專利名稱：EphA2激動性單克隆抗體及其使用方法
1.發(fā)明領(lǐng)域本申請要求2003年11月20日提交的美國專利臨時申請No.60/524,177的優(yōu)先權(quán)，后者是2003年5月12日提交的美國專利非臨時申請No.10/436,783的部分繼續(xù)申請，此非臨時申請要求2002年5月10日提交的美國專利臨時申請No.60/379,368和2002年10月14日提交的60/418,204和2003年4月3日提交的60/460,358的優(yōu)先權(quán)，這些專利申請的全部內(nèi)容均納入本文作參考。
本發(fā)明涉及用于治療、控制或預(yù)防癌癥的方法和組合物。本發(fā)明的方法包括給予有效量的一種或多種EphA2的特異性抗體，優(yōu)選單克隆抗體，這些抗體是EphA2的激動劑，和/或能優(yōu)先選擇性結(jié)合在癌細(xì)胞而不是非癌細(xì)胞上暴露或數(shù)量增加的EphA2表位。本發(fā)明也提供了只含有本發(fā)明的一種或多種單克隆抗體，或該抗體與一種或多種用于癌癥治療的其它藥物相組合的藥物組合物。還提供了有治療作用的抗EphA2抗體的檢測方法和篩選方法。
2.發(fā)明背景癌癥癌或腫瘤是由于細(xì)胞生長異常和失控所產(chǎn)生的贅生腫塊，可以是良性或惡性。良性腫瘤通常維持在局部區(qū)域。惡性腫瘤統(tǒng)稱為癌。術(shù)語“惡性”一般指腫瘤可能入侵和破壞相鄰的機體結(jié)構(gòu)和擴散到遠(yuǎn)處部位引起死亡(綜述見Robbins和Angell，1976，Basic Pathology，第二版，W.B.Saunders Co，Philadelphia，68-122頁)。癌可發(fā)生在機體的許多部位，根據(jù)其起源有不同的表現(xiàn)。癌細(xì)胞能破壞其起源的機體組織部分，然后擴散到機體的其它部分，在那兒開始新的增殖而引起更大的破壞。
每年有1,200萬以上的美國人發(fā)生癌癥。癌癥是美國第二主要死亡原因，如果此傾向持續(xù)下去，到2010年預(yù)計癌癥將成為主要的死亡原因。肺癌和前列腺癌是美國男性的頂級癌癥殺手。肺癌和乳腺癌則是美國婦女的頂級癌癥殺手。美國男性兩人中在其生命期間的某時候有一人會診斷患有癌癥。美國婦女三人中在其生命期間的某時候會有一人診斷患有癌癥。
尚沒發(fā)現(xiàn)可治愈的癌癥。目前可選擇的治療方法，包括手術(shù)、化療和放射治療常常要么無效，要么有嚴(yán)重的副作用。
轉(zhuǎn)移癌當(dāng)腫瘤細(xì)胞群落獲得在體內(nèi)轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)距離和外部位點的能力時，就產(chǎn)生了大多數(shù)威脅生命的癌。這些轉(zhuǎn)移性細(xì)胞通過克服通常限制細(xì)胞轉(zhuǎn)移到不同組織的限制條件而存活。例如，如果將一般的乳腺上皮細(xì)胞移植到肺部，那么它一般不能生長或存活，然而肺轉(zhuǎn)移瘤是乳腺癌發(fā)病率和死亡率的主要原因。近來有證據(jù)表明，在原發(fā)性腫瘤在臨床上有表現(xiàn)之前的很長時間，轉(zhuǎn)移性細(xì)胞就可擴散到了全身。在檢測到并除去原發(fā)性腫瘤之后，這些微轉(zhuǎn)移性細(xì)胞可以保持休眠幾個月或幾年。因此，更好地了解轉(zhuǎn)移性細(xì)胞在外部微環(huán)境中的生長和存活機理對于改進治療非常重要，這樣可以對抗轉(zhuǎn)移性癌癥，并可較早地診斷和定位轉(zhuǎn)移。
癌細(xì)胞信號癌癥是一種異常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)疾病。異常細(xì)胞信號克服對細(xì)胞生長和存活的錨定依賴性限制(Rhim等人，Critical Reviews in Oncogenesis 8305，1997；Patarca，Critical Reviews in Oncogenesis 7343，1996；Malik等人，Biochimicaet Biophysica Acta 128773，1996；Cance等人，Breast Cancer Res Treat 35105，1995)。酪氨酸激酶活性是由ECM錨定誘導(dǎo)的，而且確實地，酪氨酸激酶的表達(dá)或功能通常在惡性細(xì)胞中增大(Rhim等人，Critical Reviews inOncogenesis 8305，1997；Cance等人，Breast Cancer Res Treat 35105，1995；Hunter，Cell 88333，1997)。基于惡性細(xì)胞生長需要酪氨酸激酶活性的事實，酪氨酸激酶成為新治療方法的標(biāo)靶(Levitzki等人，Science 2671782，1995；Kondapaka等人，Molecular & Cell Endocrinology 11753，1996；Fry等人，Current Opinion in BioTechnology 6662，1995)。不幸地是，與腫瘤細(xì)胞特異性有關(guān)的障礙經(jīng)常限制這些藥物的應(yīng)用。具體而言，酪氨酸激酶活性通常對于良性組織的功能和存活是至關(guān)重要的(Levitzki等人，Science 2671782，1995)。為了使間接毒性最小化，識別在腫瘤細(xì)胞中選擇性過表達(dá)的酪氨酸激酶，然后以其為標(biāo)靶非常重要。
EphA2EphA2是成熟上皮中表達(dá)的一種130Kd的受體酪氨酸激酶，發(fā)現(xiàn)其在上皮中含量低但在細(xì)胞-細(xì)胞粘附部位含量豐富(Zantek等，.Cell Growth &Differetiation.10629，1999；Londberg等.，Molecular & Cellular Biology.106316，1990)。其亞細(xì)胞定位很重要，因為EphA2結(jié)合的配體(稱為EphrinsA1-A5)錨定在細(xì)胞膜上(Eph Nomenclature Committee，1997，Cell.90403；Gale等.，1997，Cell & Tissue Research.290227)。配體結(jié)合的主要結(jié)果是EphA2自身磷酸化(Lindberg等，1990，同上)。然而，與其它受體酪氨酸激酶不同，EphA2在缺少配體結(jié)合或磷酸酪氨酸成分時仍能保持酶活性(Zantek等，1999，同上)。大多數(shù)侵襲性癌細(xì)胞上的EphA2表達(dá)上調(diào)。
癌癥治療發(fā)展抗轉(zhuǎn)移試劑的一個障礙是用于設(shè)計和評估這些藥物的分析系統(tǒng)。大多數(shù)常規(guī)癌癥治療是以快速生長的細(xì)胞為靶。然而，癌細(xì)胞并不一定必需地快速生長，而是可以在不允許正常細(xì)胞存活的條件下存活或生長(Lawrence和Steeg，1996，World J.Urol.14124-130)。正常細(xì)胞與惡性細(xì)胞行為上的這些基本差異為治療靶提供了機會。擴散到全身的微轉(zhuǎn)移腫瘤的實例強調(diào)了在外部和三維微環(huán)境中需要評估可能的化學(xué)治療藥物。在常用細(xì)胞培養(yǎng)條件下可用多種標(biāo)準(zhǔn)癌藥物分析法來測量腫瘤細(xì)胞的生長或存活(即單層生長)。然而，細(xì)胞行為在二維分析中通常不能可靠地預(yù)測體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞行為。
如今，癌癥治療可以包括外科治療、化學(xué)治療、激素治療和/或放射治療，以根除患者的腫瘤細(xì)胞(參見，例如，Stockdale，1998，″Principles of CancerPatient Management″，Scientific American Medicine，卷3，Rubenstein和Federman，第12章，第IV部分)。近來，癌癥治療也可以包括生物治療或免疫治療。所有這些方法對患者而言都有明顯的缺點。例如，外科治療可能由于患者的健康情況而不適宜，或者患者不能接受。此外，外科治療不可能完全除去腫瘤組織。放射治療只有在新生組織比正常組織表現(xiàn)出更高的放射敏感性時才有效，同時放射治療還會產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。激素治療雖然是有效的，但是其很少以單一試劑給予，其經(jīng)常在使用其它治療除去大部分癌細(xì)胞后，用于預(yù)防或延緩癌癥復(fù)發(fā)。生物治療/免疫治療受到次數(shù)限制，并且每種治療通常只對極特定類型的癌癥有效。
關(guān)于化學(xué)治療，有多種化學(xué)治療性試劑可用于治療癌癥。大部分癌癥化學(xué)治療是直接抑制DNA合成或間接抑制脫氧(核糖)核苷三磷酸前體的生物合成以預(yù)防DNA復(fù)制和伴隨的細(xì)胞分裂(參見，例如，Gilman等人，Goodman和Gilman′sThe Pharmacological Basis of Therapeutics，第八版(Pergamom Press，New York，1990))。這些試劑包括烷基化試劑，如亞硝基脲，抗代謝物，如甲氨蝶呤和羥基脲，及其它試劑，如依托泊苷(etoposide)，campathecins，博來霉素，多柔比星，柔紅霉素等，盡管它們具有必需的細(xì)胞周期特異性，但是由于它們對DNA復(fù)制起作用，因此可以在S期殺死細(xì)胞。其它試劑，具體而言是秋水仙堿和長春花生物堿，如長春堿和長春新堿，可以干擾微管組裝，從而使有絲分裂停滯?；瘜W(xué)治療方法通常包括給予化學(xué)治療性試劑的組合來提高治療效果。
盡管可以使用多種化學(xué)治療性試劑，但是化學(xué)治療具有很多缺點(參見，例如，Stockdale，1998，″Principles of Cancer Patient Management″，ScientificAmerican Medicine，卷3，Rubenstein和Federman，第12章，第10部分)。幾乎所有的化學(xué)治療性試劑都有毒性，而且化學(xué)治療會引發(fā)明顯的并經(jīng)常是很危險的副作用，包括嚴(yán)重惡心，骨髓抑制，免疫抑制等。此外，即使給予化學(xué)治療性試劑的組合，很多腫瘤細(xì)胞仍對化學(xué)治療性試劑具有抵抗性或會發(fā)展成具有抵抗性。事實上，對治療方法中使用的特定化學(xué)治療性試劑有抵抗性的那些細(xì)胞經(jīng)常被證實對其它藥物也有抵抗性，即使那些試劑的作用機理不同于特異性治療中所用藥物的作用機理；這種現(xiàn)象稱為多向耐藥性或多藥耐藥性。因此，由于耐藥性，多種癌癥難于進行標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)治療。
這樣就明顯需要可選擇的癌癥治療方法，尤其是用于治療難于用標(biāo)準(zhǔn)癌癥治療法(如外科治療，放射治療，化學(xué)治療，及激素治療)治療的癌癥的治療方法。此外，僅通過一種方法來治療癌癥非常少見。因此，需要研發(fā)治療癌癥的新治療性試劑和治療癌癥的新的更有效的治療組合。
3.發(fā)明概述在許多惡性癌癥中，EphA2都過度表達(dá)并發(fā)生功能變化。EphA2是一種癌蛋白并且能充分賦予癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力。惡性細(xì)胞上EphA2的過度表達(dá)表現(xiàn)出其激酶活性不依賴于與配體的結(jié)合。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)EphA2水平降低可導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)移行為減少。具體來說，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，能激發(fā)EphA2，即誘導(dǎo)EphA2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗體，確實能降低EphA2的表達(dá)和抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和/或轉(zhuǎn)移。雖然不想受到任何作用機制的束縛，但認(rèn)為激動性抗體可通過誘導(dǎo)EphA2自身磷酸化，從而導(dǎo)致隨后的EphA2降解而下調(diào)其表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的行為。因此本發(fā)明的抗體可促進EphA2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并增強EphA2的磷酸化(“EphA2激動性抗體”)。
根據(jù)亞細(xì)胞位置，配體結(jié)合屬性或蛋白組織(例如，結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞膜中的方向)的差異可以進一步區(qū)分癌細(xì)胞上的EphA2和非癌細(xì)胞上的EphA2。在非癌細(xì)胞中，EphA2以低水平表達(dá)并定位在細(xì)胞-細(xì)胞接觸位點，在該處它與其膜錨定配體結(jié)合。然而，癌細(xì)胞通常表現(xiàn)出較低的細(xì)胞間接觸，這可以降低EphA2-配體的結(jié)合。此外，EphA2的過表達(dá)可能使EphA2相對于配體過量，這會提高非配體結(jié)合的EphA2的量。因此，改變EphA2的亞細(xì)胞分布或膜定向可以使EphA2定位到癌細(xì)胞中配體不能接近的位置。此外，在癌細(xì)胞中EphA2可以具有變化的配體結(jié)合屬性(例如，由于變化構(gòu)型的原因)，這使得其不能與其配體穩(wěn)定地相互作用，而不論其是否被定位到細(xì)胞間的連接處。在每種情況下，這些變化都能在癌細(xì)胞的EphA2上暴露出在非癌細(xì)胞中不會暴露出的某些抗原表位。因此，本發(fā)明也提供如下抗體其可特異性結(jié)合EphA2，但優(yōu)選結(jié)合在癌細(xì)胞而不是非癌細(xì)胞上暴露的EphA2抗原表位(“暴露的EphA2表位抗體”)。使癌細(xì)胞暴露于這種EphA2抗體(其優(yōu)選結(jié)合在癌細(xì)胞而不是非癌細(xì)胞上選擇性暴露或增加的EphA2表位)可以使治療/預(yù)防抗體以癌細(xì)胞為靶，并具有防止或降低細(xì)胞增生的能力，同時不傷害非癌細(xì)胞。
本發(fā)明提供篩選和鑒定能結(jié)合和激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先選擇性結(jié)合在癌細(xì)胞而不是非癌細(xì)胞上暴露或數(shù)量增加的EphA2表位的抗體，優(yōu)選是單克隆抗體。具體來說，本發(fā)明的抗體能結(jié)合EphA2的胞外結(jié)構(gòu)域，優(yōu)先誘導(dǎo)EphA2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和EphA2自身磷酸化。另一具體實施方案中，本發(fā)明的抗體能結(jié)合EphA2的胞外結(jié)構(gòu)域和優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞而不是非癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位。在一實施方案中，本發(fā)明的抗體是EA2、EA3、EA4和EA5。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體是人的、人源化的或嵌合抗體。
在一實施方案中，要鑒定優(yōu)先結(jié)合暴露在癌細(xì)胞而不是非癌細(xì)胞上的EphA2表位的抗體，可篩選能優(yōu)先結(jié)合未與配體(如EphrinA1)結(jié)合的且不位于細(xì)胞-細(xì)胞接觸部位的EphA2的抗體。本領(lǐng)域中用于測定細(xì)胞上抗體結(jié)合/定位的任何公知方法都可用于篩選具有所需結(jié)合屬性的候選抗體。在特定實施方案中，免疫熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀被用于測定抗體的結(jié)合屬性。在此實施方案中，當(dāng)EphA2與配體結(jié)合并定位至細(xì)胞-細(xì)胞接觸處時與EphA2的結(jié)合較差而與細(xì)胞上的自由EphA2很好結(jié)合的抗體也包括在本發(fā)明中。在另一個特定實施方案中，使用基于細(xì)胞的分析或ELISA分析，來選擇具有與配體(例如，細(xì)胞錨定的或純化的配體)競爭結(jié)合EphA2能力的EphA2抗體。
