zhuǎn)化)來(lái)生產(chǎn)6-ACA，這在目前是未知的。本發(fā)明的發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)了一種新穎的方法，用于對(duì)6-氨基己酸進(jìn)行生物化學(xué)合成，其中，結(jié)構(gòu)式[1]的6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)H2N-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-COOH[1]或6-氨基-2-羥基己酸(6-AHHA)(這是一種能被轉(zhuǎn)化為6-氨基己-2-烯酸的化合物)被具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶處理，所述的酶活性針對(duì)含α，β-烯酸酯基團(tuán)和伯氨基的分子，具體而言，被具有針對(duì)6-氨基己-2-烯酸的α，β-烯酸酯還原酶活性的酶處理。本文中，針對(duì)含α，β-烯酸酯基團(tuán)和伯氨基的分子的α，β-烯酸酯還原酶活性應(yīng)被理解為，能將與羧酸(-COOH)或羧酸根(-COO-)或酯(-COOR，R表示至多6個(gè)C原子的低級(jí)烷基)相鄰的α，β-位置上的α，β-碳-碳雙鍵轉(zhuǎn)化為還含有伯氨基(即，不形成酰胺基團(tuán)一部分的-NH2基團(tuán))的分子中的碳-碳單鍵。單取代或二取代的氨基不被包含在本文所使用的伯氨基的定義內(nèi)。術(shù)語(yǔ)α，β-烯酸酯還原酶活性包括可測(cè)量到的活性的所有可能水平上的此類活性，包括可通過技術(shù)人員已知的方法獲得的增加的活性水平，例如，通過過量表達(dá)、誘導(dǎo)或者對(duì)相關(guān)基因加以調(diào)控、增加相關(guān)基因的拷貝數(shù)、增加相關(guān)基因的內(nèi)源活性等方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，或者通過優(yōu)化試驗(yàn)條件來(lái)實(shí)現(xiàn)。除6-AHEA之外，能通過脫水作用轉(zhuǎn)化為6-AHEA的、相應(yīng)的飽和α-羥基-取代的化合物6-AHHA也可用于本發(fā)明的方法。在本專利申請(qǐng)的上下文中，該化合物被認(rèn)為與α-未取代的α，β-烯酸酯6-AHEA等同。應(yīng)當(dāng)注意，由本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的生物化學(xué)反應(yīng)，關(guān)于含α，β-烯酸酯基團(tuán)和伯氨基的分子的轉(zhuǎn)化方面，在本領(lǐng)域中并未有描述和教導(dǎo)，盡管具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶(大多數(shù)情況下，通常特別用于含有不與氫等同的α-取代基的α，β-烯酸酯)是技術(shù)人員已知用于針對(duì)大范圍底物的其它類型的反應(yīng)的。通常，此類使用具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶的已知的反應(yīng)是用于對(duì)應(yīng)異構(gòu)體特異性酶的合成的。例如，見H.Simonetal.的Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，Vol13(1974)，p.608-609、B.Rambecketal.的如上文中第609頁(yè)、I.Thanosetal.的J.Biotechnol.9，13-29(1987)、H.Simonetal.的Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，Vol.24(1985)，p.539-553和US-A-4,464,235。在H.Simon的Chem.Biochem.Flavoenzymes(1991)，Chapter11，pages317-328(出版者CRC，BocaRaton)中可以找到關(guān)于具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶的綜述。這些文獻(xiàn)中的后者表明，所述α，β-烯酸酯還原酶活性涉及從被還原的酶到烯酸酯化合物的氫化物轉(zhuǎn)移。I.Thanosetal.(上文中引用的)關(guān)注使用來(lái)自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460的烯酸酯還原酶針對(duì)α-取代的烯酸酯進(jìn)行的電酶還原方面。在WO-03/066863中顯示了具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶的其它例子，這些例子涉及對(duì)立體化學(xué)上純凈的α-取代的羰基化合物的合成。該文獻(xiàn)沒有顯示針對(duì)所用的烯酸酯還原酶的任何含有伯氨基的底物。因此，完全沒有教導(dǎo)表明，具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶適合用于對(duì)羧酸基團(tuán)鄰近的α-位置上未被取代且還含有伯氨基的化合物，例如6-ACA進(jìn)行生物化學(xué)合成。事實(shí)上，技術(shù)人員考慮到上述可能的氫化物轉(zhuǎn)移機(jī)制，將更可能預(yù)期到那些要被具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶轉(zhuǎn)化的分子中伯氨基的存在，會(huì)對(duì)此類轉(zhuǎn)化反應(yīng)造成負(fù)面影響。預(yù)期中帶正電的氨基看起來(lái)將是被轉(zhuǎn)移的氫化物的優(yōu)選受體，因此會(huì)對(duì)烯酸酯還原酶活性造成負(fù)面干擾。還應(yīng)注意到，Steinbacheretal.(見STN數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)2003101473)進(jìn)行的評(píng)述指出烯酸酯還原酶具有寬廣的底物特異性，這與來(lái)自其它文獻(xiàn)(例如，上文引用的H.Simonetal.)的數(shù)據(jù)一致，其中顯示了針對(duì)菌株ClostridiumtyrobutyricumDSM1460(與上文引用的I.Thanosetal.的工作中使用的同樣的菌株)中烯酸酯還原酶反應(yīng)的寬廣范圍的底物的使用，這并未改變所述的觀點(diǎn)。此外，在文獻(xiàn)中，對(duì)來(lái)自不同梭狀芽胞桿菌的烯酸酯還原酶的克隆、測(cè)序和表達(dá)已有描述(見，F(xiàn).Rohdich，etal.的J.Biol.Chem.276(6)，5779-5787(2001))。特別地，ClostridiumtyrobutyricumDSM1460和ClostridiumthermoaceticumDSM1974(該菌株近來(lái)與許多其它Clostridium種的菌柱一起被重新命名，因此現(xiàn)在也被稱為Moorellathermoacetica)的烯酸酯還原酶(enr)基因被克隆和測(cè)序。然而，此類克隆目前還沒有在來(lái)自例如，Bacillus、Corynebacterium或Pichia屬的任何種中開展。但是，具體而言，關(guān)于在E.coli中克隆來(lái)自Moorellathermoacetica和來(lái)自Clostridiumtyrobutyricum的enr基因已被F.Rohdich描述過。關(guān)于這些克隆，應(yīng)當(dāng)注意到，后者(來(lái)自C.tyrobutyricum)并未被Rohdichetal.在厭氧條件下(即在厭氧條件下生長(zhǎng))試驗(yàn)過，并且在有氧條件下的實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致烯酸酯還原酶的失活形式；而前者(來(lái)自M.thermoacetica)在有氧條件下表達(dá)時(shí)給出了同樣的結(jié)果，僅在厭氧條件下才能產(chǎn)生烯酸酯還原酶的活性形式。此外，在WO-03/066863中，已描述了在E.coli中對(duì)從Burkholderia種獲得的烯酸酯還原酶進(jìn)行克隆，這些酶已被測(cè)序。因此，引用的參考文獻(xiàn)中沒有一篇教導(dǎo)了形成本發(fā)明基礎(chǔ)的6-ACA形成反應(yīng)。如發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的，具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶(用于本發(fā)明的方法中的)可以是來(lái)自一大組的微生物屬(厭氧的以及需氧的那些)的任何合適的酶(即，如果可被確認(rèn)為具有針對(duì)含α，β-烯酸酯基團(tuán)和伯氨基的分子，尤其是針對(duì)6-氨基己-2-烯酸的α，β-烯酸酯還原酶活性，該酶就是合適的)，例如，來(lái)自Acetobacterium、Achromobacter、Acremonium、Agrobacterium、Alcaligenes、Bacillus、Bradyrhizobium、Burkholderia、Caloramator、Cephalosporium、Clostridium、Escherichia、Eubacterium、Filifactor、Fusobacterium、Kluyveromyces、Mesorhizobium、Moorella、Ochrobactrum、Oxalophagus、Oxobacter、Paenibacillus、Pseudomonas、Ralstonia、Rhizobium、Rhodotorula、Salmonella、Shigella、Sinorhizobium、Sporohalobacter、Syntrophospora、Thermoanaerobacter、Thermoanaerobacterium、Tilachlidium、Vibrio、Xanthobacter或Yersinia的屬。優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶是來(lái)自Acetobacterimsp.、Acremoniumsp.、Agrobacteriumsp.、Burkholderiasp.、Cephalosporiumsp.、Clostridiumsp.、Escherichiasp.、Moorellasp.、Ochrobactrumsp.、Pseudomonassp.、Salmonellasp.、Shigellasp.、Tilachlidiumsp.、Yersiniasp.和Vibriosp.種的組的微生物的酶。更優(yōu)選地，具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶是來(lái)自Acremoniumsp.、Clostridiumsp.、Moorellasp.、或Ochrobactrumsp.的酶。