專利名稱：谷胱甘肽純化分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種谷胱甘肽(GSH)純化分離方法，特別是用離子交換層析法分離谷胱甘肽，屬于生物化工領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
谷胱甘肽是一種具有重要生理功能的活性三肽，它由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)肽鍵縮合而成，化學(xué)名為γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸。谷胱甘肽的相對分子質(zhì)量為307.33，熔點189～193℃(分解)，晶體呈無色透明細(xì)長柱狀，等電點為5.93。它溶于水、稀醇、液氨和二甲基甲酰胺，而不溶于醇、醚和丙酮。谷胱甘肽固體較為穩(wěn)定，而水溶液在空氣中則易被氧化。兩分子還原型谷胱甘肽(GSH)的活潑巰基氧化縮合為二硫鍵，即得到氧化型谷胱甘肽(GSSG)。
酵母的谷胱甘肽粗提液濃度非常低，而且在谷胱甘肽的粗提液中常常含有很多雜質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多糖、多肽、氨基酸、鹽類等等，因此高純度、高回收率的谷胱甘肽的工業(yè)化分離較困難。有報道的分離純化谷胱甘肽的方法有以下七種離子交換層析法，銅鹽法，銅鹽-離子交換耦合法，電滲析法，Q-瓊脂糖凝膠柱層析，雙水相結(jié)合溫度誘導(dǎo)相分離法及金屬汞親和層析。其中有工業(yè)前景的方法主要有1)離子交換層析法離子交換層析法具備離子交換與層析分離的雙重特點，從而使谷胱甘肽不僅與雜質(zhì)分離而且獲得純化，加之其具備連續(xù)操作的優(yōu)點，離子交換層析法是分離谷胱甘肽最具前途的一種生物分離方法。離子交換層析法的關(guān)鍵是高選擇性的離子交換樹脂以及分離純化條件的優(yōu)化。在日本專利(JP58,028,299)中，將谷胱甘肽抽提液在25-35℃，pH2.0-3.5，經(jīng)超濾膜除雜后，再由反滲透膜濃縮，既避免了傳統(tǒng)硅藻土過濾除雜的不徹底性，而且還有效降低了還原型谷胱甘肽的分解，提供的一例中谷胱甘肽回收率比傳統(tǒng)方法提高了15％。在日本Noguchi Sadao的專利(JP52100421)中把含有氨基酸、無機鹽等雜質(zhì)的谷胱甘肽溶液用HCl或H2SO4調(diào)節(jié)pH至3以下，用苯乙烯系樹脂進(jìn)行處理，再用洗脫劑進(jìn)行洗脫，得到谷胱甘肽溶液，經(jīng)濃縮，加入微量結(jié)晶劑，于冷藏室內(nèi)結(jié)晶。經(jīng)兩次重結(jié)晶所得到的谷胱甘肽高純物其純度達(dá)到97.5％。日本文獻(xiàn)(JP 62,246,594)均報道了離子交換層析再結(jié)合模擬移動床裝置連續(xù)分離的方法。Maki Haruhiko(Maki H，F(xiàn)ukuda H，Morikawa H.The Separation of Glutathioneand Glutamic Acid Using a Simulated Moving-Bed Adsorber system[J].Journalof Fermentation Technology，1987，6561-70)用大孔強酸性陽離子交換樹脂作為吸附劑，以低濃度的酸溶液或堿溶液洗脫，利用模擬移動床來分離制備谷胱甘肽，谷胱甘肽的純度為75％以上，回收率為60％。上述離子交換層析法分離谷胱甘肽時，由于谷胱甘肽與谷氨酸性質(zhì)相近，谷氨酸作為谷胱甘肽合成的前體物質(zhì)，在酵母細(xì)胞中的含量與谷胱甘肽相當(dāng)，谷氨酸與谷胱甘肽的等電點接近，所以在一定的PH值范圍內(nèi)，所帶電荷相同，故造成分離的難度增大，因此分離時不但需要嚴(yán)格控制液樣PH值及洗脫液種類等工藝條件，且單柱的分離效率低，需經(jīng)過反復(fù)分離。