在一實施方案中，本發(fā)明的抗體是EA2、EA3、EA4和EA5。在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體是人或人源化抗體。在最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體是人源化EA2、EA3、EA4或EA5。在一具體實施方案中，本發(fā)明的抗體不是EA2或EA5。
因此，本發(fā)明涉及用于預(yù)防、治療或控制患者癌癥，特別是轉(zhuǎn)移性癌癥的藥物組合物和預(yù)防及治療方案，該方案包括給予能特異性結(jié)合和激發(fā)EphA2，和/或能優(yōu)先選擇性結(jié)合在癌細(xì)胞而不是非癌細(xì)胞上暴露或數(shù)量增加的EphA2表位的一種或多種抗體。在一實施方案中，所述癌癥是上皮細(xì)胞來源的癌癥。在另一實施方案中，所述癌癥是皮膚、肺、結(jié)腸、乳腺、前列腺、腎或胰腺癌。在另一實施方案中，被預(yù)防、治療或控制的癌中的癌細(xì)胞過度表達(dá)EphA2。在優(yōu)選實施方案中，由于細(xì)胞間接觸減少、亞細(xì)胞水平的定位變化，或EphA2的量相對于配體增加，因而某些EphA2未與配體結(jié)合。在優(yōu)選實施方案中，采用本發(fā)明的方法來預(yù)防、治療或控制腫瘤的轉(zhuǎn)移?？蓪⒈景l(fā)明的抗體與一種或多種其它癌癥治療藥物聯(lián)合給予。具體來說，本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或控制患者中癌癥的方法，包括給予所述患者治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的一種或多種EphA2抗體，并組合給予EphA2抗體以外的治療或預(yù)防有效量的一種或多種化療、激素治療、生物學(xué)治療/免疫治療和/或放射治療藥物，或與手術(shù)組合。
本發(fā)明的方法和組合物不僅可用于未治療的患者，還可以用于治療部分或完全難以用現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)和實驗癌癥療法治療的患者并提高治療功效，現(xiàn)有的治療方法包括但不限于化學(xué)治療、激素治療、生物治療、放射治療和/或外科治療。因此，在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了治療和預(yù)防方法，用于治療或預(yù)防表現(xiàn)出是或可能是用除了給予本發(fā)明的EphA2抗體的治療方法外的其它治療方法難于治療或不反應(yīng)的癌癥。在具體實施方案中，向難于治療的或?qū)Ψ腔贓phA2的治療不反應(yīng)的患者給予本發(fā)明的一種或多種抗體，使該患者可以治療或產(chǎn)生反應(yīng)。因此，該治療對于以前難于治療或不反應(yīng)的患者可以產(chǎn)生治療效果。
此外，本發(fā)明提供篩選本發(fā)明EphA2抗體的方法。具體來說，可采用常規(guī)的免疫學(xué)技術(shù)來篩選能結(jié)合EphA2，特別是EphA2胞外結(jié)構(gòu)域的抗體。在一實施方案中，為鑒定激動性EphA2抗體，可篩選能誘導(dǎo)EphA2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，如增強EphA2的磷酸化和/或降解EphA2的EphA2抗體。
在另一個實施方案中，為識別優(yōu)選結(jié)合在癌細(xì)胞而不是非癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體，可以篩選具有優(yōu)選結(jié)合EphA2的能力的抗體，該EphA2未與配體(例如，Ephrin A1)結(jié)合且不是定位在細(xì)胞-細(xì)胞接觸處。本領(lǐng)域中用于測定細(xì)胞上抗體結(jié)合/定位的任何公知方法都可用于篩選具有所需結(jié)合屬性的候選抗體。在特定實施方案中，免疫熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀被用于測定抗體的結(jié)合屬性。在此實施方案中，當(dāng)EphA2與配體結(jié)合并定位至細(xì)胞-細(xì)胞接觸處時與EphA2的結(jié)合較差而與細(xì)胞上的自由EphA2很好結(jié)合的抗體也包括在本發(fā)明中。在另一個特定實施方案中，使用基于細(xì)胞的分析或ELISA分析，來選擇具有與配體(例如，細(xì)胞錨定的或純化的配體)競爭結(jié)合EphA2能力的EphA2抗體。
本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的EphA2抗體來評估癌癥治療功效的基于EphA2或基于非EphA2的診斷方法。通常，EphA2表達(dá)的增加與侵入性和轉(zhuǎn)移性癌的增加有關(guān)。因此，用特定治療使EphA2表達(dá)降低表明，該治療降低了癌侵入和/或轉(zhuǎn)移的可能性。在特定的實施方案中，本發(fā)明的診斷方法提供了使用遠(yuǎn)離原發(fā)性腫瘤位點的組織和流體，例如全血、唾液、尿、血清、細(xì)針吸出物(即活組織檢查)的轉(zhuǎn)移成像和定位方法，以及診斷和預(yù)后的方法(及使用原發(fā)腫瘤的組織和流體的方法)。在其它實施方案中，本發(fā)明的診斷方法提供了體內(nèi)轉(zhuǎn)移成像和定位方法及診斷和預(yù)后的方法。在這些實施方案中，使用本發(fā)明的抗體，優(yōu)選是暴露的EphA2表位抗體檢測原發(fā)性轉(zhuǎn)移腫瘤。本發(fā)明的抗體也可用于冷凍或固定細(xì)胞的免疫組織化學(xué)分析或組織分析。
在另一個實施方案中，提供了包含本發(fā)明的藥物組合物或診斷試劑的試劑盒。
3.1定義術(shù)語″激動劑″本文用于指能提高其它分子活性或功能的化合物，包括蛋白質(zhì)、多肽、肽、抗體、抗體片段、大分子或小分子(小于10kD)。EphA2激動劑可增強EphA2蛋白的磷酸化和降解。能激發(fā)EphA2的EphA2抗體可以優(yōu)選結(jié)合或可以不結(jié)合在癌細(xì)胞而不是在非癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位。
術(shù)語″免疫特異性結(jié)合EphA2的抗體及其片段″本文用于指能特異性結(jié)合EphA2多肽或EphA2多肽的片段但不能特異性結(jié)合其它非EphA2多肽的抗體及其片段。這些抗體或其片段宜免疫特異性結(jié)合EphA2多肽或其片段，但與其它抗原無非特異性交叉反應(yīng)(如在相應(yīng)的免疫試驗中不與非EphA2蛋白如BSA競爭結(jié)合)。例如可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的免疫試驗或其它技術(shù)來鑒定能免疫特異性結(jié)合EphA2多肽的抗體及其片段。本發(fā)明的抗體包括但不限于合成抗體、單克隆抗體、重組生成的抗體、內(nèi)抗體、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、合成抗體、單鏈Fv(scFv)、Fab片段、F(ab′)片段、二硫化物連接的Fv(sdFv)(包括雙特異性sdFvs)、及抗獨特型(抗Id)抗體，以及上述任何抗體的表位結(jié)合片段。具體來說，本發(fā)明的抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有能免疫特異性結(jié)合EphA2抗原的抗原結(jié)合部位(如抗EphA2抗體的一種或多種互補決定區(qū)(CDR))的分子。能免疫特異性結(jié)合EphA2多肽或其片段的激動性抗體或片段優(yōu)選激發(fā)EphA2而不明顯激發(fā)其它活性。
本文中，術(shù)語″癌″指涉及到具有轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)端位置并表現(xiàn)出不同于非癌細(xì)胞的表型特性的細(xì)胞疾病，該表型特性例如，在三維基板如軟瓊脂中的集落形成或三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑如MATRIGELTM中的管狀網(wǎng)絡(luò)或網(wǎng)狀基質(zhì)形成。非癌細(xì)胞在軟瓊脂中不形成集落，而在三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑中形成明顯的球狀結(jié)構(gòu)。雖然有各種機理，但是癌細(xì)胞在發(fā)展中獲得獨特的功能能力。這種能力包括回避細(xì)胞凋亡、生長信號自足、對抗生長信號不敏感、組織侵入/轉(zhuǎn)移、無限的復(fù)制能力及持續(xù)的血管生成。術(shù)語″癌細(xì)胞″包括惡化前的癌細(xì)胞和惡性癌細(xì)胞。
術(shù)語″衍生物″本文用于指包括EphA2多肽、EphA2多肽片段、免疫特異性結(jié)合EphA2多肽的抗體或免疫特異性結(jié)合EphA2多肽的抗體片段的氨基酸序列的多肽，它們通過氨基酸殘基的取代、缺失或添加而改變。在某些實施方案中，抗體衍生物及其片段在一個或多個CDR中具有氨基酸殘基的取代、缺失或添加。該抗體衍生物與非衍生抗體相比，可具有基本上相同、更好或較差的結(jié)合能力。在具體實施方案中，CDR中有1、2、3、4或5個氨基酸殘基被取代、缺失或添加(即突變)。術(shù)語″衍生物″本文還用于指EphA2多肽、EphA2多肽片段、免疫特異性結(jié)合EphA2多肽的抗體或免疫特異性結(jié)合EphA2多肽的抗體片段，它們經(jīng)過修飾，如通過使其與任何類型的分子共價結(jié)合來修飾。例如但不限于可以通過糖基化、乙?；⒕垡叶蓟?、磷酸化、酰胺化、用公知的保護/阻擋基團衍生、蛋白斷裂、細(xì)胞配體或其它蛋白融合等來修飾EphA2多肽、EphA2多肽片段、抗體或抗體片段。可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，包括但不限于化學(xué)裂解、乙酰化、甲?；⒁旅顾氐拇x合成等化學(xué)修飾方法，來修飾EphA2多肽、EphA2多肽片段、抗體或抗體片段的衍生物。此外，EphA2多肽、EphA2多肽片段、抗體或抗體片段的衍生物可含有一種或多種非經(jīng)典氨基酸。在一實施方案中，多肽衍生物具有與上述EphA2多肽、EphA2多肽片段、抗體或抗體片段相似或相同的功能。在另一實施方案中，與未改變的多肽相比，EphA2多肽、EphA2多肽片段、抗體或抗體片段的衍生物的活性發(fā)生改變。例如，衍生物抗體或其片段可以更緊地結(jié)合表位或更耐蛋白水解。
術(shù)語″表位″本文用于指在動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選小鼠或人中中的EphA2多肽具有抗原或免疫原活性的一部分。具有免疫原活性的表位是在動物中產(chǎn)生抗體反應(yīng)的EphA2多肽的一部分。具有抗原活性的表位是可通過本領(lǐng)域公知的方法(例如，通過免疫測定)測定的抗體免疫特異性結(jié)合的EphA2多肽的一部分?？乖员砦徊灰欢ㄊ敲庖咴员砦?。
本文所述的″片段″包括含有EphA2多肽或免疫特異性結(jié)合EphA2多肽的抗體的氨基酸序列的至少5個連續(xù)氨基酸殘基，至少10個連續(xù)氨基酸殘基，至少15個連續(xù)氨基酸殘基，至少20個連續(xù)氨基酸殘基，至少25個連續(xù)氨基酸殘基，至少40個連續(xù)氨基酸殘基，至少50個連續(xù)氨基酸殘基，至少60個連續(xù)氨基酸殘基，至少70個連續(xù)氨基酸殘基，至少連續(xù)80個氨基酸殘基，至少連續(xù)90個氨基酸殘基，至少連續(xù)100個氨基酸殘基，至少連續(xù)125個氨基酸殘基，至少150個連續(xù)氨基酸殘基，至少連續(xù)175個氨基酸殘基，至少連續(xù)200個氨基酸殘基，或至少連續(xù)250個氨基酸殘基的肽或多肽。優(yōu)選地，抗體片段是表位結(jié)合片段。
術(shù)語″人源化抗體″本文用于指非人(例如，鼠類)抗體形式，它們包括來源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。對于大部分，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中該受體的高度可變區(qū)域殘基被非人物種(供者抗體)的高度可變區(qū)域殘基代替，該非人物種如小鼠、大鼠、野兔或具有所需特異性、親合性和能力的非人靈長類。在一些情況下，人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基代替。此外，人源化抗體可以包括在受者抗體或供者抗體未被發(fā)現(xiàn)的殘基。進行的這些修飾進一步改變抗體的性能。通常，人源化抗體包括基本上所有的至少一個、通常至少兩個可變區(qū)域，其中所有或基本上所有的高度可變區(qū)域與非人免疫球蛋白的那些相應(yīng)，且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體可選擇地還包括至少一部分免疫球蛋白不變區(qū)(Fc)，通常是與EphA2多肽免疫特異性結(jié)合的人免疫球蛋白的不變區(qū)，其通過導(dǎo)入氨基酸殘基的取代、缺失或添加(即突變)而發(fā)生改變。在一些實施方案中，人源化抗體是衍生物。這種人源化抗體包括在一個或多個非人CDR中取代、缺失或添加的氨基酸殘基。與非衍生物人源化抗體相比，人源化抗體衍生物具有基本上相同的結(jié)合，更好的結(jié)合，或更差的結(jié)合。在特定實施方案中，CDR的1個、2個、3個、4個、或5個氨基酸殘基被取代、缺失或添加(即突變)。關(guān)于人源化抗體的進一步的細(xì)節(jié)，請參考?xì)W洲專利EP 239,400、EP 592,106及EP519,596；國際公布WO 91/09967和WO 93/17105；美國專利5,225,539、5,530,101、5,565,332、5,585,089、5,766,886及6,407,213；和Padlan，1991，Molecular Immunology 28(4/5)489-498；Studnicka等人，1994，ProteinEngineering 7(6)805-814；Roguska等人，1994，PNAS 91969-973；Tan等人，2002，J.Immunol.1691119-25；Caldas等人，2000，Protein Eng.13353-60；Morea等人，2000，Methods 20267-79；Baca等人，1997，J.Biol.Chem.27210678-84；Roguska等人，1996，Protein Eng.9895-904；Couto等人，1995，Cancer Res.55(23 Supp)5973s-5977s；Couto等人，1995，Cancer Res.551717-22；Sandhu，1994，Gene 150409-10；Pedersen等人，1994，J.Mol.Biol.235959-73；Jones等人，1986，Nature 321522-525；Reichmann等人，1988，Nature 332323-329；和Presta，1992，Curr.Op.Struct.Biol 2593-596。
本文中，術(shù)語″高度可變區(qū)″指抗體中負(fù)責(zé)結(jié)合抗原的氨基酸殘基。高度可變區(qū)域包括源于″互補決定區(qū)″或″CDR″的氨基酸殘基(即輕鏈可變區(qū)域中的殘基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)和重鏈可變區(qū)域中的31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))和/或源于″高度可變環(huán)″的那些氨基酸殘基(即輕鏈可變區(qū)域中的殘基26-32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)和重鏈可變區(qū)域中的26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，1987，J.Mol.Biol.196901-917)。EA2和EA5的CDR殘基列于表1中?！蹇蚣軈^(qū)″或″FR″殘基是除了所定義的高度可變區(qū)域殘基之外的那些可變區(qū)域殘基。