最優(yōu)選地，具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶是來(lái)自AcremoniumstrictumCBS114157(保藏日2003年12月19日；按照布達(dá)佩斯條約保藏)、ClostridiumtyrobutyricumDSM1460(可從DeutscheSammlungMikroorganismenundZellkulturen獲得)、MoorellathermoaceticaDSM1974(可從DeutscheSammlungMikroorganismenundZellkulturen獲得)(該酶還被稱為DSM1974，直到1980年1月1日，被命名為Clostridiumthermoaceticum)、OchrobactrumanthropiNCIMB41200(保藏日為2003年12月16日；按照布達(dá)佩斯條約保藏)或ClostridiumkluyveriDSM555(可從DeutscheSammlungMikroorganismenundZellkulturen獲得)的酶。在上下文中，應(yīng)當(dāng)注意到，大量的Clostridium種近來(lái)被重命名。上文中給出的名字因此指出了可由其獲得具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶的菌株(細(xì)胞)和品種。使用來(lái)自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460或來(lái)自MoorellathermoaceticaDSM1974的具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶時(shí)，發(fā)明人已獲得了根據(jù)本發(fā)明的向6-ACA的生物化學(xué)轉(zhuǎn)化的好結(jié)果。優(yōu)選地，針對(duì)含α，β-烯酸酯基團(tuán)和伯氨基的分子的具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶具有在空氣中穩(wěn)定的α，β-烯酸酯還原酶活性。這意味著，該酶將能在游離氧存在的條件下催化想要的生物轉(zhuǎn)化，而沒有任何明顯的鈍化，即，在生物轉(zhuǎn)化過程中鈍化不會(huì)超過酶活的標(biāo)準(zhǔn)偏差。此類具有空氣中穩(wěn)定活性的酶可被稱為耐氧酶。因此，在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶具有在空氣中穩(wěn)定的α，β-烯酸酯還原酶活性，并且是來(lái)自Agrobacteriumsp.、Burkholderiasp.、Escherichiasp.、Pseudomonassp.、Salmonellasp.、Shigellasp.、Yersiniasp.和Vibriosp.種的組的微生物的酶。更優(yōu)選地，具有空氣中穩(wěn)定的α，β-烯酸酯還原酶活性的酶是來(lái)自Escherichiacoli種的，最優(yōu)選地，是來(lái)自EscherichiacoliK12的酶。本發(fā)明的方法非常適合在3至9范圍內(nèi)的pH下通過將6-氨基己-2-烯酸轉(zhuǎn)化為6-氨基己酸來(lái)進(jìn)行，優(yōu)選地，4至8范圍內(nèi)的pH，更優(yōu)選地，5至8，最優(yōu)選地，在厭氧條件下5.5至7pH，在有氧條件下，6.5至8pH?？赏ㄟ^以如下方式提供6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)化合物，或者提供能代謝為該化合物的產(chǎn)品(但與純粹的碳源例如葡萄糖不同)，使得起始材料6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)可為根據(jù)本發(fā)明的生物化學(xué)轉(zhuǎn)化所用，所述方式使得該化合物在所用的反應(yīng)器中以非限制性和非抑制性的濃度存在，例如通過向其中進(jìn)行生物化學(xué)過程的反應(yīng)容器(例如，發(fā)酵罐)中補(bǔ)料來(lái)進(jìn)行。其中6-AHEA(或其可被代謝的前體)以上述方式用于反應(yīng)容器中的根據(jù)本發(fā)明的方法被稱為“前體發(fā)酵”。當(dāng)然，還可通過發(fā)生于含α，β-烯酸酯還原酶活性的微生物中的任何合適的生物化學(xué)方法，使得6-AHEA(或任何能被代謝為其但與純粹的碳源不同的產(chǎn)品)可以被根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化所利用。例如，人們已知，賴氨酸可通過在Corynebacteriumglutamicum細(xì)胞中的生物轉(zhuǎn)化來(lái)產(chǎn)生(例如，見PfefferleW.的Adv.Biochem.Eng.(2003)，Vol.79，p59-112)。Corynebacteriumglutamicum完整基因組序列的已知對(duì)于賴氨酸的生物技術(shù)生產(chǎn)的改進(jìn)產(chǎn)生了重大的影響。假設(shè)微生物中的賴氨酸隨后可被轉(zhuǎn)化為6-AHEA，這是迄今為止未被公開或提出的方法，它將可能是制備可用于本發(fā)明轉(zhuǎn)化的6-AHEA的合適方法。通過技術(shù)人員容易獲得的化學(xué)方法，可將通過生物化學(xué)合成(生物轉(zhuǎn)化)產(chǎn)生的賴氨酸轉(zhuǎn)化為6-AHEA。例如，按照Houben-Weyl，MethodsofOrganicChemistry(4thedition)，VolE22a，Thieme，Stuttgart，2002page166-191所述，通過首先用賴氨酸-銅(II)復(fù)合物方法保護(hù)ε-氨基來(lái)進(jìn)行?？蛇x的保護(hù)基團(tuán)是乙?；?、苯甲?；?、苯乙?；?、芐氧羰基或鄰苯二甲酰亞胺基(phthaloylimide)。隨后在硫醇或硒醇存在的情況下對(duì)α-氨基進(jìn)行的亞硝化反應(yīng)導(dǎo)致了相應(yīng)的α-硫或α-硒醚的形成。該亞硝化可以在具有NaNO2/H2SO4的水性介質(zhì)中進(jìn)行，或者在使用例如，亞硝酸異戊酯(iso-amylnitrite)的無(wú)水條件下進(jìn)行。硫醇的合適例子是(被取代的)苯硫酚和苯甲基硫醇；該反應(yīng)中苯硒醇是作為硒醇優(yōu)選的。隨后用H2O2對(duì)α-硫醚或α-硒醚氧化以及隨后進(jìn)行原位消去反應(yīng)將獲得ε-保護(hù)的6-AHEA。該過程的例子由S.Bory，M.Gaudry，A.Marquet；NouveauJournaldeChimie(1986)，10，709-713所描述。通過酸或堿催化的對(duì)ε-保護(hù)基團(tuán)的水解，獲得6-AHEA。當(dāng)6-AHEA是在細(xì)胞中通過生物化學(xué)方法產(chǎn)生(或來(lái)自通過生物轉(zhuǎn)化制造的賴氨酸)的情況下，得到的6-ACA(以及在從細(xì)胞中排出和通過任何已知方法進(jìn)行的環(huán)化之后從其獲得的己內(nèi)酰胺)與從化石給料(fossilefeedstock)的化學(xué)途徑獲得的6-ACA(和/或由此獲得的己內(nèi)酰胺，分別從其獲得的產(chǎn)品，例如，從此類己內(nèi)酰胺獲得的尼龍-6)可以很容易地區(qū)分開。在后一種情況中，分子中不存在14C是顯而易見的。或者，可以用12C比13C比14C同位素的比例(可通過StableIsotopeRatioMassSpectrometry(SIRMS)方法，或通過所謂的經(jīng)由NuclearMagneticResonance的Site-SpecificNaturalIsotopeFractionation(SNIF-NMR，它們可用于對(duì)生物物質(zhì)的鑒定)作為6-ACA(和/或己內(nèi)酰胺)來(lái)源的指紋，因?yàn)椋?2C比13C比14C同位素的比例將與環(huán)境二氧化碳中存在的值大致相同。起始材料，6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)還可通過純粹的化學(xué)方法獲得，例如，與P.Hughesetal.關(guān)于蘇-3-羥基賴氨酸合成的J.Org.Chem.vol.59(1994)，pages5799-5802中所述的方法中流程2的步驟a和i類似的方法。這被展示在本申請(qǐng)的實(shí)驗(yàn)部分中。根據(jù)本發(fā)明的方法優(yōu)選在選自由Aspergillus、Bacillus、Corynebacterium、Escherichia和Pichia屬組成的組的宿主生物中進(jìn)行。屬于Corynebacteriumsp.的組，例如C.glutamicum的宿主生物是特別優(yōu)選的，因?yàn)檫@些微生物已知適合用于對(duì)賴氨酸的生物合成生產(chǎn)。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，適于對(duì)6-氨基己酸進(jìn)行生物化學(xué)合成的宿主菌株以及由此的宿主細(xì)胞選自Escherichiacoli、Bacillus、Corynebacteriumglutamicum、Aspergillusniger或Pichiapastoris宿主細(xì)胞的組，其中，編碼具有針對(duì)含α，β-烯酸酯基團(tuán)和伯氨基的分子的α，β-烯酸酯還原酶活性的α，β-烯酸酯還原酶基因被克隆和表達(dá)?？梢源嫒魏紊鲜靓?，β-烯酸酯還原酶基因，編碼具有α，β-烯酸酯還原酶活性并且能將6-AHEA以足夠程度轉(zhuǎn)化為6-ACA的任何其它基因可以使用，其被認(rèn)為是落在了要求保護(hù)的范圍之內(nèi)。在本申請(qǐng)?zhí)岬降募?xì)胞中，現(xiàn)有技術(shù)中僅描述了用來(lái)自MoorellathermoaceticaDSM1974或來(lái)自Clostridiumtyrobutyricum的α，β-烯酸酯還原酶基因克隆的Escherichiacoli細(xì)胞；上面提到的其它細(xì)胞都是新穎的細(xì)胞。此外，如本發(fā)明所發(fā)現(xiàn)的，編碼具有空氣中穩(wěn)定的、針對(duì)含α，β-烯酸酯基團(tuán)和伯氨基的分子的α，β-烯酸酯還原酶活性的酶的基因可被用于本發(fā)明的方法。例如，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，已知具有N-乙基馬來(lái)酰亞胺還原酶活性的基因，EscherichiacoliK12(菌株W3110)的nemA基因(編號(hào)D86931)也具有針對(duì)含α，β-烯酸酯基團(tuán)和伯氨基的分子的α，β-烯酸酯還原酶活性。nemA基因的這種α，β-烯酸酯還原酶活性以前是未知的?；谂c來(lái)自E.coli的nemA基因的序列同源性，編碼具有在空氣中穩(wěn)定的、針對(duì)含α，β-烯酸酯基團(tuán)和伯氨基的分子的α，β-烯酸酯還原酶活性的酶的其它基因?qū)⒖蓮膩?lái)自例如Agrobacterium、Escherichia、Pseudomonas、Salmonella、Shigella、Yersinia和Vibrio的菌株中獲得。