一種雷帕霉素的分離純化方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領域，具體涉及一種雷帕霉素的分離純化方法。
【背景技術】
[0002]雷帕霉素(Rapamycin)現(xiàn)稱為西羅莫司(Sirolimus)，是1975年由Veniza等分離得到的吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)所產(chǎn)的大環(huán)內(nèi)脂類抗生素。經(jīng)過多年的研宄雷帕霉素現(xiàn)已被開發(fā)成為臨床使用的強效免疫抑制劑。同時以雷帕霉素為前體，化學修飾合成所得的一些結構新穎衍生物，被發(fā)現(xiàn)在免疫抑制、抗癌、抗帕金森氏癥與艾滋病等方面上，具有新的治療作用，其中其合成物Temsirolimus、Everolimus、AP23573已作為抗腫瘤靶向新藥物進行臨床研宄，雷帕霉素在醫(yī)藥應用領域具有廣泛前景。
[0003]當前雷帕霉素的生產(chǎn)主要通過發(fā)酵法生產(chǎn)，如中國發(fā)明專利申請公布書CN101486976A所述一般西羅莫司發(fā)酵效價只有200 μ g/ml左右，發(fā)酵副產(chǎn)物較多，導致后序提取時的層析分離比較困難，工作較為復雜，酵培養(yǎng)的發(fā)酵液經(jīng)過濾得菌體后經(jīng)甲醇萃取濃縮后，再通過一系列純化工藝如色譜層析、萃取、結晶等獲得西羅莫司純品，產(chǎn)品收率低于20%。所以該說明書公開了一種吸水鏈霉菌及其應用的技術方案，提供了一種高單位的西羅莫司產(chǎn)生菌，效價為600 μ g/ml以上，但是產(chǎn)品收率只達到了 30?35%。
[0004]CN102443012A公布了一種高純度提取純化方法a.用丙酮或乙醇抽提發(fā)酵液過濾后得到的菌絲體，得到抽提液后，真空濃縮得濃縮抽提液；b.用乙酸乙酯萃取發(fā)酵液過濾后得到的上清液，分離乙酸乙酯相得萃取液，真空濃縮得濃縮萃取液；c.將a中的濃縮抽提液和b中的濃縮萃取液合并得濃縮液，并加入到裝有大孔樹脂的床層進行吸附，用丙酮和水的混合溶液作為洗滌劑洗滌大孔樹脂，收集洗脫液并真空濃縮，得濃縮洗脫液；d.用乙酸乙酯萃取c得到的濃縮洗脫液，經(jīng)無水硫酸鈉或無水硫酸鎂脫水后真空濃縮得濃縮液，上樣硅膠柱進行層析分離，正庚烷和丙酮混合溶液作為洗滌劑洗滌硅膠柱，正庚烷和丙酮混合溶液作為洗脫劑洗脫硅膠柱，收集洗脫液并真空濃縮得濃縮液；e.將步驟d得到的濃縮液溶于石油醚或乙醚中結晶，干燥得到雷帕霉素粗品。f.丙酮溶解雷帕霉素粗品，真空濃縮后用乙醚重結晶，干燥得到雷帕霉素純品。
[0005]楊國新等在《海峽藥學》(2007年，第19卷第17期，25-26頁)文獻中公開:發(fā)酵液經(jīng)離心后得到菌絲體，菌絲體用兩倍量體積的95%酒精分別浸泡兩次，離心棄菌絲渣，合并酒精浸泡液，減壓濃縮去除酒精。殘留液用等體積的乙酸乙酯分別萃取兩次，合并乙酯層并用飽和NaCl溶液洗滌I次，經(jīng)無水似2504干燥Ih后，過濾，減壓濃縮除去乙酸乙酯得上柱物。上柱物溶于適當體積的洗脫劑(乙酯-石油醚洗脫系統(tǒng))，200?300目硅膠柱層析，分段收集，HPLC檢測，合并含西羅莫司的洗脫液，減壓濃縮，濃縮液經(jīng)乙醚結晶，洗晶，結晶。經(jīng)上述制備的西羅莫司結晶溶于少量的洗脫劑，硅膠(200?300目)柱層析分離，分部收集，分離過程用高效液相跟蹤檢測。合并含西羅莫司的洗脫液，減壓濃縮，濃縮液經(jīng)乙醚結晶，洗晶，重結晶得高純度西羅莫司樣品。
[0006]美國專利公布說明書US20100029933A1公布了雷帕霉素的純化技術方案，該方案從發(fā)酵液中純化得到純品純度達到98.8%，總雜質(zhì)含量小于1.2%，單雜低于0.15%，提純方案為a)用疏水性溶劑萃取發(fā)酵液中的雷帕霉素并濃縮b)加入親水性的溶劑分離雜質(zhì)；c)將步驟得到的產(chǎn)物吸附到惰性載體上，用堿和酸連續(xù)洗滌，然后洗脫；d)收集步驟c得到的洗脫液或直接用步驟b中含雷帕霉素的溶液，上硅膠柱，收集洗脫液；e)將步驟d)得到的產(chǎn)物結晶；f)溶解f步驟中的結晶品，進行疏水作用或反相色譜；并將g重結晶得到的高哦純度的雷帕霉素但是利用該方法純化收率不高，在一個具體實例中可以得知Ilkg的雷帕霉素發(fā)酵液最后的純品只有6g，稱取3g純品進一步純化結晶得到2.5g。