本文中，術(shù)語″組合″指使用多于一種的預(yù)防和/或治療性試劑。使用術(shù)語″組合″并不限制將預(yù)防和/或治療性試劑給予患有高增生性細(xì)胞病癥(尤其是癌癥)的個體的順序。在將第二種預(yù)防或治療性試劑給予患有或易患高增生性細(xì)胞病癥(尤其是癌癥)的個體之前(例如，1分鐘、5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周前)、同時、或在此之后(例如、1分鐘、5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周后)，可以給予第一種預(yù)防或治療性試劑。預(yù)防或治療性試劑以一定順序和時間間隔給予個體，使得本發(fā)明的試劑可以與其它試劑一起發(fā)揮作用，從而比以其它方式給予提供更大的益處。任何額外的預(yù)防或治療性試劑可以與其它額外的預(yù)防或治療性試劑以任何順序給予。
本文中，術(shù)語″低耐受性″指一種狀態(tài)，在該狀態(tài)下患者出現(xiàn)治療副作用，從而使患者不適于治療和/或不能繼續(xù)治療，因為副作用的不利影響和/或危害超過治療效果。
本文中，術(shù)語″控制″指個體從預(yù)防或治療性試劑的給藥中得到有益效果，但該有益效果不會使疾病治愈。在某些實施方案中，個體被給予一種或多種預(yù)防或治療性試劑以″控制″疾病，從而預(yù)防疾病的進展或惡化。
本文中，術(shù)語″不反應(yīng)/難于治療″用于描述用一種或多種現(xiàn)有的治療方法(例如癌癥治療方法)，如化學(xué)治療、放射治療、外科治療、激素治療和/或生物治療/免疫治療，尤其是對特定癌癥的標(biāo)準(zhǔn)治療方案治療的患者，所述治療方法在臨床上不足以治愈患者，例如，保持對治療不敏感，因而這些患者需要額外的有效治療。此術(shù)語也可用于描述對治療有反應(yīng)，但產(chǎn)生副作用、復(fù)發(fā)、產(chǎn)生抵抗性等的患者。在各種實施方案中，“不反應(yīng)/難于治療”意思是指至少有一些明顯部分的癌細(xì)胞未被殺死，或它們的細(xì)胞分裂未得到抑制。通常本領(lǐng)域公知的用于分析癌細(xì)胞治療有效性的任何方法，可以用來在體內(nèi)或體處對癌細(xì)胞是否是“不反應(yīng)/難于治療”進行測定，在本文中使用本領(lǐng)域已接受的″難于治療″的含義。在各種實施方案中，如果癌細(xì)胞數(shù)量沒有明顯降低，或都在治療中有所增加，那么癌癥為″不反應(yīng)/難于治療″的。
本文中，術(shù)語″增強″指提高治療性試劑在通用或核準(zhǔn)劑量下的效力。
本文中，術(shù)語″預(yù)防″指通過給予個體預(yù)防或治療性試劑而防止疾病發(fā)作、復(fù)發(fā)或擴散。
術(shù)語″預(yù)防性試劑″本文用于指可用于防止EphA2過度表達(dá)相關(guān)疾病，特別是癌癥的發(fā)生、復(fù)發(fā)或擴散的任何試劑。某些實施方案中，術(shù)語“預(yù)防性試劑”指EphA2的激動性抗體或暴露的EphA2表位抗體(如EA2、EA3、EA4或EA5)。在某些實施方案中，術(shù)語“預(yù)防性試劑”指癌癥的化療、放射治療、激素治療、生物學(xué)治療(如免疫治療)和/或本發(fā)明的EphA2抗體治療。在其它實施方案中，可組合給予一種以上的預(yù)防性試劑。
″預(yù)防有效量″本文用于指足以防止癌癥復(fù)發(fā)或擴散的預(yù)防性試劑的量。預(yù)防有效量可以指預(yù)防性試劑的量足以防止患者，包括但不限于易患癌癥或以前接觸過致癌物質(zhì)的患者中癌的復(fù)發(fā)或擴散，或癌的發(fā)生。預(yù)防有效量也可以指可以在癌癥預(yù)防中提供預(yù)防效果的預(yù)防性試劑的量。另外，本發(fā)明預(yù)防性試劑的預(yù)防有效量是指預(yù)防性試劑單獨的量，或與其它試劑組合的量，它們能夠在癌癥預(yù)防中提供預(yù)防效果。關(guān)于本發(fā)明的EphA2抗體的量，該術(shù)語包括可以提高整個預(yù)防作用或增強預(yù)防效果或與另一種預(yù)防性試劑的協(xié)同作用的量。
本文中，″方案″包括給藥時間和給藥方法。
本文中，術(shù)語″副作用″包括預(yù)防或治療性試劑的不需要和不利的作用。不利作用總是不想要的，但是不想要的作用不必然是不利的。預(yù)防或治療性試劑的不利作用可能是有害的或令人不舒適的或有危險的。化學(xué)治療的副作用包括但不限于胃腸毒性，如但不限于，早期或晚期痢疾和腸胃氣脹、惡心、嘔吐、厭食、白血球減少癥、貧血癥、嗜中性白血球減少癥、虛弱、腹痙攣、發(fā)燒、疼痛、體重下降、脫水、禿頭癥、呼吸困難、失眠癥、頭昏眼花、粘膜病、口腔干燥、及腎衰竭、及便秘、神經(jīng)和肌肉影響、對腎和膀胱的臨時或永久性損害、流感類癥狀、體液滯留、及臨時或永久性不孕。放射治療的副作用包括但不限于疲勞、口干、及食欲下降。生物治療/免疫治療的副作用包括但不限于在給予位置皮疹或腫脹，流感類癥狀，如發(fā)燒，發(fā)冷和疲勞，消化道問題和過敏反應(yīng)。激素治療的副作用包括但不限于惡心、受精力問題、消沉、食欲下降、眼睛問題、頭痛、及體重波動?；颊叱霈F(xiàn)的其它不需要作用還有多種并且在本領(lǐng)域中是公知的。許多作用公開于Physicians’Desk Reference(第58版，2002)中。
本文中，術(shù)語″單鏈Fv″和″scFv″指包括抗體的VH和VL區(qū)域的抗體片段，其中這些區(qū)域存在于單個多肽鏈中。通常，F(xiàn)v多肽還含有在VH和VL區(qū)域間的多肽連接，其可以使scFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。對于scFv，請參見Pluckthun，THe Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg和Moore編.Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。在特定實施方案中，scFv包括雙特異性scFv和人源化scFv。
本文中，術(shù)語″個體″和″患者″可交換使用。本文中，個體優(yōu)選是哺乳動物，如非靈長類(例如牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)和靈長類(例如猴子和人)，最優(yōu)選是人。
本文中，術(shù)語″治療″指根除、減少或緩解疾病或病癥的癥狀，尤其是通過給予一種或多種治療性試劑根除、減少或緩解或控制原發(fā)性、區(qū)域性或轉(zhuǎn)移性癌組織。在某些實施方案中，這些術(shù)語指通過將一種或多種治療性試劑給予患有這種疾病的個體來最小化或延緩癌癥擴散。
本文中，術(shù)語″治療性試劑″指可用于預(yù)防、治療或控制EphA2過度表達(dá)相關(guān)性疾病，特別是癌癥的任何試劑。在某些實施方案中，術(shù)語″治療性試劑″指EphA2激動性抗體或暴露的EphA2表位抗體，如EA2、EA3、EA4或EA5。在某些其它實施方案中，術(shù)語″治療性試劑″指癌癥化學(xué)治療、放射治療、激素治療、生物治療/免疫治療、和/或本發(fā)明的EphA2抗體。在其它實施方案中，可以組合給予多種的預(yù)防性試劑。
本文中，″治療有效量″指足以破壞、修飾、控制或去除原發(fā)性、局部性或轉(zhuǎn)移性癌組織的治療性試劑的量。治療有效量可以指足以延緩或最大程度地減少癌擴散的治療性試劑的量。治療有效量可以指在治療或控制癌癥中提供治療效果的治療性試劑的量。此外，本發(fā)明治療性試劑的治療有效量指治療性試劑單獨的量，或與其它治療組合的量，它們能夠在癌癥的治療或控制中提供治療效果。關(guān)于本發(fā)明中EphA2抗體的量，該術(shù)語包括可以提高整個治療作用、或降低或避免不想要的效果、或增強治療效果或與另一種治療性試劑的協(xié)同作用的量。
4.


圖1A-1CEphA2抗體促進MDA-MB-231細(xì)胞的酪氨酸磷酸化和EphA2降解。(A、B)在存在EA5或EA2或?qū)φ諘r37℃培育MDA-MB-231細(xì)胞單層8分鐘。然后用EphA2特異性抗體免疫沉淀細(xì)胞裂解物，用SDS-PAGE溶解，用磷酰酪氨酸特異性抗體作western印染分析(A)。剪下膜條用免疫沉淀中用的EphA2特異性抗體再檢測作為負(fù)載對照(B)。用抗體培育后EphA2磷酸化水平提高(C)。在存在30μg/ml EA5或EA2或?qū)φ諘r37℃培育MDA-MB-231細(xì)胞單層24小時。然后用SDS-PAGE溶解細(xì)胞裂解物，用EphA2特異性抗體作westerb印染分析。用抗體培育后EphA2蛋白水平降低。分子量標(biāo)準(zhǔn)品的相對遷移率見左側(cè)各印染條。(A)中標(biāo)出了抗體的重鏈(IgH)和輕鏈(IgL)。
圖2A-2DEphA2抗體促進了A549細(xì)胞的酪氨酸磷酸化和EphA2降解。在存在EA5或EA2或?qū)φ?PBS)時37℃培育A549細(xì)胞單層(A、B)10分鐘或(C、D)5小時。然后用EphA2特異性抗體D7免疫沉淀細(xì)胞裂解物，用SDS-PAGE溶解，用磷酰酪氨酸特異性抗體作western印染分析(A，C)。剪下膜條用免疫沉淀中所用的EphA2特異性抗體再檢測作為負(fù)載對照(B、D)。
圖3A-3BEphA2抗體在體外抑制了惡性腫瘤細(xì)胞的增殖。在軟瓊脂中37℃培育純化的EphA2抗體與惡性或良性腫瘤細(xì)胞7天。(A)A549惡性肺癌細(xì)胞與10μg/ml或2.5μg/ml EA5或EA2單克隆抗體或?qū)φ?PBS)一起培育。所用的各種劑量抗體均抑制了軟瓊脂中細(xì)胞的生長。(B)通過過度表達(dá)EphA2(MCF-7EphA2)使良性MCF-7乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞。將兩種腫瘤細(xì)胞與EA5單克隆抗體或?qū)φ?PBS)一起培育。EA5抑制了MCF-7EphA2細(xì)胞在軟瓊脂中生長的能力。結(jié)果報告為每個高倍視野下所觀察到的細(xì)胞集落數(shù)(HPF)。
圖4A-4DEphA2抗體EA5體外抑制腫瘤細(xì)胞生長。給無胸腺小鼠同位(A)或皮下(B)植入MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞。(C)給無胸腺小鼠皮下植入A549肺癌細(xì)胞。當(dāng)腫瘤生長到平均體積100mm3后腹膜內(nèi)給予小鼠6mg/kg所示抗體或陰性對照(PBS或1A7抗體)，每周兩次，持續(xù)3周。評估腫瘤生長并表示為腫瘤體積除以最初的腫瘤體積(100mm3)的比率。(D)給無胸腺小鼠皮下植入MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞。當(dāng)腫瘤生長到平均體積100mm3后腹腔內(nèi)給予小鼠6mg/kg所示抗體或陰性對照，每周二次其三周。處死小鼠測定腫瘤體積。陰性對照為黑色，EA5為白色。
圖5A-5BEphA2過度表達(dá)選擇性促進惡性細(xì)胞生長。(A)將1×105個對照細(xì)胞(白條)或MCF-7EphA2細(xì)胞(黑條)在存在1mg/ml的17β雌二醇的軟瓊脂中懸浮培養(yǎng)14天，然后進行顯微鏡觀察評價。EphA2轉(zhuǎn)染細(xì)胞形成了更多的集落(47個/高倍視野HPF)，而匹配的對照少(1個集落/HPF；P＜0.01)。(B)單層生長試驗不能區(qū)分對照(白圈)與MCF-7EphA2細(xì)胞(黑方塊)的生長。
圖6A-6BEphA2過度表達(dá)促進了腫瘤化能力。(A)將1×106個對照細(xì)胞(白圈)或MCF-7EphA2細(xì)胞(黑方塊)植入無胸腺小鼠(每組20只，n＝20)的乳房脂肪墊中并提供雌激素(1mg/ml的17β雌二醇)。MCF-7EphA2細(xì)胞形成的腫瘤顯著大于匹配對照形成的腫瘤(P＝0.027)。(B)用EphA2抗體(D7)作western印染評價分離自植入細(xì)胞或切除腫瘤(T)的等量蛋白裂解液。將膜切成條帶用β-連環(huán)蛋白特異性抗體作為負(fù)載對照再檢測。
圖7A-7CEphA2過度表達(dá)減少了對雌激素的依賴性。(A)用不存在外源性雌激素的軟瓊脂懸浮培養(yǎng)1×105個對照細(xì)胞(白條)或MCF-7EphA2細(xì)胞(黑條)，14天后顯微鏡觀察評價集落形成。與匹配的對照(白圈)相比，在不存在雌激素時MCF-7EphA2細(xì)胞(黑方塊)的單層生長(B)和形成腫瘤能力增強(分別是P＜0.01和P＜0.004)。
圖8A-8BEphA2過度表達(dá)降低了對三苯氧胺的敏感性。(A)用存在1μM三苯氧胺(TAM)和/或1μM 17β雌二醇的軟瓊脂懸浮培養(yǎng)1×105個MCF-7或MCF-7EphA2細(xì)胞，14天后顯微鏡觀察評價集落形成。(B)將MCF-7(園圈)或MCF-7EphA2細(xì)胞(方塊)植入到乳房脂肪墊中(n＝15，每組15只小鼠)并提供雌激素。植入后17天開始三苯氧胺治療。在標(biāo)出的時間測定三苯氧胺處理(黑圈和方塊)和鹽水處理(白圈和方塊)動物的腫瘤體積。注意到與對照相比，三苯氧胺對MCF-7EphA2的抑制作用較差(P＝0.01)。
圖9A-9F雌激素受體在MCF-7EphA2細(xì)胞中得到表達(dá)，但是功能發(fā)生了改變。用EphA2特異性抗體(D7)作western印染分析評估MCF-7EphA2對照細(xì)胞和MCF-7EphA2細(xì)胞中的(A)ERα和(B)ERβ水平。(C、D)將膜切成條帶用β-連環(huán)蛋白特異性抗體作為負(fù)載對照再檢測。(E、F)用CAT報告系統(tǒng)測定雌激素受體活性，顯示對照和MCF-7EphA2細(xì)胞的雌激素受體活性相當(dāng)。圖(F)顯示三次實驗得到的平均結(jié)果。E2表示雌激素處理；TAM表示三苯氧胺處理，％轉(zhuǎn)化表示CAT酶將非乙?；孜?非-AC)轉(zhuǎn)變成乙?；孜?AC)的底物量。
圖10A-10CEphA2激動性抗體EA5降低了惡性細(xì)胞的生長。在存在3μg/ml的EA5的條件下培養(yǎng)MCF-7EphA2細(xì)胞所示時間，然后抽提將樣品，用EphA2特異性抗體(D7)作western印染分析。(B)將膜切成條帶用β-連環(huán)蛋白特異性抗體作為負(fù)載對照再檢測。(C)用存在或不存在三苯氧胺(TAM，1Mm)和EphA2激動性抗體(EA5，10μg/ml)的軟瓊脂懸浮培養(yǎng)1×105個對照細(xì)胞或MCF-7EphA2細(xì)胞。觀察到EA5提高了MCF-7EphA2細(xì)胞對三苯氧胺的敏感性。
圖11A-11DEA5和EA2選擇性結(jié)合惡性細(xì)胞。免疫熒光染色顯示，抗EphA2單克隆抗體EA5(A、C)和EA2(B、D)與惡性MDA-MB-231乳腺上皮腫瘤細(xì)胞的結(jié)合(A、B)強于良性乳腺上皮腫瘤細(xì)胞(C、D)。
圖12EA5與惡性前列腺癌細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)。抗EphA2單克隆抗體EA5在福爾馬林固定的石蠟包埋的臨床標(biāo)本中鑒定到惡性前列腺癌細(xì)胞。
圖13A-13DEphA2 EA5抗體優(yōu)選結(jié)合癌細(xì)胞。4℃用10μg/mlEph099B-233.152(A、B)或EA5(C、D)培養(yǎng)非轉(zhuǎn)化的MCF-10A細(xì)胞(A、C)或轉(zhuǎn)化的MDA-MB-231細(xì)胞(B、D)，然后固定并用偶聯(lián)熒光素的抗小鼠IgG進行免疫標(biāo)記。
圖14A-14DEphA2 EA5抗體通過減少細(xì)胞-細(xì)胞接觸優(yōu)選結(jié)合暴露的EphA2表位。(A、B)在用EGTA處理前(A)或處理后(B)，4℃下用EA5標(biāo)記非轉(zhuǎn)化的MCF-10A細(xì)胞，然后固定并用偶聯(lián)熒光素的抗小鼠IgG進行免疫標(biāo)記。(C、D)在用EGTA處理前(中間)或處理后(上圖)，用EA5標(biāo)記非轉(zhuǎn)化的MCF-10A細(xì)胞(C)或轉(zhuǎn)化的MDA-MB-231細(xì)胞(D)。對照細(xì)胞僅與次級抗體一起培育(底圖)。用流式細(xì)胞儀測定EA5-EphA2結(jié)合的量。