就本專利申請(qǐng)的目的而言，編碼具有在空氣中穩(wěn)定的、針對(duì)含α，β-烯酸酯基團(tuán)和伯氨基的分子的α，β-烯酸酯還原酶活性的酶的所有此類其它基因都被認(rèn)為是與nemA等同的。因此，本發(fā)明還特別涉及如下新穎的細(xì)胞-Escherichiacoli宿主細(xì)胞，其中，來(lái)自O(shè)chrobactrumanthropiNCIMB41200或來(lái)自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯還原酶基因被克隆和表達(dá)；-Bacillus宿主細(xì)胞，其中，來(lái)自MoorellathermoaceticaDSM1974，或來(lái)自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460，或來(lái)自O(shè)chrobactrumanthropiNCIMB41200，或來(lái)自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯還原酶基因被克隆和表達(dá)；-Corynebacteriumglutamicum宿主細(xì)胞，其中，來(lái)自MoorellathermoaceticaDSM1974，或來(lái)自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460，或來(lái)自O(shè)chrobactrumanthropiNCIMB41200，或來(lái)自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯還原酶基因被克隆和表達(dá)；-Aspergillusniger宿主細(xì)胞，其中，來(lái)自MoorellathermoaceticaDSM1974，或來(lái)自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460，或來(lái)自O(shè)chrobactrumanthropiNCIMB41200，或來(lái)自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯還原酶基因被克隆和表達(dá)；-Pichiapastoris宿主細(xì)胞，其中，來(lái)自MoorellathermoaceticaDSM1974，或來(lái)自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460，或來(lái)自O(shè)chrobactrumanthropiNCIMB41200，或來(lái)自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯還原酶基因被克隆和表達(dá)；以及-選自Aspergillus、Bacillus、Corynebacterium和Pichia宿主細(xì)胞的組的宿主細(xì)胞，其中，來(lái)自E.coliK12的在空氣中穩(wěn)定的α，β-烯酸酯還原酶基因nemA被克隆和表達(dá)。通常，具有在空氣中穩(wěn)定的α，β-烯酸酯還原酶活性的酶在本發(fā)明的上下文中是明確優(yōu)選的。這是因?yàn)樵谟醒鯒l件下培養(yǎng)和/或使用的微生物中它們能被表達(dá)和使用?？梢酝ㄟ^技術(shù)人員已知的任何合適的克隆策略，例如通過實(shí)驗(yàn)部分中描述的方法，來(lái)獲得下述Escherichiacoli、或Bacillus、或Corynebacteriumglutamicum、或Aspergillusniger或Pichiapastoris宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞中，來(lái)自MoorellathermoaceticaDSM1974，或來(lái)自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460，或來(lái)自O(shè)chrobactrumanthropiNCIMB41200，或分別來(lái)自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯還原酶基因被克隆和表達(dá)(或者，與它們同源、并且編碼具有α，β-烯酸酯還原酶活性且能以足夠程度將6-AHEA轉(zhuǎn)化為6-ACA的酶的任何此類基因)。還可參考公知的手冊(cè)，SambrookJ.，F(xiàn)ritsch，E.F.，andManiatis，T.MolecularClonningALaboratoryManual.2nded.，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1989。類似地，此類克隆策略還可被用于構(gòu)建上面提到的nemA克隆(或與其等同的克隆)。此外，特別是當(dāng)從真菌中獲得的基因被克隆到細(xì)菌菌種中的情況下，技術(shù)人員將使用合適的手段，不僅用于改造轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列，此外還使用經(jīng)過分離的或通過合成獲得的cDNA序列，以獲得將被制造的酶的功能性表達(dá)。此外，本發(fā)明還涉及對(duì)6-氨基己酸(6-ACA)進(jìn)行前體發(fā)酵的方法，其中，從6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)或從6-氨基-2-羥基己酸(6-AHHA)開始，應(yīng)用至少一個(gè)酶步驟，其中使用具有針對(duì)含α，β-烯酸酯基團(tuán)和伯氨基的分子的α，β-烯酸酯還原酶活性的酶，特別是使用具有針對(duì)6-氨基己-2-烯酸的α，β-烯酸酯還原酶活性的酶。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，此類前體發(fā)酵在能體內(nèi)形成6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)的微生物中進(jìn)行。事實(shí)上，在這種情況下，根據(jù)本發(fā)明的6-ACA的形成是起始自任何合適碳源的向6-ACA的生物轉(zhuǎn)化。適合用于本發(fā)明方法的此類特殊實(shí)施方式的碳源是寡糖和二糖，例如，麥芽糖，β-半乳糖苷，蜜二糖，表蜜二糖(epimelibiose)，肌醇半乳糖苷，蜜二醇(melibitol)，半乳糖苷甘油和海藻糖(trehalose)，己糖，例如，D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、L-山梨糖和D-半乳糖，含有葡萄糖的溶液或漿體，淀粉，含有碳源的溶液或漿體，氨基糖，例如，N-乙酰-D-葡糖胺和D-葡糖胺，甲基戊糖，例如，L-海藻糖(fucose)和L-鼠李糖，戊糖和丙糖，例如，L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、木糖醇、D-來(lái)蘇糖、D-核糖、2-脫氧-2-D-核糖和二羥基丙酮，核苷和去氧核苷中的戊糖，例如，胞嘧啶核苷、去氧胞嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、去氧腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、黃嘌呤核苷、胸腺嘧啶脫氧核苷(去氧尿嘧啶核苷)，嘌呤(腺嘌呤、次黃嘌呤、鳥嘌呤核糖核苷)，hexuronides，hexuronates和己糖酸酯，例如D-葡萄糖酸酯和D-半乳糖醛酸酯(D-galactonate)，磷酸化的糖和羧酸酯，例如己糖磷酸酯以及sn-甘油3-磷酸酯，二羧酸酯，例如琥珀酸酯、富馬酸酯和L-蘋果酸酯，三羧酸，多羥基化合物，例如，D-甘露糖醇、D-葡萄糖醇、D-山梨糖醇、半乳糖醇、衛(wèi)矛醇、D-阿拉伯醇、核糖醇和木糖醇、甘油，二碳化合物，例如乙醇和乙酸酯，脂肪酸，羥乙酸酯(glycolate)和乙醛酸酯(glyoxylate)以及甲醇，可食用油或任意上述化合物的混合物。最優(yōu)選地，6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)是在體內(nèi)從含有合適碳源的溶液或漿體形成的。此類合適的碳源可以選自葡萄糖、含有葡萄糖的溶液或漿體、(甲)乙醇、葡萄糖酸酯、戊糖、己糖、淀粉和脂肪酸的組。特別地，使用的碳源是葡萄糖。如上所述，因?yàn)閷?duì)游離氧耐受的(并且因此可被描述為在空氣中穩(wěn)定的)、具有針對(duì)6-AHEA的烯酸酯還原酶活性的酶是本發(fā)明范圍內(nèi)優(yōu)選的(即，在有氧條件下培養(yǎng)和/或使用的微生物中可被表達(dá)和使用的酶)，因此優(yōu)選使用在有氧條件下可用的微生物。有氧條件下的生長(zhǎng)效率(即，也是生物物質(zhì)產(chǎn)量)以及相關(guān)(多種)酶和/或?qū)⒈簧a(chǎn)的物質(zhì)產(chǎn)生的效率，通常比厭氧條件下的生長(zhǎng)要高得多。例如，能獲得好得多的關(guān)于葡萄糖(或其它碳源)的產(chǎn)量。此類優(yōu)點(diǎn)在，例如，通用手冊(cè)H.Schlegel，Thieme，Germany(1981)的“AllgemeineMikrobiologie”中有所描述。此外，本發(fā)明涉及新穎的、通過生物化學(xué)方法生產(chǎn)的如本文所公開的物質(zhì)，涉及由此獲得的、且12C比13C比14C同位素比例與環(huán)境二氧化碳中存在的值大致相同的產(chǎn)品，即，涉及通過生物化學(xué)方法生產(chǎn)的、具有與環(huán)境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例的6-氨基己-2-烯酸；具有與環(huán)境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例的6-氨基-己酸；具有與環(huán)境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例的、從通過生物化學(xué)方法生產(chǎn)的6-羧基-6-氨基己-2-烯酸或6-氨基-己酸產(chǎn)生的ε-己內(nèi)酰胺；涉及具有與環(huán)境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例的尼龍-6或其衍生物，所述尼龍-6是從通過生物化學(xué)方法生產(chǎn)的6-氨基己-2-烯酸或6-氨基-己酸，或從ε-己內(nèi)酰胺產(chǎn)生的，所述ε-己內(nèi)酰胺是從通過生物化學(xué)方法生產(chǎn)的6-氨基己-2-烯酸或6-氨基-己酸生產(chǎn)的。通過本文描述的方法，可以容易地鑒定出這些新穎的化合物，例如，通過StableIsotopeRatioMassSpectrometry(SIRMS)方法或通過由NMR進(jìn)行的Site-SpecificNaturalIsotopeFractionation。這些新穎的化合物與從化石碳源通過化學(xué)合成獲得的、在現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)中有所描述的相應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)式明顯不同(即，它們的12C比13C比14C同位素比例方面)。