2)金屬汞親和層析谷胱甘肽是一種巰基化合物，由于巰基化合物具有很強的與汞化學(xué)親和作用因此用含汞樹脂提取含巰基化合物能取得良好的效果。報道用金屬離子汞親和層析分離谷胱甘肽的方法(王輝.含汞樹脂分離提純谷胱甘肽[J].華東理工大學(xué)學(xué)報，1996，22(6)717-721；苑小林，等.鮮酵母中谷胱甘肽(GSH)分離純化的初步研究[J].藥物生物技術(shù)，1998，5(2)89-91)。該方法先將對氨基苯汞乙酸-二乙烯基苯載體上，形成含汞樹脂用于提取谷胱甘肽，提高樹脂的選擇性，其操作容量為每立升樹脂吸附谷胱甘肽0.16mol，pH影響樹脂對谷胱甘肽的吸附，適宜的pH為3-9。高濃度鹽對洗脫有直接影響。樹脂對其它物質(zhì)也有不同程度的吸附，在高濃度鹽的條件下，易使汞從樹脂上斷開，從而影響產(chǎn)品的純度。當(dāng)樹脂用于提取酵母提取液中的谷胱甘肽時，控制pH在3.0-4.0時能得到很好的分離效果。其中，王輝等做得谷胱甘肽回收率為54.3％。雖然金屬離子汞親和層析制取谷胱甘肽有選擇性好等優(yōu)點，但存在汞污染，回收率低等缺點，尤其不適用于藥用、食用谷胱甘肽的生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決了離子交換層析法分離介質(zhì)的高度專一性和選擇性，從而提供了一種從谷胱甘肽抽提液中一步分離獲得高純谷胱甘肽的分離方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案包括在層析柱中離子交換、一定PH值范圍的緩沖液平衡及酸、堿洗脫過程，其中層析分離介質(zhì)是帶有-S-R基團(tuán)或-S-S-R’基團(tuán)的樹脂類、纖維素類、交聯(lián)葡聚糖或交聯(lián)瓊脂糖類物質(zhì)，其中R是氫原子(H)，二氨基甲基(CH(NH2)2)，R’是吡啶基(C5H4N)、乙基(C2H5)等基團(tuán)，將預(yù)處理后的分離介質(zhì)填裝成層析柱，用pH值1.0～10.0的緩沖液平衡層析柱，調(diào)pH值為1.0～10.0的谷胱甘肽抽提液上樣，用同樣的緩沖液沖洗后，洗脫得到含谷胱甘肽的洗脫液。
上述類介質(zhì)可以是苯乙烯系、丙乙烯系、甲基丙烯酸系、丙烯酸系、苯烯酸系、環(huán)氧系等帶有-S-R基團(tuán)或-S-S-R’基團(tuán)的樹脂。
上述緩沖液可以是磷酸氫二鈉(鉀、銨)-磷酸二氫鈉(鉀、銨)緩沖液，三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，乙酸-乙酸鈉緩沖液，鹽酸-磷酸氫二鈉(鉀、銨)緩沖液，巴比妥-鹽酸緩沖液等。
本發(fā)明的洗脫過程為通常的酸、堿洗脫方法。帶有-S-R基團(tuán)或-S-S-R’基團(tuán)的分離介質(zhì)可以選擇市售產(chǎn)品，如LSC-200牌號的苯乙烯系樹脂，及LSC-400牌號的苯乙烯系樹脂，也可以合成方法制備。
本發(fā)明的效果是(1)采用了含有-S-R基團(tuán)或-S-S-R’基團(tuán)的分離介質(zhì)，因而與含有-SH基的谷胱甘肽可以形成-S-S-鍵，對谷胱甘肽具有高度專一性和選擇性，有效地將谷胱甘肽從其抽提液中分離出來，一步分離的谷胱甘肽就達(dá)到高度純化，結(jié)晶后谷胱甘肽純度可以達(dá)到99％。(2)由于該分離介質(zhì)對谷胱甘肽的高度選擇性，緩沖液PH值及洗脫控制條件范圍寬，便于控制，樹脂吸附谷胱甘肽后用堿或酸洗脫得到的溶液經(jīng)HPLC檢測主要成份為谷胱甘肽，僅含有很少量的雜質(zhì)，并且具有濃縮效果，洗脫液體積減少45％，谷胱甘肽濃度增加近兩倍，洗脫得率可達(dá)80～95％，實現(xiàn)從酵母抽提液中一步分離谷胱甘肽就達(dá)到高度純化的效果，大大提高單柱分離效率。
具體實施例方式實施例1將含有-SH基團(tuán)的苯乙烯系樹脂預(yù)處理后填裝在1.0cm×40cm的層析柱中，用pH值7.0的0.2M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液平衡層析柱，然后用調(diào)pH值為7.0的GSH抽提液上樣30ml(0.7mgGSH/ml)，用同樣的緩沖液沖洗后，用0.2M的氫氧化鈉洗脫，可得到只含GSH的洗脫液，洗脫得率可達(dá)92％，結(jié)晶后純度達(dá)？99％實施例2將含有-S-S-C5H4N基團(tuán)的苯乙烯系樹脂預(yù)處理后填裝在3.5cm×40cm的層析柱中，用pH值10.0的0.5M Tris-鹽酸緩沖液平衡層析柱，然后用調(diào)pH值為10.0的GSH抽提液上樣300ml(0.7mgGSH/ml)，用同樣的緩沖液沖洗后，用0.2M的鹽酸洗脫，可得到只含GSH的洗脫液，洗脫得率可達(dá)86％。結(jié)晶后純度達(dá)？99％。