圖15A-15BEphA2 EA5表位與配體結(jié)合位點相區(qū)別。(A)將固定的Ephrin A1-Fc與EphA2-Fc一起培育并與之結(jié)合。將標(biāo)記的Ephrin A1-Fc(黑色)或EA5(白色)與EphA2-Ephrin A1-Fc復(fù)合物一起培育，測定結(jié)合量。(B)將固定的Ephrin A1-Fc與EphA2-Fc一起培育并與之結(jié)合。然后將標(biāo)記的EA5與EphA2-Ephrin A1復(fù)合物一起培育。以所示量將未標(biāo)記的競爭物與EphA2-Ephrin A1-EA5復(fù)合物一起培育。競爭物是Ephrin A1-Fc(黑色)或EA5(白色)。
圖16EA2的VL和VH序列。顯示了EA2(A)VL(分別為SEQ IDNo1和9)和(B)VH(分別為SEQ ID No5和13)的氨基酸和核酸序列。用黑體和下劃線表示CDR的序列。
圖17EA5的VL和VH序列。用黑體和下劃線表示CDR的序列。(A)顯示EA5VL的氨基酸和核酸序列(分別為SEQ ID NO17和25)。用根據(jù)輕鏈蛋白質(zhì)序列的氨基末端設(shè)計的簡并引物(即第三位堿基雖變動但所有的密碼子仍編碼相同的對應(yīng)氨基酸的寡核苷酸)鑒定到含有EA5輕鏈可變區(qū)的多核苷酸序列的三個克隆。鑒定到的這三個克隆含有可變輕鏈EA5的多核苷酸序列，6位和9位堿基是用粗體字母‘k’命名的鳥嘌呤(G)或酪氨酸(T)，15位堿基是用粗體字母命名的G、T或胞嘧啶(C)。(B)顯示EA5 VH的氨基酸和核酸序列(分別為SEQ ID NO21和29)。
5.發(fā)明詳述本發(fā)明部分地基于發(fā)明人的如下發(fā)現(xiàn)EphA2單克隆抗體可抑制癌細(xì)胞的表型。降低EphA2的活性能選擇性地抑制惡性癌細(xì)胞的生長?？捎肊phA2激動性單克隆抗體來降低EphA2活性。雖然不想受任何作用機理的限制，但通過刺激(即激發(fā))EphA2信號傳導(dǎo)以引起EphA2磷酸化而使其降解可實現(xiàn)對癌細(xì)胞生長的這種抑制。癌細(xì)胞生長降低是由于EphA2水平降低和不依賴于配體的EphA2信號傳導(dǎo)。
因此，本發(fā)明涉及用來治療、抑制和控制癌癥，特別是轉(zhuǎn)移性癌的方法和組合物。本發(fā)明的具體方面涉及含有能抑制癌細(xì)胞，特別是過度表達(dá)EphA2的那些癌細(xì)胞的增殖和入侵的化合物的方法和組合物。本發(fā)明還涉及治療、抑制或控制上皮細(xì)胞起源的轉(zhuǎn)移性癌癥，特別是人的乳腺、肺、皮膚和前列腺、膀胱、腎與胰腺癌的方法和組合物。本發(fā)明的其它組合物和方法包括其它類型的活性成分與本發(fā)明的EphA2抗體的組合。
本發(fā)明也涉及治療、抑制和控制用當(dāng)前或標(biāo)準(zhǔn)的癌癥治療方法，如化療、放療、激素治療和生物學(xué)治療部分或完全地難于治療的癌癥的方法。
本發(fā)明還提供了采用本發(fā)明的EphA2抗體，特別是暴露的EphA2表位抗體來評估癌癥治療功效的基于EphA2的或非基于EphA2的診斷方法。本發(fā)明的診斷方法也可用于預(yù)測癌癥進程。在特定的實施方案中，本發(fā)明的診斷方法提供了使用遠(yuǎn)離原發(fā)性腫瘤位點的組織和流體的轉(zhuǎn)移成像和轉(zhuǎn)移定位的方法及診斷和預(yù)后的方法(及使用原發(fā)性腫瘤的組織和流體的方法)。在其它實施方案中，本發(fā)明的診斷方法提供了轉(zhuǎn)移成像和轉(zhuǎn)移定位的方法及體內(nèi)診斷和預(yù)后的方法。
5.1抗體如上所述，本發(fā)明包括給予抗體(優(yōu)選是單克隆抗體)或其片段，該抗體或其片斷可免疫特異性結(jié)合及激發(fā)EphA2信號傳導(dǎo)(EphA2激動性抗體)，和/或可優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞而不是非癌細(xì)胞上選擇性暴露或數(shù)量增加的EphA2表位(“暴露的EphA2表位抗體”)。在一實施方案中，該抗體能結(jié)合EphA2的胞外結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選也能激發(fā)EphA2，如增強EphA2的磷酸化。在另一實施方案中，該抗體能結(jié)合EphA2的胞外結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選地還結(jié)合在癌細(xì)胞而不是非癌細(xì)胞上選擇性暴露或數(shù)量增加的EphA2表位。在更優(yōu)選的實施方案中，該抗體是EA2、EA3、EA4或EA5。另一實施方案中，該抗體能結(jié)合EA2、EA3、EA4或EA5所結(jié)合的表位，和/或如ELISA檢測的那樣，能與EA2、EA3、EA4或EA5競爭結(jié)合EphA2。其它實施方案中，本發(fā)明的抗體能免疫特異性結(jié)合及激發(fā)EphA2信號傳導(dǎo)，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞而不是非癌細(xì)胞上選擇性暴露或數(shù)量增加的EphA2表位，能或不能與EphA2的配體如EphrinA1競爭結(jié)合。
產(chǎn)生本發(fā)明的抗體EA2(品系EA2.31)和EA5(品系EA5.12)的雜交瘤已按專利微生物保存的國際布達(dá)佩斯條約于2002年5月22日保存在美國典型培養(yǎng)物收集中心(ATCC，PO，Box，1549，Manassas，VA20108)，其登記號分別為PTA-4380和PTA-4381，本文作為參考。EA2和EA5抗體的VL和VH區(qū)的氨基酸序列分別見圖16A-16B和圖17A-17B。表1列出了EA2和EA5CDR序列。在最優(yōu)選實施方案中，該抗體是人或人源化抗體。
本發(fā)明的方法所用的抗體包括但不限于單克隆抗體、合成的抗體、多重特異性抗體(包括雙特異性抗體)、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈Fv(scFv)(包括雙特異性scFv)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab’)片段、二硫鍵連接的Fv(sdFv)和上述任一抗體的表位結(jié)合片段。具體來說，本發(fā)明方法所用的抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有能特異性結(jié)合EphA2的抗原結(jié)合位點的分子，其是EphA2的激動劑和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞而不是非癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位。本發(fā)明的免疫球蛋白分子可以是任何類(如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，型(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或免疫球蛋白分子的亞類。
本發(fā)明的方法所用的抗體可源于任何動物，包括鳥和哺乳類動物(例如，人類、鼠科、驢、羊、兔、山羊、豚鼠、豬、駱駝、馬或雞)。優(yōu)選地，該抗體為人或人源化單克隆抗體。在本文中，″人″抗體包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗體，還包括從人免疫球蛋白庫或表達(dá)人基因抗體的小鼠或其它動物分離出的抗體。
本發(fā)明方法所用的抗體可具有單特異性、雙特異性、三特異性或多特異性。多特異性抗體可免疫特異性結(jié)合EphA2多肽的不同表位，或免疫特異性結(jié)合EphA2多肽及異種表位，如異種多肽或固體載體材料。參見，例如，國際公開WO 93/17715、WO 92/08802、WO 91/00360及WO 92/05793；Tutt等人，1991，J.Immunol l.14760-69；美國專利4,474,893，4,714,681，4,925,648，5,573,920及5,601,819；和Kostelny等人，1992，J.Immunol l.1481547-1553。
在特定實施方案中，本發(fā)明的方法所用的抗體是EA2、EA3、EA4或EA5，或其抗原結(jié)合片段(如上述本發(fā)明抗體的一個或多個互補決定區(qū)(CDR)，見表1)。在另一實施方案中，本發(fā)明的方法所用的激動性抗體能結(jié)合與EA2、EA3、EA4或EA5之一相同的表位，或在ELISA檢測等中能與EA2、EA3、EA4或EA5競爭結(jié)合EphA2。
本發(fā)明還包括免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體或其片段，所述抗體包含的VH CDR具有EA2、EA3、EA4或EA5的VH CDR之一的氨基酸序列。本發(fā)明還包括免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體的用途，所述抗體包含的VH CDR具有EA2、EA3、EA4或EA5的VH CDR之一的氨基酸序列。本發(fā)明還包括免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體的用途，所述抗體包含有EA2、EA3、EA4或EA5的一個或多個VH CDR和一個或多個VL CDR。具體來說，本發(fā)明包括免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體的用途，所述抗體包含EA2、EA3、EA4或EA5的VH CDR和VL CDR的VH CDR1和VL CDR1；VH CDR1和VL CDR2；VH CDR1和VL CDR3；VH CDR2和VL CDR1；VH CDR2和VL CDR2；VH CDR2和VL CDR3；VH CDR3和VL CDR1；VH CDR3和VL CDR2；VH CDR3和VL CDR3；VH1 CDR1，VHCDR2和VL CDR1；VHCDR1，VH CDR2和VL CDR2；VH CDR1，VH CDR2和VL CDR3；VH CDR2，VH CDR3和VL CDR1；VH CDR2，VH CDR3和VL CDR2；VH CDR2，VH CDR3和VL CDR3；VH CDR1，VH CDR3和VLCDR1；VH CDR1，VH CDR3和VL CDR2；VH CDR1，VH CDR3和VL CDR3；VH CDR1，VL CDR1和VL CDR2；VH CDR1，VL CDR1和VL CDR3；VHCDR1，VL CDR2和VL CDR3；VH CDR2，VL CDR1和VL CDR2；VHCDR2，VL CDR1和VL CDR3；VH CDR2，VL CDR2和VL CDR3；VHCDR3，VL CDR1和VL CDR2；VH CDR3，VL CDR1和VL CDR3；VHCDR3，VL CDR2和VL CDR3；VH CDR1，VH CDR2，VH CDR3和VL CDR1；VH CDR1，VH CDR2，VH CDR3和VL CDR2；VH CDR1，VH CDR2，VH CDR3和VL CDR3；VH CDR1，VL CDR1，VL CDR2和VL CDR3；VH CDR2，VLCDR1，VL CDR2和VL CDR3；VH CDR3，VL CDR1，VL CDR2和VL CDR3；VH CDR1，VH CDR2，VL CDR1和VL CDR2；VH CDR1，VH CDR2，VL CDR1和VL CDR3；VH CDR1，VH CDR2，VL CDR2和VL CDR3；VH CDR1，VHCDR3，VL CDR1和VL CDR2；VH CDR1，VH CDR3，VL CDR1和VL CDR3；VH CDR1，VH CDR3，VL CDR2和VL CDR3；VH CDR2，VH CDR3，VL CDR1和VL CDR2；VH CDR2，VH CDR3，VL CDR1和VL CDR3；VH CDR2，VHCDR3，VL CDR2和VL CDR3；VH CDR1，VH CDR2，VH CDR3，VL CDR1和VL CDR2；VH CDR1，VH CDR2，VH CDR3，VL CDR1和VL CDR3；VHCDR1，VH CDR2，VL CDR3，VL CDR2和VL CDR3；VH CDR1，VH CDR2，VLCDR1，VL CDR2和VL CDR3；VH CDR1，VH CDR3，VL CDR1，VL CDR2和VL CDR3；VH CDR2，VH CDR3，VL CDR1，VL CDR2和VL CDR3；VHCDR1，VH CDR2，VH CDR3，VL CDR1，VL CDR2和VL CDR3；或它們的任何組合。在具體實施方案中，VH CDR1是SEQ ID NO6；VH CDR2是SEQ ID NO7；VH CDR3是SEQ ID NO8；VL CDR1是SEQ ID NO2；VL CDR2是SEQ ID NO3；VL CDR3是SEQ ID NO4。在其它具體實施方案中，VH CDR1是SEQ ID NO22；VH CDR2是SEQ ID NO23；VH CDR3是SEQ ID NO24；VL CDR1是SEQ ID NO18；VL CDR2是SEQ ID NO19；VL CDR3是SEQ ID NO20(見表1)。本發(fā)明還包括含有1、2、3、4或5個氨基酸的取代、添加或缺失的結(jié)合EphA2的任何上述序列。
在一實施方案中，免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體包含具有SEQ ID NO6氨基酸序列的VH CDR1和具有SEQ ID NO2氨基酸序列的VL CDR1。在另一實施方案中，免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體包含具有SEQ ID NO6氨基酸序列的VHCDR1和具有SEQ ID NO3氨基酸序列的VL CDR2。在另一實施方案中，免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體包含具有SEQ ID NO6氨基酸序列的VH CDR1和具有SEQ ID NO4氨基酸序列的VL CDR3。
在另一實施方案中，免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體包含具有SEQ ID NO22氨基酸序列的VH CDR1和具有SEQ ID NO18氨基酸序列的VL CDR1。在另一實施方案中，免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體包含具有SEQ ID NO22氨基酸序列的VHCDR1和具有SEQ ID NO19氨基酸序列的VL CDR2。在另一實施方案中，免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體包含具有SEQ ID NO22氨基酸序列的VH CDR1和具有SEQ ID NO20氨基酸序列的VL CDR3。
在另一實施方案中，免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體包含具有SEQ ID NO7氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO2氨基酸序列的VL CDR1。在另一實施方案中，免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體包含具有SEQ ID NO7氨基酸序列的VHCDR2和具有SEQ ID NO3氨基酸序列的VL CDR2。在另一實施方案中，免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體包含具有SEQ ID NO7氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO4氨基酸序列的VL CDR3。
在另一實施方案中，免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體包含具有SEQ ID NO23氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO18氨基酸序列的VL CDR1。在另一實施方案中，免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體包含具有SEQ ID NO23氨基酸序列的VHCDR2和具有SEQ ID NO19氨基酸序列的VL CDR2。在另一實施方案中，免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體包含具有SEQ ID NO23氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO20氨基酸序列的VL CDR3。