下述實(shí)驗(yàn)結(jié)果將對(duì)本發(fā)明加以詳述，但是，本發(fā)明并不被該實(shí)驗(yàn)部分的方法或原理所限制。此外，應(yīng)當(dāng)清楚，通過類推，本發(fā)明將可用于從ω-氨基2-烯烴羧酸對(duì)更高級(jí)的α，ω-氨基羧酸進(jìn)行生物合成(以及隨后對(duì)來(lái)自其的聚酰胺的生產(chǎn))。例如，11-氨基-2-十一烯酸可以作為合成聚酰胺-11的起始化合物。用于通過處理其相應(yīng)的α，β-不飽和羧酸來(lái)生產(chǎn)此類高級(jí)α，ω-氨基羧酸的實(shí)施方式被認(rèn)落為在本發(fā)明權(quán)利要求的范圍內(nèi)。I從4-氨基丁醛二乙縮醛來(lái)制備6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)在R.Hamiltonetal.，Tet.Letters1993(34)，p.2847-2850，在P.Hughesetal.，J.Org.Chem.1994(59)，p.5799-5802，以及在C.Stammeretal.，J.Org.Chem.1969(34)，p.2306-2311中分別描述了相關(guān)的反應(yīng)步驟。在Dean-Stark條件下，4-氨基丁醛二乙縮醛(技術(shù)級(jí)，90％；202.4g，1130mmol)和鄰苯二甲酸酐(186g，1256mmol)在含有大約10wt.％三乙胺(TEA；166g，1640mmol)的甲苯(1700ml)中進(jìn)行4小時(shí)的反應(yīng)。冷卻至室溫(RT)后，真空蒸發(fā)掉溶劑和多余的TEA。將殘余物溶解，在2MHCl水溶液(2000ml)和丙酮(2800ml)的混合物中回流20分鐘。冷卻至室溫后，真空移除丙酮，用CH2Cl2(5×200ml)萃取殘余物。用2MHCl水溶液(3×200ml)和飽和NaHCO3水溶液(2×200ml)來(lái)洗有機(jī)相。在Na2SO4上干燥溶液之后，通過真空蒸發(fā)掉CH2Cl2來(lái)分離4-鄰苯二甲酰亞氨基正丁醛(4-phtalimidobutanal)。在真空下除濕器中于P2O5上干燥之后，獲得了240.5g的4-鄰苯二甲酰亞氨基正丁醛(產(chǎn)率98％)。再將4-鄰苯二甲酰亞氨基正丁醛(120.9g，556mmol)溶于600ml的CH2Cl2，用600mlCH2Cl2中的(三苯基正膦基亞基)乙酸甲酯(methyl(triphenylphosphoranylidene)acetate)(186g，556mmol)對(duì)其進(jìn)行處理。1小時(shí)后，在真空下對(duì)混合物進(jìn)行濃縮，分七等分進(jìn)行色譜(MerckKieselgel60；7×14cm柱；用己烷中30％的乙酸乙酯進(jìn)行洗脫)，得到了145.6g(96％)的甲基-6-鄰苯二甲酰亞氨基己-2-烯酸酯(6-phtalimidohex-2-enoate)，其為白色固體。甲基-6-鄰苯二甲酰亞氨基己-2-烯酸酯(145.6g；533mmol)被溶于甲醇(900ml)，與1700ml蒸餾水中的71.6gNaOH(1790mmol)在室溫下攪拌8小時(shí)。用木炭處理溶液并過濾。用260ml37％的HCl水溶液對(duì)濾出物進(jìn)行酸化，然后回流3小時(shí)。冷卻至室溫后，將小量沉淀物過濾掉，將溶液在真空下濃縮至開始結(jié)晶。沉淀物被濾走，在真空下將溶液蒸發(fā)至干。用2-丙醇和乙酸乙酯的7∶1(體積/體積)混合物(2×800ml)煮沸殘余物，以提取產(chǎn)物。過濾之后，真空下蒸發(fā)溶劑，殘余物從2-丙醇(385ml)中重結(jié)晶出來(lái)，得到了36.7g(42％)的6-氨基-己-2-烯酸HCl鹽。用250MHzNMR在CD3OD中進(jìn)行測(cè)量得到的關(guān)于6-AHEA的NMR數(shù)據(jù)如下所示質(zhì)子a、b、c、d和e分別位于α、β、γ、δ和ε碳原子處。II培養(yǎng)基及其制備II.1PYG培養(yǎng)基(非選擇性)向1l去離子水中加入1.25g蛋白胨、1.25g酵母提取物和3g葡萄糖；將pH調(diào)至pH5.8。分裝到青霉素瓶中(100ml瓶中50ml培養(yǎng)基)，加熱(通過放置在沸水浴中進(jìn)行，但瓶中樣品不沸騰)以除去O2，然后用N2沖(經(jīng)過培養(yǎng)基，在N2較之培養(yǎng)基壓力稍稍高出的情況下進(jìn)行)。在121℃下滅菌15分鐘?？蛇x地，最后的痕量O2可通過加入0.05％的滅菌巰基乙酸鈉來(lái)去除。II.選擇性培養(yǎng)基(丁烯酸酯培養(yǎng)基；(按照F.Rohdichetal.，J.Biol.Chem.276(6)，5779-5787(2001)和Bader，J.etal.，Hoppe-Seyler’sZ.Physiol.Chem.，Bd.359，pages19-27，(1978)))向1l去離子水中加入6g丁烯酸、0.3gNaOH、150mg(NH4)2HPO4、100mgK2HPO4、33mgMgCl2·6H2O、50mgNH4Cl、1g酵母提取物、1g胰蛋白酪蛋白(trypticcaseine)、40mgCaCl2·2H2O、0.4mgMnSO4·2H2O、0.4mgFeSO4·2H2O、10mg(NH4)6MO7O24·4H2O、0.04mg生物素、0.8mgp-氨基苯酸、0.5mg刃天青、8mg50％K2CO3和0.05％的巰基乙酸鈉。所有成分(除維生素-、K2CO3-和巰基乙酸鈉溶液之外)被混合起來(lái)，并被分配到一些青霉素瓶中(100ml瓶中50ml)。之后，用N2氣流沖刷瓶子，并進(jìn)行滅菌(121℃，15分鐘)。隨后，加入其它化合物的滅菌且不含氧的混合物。檢查pH，如果需要的話，加入額外的滅菌K2CO3溶液，將pH調(diào)節(jié)至大約pH6.4。對(duì)于更大規(guī)模(500ml培養(yǎng)物)而言，遵循同樣的過程，除了加入丁烯酸酯和FeSO4的程序有變。按照Arch.Microbiol，127，279-287(Bader，J.etal.(1980))，如果遵循最優(yōu)的培養(yǎng)過程，即，從35mM丁烯酸酯代替70mM，以及1.8×10-5MFeSO4開始，那么烯酸酯還原酶的量將增加。當(dāng)培養(yǎng)物變得穩(wěn)定時(shí)，加入35mM丁烯酸酯和2×10-5MFeSO4。收獲細(xì)胞的最好時(shí)機(jī)是穩(wěn)定生長(zhǎng)階段之后12小時(shí)。II.3用于E.coliTOP10克隆的培養(yǎng)基在N2氣氛下，將一種豐富的培養(yǎng)基，LuriaBertani培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基，也被稱為L(zhǎng)uria培養(yǎng)基或Lenox培養(yǎng)基，每l含有10g細(xì)菌胰蛋白胨、5g酵母提取物和5gNaCl)用于培養(yǎng)E.coliTOP10/pBAD-Ctyr(1)-enr-DEST、E.coliTOP10/pBAD-Mther(1)-enr-DEST和E.coliTOP10/pBAD-nemA_Eco。每份培養(yǎng)基都含有適當(dāng)?shù)目股?，如部分III中所示。II.4培養(yǎng)條件C.tyrobutyricumDSM1460被培養(yǎng)于厭氧條件下(N2氣氛)，選擇性培養(yǎng)基(見上文)上。MthermoaceticaDSM1974被培養(yǎng)于厭氧條件下(N2氣氛)，非選擇性(PYG)培養(yǎng)基(見上文)上。C.tyrobutyricumDSM1460被培養(yǎng)于37℃，MoorellathermoaceticaDSM1974被培養(yǎng)于55-60℃。E.coliTOP10/pBAD-Ctyr(1)-enr-DEST和E.coliTOP10/pBAD-Mther(1)-enr-DEST被培養(yǎng)于厭氧條件下(N2氣氛)，28℃。E.coliTOP10/pBAD-nemA_Eco被培養(yǎng)于有氧條件下，28℃。III構(gòu)建載體和質(zhì)粒III.1通用程序按照在SambrookJ.，F(xiàn)ritsch，E.F.，andManiatis，T.MolecularClonningALaboratoryManual.2nded.，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1989或廠商說明書的描述，來(lái)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆技術(shù)，例如質(zhì)粒DNA分離、凝膠電泳、對(duì)核酸進(jìn)行酶限制性修飾、E.coli轉(zhuǎn)化等。如無(wú)特別指明，標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆酶，例如，限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶等從Invitrogen(Breda，荷蘭)獲得。合成的寡核苷酸從Sigma-Genosys(Cambridge，UK)和Invitrogen(Paisley，Scotland，UK)獲得。利用BaseClear(Leiden，荷蘭)，使用有染料標(biāo)記的雙脫氧終止物進(jìn)行鏈終止反應(yīng)來(lái)進(jìn)行DNA序列分析。III.2構(gòu)建GatewayTM目的載體pBAD/Myc-His-DEST用于在E.coli中表達(dá)來(lái)自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460和MoorellathermoaceticaDSM1974的烯酸酯還原酶基因，以及用于在E.coliTOP10中表達(dá)來(lái)自EscherichiacoliK12的N-乙基馬來(lái)酰亞胺還原酶基因(nemA)的目的載體pBAD/Myc-His-DEST是通過將cat/ccdB盒引入到商業(yè)可獲得的E.coli表達(dá)載體pBAD/Myc-HisC中制備的。cat/ccdB盒是通過PCR擴(kuò)增得到的，其中使用5’-AAGAAGACCGGATCCTACTTTCTCCATACCCGTTTTTTGGGCTAACACAAGTTTGTACAAAAAAGCTGAAC-3’[SEQIDNo.1]作為正向引物(具有雙下劃線標(biāo)出的啟動(dòng)子序列、下劃線標(biāo)出的BpiI識(shí)別切割位點(diǎn)、斜體標(biāo)出的attR序列)以及5’-TTGTTCTACGTAACCACTTTGTACAAGAAAGCTGAAC-3’[SEQID.No.2]作為反向引物(具有下劃線標(biāo)出的SnaBI切割位點(diǎn)和斜體表示的attR序列)，用載體pDEST15(Invitrogen)作為模板。按照廠商說明書，用ExpandHighFidelity聚合酶(RocheAppliedScience，Mannheim，德國(guó))產(chǎn)生了單一片段。通過凝膠電泳驗(yàn)證了擴(kuò)增片段具有正確的大小(1792bp)。