實施例3將含有-SH基團(tuán)的苯乙烯系樹脂預(yù)處理后填裝在7.0cm×40cm的層析柱中，用pH值4.0的0.1M乙酸-乙酸鈉緩沖液平衡層析柱，然后用調(diào)pH值為4.0的GSH抽提液上樣1300ml(0.7mgGSH/ml)，用同樣的緩沖液沖洗后，用0.1M～0.2M的氨水梯度洗脫，可得到只含GSH的洗脫液，洗脫得率可達(dá)84％。
實施例4將含有-S-CH(NH2)2基團(tuán)的苯乙烯系樹脂預(yù)處理后填裝在7.0cm×40cm的層析柱中，用pH值3.0的0.2M磷酸氫二銨-HCl緩沖液平衡層析柱，然后用調(diào)pH值為3.0的GSH抽提液上樣1300ml(0.7mgGSH/ml)，用同樣的緩沖液沖洗后，用0.1M～0.2M的氫氧化鈉梯度洗脫，可得到只含GSH的洗脫液，洗脫得率可達(dá)92％。結(jié)晶后純度達(dá)？99％。
實施例5將含有-S-S-C5H4N基團(tuán)交聯(lián)葡聚糖介質(zhì)填裝在1.0cm×40cm的層析柱中，用pH值3.0的0.2M磷酸氫二鈉-HCl緩沖液平衡層析柱，然后用調(diào)pH值為3.0的GSH抽提液上樣30ml(0.7mgGSH/ml)，用同樣的緩沖液沖洗后，用0.15M的氫氧化鈉洗脫，可得到只含GSH的洗脫液，洗脫得率可達(dá)90％。
實施例6將含有-S-CH(NH2)2基團(tuán)的交聯(lián)瓊脂糖介質(zhì)填裝在3.5cm×40cm的層析柱中，用pH值7.0的0.2M巴比妥-鹽酸緩沖液平衡層析柱，然后用調(diào)pH值為7.0的GSH抽提液上樣300ml(0.7mgGSH/ml)，用同樣的緩沖液沖洗后，用0.1M～0.2M的鹽酸梯度洗脫，可得到只含GSH的洗脫液，洗脫得率可達(dá)88％。
實施例7
將含有-SH基團(tuán)的甲基丙烯酸系樹脂經(jīng)過預(yù)處理樹脂填裝在7.0cm×40cm的層析柱中，用pH值1.0的0.2M磷酸氫二銨-磷酸二氫銨緩沖液平衡層析柱，然后用調(diào)pH值為1.0的GSH抽提液上樣1300ml(0.7mgGSH/ml)，用同樣的緩沖液沖洗后，用0.15M的氫氧化鈉洗脫，可得到只含GSH的洗脫液，洗脫得率可達(dá)85％。
權(quán)利要求
1.一種谷胱甘肽純化分離方法，包括在層析柱中離子交換、一定PH值范圍的緩沖液平衡及酸、堿洗脫過程，其特征在于層析分離介質(zhì)是帶有-S-R基團(tuán)或-S-S-R’基團(tuán)的樹脂、纖維素、交聯(lián)葡聚糖或交聯(lián)瓊脂糖，其中R是氫原子或二氨基甲基基團(tuán)，R’是吡啶基、乙基基團(tuán)，將預(yù)處理后的分離介質(zhì)填裝成層析柱，用pH值1.0～10.0的緩沖液平衡層析柱，調(diào)pH值為1.0～10.0的谷胱甘肽抽提液上樣，用同樣的緩沖液沖洗后，洗脫得到含谷胱甘肽的洗脫液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于分離介質(zhì)所用的樹脂是帶有-S-R基團(tuán)或-S-S-R’基團(tuán)的苯乙烯系樹脂、丙乙烯系樹脂、甲基丙烯酸系樹脂、丙烯酸系樹脂、苯烯酸系樹脂或環(huán)氧系樹脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于緩沖液是磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、鹽酸-磷酸氫二鈉緩沖液或巴比妥-鹽酸緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種谷胱甘肽純化分離方法，選擇了含有－S－R基團(tuán)或－S－S－R’基團(tuán)(的分離介質(zhì)，將分離谷胱甘肽的介質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理后，填裝成層析柱，用pH值1.0～10.0的緩沖液平衡層析柱，調(diào)pH值為1.0～10.0的谷胱甘肽抽提液上樣，用同樣的緩沖液沖洗后，用堿或酸洗脫，可得到只含谷胱甘肽的洗脫液。由于介質(zhì)對谷胱甘肽的高度專一選擇吸附，可以有效地將谷胱甘肽分離出來，實現(xiàn)從谷胱甘肽抽提液中一步分離就高度純化，谷胱甘肽結(jié)晶后可以得到純度為99％的產(chǎn)品。
文檔編號C07K1/00GK1807447SQ200510002408
公開日2006年7月26日 申請日期2005年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月21日
發(fā)明者譚天偉, 丁軻 申請人:北京化工大學(xué)