在另一實施方案中，免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體包含具有SEQ ID NO8氨基酸序列的VH CDR3和具有SEQ ID NO2氨基酸序列的VL CDR1。在另一實施方案中，免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體包含具有SEQ ID NO8氨基酸序列的VHCDR3和具有SEQ ID NO3氨基酸序列的VL CDR2。在另一實施方案中，免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體包含具有SEQ ID NO8氨基酸序列的VH CDR3和具有SEQ ID NO4氨基酸序列的VL CDR3。
在另一實施方案中，免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體包含具有SEQ ID NO24氨基酸序列的VH CDR3和具有SEQ ID NO18氨基酸序列的VL CDR1。在另一實施方案中，免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體包含具有SEQ ID NO24氨基酸序列的VHCDR3和具有SEQ ID NO19氨基酸序列的VL CDR2。在另一實施方案中，免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體包含具有SEQ ID NO24氨基酸序列的VH CDR3和具有SEQ ID NO20氨基酸序列的VL CDR3。
本發(fā)明方法所用的抗體包括經(jīng)修飾的衍生物，即通過使任何類型的分子與抗體共價連接來修飾的衍生物。例如但不限于，所述的抗體衍生物包括修飾的抗體，例如通過糖基化、乙?；?、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、用公知的保護/阻擋基團衍生、蛋白裂解、細(xì)胞配體或其它蛋白融合等來修飾抗體。眾多化學(xué)修飾可用已知的技術(shù)進行，包括但不限于，特定化學(xué)裂解、乙?；?、甲酰化、衣霉素的代謝合成等。此外，該衍生物可含有一種或多種非典型氨基酸。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的抗體或含有本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的框架區(qū)的其片段。在一具體實施方案中，本發(fā)明的抗體或其片段含有人的框架區(qū)。本發(fā)明的抗體或其片段優(yōu)選是人的或人源化的。在一具體實施方案中，本發(fā)明的抗體或其片段含有EA2、EA3、EA4或EA5之一(或任何其它EphA2激動性抗體，或能優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞而不是非癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體)的一個或多個CDR。它們能結(jié)合EphA2和優(yōu)選地激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞而不是非癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位。
本發(fā)明包括單結(jié)構(gòu)域抗體，包括駱駝化(camelized)的單結(jié)構(gòu)域抗體(見例如Muyldermans等.，2001，Trend Biochem Sci.26230；Nuttall等.，2000，Cur Pham Biotech.1253；Reichmann和Muyldermans，1999，JImmunol Meth.23125；國際專利WO 94/04678；WO 94/25591；美國專利No.6,005,079；它們的內(nèi)容納入本文作參考)。在一實施方案中，本發(fā)明提供的單結(jié)構(gòu)域抗體包含有二個VH結(jié)構(gòu)域，該VH結(jié)構(gòu)域具有EA2、EA3、EA4或EA5的任一VH結(jié)構(gòu)域(或任何其它EphA2激動性抗體，或能優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上但不是在非癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體)的氨基酸序列，其經(jīng)過修飾而形成該單結(jié)構(gòu)域抗體。在本發(fā)明的另一實施方案中，本發(fā)明提供的單結(jié)構(gòu)域抗體也包含有二個VH結(jié)構(gòu)域，該VH結(jié)構(gòu)域含有EA2、EA3、EA4或EA5的任一VH結(jié)構(gòu)域(或任何其它EphA2激動性抗體，或能優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞而不是非癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體)的一個或多個VH CDR。
本發(fā)明的方法還包括使用抗體或其片段，其在哺乳動物(優(yōu)選人)中的半衰期(例如，血清半衰期)為15天以上，優(yōu)選是20天以上、25天以上、30天以上、35天以上、40天以上、45天以上、2個月以上、3個月以上、4個月以上或5個月以上。本發(fā)明的抗體或片段在哺乳動物(優(yōu)選人)中半衰期增大，使得所述抗體或抗體片段在哺乳動物中的血清滴度升高，從而降低了給予所述抗體或抗體片段的頻率和/或降低了給予的所述抗體或抗體片段的濃度?？赏ㄟ^本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員所公知的技術(shù)提高抗體或其片段的體內(nèi)半衰期。例如，通過修飾(例如取代、缺失或添加)參與Fc區(qū)域與FcRn受體間的相互反應(yīng)的氨基酸殘基，可以提高抗體或其片段的體內(nèi)半衰期(參見，例如，國際公開WO 97/34631和WO 02/060919，這里引用其全部內(nèi)容作為參考)。通過使所述抗體或抗體片段與聚合物分子，如高分子量的聚乙二醇(PEG)連接，可以提高抗體或其片段的體內(nèi)半衰期。PEG可與所述抗體或抗體片段連接，使用或不使用多功能連接子，或者通過PEG與所述抗體或抗體片段的N-或C-端的位點特異性結(jié)合，或通過賴氨酸殘基上的ε-氨基?？梢允褂檬股锘钚該p失最小的線性或帶分支的聚合體衍生物。通過SDS-PAGE和質(zhì)譜密切監(jiān)測結(jié)合的程度，來確保PEG分子與抗體的適當(dāng)結(jié)合。未反應(yīng)的PEG可通過例如尺寸排除法或離子交換色譜而與抗體-PEG偶聯(lián)物分離。
本發(fā)明還包括抗體或其片段的用途，該抗體或其片段在框架或可變區(qū)中含有帶突變(一個或多個氨基酸取代)的EA2、EA3、EA4或EA5的一個或二個可變區(qū)的氨基酸序列。這些抗體中的突變優(yōu)選能維持或提高該抗體與其免疫特異性結(jié)合的特定抗原的親合力和/或親和力?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來測定抗體對特定抗原的親和力。
本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員所知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可用于誘導(dǎo)編碼抗體或其片段的核苷酸序列發(fā)生突變，包括例如，定點突變和PCR介導(dǎo)的突變，從而使氨基酸取代。優(yōu)選地，相對于原抗體或其片段而言，該衍生物包括小于15個氨基酸的取代、小于10個氨基酸的取代、小于5個氨基酸的取代、小于4個氨基酸的取代、小于3個氨基酸的取代、或小于2個氨基酸的取代。在優(yōu)選實施方案中，該衍生物含有保守氨基酸取代，該取代發(fā)生在一個或多個預(yù)計的非必須氨基酸殘基處。
本發(fā)明還包括能免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體或及片段，所述抗體或其片段含有的輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與EA2、EA3、EA4或EA5的輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)的氨基酸序列具有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％的一致性。在某些實施方案中，本發(fā)明的免疫特異性結(jié)合EphA2的抗體或其片段含有的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID NO1或SEQ ID No17具有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％的一致性。在其它實施方案中，本發(fā)明的免疫特異性結(jié)合EphA2的抗體或其片段含有的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID NO5或SEQ ID No21具有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％的一致性。在其它實施方案中，本發(fā)明能免疫特異性結(jié)合EphA2的抗體或其片段含有的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID NO1或SEQ ID No17具有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％的一致性，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與SEQ IDNO5或SEQ ID NO21具有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％的一致性。
本發(fā)明還包括免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體或其片段，所述抗體或抗體片段包含的一個或多個CDR的氨基酸序列與EA2、EA3、EA4或EA5的一個或多個CDR的氨基酸序列至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同。在一實施方案中，本發(fā)明的免疫特異性結(jié)合EphA2的抗體或其片段含有的CDR的氨基酸序列與SEQ ID NO1、2、3、4、18、19或20至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同。在另一實施方案中，本發(fā)明的免疫特異性結(jié)合EphA2的抗體或其片段含有的CDR的氨基酸序列與SEQ ID NO6、7、8、22、23或24至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同。
可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，包括但不限于BLAST蛋白檢索法，來測定兩個氨基酸序列的相同百分比。
本發(fā)明還包括能免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體或其片段，所述抗體或其片段包含的一個或多個CDR的氨基酸序列與SEQ ID NO2、3、4、6、7、8、18、19、20、22、23或24相比，含有氨基酸殘基取代、缺失或添加。含有氨基酸殘基取代、缺失或添加的一個或多個CDR的該抗體，與不含有氨基酸殘基取代、缺失或添加的一個或多個CDR的抗體相比，可具有基本上相同的、更好的或較差的結(jié)合能力。在具體實施方案中，CDR的1、2、3、4或5個氨基酸殘基被取代、缺失或添加(即突變)。
本發(fā)明還包括免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞而不是非癌細(xì)胞上選擇性暴露或數(shù)量增加的EphA2表位的抗體或其片段的用途，其中，所述抗體或其片段由能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與EA2、EA3、EA4或EA5的核苷酸序列雜交的核苷酸序列編碼。在一實施方案中，本發(fā)明提供了免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞而不是非癌細(xì)胞上選擇性暴露或數(shù)量增加的EphA2表位的抗體或其片段，所述抗體或其片段含有能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與EA2、EA3、EA4或EA5輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)。在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了免疫特異性結(jié)合EphA2的抗體或其片段，該抗體或片斷含有能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO9或SEQ ID NO25的核苷酸序列雜交的核苷酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞而不是非癌細(xì)胞上選擇性暴露或數(shù)量增加的EphA2表位的抗體或其片段，所述抗體或其片段含有能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與EA2、EA3、EA4或EA5重鏈可變區(qū)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列編碼的重鏈可變區(qū)。在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了免疫特異性結(jié)合EphA2的抗體或其片段，該抗體或其片段含有能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO13或SEQ ID NO29的核苷酸序列雜交的核苷酸序列編碼的重鏈可變區(qū)。在其它實施方案中，本發(fā)明的免疫特異性結(jié)合EphA2的抗體或其片段含有能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO9或SEQID NO25的核苷酸序列雜交的核苷酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)，和能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO13或SEQ ID NO29的核苷酸序列雜交的核苷酸序列編碼的重鏈可變區(qū)。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞而不是非癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體或其片段，所述抗體或其片段含有能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與EA2、EA3、EA4或EA5的一個或多個CDR的核苷酸序列雜交的核苷酸序列編碼的一個或多個CDR。在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的免疫特異性結(jié)合EphA2的抗體或其片段含有能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO10、11、12、26、27或28的核苷酸序列雜交的核苷酸序列編碼的CDR。在另一實施方案中，本發(fā)明的免疫特異性結(jié)合EphA2的抗體或其片段含有能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO14、15、16、30、31或32的核苷酸序列雜交的核苷酸序列編碼的CDR。
嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件包括但不限于在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中約45℃與結(jié)合在濾膜上的DNA雜交，然后在50-65℃用0.2×SSC/0.1％SDS洗滌一次或多次，高嚴(yán)謹(jǐn)條件是在6×SSC中約45℃與結(jié)合在濾膜上的DNA雜交，約60℃用0.1×SSC/0.2％SDS洗滌一次或多次，其它嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是該領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(見例如，Ausubel，F(xiàn) M等編，1989 Current Protocols inMolecular Biology，第1卷，Green Publishing Associates，Inc.和Jong Wileyand Sons，Inc.NY，6.3.1-6.3.6和2.10.3頁)。
本發(fā)明還包括能免疫特異性結(jié)合EphA2并激發(fā)EphA2，和/或優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體或其片段，所述抗體或其片段包含的由一個或多個CDR核苷酸序列編碼的一個或多個CDR中，與SEQ ID NO10、11、12、14、15、16、26、27、28、30、31或32相比，含有氨基酸殘基的取代、缺失或添加。含有氨基酸殘基的取代、缺失或添加的一個或多個CDR的抗體與含有無氨基酸殘基的取代、缺失或添加一個或多個CDR的抗體相比，具有基本上相同、更強或較差的結(jié)合能力。在一具體實施方案中，所述CDR中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核酸殘基被取代、缺失或添加(即突變)。氨基酸的取代可能會或不會改變該突變CDR的氨基酸序列。
表1
5.1.1抗體偶聯(lián)物本發(fā)明包括與異源多肽(或其一部分，優(yōu)選至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100個氨基酸的多肽)重組融合或化學(xué)結(jié)合(包括共價和非共價結(jié)合)成融合蛋白的抗體或其片段的用途。該融合不必是直接的，可通過連接子序列來融合。例如，通過將抗體與對特定靶細(xì)胞表面受體具有特異性的抗體偶聯(lián)，使用該抗體可以體內(nèi)或體外地將異源多肽靶定到特定細(xì)胞型上。使用本領(lǐng)域公知的方法，與異源多肽融合或偶聯(lián)的抗體可用于體內(nèi)免疫檢測和純化方法。參考，例如，國際公開WO 93/21232；EP 439,095；Naramura等人，1994年，Immunol.Lett.3991-99；美國專利5,474,981；Gillies等人，1992年，PNAS 891428-1432；和Fell等人，1991年，J.Immunol.1462446-2452，在此引用其全部內(nèi)容作為參考。在一些實施方案中，待檢測、治療、控制或監(jiān)控的病征是過度表達(dá)EphA2的惡性癌。在其它實施方案中，待檢測、治療、控制或監(jiān)控的病征是過度表達(dá)EphA2的惡化前的癌。在特定實施方案中，惡化前的癌是高級前列腺上皮內(nèi)腫瘤(PIN)、乳腺纖維腺瘤、纖維囊腫疾病或復(fù)合痣。
本發(fā)明還包括組合物，該組合物包括與抗體片段融合或偶聯(lián)的異源多肽。例如，所述異源多肽可以與Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段或它們的一部分融合或偶聯(lián)。使多肽與抗體部分融合或偶聯(lián)的方法在本領(lǐng)域是已知的。參見，例如，美國專利5,336,603，5,622,929，5,359,046，5,349,053，5,447,851及5,112,946；EP 307,434；EP 367,166；國際公開WO96/04388和WO 91/06570；Ashkenazi等人，1991年，PNAS 8810535-10539；Zheng等人，1995年，J.Immunol.1545590-5600；和Vil等人，1992年，PNAS 8911337-11341(所述參考文獻的內(nèi)容納入本文作參考)通過基因改組、基序改組(motif-shuffling)、外顯子改組和/或密碼子改組技術(shù)(總體稱作″DNA改組″)可以產(chǎn)生其它融合蛋白，如EA2、EA3、EA4或EA5之一(或其它能免疫特異性結(jié)合在癌細(xì)胞而不是非癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的EphA2激動性抗體或EphA2抗體)的融合蛋白?？衫肈NA改組來改變本發(fā)明的抗體及其片段的活性(如具有較高親和力和較低解離速率的抗體或片段)。通常參考，美國專利5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252、和5,837,458；及Patten等人，1997，Curr.Opinion Biotechnol.8724-33；Harayama，1998，Trends Biotechnol.1676；Hansson等人，1999，J.Mol.Biol.287265；Lorenzo和Blasco，1998，BioTechniques 24308(在此引入這里每個專利和出版物的全部內(nèi)容作為參考)?？贵w或其片段，或其編碼的抗體或其片段可以在重組之前，通過易錯PCR、隨機核苷酸插入或其它方法進行隨機突變來進行改變。編碼抗體或抗體片段的，免疫特異性結(jié)合EphA2的多核苷酸的一個或多個部分可以與一種或多種異源分子的一種或多種成分、基序、段、部分、區(qū)域、片段等重組。
另外，還可以將抗體或其片段與標(biāo)記序列(如肽)融合以利于其純化。在優(yōu)選實施方案中，標(biāo)記的氨基酸序列是六組氨酸肽，如pQE載體中的標(biāo)簽(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)，其中許多是商業(yè)上可提供的。例如，如Gentz等人，1989，PNAS 86821中所描述的，六組氨酸可以為純化融合蛋白提供便利。用于純化的其它肽標(biāo)簽包括但不限于，紅血球凝聚素″HA″標(biāo)簽，其相應(yīng)于源自流感紅血球凝聚素蛋白的表位(Wilson等人，1984，Cell 37767)和″Flag″標(biāo)簽。
在其它實施方案中，將本發(fā)明的抗體或其片段或變體與診斷或檢測試劑偶聯(lián)。作為臨床檢測的一部分，這種抗體可用于監(jiān)控或預(yù)測癌癥的發(fā)展和進程，如測定特定治療的功效。此外，這種抗體可用于監(jiān)控或預(yù)測與過度表達(dá)EphA2的細(xì)胞有關(guān)的前癌疾病(如高級前列腺上皮內(nèi)腫瘤(PIN)、乳腺纖維腺瘤、纖維囊腫疾病或復(fù)合痣)發(fā)展或進程。在一實施方案中，將暴露的EphA2表位抗體與診斷或檢測試劑偶聯(lián)。在一更具體的實施方案中，所述抗體是EA2。在另一具體實施方案中，所述抗體是EA5。
這種診斷和檢測可通過使抗體與可檢測物質(zhì)配合來實現(xiàn)，該可檢測物質(zhì)包括但不限于各種酶，如但不限于辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；輔基，如但不限于鏈霉親和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；熒光材料，如但不限于，傘形酮，熒光素，熒光素異硫代氰酸酯，若丹明，二氯三嗪基胺熒光素，丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料，如但不限于，發(fā)光氨；生物發(fā)光材料，如但不限于，熒光素酶，昆蟲螢光素，及發(fā)光蛋白質(zhì)；放射性材料，如但不限于，鉍(213Bi)，碳(14C)，鉻(51Cr)，鈷(57Co)，氟(18F)，釓(153Gd，159Gd)，鎵(68Ga，67Ga)，鍺(68Ge)，鈥(166Ho)，銦(115In，113In，112In，111In)，碘(131I，125I，123I，121I)，鑭(140La)，镥(177Lu)，錳(54Mn)，鉬(99Mo)，鈀(103Pd)，磷(32P)，鐠(142Pr)，钷(149Pm)，錸(186Re，188Re)，銠(105Rh)，釕(97Ru)，釤(153Sm)，鈧(47Sc)，硒(75Se)，鍶(85Sr)，硫(35S)，锝(99Tc)，鉈(201Ti)，錫(113Sn，117Sn)，氚(3H)，氙(133Xe)，鐿(169Yb，175Yb)，釔(90Y)，鋅(65Zn)；使用各種正子斷層造影的正電子發(fā)射金屬，以及非放射性的順磁金屬離子。
本發(fā)明還包括與治療性試劑偶聯(lián)的抗體或其片段的用途。
可以將抗體或其片段與治療性部分偶聯(lián)，如細(xì)胞毒素，例如，抑制細(xì)胞生長或殺死細(xì)胞的試劑，治療性試劑或放射性金屬離子，例如，α-發(fā)射體。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性試劑包括對細(xì)胞有害的任何試劑。例子包括紫杉醇(paclitaxel)，細(xì)胞松弛素B，短桿菌肽D，溴乙非啶，依米丁，絲裂霉素，依托泊苷，鬼臼噻吩甙，長春新堿，長春堿，秋水仙堿，多柔比星，柔紅霉素，二羥基炭疽菌素二酮，米托蒽醌，光神霉素，放射菌素D，1-去氫睪酮，糖皮質(zhì)激素，普魯卡因，丁卡因，利多卡因，心得安，嘌呤霉素，表柔比星，及環(huán)磷酰胺和其類似物或同系物。治療性試劑包括但不限于，抗代謝物(例如甲氨蝶呤，6-巰嘌呤，6-硫鳥嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶脫焦炭)，烷化試劑(例如氮芥，thioepa，苯丁酸氮芥，苯丙酸氮芥，雙氯乙基亞硝脲(BCNU)和洛莫司汀(CCNU)，環(huán)硫代磷酰胺，白消安，二溴甘露醇，鏈脲霉素，絲裂霉素C，及順式二氯二氨鉑(II)(DDP)順鉑)，蒽環(huán)霉素(例如，柔紅霉素(前柔紅霉素)和多柔比星)，抗生素(例如，放線菌素D(前放射菌素)，博來霉素，光神霉素及安曲霉素(AMC))，及抗有絲分裂試劑(例如長春新堿和長春堿)。
另外，可將抗體或其片段與能修飾給定生物學(xué)反應(yīng)的治療性試劑或藥物部分偶聯(lián)。不應(yīng)將治療性試劑或藥物部分理解為僅限于典型的化學(xué)治療性試劑。例如，所述藥物部分可以是具有所需生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或多肽。這類蛋白質(zhì)包括例如毒素如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單胞桿菌外毒素、霍亂毒素、或白喉毒素；蛋白質(zhì)如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經(jīng)生長因子、血小板生長因子、組織纖溶酶原激活劑、凋亡試劑如TNF-α、TNF-β、AIMI(見國際公開WO 97/33899)、AIMII(見國際公開WO 97/34911)、Fas配體(見國際公開專利WO 99/23105)；溶血栓試劑或抗新生血管試劑，如血管生長抑素或內(nèi)皮生長抑素；或生物應(yīng)答修飾劑如淋巴因子(如白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(“GM-CSF”)和粒細(xì)胞集落刺激因子(“G-CSF”)、或生長因子(如生長激素(“GH”)。
另外，可將抗體與用于偶聯(lián)放射金屬離子的治療性部分如放射活性物質(zhì)或大環(huán)螯合劑偶聯(lián)(參見以上放射活性物質(zhì)的例子)。在某些實施方案中，所述大環(huán)螯合劑是1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷基-N，N’，N”，N”-四乙酸(DOTA)，其可通過接頭分子與抗體連接。這類接頭分子是本領(lǐng)域常見的，見Denardo等.，1998，Clin Cancer Res.42483-90；Peterson等.，1999，BioconjugChem.10553；和Zimmerman等.，1999，Nucl Med Biol.26943-50，其各自內(nèi)容納入本文作參考。
在一具體實施方案中，所述偶聯(lián)的抗體是能優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞而不是非癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的EphA2抗體(即暴露的EphA2表位抗體)。在更具體的實施方案中，所述偶聯(lián)的抗體是EA2。在另一具體實施方案中，所述偶聯(lián)的抗體是EA5。
將治療性部分與抗體偶聯(lián)的技術(shù)是公知的?？捎靡阎椒ǎǖ幌抻谌?希弗氏堿連接鍵、酸不穩(wěn)定連接鍵、順式烏頭酸連接鍵、肼連接鍵、酶可降解連接鍵來將許多部分偶聯(lián)到抗體上(見綜述Garnett，2002，AdvDrug Deliv Rev.53171-216)。將治療性部分與抗體偶聯(lián)的其它技術(shù)是公知的，見例如，Armon等“Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs inCancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Reisfeld等編，243-56頁(Alan R，Liss，Inc 1985)；Hellstrom等，“Antibodies for DrugDelivery”，in Controlled Drug Delivery(第二版)，Robinson等編，625-53頁(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers of Cytotoxic Agentsin Cancer TherapyA Review，”in Monoclonal Antibody 84Biological andClinical Applications，Pinchera等編，475-506頁(1985)；“Analysis，Results，and Future Prospective of the Therapeutic use of Radiolabeled Antibody inCancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy，Baldwin等編，303-16頁(Academic Press 1985)和Thorpe等，1982，ImmunolRev，62119-58。融合或偶聯(lián)抗體與多肽部分的方法是本領(lǐng)域公知的。見例如，美國專利5,336,603；5,622,929；5,359,046；5,349,053；5,447,851和5,112,946；EP307,434；EP367,166；國際公開專利WO 96/04388和WO91/06570；Ashkenazi等.，1991，PNAS.8810535-10539；Zheng等.，1995，JImmunol.1545590-5600；和Vil等.，1992，PNAS.8911337-11341?？贵w與所述部分的融合不一定是直接融合，也可通過接頭序列融合。這類接頭分是本領(lǐng)域公知的，見Denardo等.，1998，Clin Cancer Res.42483-90；Peterson等.，1999，Bioconjug Chem.10553；Zimmerman等.，1999，Nucl MedBiol.26943-50；Garnett，2002，Adv Drug Deliv Rev.53171-216，其各自內(nèi)容納入本文作參考。
可選擇地，可將抗體與第二抗體偶聯(lián)形成如Segal在美國專利4,676,980中所述的抗體異質(zhì)性偶聯(lián)物，此專利內(nèi)容納入本文作參考。
也可將抗體與固體支持物結(jié)合，其在靶抗原的免疫試驗或純化中特別有用。這類固相支持物包括但不限于玻璃、纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
5.1.2產(chǎn)生抗體的方法所述抗體或其片段可用本領(lǐng)域已知的抗體合成方法來合成，具體地，通過化學(xué)合成，或優(yōu)選地通過重組表達(dá)技術(shù)合成。