用QIAquickGelExtractionKit(QIAGENGmbH，Hilden，德國(guó))從預(yù)備的瓊脂糖凝膠中對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行純化之后，用BpiI(MBIFermentas，St.Leon-Rot，德國(guó))(導(dǎo)致與BamHI互補(bǔ)的上懸掛)和SnaBI(NewEnglandBiolabs，F(xiàn)rankfurt，德國(guó))去消化片段，用T4DNA連接酶將其連接到用BamHI和SnaBI消化過的E.coli表達(dá)載體pBAD/Myc-HisC(Invitrogen)中。連接混合物隨后被用于轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)E.coliDB3.1細(xì)胞(Invitrogen)。通過將整個(gè)轉(zhuǎn)化混合物涂布到含有35μg/ml氯霉素的2*TY平板上接著在37℃培養(yǎng)過夜來(lái)選擇重組細(xì)胞。從三個(gè)單個(gè)菌落分離出重組質(zhì)粒之后，對(duì)插入物進(jìn)行測(cè)序。這些克隆之一被證實(shí)含有想要的插入，其被命名為pBAD/Myc-His-DEST。雖然在對(duì)照序列(Invitrogen-pDEST15的核苷酸序列)與質(zhì)粒pBAD/Myc-His-DEST測(cè)序部分的核苷酸序列之間有7處不符，但是pBAD/Myc-His-DEST所有重要的特征(氯霉素抗性、ccdB選擇和attR重組)都是具有完全功能的。III.3構(gòu)建質(zhì)粒pBAD-Ctyr(1)-enr-DEST用PCR和用于克隆的GatewayTM技術(shù)(InvitrogenCorp.，Carlsbad，California，USA)，將C.tyrobutyricum烯酸酯還原酶基因克隆進(jìn)E.coli表達(dá)載體pBAD/Myc-His-DEST。使用5’AGGAGGAATTAACCATGAAAAACAAATCTTTATTTGAACC-3’[SEQIDNo.3]作為正向引物(具有下劃線表示的Shine-Delgarno位點(diǎn)、斜體表示的ATG起始密碼子和雙下劃線的attB1位點(diǎn))，使用5’CTAACAGTTAAGTCCAATTTCATTTCC-3’[SEQIDNo.4]作為反向引物(具有斜體表示的終止密碼子和雙下劃線表示的attB2位點(diǎn))，基因組DNA作為模板，對(duì)烯酸酯還原酶開放閱讀框進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增。起始密碼子被改變(GTG到ATG)。使用Promega產(chǎn)品，按照通常用的方案來(lái)分離基因組DNA。為進(jìn)行分離，用C.tyrobutyricum去接種50ml選擇性丁烯酸酯培養(yǎng)基，隨后在28℃培養(yǎng)過夜。在該培養(yǎng)過程的最后半小時(shí)，加入羧芐青霉素(終濃度200μg/ml)，以削弱細(xì)胞壁。通過離心收獲所有細(xì)胞，將收到的沉淀重新懸浮于pH8.0的2.5ml的50mMTris-HCl(含有50mMEDTA)中。加入50μl溶菌酶(100mg/ml)和12.5μl蛋白酶K(20mg/ml)之后，在37℃對(duì)懸浮液進(jìn)行30分鐘的培養(yǎng)。加入3mlNucleiLysisSolution(PromegaCorporation，Madison，USA)之后在80℃培養(yǎng)15分鐘，獲得完全裂解。在37℃孵育30分鐘的RNase(終濃度為4μg/ml)處理之后，加入1mlProteinPrecipitationSolution(PromegaCorporation，Madison，USA)，溶液被震蕩20秒，在冰上孵育15分鐘。離心(4000xg，4℃，15分鐘)之后，將上清液轉(zhuǎn)移到0.1倍體積NaAc(3M，pH5)與2倍體積純乙醇的混合物中。通過離心(14000xg，4℃，15分鐘)收集沉淀的DNA。最后，將沉淀溶解于1ml的10mMTris-HCl(pH8)中。按照廠商說明書，用PCRSupermixHighFidelity(Invitrogen)進(jìn)行的PCR產(chǎn)生了單條片段。通過瓊脂糖凝膠電泳來(lái)驗(yàn)證了擴(kuò)增片段的正確大小(2076bp)。用QIAGENGmbH的PCR純化試劑盒對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行純化之后，片段被用作為所謂BP體外重組反應(yīng)的底物，該反應(yīng)按照廠商(Invitrogen)的GatewayTM說明書來(lái)進(jìn)行。attB-PCR片段和pDONR201供體載體之間的重組和隨后將所獲得的混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coliTOP10感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen)的過程獲得了ENTRY克隆pDONR-Ctyr(1)enr。通過將整個(gè)轉(zhuǎn)化混合物涂布到含有50μg/ml卡納霉素的LB平板上，接著在20℃培養(yǎng)過周末，來(lái)選出重組細(xì)胞。從LB瓊脂平板上收集所有菌落，用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGENGmbH)來(lái)分離質(zhì)粒DNA。隨后，使用pDONR-Ctyr(1)enr克隆和pBAD/Myc-His-DEST的混合物，通過所謂的LR體外重組反應(yīng)，將含有烯酸酯還原酶的PCR片段引入目的載體pBAD/Myc-His-DEST(見下文)。該反應(yīng)也按照廠商的流程來(lái)進(jìn)行。將重組混合物用于轉(zhuǎn)化OneShotTM化學(xué)感受態(tài)E.coliTOP10細(xì)胞(Invitrogen)。通過將整個(gè)轉(zhuǎn)化混合物涂布到含有100μg/ml羧芐青霉素的LB瓊脂平板以及隨后在28℃培養(yǎng)過夜，來(lái)選出重組細(xì)胞。16個(gè)菌落在含有100μg/ml羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后，用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGENGmbH)來(lái)分離質(zhì)粒DNA。用AccI和RsrII限制性酶分別進(jìn)行消化，證明，被檢驗(yàn)的16個(gè)菌落中的11個(gè)含有想要的重組質(zhì)粒pBADCtyr(1)enr-DEST。將菌株E.coliTOP10/pBAD-Ctyr(1)enr-DEST的單菌落在N2氣氛下接種5mlLB培養(yǎng)基，其中補(bǔ)充有50mM磷酸鉀和100μg/ml羧芐青霉素。過夜培養(yǎng)之后，用2.5ml該預(yù)培養(yǎng)物在N2氣氛下去接種500ml相同的培養(yǎng)基。當(dāng)在28℃培養(yǎng)幾小時(shí)，達(dá)到0.4的OD620nm之后，加入0.005％的阿拉伯糖，開始誘導(dǎo)。在28℃培養(yǎng)過夜之后，通過離心(4000xg，4℃，10分鐘)收獲細(xì)胞。用大約一倍重量體積緩沖液將細(xì)胞沉淀重新懸浮于不含氧的磷酸鉀緩沖液(100mM，pH7.0)之后，將細(xì)胞沉淀貯藏于-20℃，直到用于生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。III.4構(gòu)建質(zhì)粒pBAD-Mther(1)-enr-DEST使用PCR和GatewayTM技術(shù)(Invitrogen)，將Moorellathermoacetica烯酸酯還原酶基因亞克隆進(jìn)E.coli表達(dá)載體pBAD/Myc-His-DEST。通過使用5’AGGAGGAATTAACCATGGTAGCCTATACCAGACTTTTTG-3’[SEQIDNo.5]作為正向引物(具有下劃線表示的Shine-Delgarno位點(diǎn)、斜體表示的ATG起始密碼子和雙下劃線表示的attB1位點(diǎn))和5’CTAAATCCCTCGCCCTACCTC-3’[SEQIDNo.6]作為反向引物(具有斜體表示的終止密碼子和雙下劃線表示的attB2位點(diǎn))，基因組DNA作為摸板，對(duì)烯酸酯還原酶開放閱讀框進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增。起始密碼子被改變(GTG到ATG)。使用Promega產(chǎn)品，按照通常用的方案來(lái)分離基因組DNA。為進(jìn)行分離，從在PYG培養(yǎng)基上培養(yǎng)之后獲得的甘油貯液中分離Moorellathermoacetica。通過離心收獲所有細(xì)胞，將收到的沉淀重新懸浮于pH8.0的0.25ml50mMTris-HCl(含有50mMEDTA)中。加入0.5μl溶菌酶(100mg/ml)和1.25μl蛋白酶K(20mg/ml)之后，在37℃對(duì)懸浮液進(jìn)行30分鐘的培養(yǎng)。加入0.3mlNucleiLysisSolution(PromegaCorporation，Madison，USA)之后在80℃培養(yǎng)15分鐘，獲得完全裂解。RNase(終濃度為4μg/ml)處理和在37℃孵育30分鐘之后，加入1mlProteinPrecipitationSolution(PromegaCorporation，Madison，USA)，溶液被震蕩20秒，在冰上孵育15分鐘。離心(4000xg，4℃，15分鐘)之后，將上清液轉(zhuǎn)移到0.1倍體積NaAc(3M，pH5)與2倍體積純乙醇的混合物中。通過離心(14000xg，4℃，15分鐘)收集沉淀的DNA。最后，將沉淀溶解于0.05ml10mMTris-HCl(pH8)中。按照廠商說明書，用PCRSupermixHighFidelity(Invitrogen)進(jìn)行的PCR沒有產(chǎn)生足夠的片段。但是，第二次PCR之后，獲得了足夠的PCR片段。此外，通過瓊脂糖凝膠電泳來(lái)驗(yàn)證了擴(kuò)增片段的正確大小(2045bp)。用QIAGENGmbH的PCR純化試劑盒對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行純化之后，片段被用作為所謂BP體外重組反應(yīng)的底物，該反應(yīng)按照廠商(Invitrogen)的GatewayTM說明書來(lái)進(jìn)行。attB-PCR片段和pDONR201供體載體之間的重組和隨后將所獲得的混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coliTOP10感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen)的過程獲得了ENTRY克隆pDONR-Mther(1)enr。通過將整個(gè)轉(zhuǎn)化混合物涂布到含有50μg/ml卡納霉素的LB平板上，接著在20℃培養(yǎng)過周末，來(lái)選出重組細(xì)胞。