[0007]朱健等在中國醫(yī)藥工業(yè)雜志發(fā)表的文章《他克莫司產(chǎn)生菌的選育和生產(chǎn)工藝研宄》中公開了采用發(fā)酵液板框所得菌體丙酮浸泡，抽提液濃縮或加水稀釋使丙酮濃度〈50%(V/V)，用大孔吸附樹脂吸附，低濃度的丙酮解析，再以高濃度丙酮解析。濃縮脫除丙酮，雷帕霉素不溶于水而形成沉淀，沉淀用乙醇溶解后結晶。初次結晶得到的純度約為90%，乙醇重結晶I?2次后，純度可提尚至95%。
[0008]藤澤藥業(yè)工業(yè)公司(徐親民.他克莫司的工業(yè)化研宄[J].國外醫(yī)藥抗生素分冊，2000, 21(4): 151-155)報道采用主要工藝為收集菌絲體，丙酮浸泡，濃縮，經(jīng)過Dia1nHP20樹脂處理，洗脫液濃縮后乙酸乙酯萃取，萃取液濃縮后經(jīng)過酸性硅膠柱層析，再次經(jīng)普通硅膠層析，最后通過乙腈重結晶得到產(chǎn)品。
[0009]從以上幾個專利文獻資料的提取純化工藝中，我們可以看到雷帕霉素的粗制純度提高至95%，雷帕霉素的精制純度提高到了 99.8%以上，或者是單雜以及總雜的含量也降低到了 0.15%和1.2%以下，但是其提取純化過程處理工藝繁瑣，時間周期長，尤其是經(jīng)歷兩次硅膠柱層析，成本高，柱損耗也大大降低了收率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明針對現(xiàn)有生產(chǎn)技術中存在的工藝繁瑣，生產(chǎn)時間周期長，生產(chǎn)成本高，收率低，產(chǎn)品純度低等不足，提供一種雷帕霉素的提純方法，其優(yōu)點是工藝操作性強，獲得的產(chǎn)品的純度高，收率高，適合在工業(yè)規(guī)模上生產(chǎn)高純度雷帕霉素。
[0011]本發(fā)明的技術方案為:利用吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus ACCCN0.40417)，通過微生物發(fā)酵培養(yǎng)出含雷帕霉素的發(fā)酵液，雷帕霉素發(fā)酵液經(jīng)種子培養(yǎng)、接種前準備、接種、多階段溶氧控制、分批補料發(fā)酵階段，并采用菌絲體收集、浸提、萃取、活性炭吸附、硅膠柱層析、及冷卻析晶技術得到雷帕霉素。
[0012]優(yōu)選地，具體包括如下步驟:
[0013]A.浸提:收集雷帕霉素發(fā)酵液，過濾得菌絲體，將菌絲體浸入菌絲體質(zhì)量的5-9倍體積的有機溶劑乙醇或丙酮中，攪拌同時進行間歇超聲處理，浸提3h后混合液過濾，濾液抽提2次后得到菌絲體浸提液；
[0014]B.萃取:將菌絲體浸提液進行真空減壓濃縮，直到蒸出乙醇濃度低于20%為止，向濃縮液中加入(1:0.02kg/kg)無水硫酸鋅和(1:0.002，kg/kg)十二燒基苯磺酸鈉(SDBS)，使用乙酸乙酯進行萃取，收集萃取相；
[0015]C.活性炭吸附:向萃余相中加入(1:0.001-0.002，L/kg)醫(yī)用針形活性炭，攪拌10-40min后過濾，收集濾液；
[0016]D.粗結晶:將步驟3)所得的濾液減壓濃縮，直至蒸出的蒸汽中不含乙酸乙酯，收集濃縮液，向濃縮液中添加濃縮液1-3倍體積的環(huán)己烷，充分攪拌后置于4°C下析晶24h，析晶液抽濾，即可得到雷帕霉素粗品；
[0017]E.硅膠柱層析:用正己烷、丙酮混合液(3-4:1，v/v)溶解雷帕霉素粗品，將溶液加入硅膠層析柱中，分別使用正己烷丙酮混合液梯度洗脫，分段收集，同時使用HPLC在線檢測，收集含雷帕霉素單一成分的洗脫液；
[0018]F.結晶:將步驟5)得到的濃縮液溶于環(huán)己烷與丙酮混合溶劑中結晶，得到雷帕霉素晶體，干燥得到雷帕霉素半成品；
[0019]G.重結晶:將雷帕霉素半成品溶于乙酸乙酯與乙醚混合溶劑中結晶，于結晶罐中降溫攪
[0020]拌析晶，6h后對結晶液進行抽濾，得到雷帕霉素晶體。
[0021]進一步優(yōu)選地，包括如下步驟:
[0022]A.浸提:
[0023]收集雷帕霉素液，通過板框壓濾機實現(xiàn)固液分離，得到菌絲體，將菌絲體浸入菌絲體質(zhì)量的5-9倍體積的有機溶劑乙醇或丙酮中，開啟攪拌同時對料液進行間歇超聲處理，浸提3h后混合液再次通過板框壓濾機壓濾收集濾液，進行抽提2次，得到菌絲體浸提液；并取樣檢測濃度，通過計算收率在95%以上；
[0024]步驟A所述的有機溶劑優(yōu)選為90 %的乙醇-水溶液；
[0025]B.萃取:
[0026]將菌絲體浸提液進行真空減壓濃縮，直到蒸出乙醇濃度低于20%為止，添加(1:0.02kg/kg)無水硫酸鋅和(1:0.002，kg/kg)十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)，使用1-4倍體積乙酸乙酯進行萃取，攪拌10-30min后，靜置6_10h，分離萃取相與萃余相，收集萃取相，萃取收率在98%以上；
[0027]步驟B所述萃取使用乙酸乙酯體積