可用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)來制備單克隆抗體，包括用雜交瘤、重組和噬菌體展示技術(shù)或它們的組合。例如，單克隆抗體可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的雜交瘤技術(shù)來制備，例如Harlow等.，AntibodiesA Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988)；Hammerling等.，inMonoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas.563-681(Elsevier，N Y，1981)(所述參考文獻內(nèi)容納入本文作參考)。術(shù)語“單克隆抗體”在此不限于通過雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的抗體。術(shù)語“單克隆抗體”指衍生自一個克隆，包括真核、原核或噬菌體克隆的抗體，不論其用何種方法產(chǎn)生。
用雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生和篩選特異性抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法。簡而言之，用EphA2(全長蛋白或其結(jié)構(gòu)域，如胞外或配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域)免疫小鼠，一旦在小鼠血清中檢測到免疫應(yīng)答，如EphA2的特異性抗體，即收獲該小鼠脾臟，分離脾細(xì)胞。然后用熟知的技術(shù)將該脾細(xì)胞與合適的骨髓瘤細(xì)胞，如得自ATCC的SP20細(xì)胞系細(xì)胞融合。選擇雜交瘤，進行有限稀釋克隆。用本領(lǐng)域已知的方法測試雜交瘤克隆的細(xì)胞是否分泌能結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體?？捎秒s交瘤陽性克隆免疫小鼠產(chǎn)生含高水平抗體的腹水。
因此，可通過培養(yǎng)分泌本發(fā)明的抗體的雜交瘤細(xì)胞來產(chǎn)生單克隆抗體，其中，優(yōu)選地該雜交瘤通過將EpgA2或其片段免疫小鼠中分離的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，然后篩選該融合得到的雜交瘤，從而得到分泌能與EphA2結(jié)合的抗體的雜交瘤克隆。
可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)來產(chǎn)生能識別特異性EphA2表位的抗體片段。例如，可用酶如木瓜蛋白酶(產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(產(chǎn)生F(ab’)2片段)蛋白水解剪切免疫球蛋白分子，來生產(chǎn)本發(fā)明的Fab和F(ab’)2片段。F(ab’)2片段含有可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)和重鏈CH1區(qū)。另外，本發(fā)明的抗體也可用本領(lǐng)域已知的各種噬菌體展示方法來產(chǎn)生。
在噬菌體展示方法中，抗體的功能性區(qū)域展示在噬菌體顆粒表面，該噬菌體顆粒攜帶有編碼這些抗體的多聚核苷酸序列。具體地說，從動物cDNA文庫(如人或小鼠淋巴組織的cDNA文庫)中擴增編碼VH和VL區(qū)的DNA序列。通過PCR將scFv接頭與編碼VH和VL區(qū)的DNA重組在一起，并克隆到噬菌粒載體(如pCANTAB6或pComb3 HSS)中。將該載體經(jīng)電穿孔進大腸桿菌內(nèi)并用輔助噬菌體感染該大腸桿菌。這些方法中所用的噬菌體通常是絲狀噬菌體，包括fd和M13，VH和VL區(qū)常與噬菌體基因III或基因VIII重組融合。可用抗原，如標(biāo)記的抗原，或結(jié)合在或被捕獲在固相表面或小珠上的抗原，來選擇或鑒定表達(dá)能結(jié)合感興趣EphA2表位的抗原結(jié)合域的噬菌體?？捎糜谥苽浔景l(fā)明抗體的噬菌體展示方法的例子見以下文獻所述的那些Brinkman等.，1995，J Immunol Methods.18241-50；Ames等.，1995，J Immunol Methods.184177；Kettleborough等.，1994，Eur JImmunol.24952-58；Persic等.，1997，Gene.1879；Burton等.，1994，Advancesin Immunology.57191-280；國際專利申請PCT/GB91/01134；國際公開專利WO 90/02809，WO 91/10737，WO 92/01047，WO 92/18619，WO 93/11236，WO 95/15982，WO 95/20401和WO 97/13844；和美國專利5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108，其各自內(nèi)容納入本文作參考。
選擇能結(jié)合EphA2，特別是EphA2胞外結(jié)構(gòu)域的噬菌體。也可篩選能激發(fā)EphA2活性(如增強EphA2磷酸化，降低EphA2水平)的抗體。
如以上參考文獻所述，挑選出噬菌體后，分離該噬菌體的抗體編碼區(qū)，用于產(chǎn)生全抗體，包括人抗體或其它所需的抗原結(jié)合片段，并在所需宿主中，包括哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母菌和細(xì)菌中表達(dá)，見以下所述。也可用本領(lǐng)域已知的方法通過重組技術(shù)來產(chǎn)生Fab、Fab’、F(ab’)2片段，見以下文獻中所述國際公開專利WO 92/22324；Mullinax等.，1992，Bio Techniques.12864；Sawai等.，1995，AJRI.3426和Better等.，1988，Science.2401041(所述文獻內(nèi)容納入本文作參考)。
為產(chǎn)生全抗體，可采用含有VH或VL核苷酸序列、限制性位點和保護限制性位點的側(cè)翼序列的PCR引物來擴增scFv克隆中的VH或VL序列。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的克隆技術(shù)，可將PCR擴增的VH區(qū)克隆到表達(dá)VH恒定區(qū)如人γ4恒定區(qū)的載體中，和將PCR擴增的VL區(qū)克隆到表達(dá)VL恒定區(qū)如人κ和δ恒定區(qū)的載體中。優(yōu)選地，表達(dá)VH或VL區(qū)的載體含有EF-1α啟動子、分泌信號肽、可變區(qū)恒定區(qū)的克隆位點和選擇性標(biāo)記如新霉素抗性基因。也可將VH和VL區(qū)克隆到一個表達(dá)必需恒定區(qū)的載體中。然后用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，將該重鏈載體和輕鏈載體共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞系中產(chǎn)生可表達(dá)全長抗體如IgG的穩(wěn)定或臨時的細(xì)胞系。
對于抗體的某些應(yīng)用，包括在人體內(nèi)的應(yīng)用和體外檢測試驗中的應(yīng)用，優(yōu)選采用人或嵌合抗體。完全的人抗體特別適合治療患者?？捎帽绢I(lǐng)域已知的各種方法制備人抗體，包括上述采用人免疫球蛋白序列的抗體文庫的噬菌體展示方法。也參見美國專利4,444,887和4,716,111；和國際公開專利WO 98/46645；WO 98/50433；WO 98/24893；WO 98/16654；WO 96/34096；WO 96/33735和WO 91/10741，其各自內(nèi)容納入本文作參考。
也可用不能表達(dá)功能性內(nèi)源免疫球蛋白，但可表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠來產(chǎn)生人抗體。例如，可隨機地或通過同源重組將人的免疫球蛋白的重鏈和輕鏈基因復(fù)合體導(dǎo)入到小鼠胚胎干細(xì)胞中?？蛇x擇地，除人的重鏈和輕鏈基因外還可將的人免疫球蛋白的可變區(qū)、恒定區(qū)和多態(tài)性區(qū)域?qū)氲叫∈笈咛ジ杉?xì)胞中。可分別或同時利用同源重組導(dǎo)入的人免疫球蛋白基因座使小鼠免疫球蛋白的重鏈和輕鏈基因失去功能。具體來說，JH區(qū)的純合缺失使內(nèi)源抗體不能產(chǎn)生。擴增經(jīng)修飾的胚胎干細(xì)胞，并將其顯微注射到胚泡中產(chǎn)生嵌合小鼠。繁殖該嵌合小鼠產(chǎn)生能表達(dá)人抗體的純合后代。用正常形式的所選抗原，如本發(fā)明的整個多肽或其一部分免疫該轉(zhuǎn)基因小鼠。可用常規(guī)雜交瘤技術(shù)從免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得針對該抗原的單克隆抗體。B細(xì)胞分化時轉(zhuǎn)基因小鼠中的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷重排，然后經(jīng)歷類型轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變。因此，采用此技術(shù)可產(chǎn)生有治療作用的IgG、IgA、IgM和IgE抗體。產(chǎn)生人抗體的此技術(shù)綜述可參見Lonberg和Huszar(1995，Int Rev Immunol.1365-93)。產(chǎn)生人抗體和人單克隆抗體的此技術(shù)及產(chǎn)生這類抗體的程序的詳細(xì)論述可見例如，國際分開專利WO98/24893；WO 96/34096和WO 96/33735；美國專利5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318和5,939,598，它們的內(nèi)容納入本文作參考。此外一些公司如Abgenix，Inc.(Fremont，CA)和Medarex(Princeton，NJ)采用與上述類似的技術(shù)產(chǎn)生所選抗原的人抗體。
嵌合抗體分子的不同部分衍生自不同的免疫球蛋白分子，如抗體可具有衍生自非人抗體的可變區(qū)和人免疫球蛋白的恒定區(qū)。產(chǎn)生嵌合抗體的方法本領(lǐng)域是已知的。參見例如，Morrison，1985，Science.2291202；Oi等.，1986，BioTechniques 4214；Gillies等.，1989，J Immunol Methods.125191-202和美國專利6,311,415；5,807,715；4,816,567和4,816,397，其內(nèi)容納入本文作參考。含有非人物種的一個或多個CDR和人免疫球蛋白分子框架區(qū)的嵌合抗體可用本領(lǐng)域已知的各種方法制備，包括例如，CDR-移植(EP239,400；國際公開專利WO 91/09967；和美國專利5,225,539；5,530,101；5,585,089)，鑲嵌或重塑(EP592,106；EP519,596；Padlan，1991，Molecular Immunology.28(4/5)489-98；Studnicka等，1994，Protein Engineering.7805；和Roguska等，1994，PNAS 91969)，和鏈改組(美國專利5,565,332)。在一實施方案中，本發(fā)明免疫特異性結(jié)合EphA2的嵌合抗體在人框架區(qū)內(nèi)含有的1、2或3個VL CDR具有EA2、EA3、EA4或EA5之一的氨基酸序列。在一具體實施方案中，本發(fā)明免疫特異性結(jié)合EphA2的嵌合抗體含有的VL CDR具有SEQ ID NO2、3、4、18、19或20的氨基酸序列。在另一實施方案中，本發(fā)明免疫特異性結(jié)合EphA2的嵌合抗體在人框架區(qū)內(nèi)含有的1、2或3個VH CDR具有EA2、EA3、EA4或EA5的VH CDR之一的氨基酸序列。在一具體實施方案中，本發(fā)明免疫特異性結(jié)合EphA2的嵌合抗體含有的VHCDR具有SEQ ID NO6、7、8、22、23或24的氨基酸序列。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明免疫特異性結(jié)合EphA2的嵌合抗體在人框架區(qū)內(nèi)含有的1、2或3個VL CDR具有EA2、EA3、EA4或EA5的VL CDR之一的氨基酸序列，和含有的1、2或3個VH CDR具有EA2、EA3、EA4或EA5的VH CDR之一的氨基酸序列。在一特別優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明免疫特異性結(jié)合EphA2的嵌合抗體在人框架區(qū)內(nèi)含有的VL CDR具有SEQ ID NO2、3、4、18、19或20的氨基酸序列，和含有的VH CDR具有SEQ ID NO6、7、8、22、23或24的氨基酸序列。在一更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明免疫特異性結(jié)合EphA2的嵌合抗體在人框架區(qū)內(nèi)含有的3個VL CDR具有EA2、EA3、EA4或EA5的VL CDR之一的氨基酸序列，和含有的3個VHCDR具有EA2、EA3、EA4或EA5的VH CDR之一的氨基酸序列。在一甚至更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明免疫特異性結(jié)合EphA2的嵌合抗體含有的VL CDR具有選自SEQ ID NO2、3、4、18、19或20的氨基酸序列，和含有的VH CDR具有選自SEQ ID NO6、7、8、22、23或24的氨基酸序列。
通常，框架區(qū)里的框架殘基會被CDR供體抗體相應(yīng)的殘基取代，從而改變了，優(yōu)選是改進了抗原結(jié)合。這些框架取代可用本領(lǐng)域公知的方法來識別，例如，通過模擬CDR與框架殘基間的相互作用來鑒別框架殘基對抗原結(jié)合的重要性來識別，和進行序列比較來識別在特定位置上的不尋?？蚣軞埢鶃碜R別。(參見，例如，美國專利5,585,089；和Riechmann等人，1988，Nature 332323，在此引入其全部內(nèi)容作為參考)。
人源化抗體是抗體或其變體或其片段，其能結(jié)合預(yù)定抗原，且含有框架區(qū)和CDR，該框架區(qū)基本上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列，CDR基本上具有非人免疫球蛋白的氨基酸序列。人源化抗體基本上包括至少一個、通常是兩個可變區(qū)域，其中所有或基本上所有的CDR區(qū)域與非人免疫球蛋白(即供體抗體)的CDR區(qū)域相應(yīng)，且所有或基本上所有框架區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的框架區(qū)。優(yōu)選地，人源化抗體還包括至少一部分免疫球蛋白不變區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的不變區(qū)。通常，該抗體包括輕鏈及至少重鏈的可變區(qū)域。該抗體還包括重鏈的CH1、鉸鏈區(qū)、CH2、CH3及CH4區(qū)域。人源化抗體可選自任何種類的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，及任何異型，包括IgG、IgG2、IgG3和IgG4。通常地，如果需要人源化抗體表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，那么該不變區(qū)是互補結(jié)合的不變區(qū)，且是典型的IgG種類。如果不需要這種細(xì)胞毒性，那么該不變區(qū)可以是IgG2種類。該人源化抗體可包括來源于多種種類或異型的序列，選擇特定的不變區(qū)以優(yōu)化所需的效果是本領(lǐng)域技術(shù)公知的。人源化抗體的框架區(qū)域和CDR區(qū)域不需要與雙親序列精確一致，例如，可通過取代、添加或缺失至少一個殘基而使供體CDR或共有框架發(fā)生突變，從而使在該位點的CDR或構(gòu)架殘基不與共有或產(chǎn)生的抗體相應(yīng)。然而，這種突變不會很多。通常，至少75％的人源化抗體殘基與雙親的框架區(qū)(FR)和CDR序列一致，更通常為90％，且最優(yōu)選的是大于95％。人源化抗體可通過使用本領(lǐng)域所知的各種技術(shù)而制得，包括但不限于，CDR接枝(歐洲專利EP 239,400、國際公開WO 91/09967和美國專利5,225,539、5,530,101及5,585,089)，鑲嵌或重構(gòu)建(歐洲專利EP 592,106和EP 519,596；Padlan，1991，Molecular Immuology28(4/5)489-498；Studnicka等人，1994，Protein Engineering 7(6)805-814；和Roguska等人，1994，PNAS 91969-973)，鏈改組(美國專利5,565,332)，及下列文獻中公開的技術(shù)，例如，美國專利6,407,213，5,766,886，5,585,089，國際公開WO 9317105，Tan等人，2002，J.Immunol.1691119-25，Caldas等人，2000，Protein Eng.13353-60，Morea等人，2000，Methods 20267-79，Baca等人，1997，J.Biol.Chem.27210678-84，Roguska等人，1996，ProteinEng.9895-904，Couto等人，1995，Cancer Res.55(23 Supp)5973s-5977s，Couto等人，1995，Cancer Res.551717-22，Sandhu，1994，Gene 150409-10，Pedersen等人，1994，J.Mol.Biol.235959-73，Jones等人，1986，Nature 321522-525，Riechmann等人，1988，Nature 332323，及Presta，1992，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596。通常，框架區(qū)里的框架殘基會被CDR供體抗體的相應(yīng)殘基取代，以改變并優(yōu)選是改進抗原結(jié)合。這些框架取代可用本領(lǐng)域公知的方法來識別，例如，通過模擬CDR與框架殘基間的相互作用來鑒別框架殘基對抗原結(jié)合的重要性來識別，和進行序列比較來識別在特定位置上的不尋?？蚣軞埢鶃碜R別。(參見，例如，美國專利5,585,089；和Riechmann等人，1988，Nature 332323，在此引入其全部內(nèi)容作為參考)。