從LB瓊脂平板上收集所有菌落，用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGENGmbH)來(lái)分離質(zhì)粒DNA。隨后，使用pDONR-Mther(1)enr克隆和pBAD/Myc-His-DEST的混合物，通過所謂的LR體外重組反應(yīng)，將含有烯酸酯還原酶的PCR片段引入目的載體pBAD/Myc-His-DEST(見下文)。該反應(yīng)也按照廠商的流程來(lái)進(jìn)行。將重組混合物用于轉(zhuǎn)化OneShotTM化學(xué)感受態(tài)E.coliTOP10細(xì)胞(Invitrogen)。通過將整個(gè)轉(zhuǎn)化混合物涂布到含有100μg/ml羧芐青霉素的LB瓊脂平板以及隨后在28℃培養(yǎng)過夜，來(lái)選出重組細(xì)胞。16個(gè)菌落在含有100μg/ml羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后，用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGENGmbH)來(lái)分離質(zhì)粒DNA。用XmaI和BamHI限制性酶分別進(jìn)行消化，證明，被檢驗(yàn)的16個(gè)菌落中的4個(gè)含有想要的重組質(zhì)粒pBAD-Mther(1)enr-DEST。將菌株E.coliTOP10/pBAD-Mther(1)enr-DEST的單菌落在N2氣氛下接種5mlLB培養(yǎng)基，其中補(bǔ)充有50mM磷酸鉀和100μg/ml羧芐青霉素。過夜培養(yǎng)之后，用2.5ml該預(yù)培養(yǎng)物在N2氣氛下去接種500ml相同的培養(yǎng)基。當(dāng)在28℃培養(yǎng)幾小時(shí)，達(dá)到0.4的OD620nm之后，加入0.005％的阿拉伯糖，開始誘導(dǎo)。在28℃培養(yǎng)過夜之后，通過離心(4000xg，4℃，10分鐘)收獲細(xì)胞。用大約一倍重量體積緩沖液將細(xì)胞沉淀重新懸浮于不含氧的磷酸鉀緩沖液(100mM，pH7.0)之后，將細(xì)胞沉淀貯藏于-20℃，直到用于生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。III.5構(gòu)建質(zhì)粒pBAD-nemA_Eco使用PCR和GatewayTM技術(shù)(Invitrogen)，將EsherichiacoliK12(菌株W3110)的nemA基因(編碼D86931，用于N-乙基馬來(lái)酰亞胺還原酶)克隆進(jìn)E.coli表達(dá)載體pBAD/Myc-His-DEST。通過使用5’AGGAGGAATTAACCATGTCATCTGAAAAACTGTATTCCCC-3’[SEQIDNo.7]作為正向引物(具有下劃線表示的Shine-Delgarno位點(diǎn)、斜體表示的ATG起始密碼子和雙下劃線表示的attB1位點(diǎn))和5’TTACAACGTCGGGTAATCGGTATAGC-3’[SEQIDNo.8]作為反向引物(具有斜體表示的終止密碼子和雙下劃線表示的attB2位點(diǎn))，EscherichiacoliK12(菌株W3110)基因組DNA作為摸板，對(duì)nemA開放閱讀框進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增。按照廠商說明書，用AccuPrimePfxDNA聚合酶(Invitrogen)進(jìn)行的PCR產(chǎn)生了單條產(chǎn)物片段。此外，通過瓊脂糖凝膠電泳來(lái)驗(yàn)證了擴(kuò)增片段的正確大小(1169bp)。用QIAGENGmbH的PCR純化試劑盒對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行純化之后，片段被用作為所謂BP體外重組反應(yīng)的底物，該反應(yīng)按照廠商(Invitrogen)的GatewayTM說明書來(lái)進(jìn)行。attB-PCR片段和pDONR201供體載體之間的重組和隨后將所獲得的混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen)的過程獲得了ENTRY克隆pENTR-nemA_Eco。通過將整個(gè)轉(zhuǎn)化混合物涂布到含有50μg/ml卡納霉素的LB平板上，接著在20℃培養(yǎng)過周末，來(lái)選出重組細(xì)胞。從LB瓊脂平板上收集所有菌落，用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGENGmbH)來(lái)分離質(zhì)粒DNA。隨后，使用pENTR-nemA_Eco克隆和pBAD/Myc-His-DEST的混合物，通過所謂的LR體外重組反應(yīng)，將含有nemA的PCR片段引入目的載體pBAD/Myc-His-DEST(見下文)。該反應(yīng)也按照廠商的流程來(lái)進(jìn)行。將重組混合物用于轉(zhuǎn)化OneShotTM化學(xué)感受態(tài)E.coliTOP10細(xì)胞(Invitrogen)。通過將整個(gè)轉(zhuǎn)化混合物涂布到含有100μg/ml羧芐青霉素的LB瓊脂平板以及隨后在28℃培養(yǎng)過夜，來(lái)選出重組細(xì)胞。3個(gè)菌落在含有100μg/ml羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后，用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGENGmbH)來(lái)分離質(zhì)粒DNA。用EcoRV和FspI限制性酶分別進(jìn)行消化，證明，所有被檢驗(yàn)的菌落中都含有想要的重組質(zhì)粒pBAD-nemA_Eco。此外，將菌株E.coliTOP10/pBAD-nemA_Eco的這些菌落在N2氣氛下接種500ml滅菌Erlenmeyer瓶中的50mlLB培養(yǎng)基，其中補(bǔ)充有100μg/ml羧芐青霉素，至細(xì)胞密度為OD620等于0.05。在每分鐘180轉(zhuǎn)(rpm)的回旋振蕩器上于28℃對(duì)這些50ml的培養(yǎng)物進(jìn)行培養(yǎng)。在OD620nm為0.6時(shí)，加入0.02％的阿拉伯糖，開始誘導(dǎo)。在28℃培養(yǎng)過夜之后，通過離心(4000xg，4℃，10分鐘)收獲細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀重新懸浮于2ml磷酸鉀緩沖液(100mM，pH7.0)之后，以1ml的份將細(xì)胞沉淀貯藏于-20℃，以備將來(lái)使用。隨后通過超聲來(lái)破碎細(xì)胞(使用帶小噴嘴的MSESoniprep150；10秒的5-10微米高度的超聲，接著是10秒的破碎。整個(gè)循環(huán)持續(xù)5分鐘。在該過程中，用丙酮-冰浴保持溶液冰涼)。破碎的細(xì)胞被離心(16000xg，1小時(shí))，不含細(xì)胞的提取物被貯藏于4℃，直到進(jìn)行還原6-ACA的試驗(yàn)。IV分析方法取決于待分析的成分，使用一些不同的HPLC(高效液相色譜)方法和LC-MS(液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用)，使用多級(jí)MS技術(shù)如MS2-SRM(選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè))和/或MS32-CRM(連續(xù)反應(yīng)監(jiān)測(cè))，條件如下所示。IV.a用于測(cè)量6-AHEA和6-ACA的HPLC分析柱來(lái)自Alltech的PrevailC18(250mm×4.6mmI.D.，5μ)柱溫度環(huán)境(±22℃)流速1.0ml/分鐘注射體積20或100μl(較高敏感度的方法使用100μl)運(yùn)行時(shí)間20至40分鐘(取決于基體背景，即，存在更多副峰的情況下使用更長(zhǎng)的運(yùn)行時(shí)間)洗脫液100mM高氯酸水溶液，pH1.0(16.3g70％高氯酸/升水)樣品溶液洗脫液探測(cè)柱后反應(yīng)/熒光(同時(shí)在λex338nm/λem＞420nm)(用鄰苯二甲醛/巰基乙醇(OPA/MCE)在環(huán)境溫度，1.0ml/分鐘下進(jìn)行柱后反應(yīng))駐留時(shí)間對(duì)6-ACA而言，14.2分鐘；對(duì)6-AHEA而言，11.7分鐘。IV.b1.LC-MS2-分析按照下述LC-和MS-條件分別進(jìn)行設(shè)備LCQ離子阱質(zhì)譜，來(lái)自ThermoFinniganLC柱250×4.6mmPrevailC18(Alltech)洗脫液0.025％(v/v)甲酸水溶液(pH3.2)流速1ml/分鐘。在進(jìn)入MS之前按1∶5分流注射體積100μlMS以陽(yáng)離子模式進(jìn)行電噴霧在LC-MS2-SRM(高選擇性及敏感性分析)模式下進(jìn)行，MS條件如下離子化陽(yáng)離子電噴霧源條件夾套氣60輔助/吹掃氣25噴霧電壓5KV毛細(xì)管溫度300℃毛細(xì)管電壓5V管透鏡偏移(tubelensoffsett)25V掃描事件原始質(zhì)量(parentmass)132.0分離寬度1.1amu標(biāo)準(zhǔn)碰撞(norm.collision)能量28％激活Q0.250激活能量30msec.SRM范圍114，寬度1.2(113.4-114.6amu)IV.b2.LC-MS3-分析按照下述LC-和MS-條件分別進(jìn)行(在其它分析中，如下所示)，不同于IV.b1中提到的那些條件設(shè)備HP1100LC系統(tǒng)(AgilentTechnologies)，偶聯(lián)到LCQDecaXP離子阱質(zhì)譜(來(lái)自ThermoFinnigan)LC柱50×4.6mmNucleosil120-5C18(Machery&Nagel)，與150×4mmAtlantisdC18串聯(lián)，5μm(Waters)柱溫度環(huán)境溫度(+/-22℃)洗脫液0.025％(v/v)甲酸+1％乙腈水溶液(pH3.2)流速1ml/分鐘，在進(jìn)入MS之前按1∶5分流注射體積2μlMSCRM(連續(xù)反應(yīng)監(jiān)測(cè))模式(高選擇性及敏感性分析模式)被用于選擇性地探測(cè)6-ACA，MS條件如下離子化陽(yáng)離子電噴霧源條件夾套氣60輔助/吹掃氣10噴霧電壓4KV毛細(xì)管溫度330℃毛細(xì)管電壓5V管透鏡偏移15V掃描模式CRMMS1原始質(zhì)量132.0分離寬度1.0amu標(biāo)準(zhǔn)碰撞能量26％MS2原始質(zhì)量114.0分離寬度1.0amu標(biāo)準(zhǔn)碰撞能量26％CRM范圍78.5-79.5和95.5-96.5amu在IV.b1所述的色譜條件下，6-ACA在3.5分鐘時(shí)被洗脫出。然后用IV.b.2所述的色譜條件，結(jié)合IV.b.1所述的質(zhì)譜SRM條件，來(lái)定量測(cè)量6-ACA。通過進(jìn)行CRMMS3實(shí)驗(yàn)，以及檢查離子m/z79和96的存在及強(qiáng)度比例，來(lái)確認(rèn)在來(lái)自SRM分析的陽(yáng)性樣品中6-ACA的存在。IV.c在大多數(shù)分析中，分別在下述的GC-、MS-條件下，使用HP6890氣相色譜進(jìn)行GC-MS分析GC條件GC類型HP6890GC+AtaFocus自動(dòng)上樣儀柱類型CPSIL8CB，LowBleed/MS柱尺寸30m×0.25mmi.d.x1.0μl爐溫60℃(1分鐘)→20℃/分鐘→280℃(0分鐘)柱流速1.2ml/分鐘，氦，恒定流速注射類型無(wú)分流(無(wú)分流時(shí)間1分鐘)襯里(liner)Altech(art.4928)，裝有減活化玻璃絲塞子注射溫度300℃注射體積0.5μlMS條件MS類型HP5973MSDMS源溫度230℃MS四級(jí)(quad)溫度150℃Aux溫度250℃掃描模式SIM，m/z113V生物轉(zhuǎn)化V.(a)用C.tyrobutyricum將6-AHEA通過生物轉(zhuǎn)化為6-ACA；通過HPLC進(jìn)行分析在手套箱中，氮?dú)饬飨?，將不含O2的緩沖液(100mM磷酸鉀，pH6.0)轉(zhuǎn)移到青霉素瓶中。用丁基橡膠塞封住瓶子。之后，經(jīng)過塞子注射底物6-AHEA(100mM貯液；調(diào)至pH6)和/或細(xì)胞(貯藏于-20℃的C.tyrobutyricum細(xì)胞的沉淀，重新懸浮于pH7的100mM磷酸鉀中)來(lái)開始反應(yīng)。最后，加入NADH(110μl5mM貯液)。反應(yīng)混合物(總體積2.3ml)由磷酸鉀緩沖液(100mM，pH6.0)、5mM6-氨基-己-2-烯酸和0.23mMNADH組成。此外，制備空白細(xì)胞混合物(無(wú)底物)和化學(xué)物質(zhì)空白混合物(無(wú)細(xì)胞)。所有反應(yīng)瓶都被孵育于37℃。以不同時(shí)間間隔取0.5ml樣品，隨后通過離心(Eppendorf5415C離心機(jī)，10分鐘，最大轉(zhuǎn)速，4℃)從中去除細(xì)胞，將樣品貯存于-20℃，直到用于分析。在HPLC分析之前，用洗脫液(100mM高氯酸水溶液，pH1.0)將樣品稀釋5至10倍。結(jié)果概括于表1中。表1通過由Clostridiumtyrobutyricum細(xì)胞對(duì)6-AHEA進(jìn)行生物還原形成6-ACA表1顯示，Clostridiumtyrobutyricum可對(duì)6-AHEA進(jìn)行生物還原，形成6-ACA。6-ACA的濃度隨時(shí)間增加。在空白細(xì)胞混合物或化學(xué)物質(zhì)空白混合物中觀察不到6-ACA。用選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)，在IV.b描述的源條件和掃描模式下，用LC-MS-MS證實(shí)了產(chǎn)物6-ACA。V.(b)通過E.colipBAD-Ctyr(1)-enr-DEST和E.colipBAD-Mther(1)-enr-DEST將6-AHEA生物轉(zhuǎn)化為6-ACA；通過HPLC和LC-MS-MSSRM進(jìn)行分析在手套箱中，氮?dú)饬飨?，將不含O2的6-AHEA溶液(20mM，處于100mM磷酸鉀緩沖液中，pH6.0)轉(zhuǎn)移到青霉素瓶中。用丁基橡膠塞封住瓶子。之后，經(jīng)過塞子注射底物細(xì)胞(貯藏于-20℃的細(xì)胞的沉淀，重新懸浮于pH7.0的100mM磷酸鉀中)和NADH溶液來(lái)開始反應(yīng)。反應(yīng)混合物(總體積大約3ml)含有磷酸鉀緩沖液(100mM，pH6.0)、20mM6-AHEA和0.23mMNADH。此外，制備空白細(xì)胞混合物(無(wú)底物)和化學(xué)物質(zhì)空白混合物(無(wú)細(xì)胞)。44小時(shí)孵育之后，取0.5ml樣品，隨后通過離心(Eppendorf5415R離心機(jī)，14000rpm，10分鐘，4℃)從中去除細(xì)胞，將樣品貯存于-20℃，直到用于分析。在即將HPLC分析之前，用洗脫液(100mM高氯酸水溶液，pH1.0)將樣品稀釋5至10倍，在即將LC-MS-MS分析之前，用MS洗脫液(0.025％(v/v)甲酸水溶液(pH3.2))將樣品稀釋5至10倍。結(jié)果概括于表2中。表2由烯酸酯還原酶克隆E.colipBAD-Ctyr(1)-enr-DEST和E.colipBAD-Mther(1)-enr-DEST通過對(duì)6-AHEA進(jìn)行生物還原形成的6-ACA表2顯示，E.colipBAD-Ctyr(1)-enr-DEST和E.colipBAD-Mther(1)-enr-DEST兩者均能進(jìn)行從6-AHEA到6-ACA的生物還原。在空白細(xì)胞混合物或化學(xué)物質(zhì)空白混合物中觀察不到6-ACA。V.(c)通過E.coliTOP10/pBAD-nemA_Eco來(lái)進(jìn)行6-AHEA到6-ACA的生物轉(zhuǎn)化；通過LC-MS3CRM來(lái)進(jìn)行分析；制備由100mMTris-緩沖液(pH7.5)構(gòu)成的反應(yīng)混合物，其中包括20mM葡萄糖、5mM6-AHEA、7.0mMNAPDH、7.0mMNADH以及10U/ml葡萄糖氧化酶。為開始從6-AHEA到6-ACA的生物轉(zhuǎn)化，加入400μl不含細(xì)胞的E.coliTOP10/pBAD-nemA_Eco提取液(總反應(yīng)體積為1ml)。23小時(shí)和48小時(shí)之后，取250-300μl樣品用于LC-MS2SRM分析。此外，在同樣的條件下孵育化學(xué)物質(zhì)空白混合物(沒有不含細(xì)胞的提取液)，在同樣的孵育時(shí)間之后取樣。結(jié)果被概括于表3中。表3通過E.coliTOP10/pBAD-nemA_Eco的不含細(xì)胞的提取液來(lái)對(duì)6-AHEA進(jìn)行生物還原形成6-ACA表3顯示，E.coliTOP10/pBAD-nemA_Eco的不含細(xì)胞的提取液能進(jìn)行從6-AHEA到6-ACA的生物還原。在化學(xué)物質(zhì)空白混合物中觀察不到6-ACA。對(duì)這些樣品中6-ACA的驗(yàn)證是通過如下方法來(lái)進(jìn)行的測(cè)定CRM分析中測(cè)得m/z為96和79的MS3片段離子的存在和強(qiáng)度比例，將該比例與同一方式處理得到的校正標(biāo)準(zhǔn)6-ACA加以比較。表4中概括了結(jié)果。表4來(lái)自CRM分析的m/z為96和79的片段離子的強(qiáng)度比例VI從6-AHEA到6-ACA的生物轉(zhuǎn)化環(huán)化6-ACA在手套箱中，氮?dú)饬飨?，將不含O2的6-AHEA溶液(20mM，處于100mM磷酸鉀緩沖液中，pH6.0)轉(zhuǎn)移到青霉素瓶中。用丁基橡膠塞封住瓶子。之后，經(jīng)過塞子注射烯酸酯還原酶克隆E.colipBAD-Ctyr(1)-enr-DEST(貯藏于-20℃的細(xì)胞沉淀，重新懸浮于pH7.0的100mM磷酸鉀中)和NADH溶液來(lái)起始生物轉(zhuǎn)化。反應(yīng)混合物具有大約3ml的總體積，其含有磷酸鉀緩沖液(100mM，pH6.0)、20mM6-AHEA和0.23mMNADH。44小時(shí)孵育之后，取0.5ml樣品，通過離心(Eppendorf5415R離心機(jī)，10分鐘，最大轉(zhuǎn)速，4℃)從中去除細(xì)胞，將樣品貯存于-20℃，直到通過將樣品注射到偶聯(lián)有質(zhì)譜儀的氣相色譜(上文所述的GC-MS)上來(lái)開始從被形成的6-ACA到己內(nèi)酰胺的環(huán)化。通過將結(jié)果與將化學(xué)物質(zhì)空白溶液注射到同樣的氣相色譜上獲得的結(jié)果相比較，可對(duì)生物轉(zhuǎn)化中形成的6-ACA的環(huán)化加以驗(yàn)證，所述空白溶液由磷酸鉀緩沖液(100mM，pH6.0)、20mM6-AHEA和0.23mMNADH構(gòu)成。由此獲得的己內(nèi)酰胺的量被計(jì)算為大約2.7ppm。序列表<110>帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司<120>6-氨基己酸的生物化學(xué)合成<130>21726WO<160>8<170>PatentInversion3.1<210>1<211>100<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>1aagaagaccggatcctacctgacgctttttatcgcaactctctactgtttctccataccc60gttttttgggctaacacaagtttgtacaaaaaagctgaac100<210>2<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>2ttgttctacgtaaccactttgtacaagaaagctgaac37<210>3<211>68<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>3gggacaagtttgtacaaaaaagcaggctaggaggaattaaccatgaaaaacaaatcttta60tttgaacc68<210>4<211>56<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>4ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctaacagttaagtccaatttcatttcc56<210>5<211>67<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>5gggacaagtttgtacaaaaaagcaggctaggaggaattaaccatggtagcctataccaga60ctttttg67<210>6<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctaaatccctcgccctacctc50<210>7<211>69<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>7ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctaggaggaattaaccatgtcatctgaaaaact60gtattcccc69<210>8<211>55<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>8ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttacaacgtcgggtaatcggtatagc5權(quán)利要求1.用于對(duì)6-氨基己酸進(jìn)行生物化學(xué)合成的方法，其中，結(jié)構(gòu)式[1]的6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)H2N-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-COOH[1]或能被轉(zhuǎn)化為6-氨基己-2-烯酸的化合物，6-氨基-2-羥基己酸(6-AHHA)被具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶處理，所述的酶活性針對(duì)含α，β-烯酸酯基團(tuán)和伯氨基的分子，具體而言，被具有針對(duì)6-氨基己-2-烯酸的α，β-烯酸酯還原酶活性的酶處理。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶是來(lái)自一種微生物的酶，所述微生物來(lái)自Acetobacterimsp.、Acremoniumsp.、Agrobacteriumsp.、Burkholderiasp.、Cephalosporiumsp.、Clostridiumsp.、Escherichiasp.、Moorellasp.、Ochrobactrumsp.、Pseudomonassp.、Salmonellasp.、Shigellasp.、Tilachlidiumsp.、Yersiniasp.和Vibriosp.種組成的組。3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶是來(lái)自Acremoniumsp.、Clostridiumsp.、Moorellasp.、或Ochrobactrumsp.的酶。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶是來(lái)自AcremoniumstrictumCBS114157、ClostridiumtyrobutyricumDSM1460、MoorellathermoaceticaDSM1974、OchrobactrumanthropiNCIMB41200或ClostridiumkluyveriDSM555的酶。5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶具有在空氣中穩(wěn)定的α，β-烯酸酯還原酶活性，并且是來(lái)自Agrobacteriumsp.、Burkholderiasp.、Escherichiasp.、Pseudomonassp.、Salmonellasp.、Shigellasp..、Yersiniasp.和Vibriosp..種組成的組的微生物的酶。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶是來(lái)自Escherichiacoli種的酶。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶是來(lái)自EscherichiacoliK12的酶。8.如權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在3至9范圍內(nèi)的pH下將6-氨基己-2-烯酸轉(zhuǎn)化為6-氨基己酸。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述pH在4至8的范圍內(nèi)。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述pH在5至8的范圍內(nèi)。11.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在厭氧條件下，所述pH在5.5至7的范圍內(nèi)，在有氧條件下，所述pH在6.5至8的范圍內(nèi)。12.如權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法在選自由Aspergillus、Bacillus、Corynebacterium、Escherichia和Pichia屬組成的組的宿主生物中進(jìn)行。13.用于對(duì)6-氨基己酸進(jìn)行生物化學(xué)合成的宿主細(xì)胞，選自Escherichiacoli、Bacillus、Corynebacteriumglutamicum、Aspergillusniger或Pichiapastoris宿主細(xì)胞的組，其中，編碼具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶的基因被克隆和表達(dá)，所述酶活性針對(duì)含α，β-烯酸酯基團(tuán)和伯氨基的分子。14.如權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞是Escherichiacoli宿主細(xì)胞，其中，來(lái)自O(shè)chrobactrumanthropiNCIMB41200或來(lái)自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯還原酶基因被克隆和表達(dá)。15.如權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞是Bacillus宿主細(xì)胞，其中，來(lái)自MoorellathermoaceticaDSM1974，或來(lái)自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460，或來(lái)自O(shè)chrobactrumanthropiNCIMB41200，或來(lái)自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯還原酶基因被克隆和表達(dá)。16.如權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞是Corynebacteriumglutamicum宿主細(xì)胞，其中，來(lái)自MoorellathermoaceticaDSM1974，或來(lái)自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460，或來(lái)自O(shè)chrobactrumanthropiNCIMB41200，或來(lái)自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯還原酶基因被克隆和表達(dá)。17.如權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞是Aspergillusniger宿主細(xì)胞，其中，來(lái)自MoorellathermoaceticaDSM1974，或來(lái)自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460，或來(lái)自O(shè)chrobactrumanthropiNCIMB41200，或來(lái)自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯還原酶基因被克隆和表達(dá)。18.如權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞是Pichiapastoris宿主細(xì)胞，其中，來(lái)自MoorellathermoaceticaDSM1974，或來(lái)自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460，或來(lái)自O(shè)chrobactrumanthropiNCIMB41200，或來(lái)自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯還原酶基因被克隆和表達(dá)。19.如權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞選自Aspergillus、Bacillus、Corynebacterium和Pichia宿主細(xì)胞的組，其中，來(lái)自E.coliK12的在空氣中穩(wěn)定的α，β-烯酸酯還原酶基因nemA被克隆和表達(dá)。20.對(duì)6-氨基己酸進(jìn)行前體發(fā)酵的方法，其中，從6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)或從6-氨基-2-羥基己酸(6-AHHA)開始，應(yīng)用至少一個(gè)酶步驟，其中使用具有針對(duì)含α，β-烯酸酯基團(tuán)和伯氨基的分子的α，β-烯酸酯還原酶活性的酶，特別是使用具有針對(duì)6-氨基己-2-烯酸的α，β-烯酸酯還原酶活性的酶。21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述方法在能體內(nèi)形成6-氨基己-2-烯酸的微生物中進(jìn)行。22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，6-氨基己-2-烯酸是在體內(nèi)從含有合適碳源的溶液或漿體形成的。23.通過生物化學(xué)方法生產(chǎn)的6-氨基己-2-烯酸，具有與環(huán)境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例。24.通過生物化學(xué)方法生產(chǎn)的6-氨基-己酸，具有與環(huán)境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例。25.ε-己內(nèi)酰胺，其具有與環(huán)境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例，是從通過生物化學(xué)方法生產(chǎn)的6-氨基己-2-烯酸或6-氨基-己酸制造的。26.從如權(quán)利要求23或24所述通過生物化學(xué)方法生產(chǎn)的任何產(chǎn)品或從如權(quán)利要求25所述的ε-己內(nèi)酰胺制造的尼龍-6和其它衍生物，其具有與環(huán)境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例。全文摘要本發(fā)明涉及從6－氨基己－2－烯酸化合物或從6－氨基－2－羥基己酸來(lái)進(jìn)行6－氨基己酸生物化學(xué)合成的方法，這是通過用具有α，β－烯酸酯還原酶活性的酶去處理含α，β－烯酸酯基團(tuán)和伯氨基的分子來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明還涉及獲得用于此類生物轉(zhuǎn)化過程的經(jīng)過遺傳工程改造的合適的細(xì)胞的方法，以及涉及從能得到6－氨基己酸的中間產(chǎn)物進(jìn)行的對(duì)6－氨基己酸的前體發(fā)酵。最后，本發(fā)明涉及一些新穎的通過生物化學(xué)方法生產(chǎn)的化合物，即，6－氨基己－2－烯酸、6－氨基己酸，以及涉及由此生產(chǎn)的己內(nèi)酰胺，以及尼龍－6和來(lái)自此類生物化學(xué)方法生產(chǎn)的化合物或己內(nèi)酰胺的其它衍生物。文檔編號(hào)C07C229/30GK1926240SQ200580002757公開日2007年3月7日申請(qǐng)日期2005年1月17日優(yōu)先權(quán)日2004年1月19日發(fā)明者比托納拉·凱薩琳娜·拉伊馬克斯-弗蘭肯,彼得呂斯·馬蒂納斯·馬特烏斯·諾斯恩,保羅·瑪麗亞·布朗特斯,馬塞爾·格哈杜斯·烏博爾特斯,韋南德·彼得·赫勒納·派特斯,桑德拉·爾恩斯特,斯蒂法恩·馬莉亞·安德勒·德威爾德曼,馬丁·舒爾曼申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司