此外，本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員使用公知的技術(shù)可用本發(fā)明的抗體來制備抗特異基因型抗體。(參見，例如，Greenspan & Bona，1989，F(xiàn)ASEB J.7437-444；和Nissinoff，1991，J.Immunol.1472429-2438)。本發(fā)明提供了使用多核苷酸的方法，該多核苷酸含有編碼本發(fā)明的抗體或其片段的核苷酸序列。
5.1.3編碼抗體的多聚核苷酸本發(fā)明的方法也包括能在如上文所述的高嚴(yán)謹(jǐn)、中或低嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與編碼本發(fā)明抗體的多聚核苷酸雜交的多聚核苷酸。在一具體實施方案中，本發(fā)明提供了分離的核酸，其含有編碼本發(fā)明的抗體(如EA2、EA3、EA4或EA5)的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。在另一具體實施方案中，本發(fā)明提供了分離核酸，其含有編碼本發(fā)明的人源化或嵌合抗體(如EA2、EA3、EA4或EA5)的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。
上述多核苷酸可以用本領(lǐng)域所公知的任何方法來獲得，且該多核苷酸的核苷酸序列可使用本領(lǐng)域所公知的任何方法來測定。因為抗體的氨基酸序列是已知的，所以編碼這些抗體的核苷酸序列可使用本領(lǐng)域所公知的方法測定，即，將已知編碼特定氨基酸的核苷酸密碼子組裝起來從而得到編碼本發(fā)明抗體或其片段的核酸。這種編碼該抗體的多核苷酸可用化學(xué)合成的寡核苷酸來組裝(例如，Kutmeier等人，1994，BioTechniques 17242)，該組裝簡而言之，包括合成交疊的寡核苷酸，該寡核苷酸含有該抗體的一部分編碼序列；退火并連接這些寡核苷酸；然后用PCR擴增該連接的寡核苷酸。例如但不限于，可采用根據(jù)所述輕鏈蛋白序列的氨基末端設(shè)計的簡并引物(如第三位堿基雖變動但所有的密碼子仍編碼相同的對應(yīng)氨基酸的寡核苷酸)來鑒定含有EA5輕鏈可變區(qū)的多聚核苷酸序列的克隆。在鑒定的含有EA5輕鏈可變區(qū)多聚核苷酸序列的三個克隆中，6位和9位堿基是鳥嘌呤(G)或酪氨酸(T)；15位堿基是G、T或胞嘧啶(C)。所有三個克隆編碼EA5VL區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO17。
可選擇地，編碼抗體的多核苷酸可由適當(dāng)來源的核酸產(chǎn)生。如果含有編碼特定抗體的核酸的克隆不能從商業(yè)上得到，但抗體分子的序列是已知的(參見例如圖16)，那么編碼該免疫球蛋白的核酸可以通過化學(xué)合成得到或從適合來源(例如，從任何表達(dá)抗體的組織或細(xì)胞產(chǎn)生的抗體cDNA庫或cDNA庫，或從任何表達(dá)抗體的組織或細(xì)胞分離的核酸，優(yōu)選是聚A+RNA，該組織或細(xì)胞如選擇來表達(dá)本發(fā)明抗體的雜交瘤，如在ATCC保藏為PTA-4380的克隆)得到，其方法是通過使用可與序列的3′端和5′端雜交的合成引物進行PCR擴增，或通過使用對特定基因序列具有特異性的寡核苷酸探針進行克隆，以例如從編碼該抗體的cDNA庫中識別cDNA克隆。然后，使用本領(lǐng)域公知的任何方法將通過PCR產(chǎn)生的擴增核酸克隆成到可復(fù)制的克隆載體中。
一旦上述抗體的核苷酸序列得到確定，那么就使用核苷酸序列操作領(lǐng)域公知的方法，來操作該抗體的核苷酸序列，該方法如，重組DNA技術(shù)，定點變異，PCR等。(參見，例如，下面文獻中所述的技術(shù)，Sambrook等人，1990，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY和Ausubel等人，編，1998，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY，在此引入其全部內(nèi)容作為參考)，以產(chǎn)生具有不同氨基酸序列的抗體，例如產(chǎn)生氨基酸取代、缺失和/或添加。
在特定實施方案中，使用常規(guī)的重組DNA技術(shù)，將一個或多個CDR插入到框架區(qū)中。該框架區(qū)可以是天然的或共有的框架區(qū)，優(yōu)選是人框架區(qū)(關(guān)于人框架區(qū)列表，參見，例如，Chothia等人，1998，J.Mol Biol.278457-479)。優(yōu)選地，通過組合框架區(qū)和CDR產(chǎn)生的多核苷酸編碼特異性結(jié)合EphA2的抗體。優(yōu)選地，如上文所述，在框架區(qū)內(nèi)可以有一個或多個氨基酸取代，并且優(yōu)選地，氨基酸取代提高了抗體與其抗原的結(jié)合。此外，這種方法可用于產(chǎn)生一個或多個參與鏈內(nèi)二硫鍵的可變區(qū)半胱氨酸殘基的氨基酸取代或缺失，從而產(chǎn)生缺少一個或多個鏈內(nèi)二硫鍵的抗體分子。本發(fā)明也包括多核苷酸的其它變體，這些變體是本領(lǐng)域公知的。
5.1.4抗體的重組表達(dá)本發(fā)明的抗體、衍生物、類似物或其片段(例如，本發(fā)明抗體的重鏈或輕鏈，或其一部分，或本發(fā)明的單鏈抗體)的重組表達(dá)，需要構(gòu)建含有編碼該抗體的多核苷酸的表達(dá)載體。一旦得到編碼本發(fā)明的抗體分子或抗體的重鏈或輕鏈或其一部分(優(yōu)選但不必須包括重鏈或輕鏈可變區(qū)域)的多核苷酸，使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)通過重組DNA技術(shù)就可制得用于制備該抗體分子的載體。因此，本文中描述了通過表達(dá)含有編碼抗體的核苷酸序列的多核苷酸來制備蛋白的方法。可以使用本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的方法來構(gòu)建含有抗體編碼序列和合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括，例如，體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)及體內(nèi)基因重組。因此，本發(fā)明提供了可復(fù)制的載體，其含有編碼本發(fā)明抗體分子、抗體的重鏈或輕鏈、抗體的重鏈或輕鏈可變區(qū)域或其一部分或重鏈或輕鏈CDR，且與啟動子操作性連接的核苷酸序列。這種載體可以包括編碼抗體分子不變區(qū)的核苷酸序列(參見，例如，國際公開WO 86/05807和WO 89/01036和美國專利5,122,464)，且該抗體的可變區(qū)域可以克隆進這種載體中，以表達(dá)全部重鏈、全部輕鏈或全部重鏈和輕鏈。
可以通過常規(guī)技術(shù)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，然后通過常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，以制備本發(fā)明的抗體。因此，本發(fā)明包括宿主細(xì)胞，其含有編碼本發(fā)明的抗體或其片段，或其重鏈或輕鏈，或其一部分，或本發(fā)明的單鏈抗體，并與異源啟動子可操作性連接的多核苷酸。在表達(dá)雙鏈抗體的優(yōu)選實施方案中，如下所述，編碼重鏈和輕鏈的載體可以在宿主細(xì)胞中共表達(dá)以表達(dá)整個免疫球蛋白分子。
可以使用各種宿主表達(dá)載體系統(tǒng)來表達(dá)本發(fā)明的抗體分子(參見，例如，美國專利5,807,715)。代表性的這種宿主表達(dá)系統(tǒng)是載體，通過該載體，可制備目的編碼序列并隨后純化；和細(xì)胞，當(dāng)用適合的核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)染時，該細(xì)胞原位表達(dá)本發(fā)明的抗體分子。這些包括但不限于用含有抗體編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物，如細(xì)菌(例如，E.coli和B.subtilis)；用含有抗體編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如，Saccharomyces pichia)；用含有抗體編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用重組病毒表達(dá)載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒病毒，TMV)感染的或用含有抗體編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如，Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或含有重組表達(dá)構(gòu)建體的哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)(例如，COS、CHO、BHK、293、NSO及3T3細(xì)胞)，它們含有源于哺乳動物細(xì)胞基因組的啟動子(例如，金屬硫蛋白啟動子)或源于哺乳動物病毒的啟動子(例如，腺病毒晚期啟動子；牛痘病毒7.5K啟動子)。優(yōu)選地，用細(xì)菌細(xì)胞如Escherichia coli，更優(yōu)選真核細(xì)胞，特別是表達(dá)整個重組抗體分子的細(xì)菌細(xì)胞或優(yōu)選的真核細(xì)胞來表達(dá)重組抗體分子。例如，結(jié)合有載體(如從人細(xì)胞巨化病毒中得到的主要中早其基因啟動子元件)的哺乳動物細(xì)胞(如中國卵巢細(xì)胞(CHO))是抗體的有效表達(dá)系統(tǒng)(Foecking等人，1986，Gene 45101；和Cockett等人，1990，BioTechnology 82)。在特定實施方案中，通過組成型啟動子，誘導(dǎo)型啟動子或組織特異性啟動子來調(diào)節(jié)編碼抗體或其片段的核苷酸序列的表達(dá)，其中該抗體免疫特異性結(jié)合并激發(fā)EphA2。
在細(xì)菌系統(tǒng)中，可以根據(jù)待表達(dá)的抗體分子的用途來有利地選擇表達(dá)載體的數(shù)量。例如，當(dāng)制備大量這種蛋白時，為了生產(chǎn)抗體分子的藥物組合物，指導(dǎo)高水平表達(dá)融合蛋白產(chǎn)物且使該蛋白產(chǎn)物容易純化的載體是理想的。這種載體包括但不限于E.coli表達(dá)載體pUR278(Ruther等人，1983，EMBO 121791)，其中該抗體編碼序列可以分別連接到該載體的帶有l(wèi)ac Z編碼區(qū)域的框架中，從而制得融合蛋白；pIN載體(Inouye & Inouye，1985，Nucleic Acids Res.133101-3109；Van Heeke & Schuster，1989，J.Biol.Chem.245503-5509)等。pGEX載體也可用于表達(dá)外源多肽，如含有谷胱甘肽5-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白。通常，這種融合蛋白是可溶解的，并易于從溶解的細(xì)胞中通過吸附、結(jié)合基質(zhì)谷胱甘肽-瓊脂糖珠，然后在游離谷胱甘肽存在下進行洗脫來純化。該pGEX載體設(shè)計成含有凝血酶或因子Xa蛋白酶剪切位點，從而可以從GST部分釋放出克隆的目標(biāo)基因產(chǎn)物。
在昆蟲系統(tǒng)中，將Autographa californica核型多角體病毒(AcNPV)用作載體來表達(dá)外源基因。病毒在Spodoptera frugiperda細(xì)胞中生長。上述抗體的編碼序列可以分別克隆到病毒的非必需區(qū)域(例如多角體蛋白基因)并置于AcNPV啟動子(例如多角體蛋白啟動子)的控制下。
在哺乳動物宿主細(xì)胞中，可以使用多個基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。在使用腺病毒作為表達(dá)載體的情況下，目標(biāo)抗體編碼序列可以連接到腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合物中，例如，連接到晚期啟動子和三聯(lián)體引導(dǎo)序列中。然后可以通過體外或體內(nèi)重組，將這種嵌合基因插入到腺病毒基因組中。在病毒基因組的非必需區(qū)域(例如，區(qū)域E1或E3)中插入會產(chǎn)生可繁殖的且能夠在感染的宿主中表達(dá)抗體分子的重組病毒(例如，參見Logan & Shenk，1984，PNAS 81355-359)。對于插入的抗體編碼序列的有效翻譯，可能還需要特定的起始信號。這些信號包括ATG起始密碼子和相鄰序列。此外，該起始密碼子必須與所需編碼序列的閱讀框協(xié)調(diào)一致，以確保整個插入物得到翻譯。這些外源翻譯控制信號和起始密碼子可以是各種來源的，包括天然和合成來源的。通過加入適合的轉(zhuǎn)錄增強子元件，轉(zhuǎn)錄終結(jié)子等，可以增強表達(dá)效率(參見，例如，Bittner等人，1987，Methods in Enzymol.153516-544)。
此外，選擇宿主細(xì)胞株，該細(xì)胞株調(diào)節(jié)嵌入序列的表達(dá)，或以特定的理想方式修飾和處理基因產(chǎn)物。蛋白產(chǎn)物的這種修飾(例如，糖基化)和處理(例如，斷裂)對于蛋白的功能是重要的。對于蛋白或基因產(chǎn)物的翻譯后處理和修飾，不同的宿主細(xì)胞具有特征性和特定機制。選擇適合的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)以確保正確修飾和處理表達(dá)的外源蛋白。因此，可以使用具有所述基因產(chǎn)物的初級轉(zhuǎn)錄、糖基化及磷酸化合適處理細(xì)胞機制的真核宿主細(xì)胞。這種哺乳動物宿主細(xì)胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、NS1和T47D、NSO(鼠類骨髓瘤細(xì)胞系，不會內(nèi)源產(chǎn)生任何免疫球蛋白鏈)，CRL7030和HsS78Bst細(xì)胞。
為了長期高產(chǎn)率地生產(chǎn)重組蛋白，穩(wěn)定表達(dá)是優(yōu)選的。例如，可以建立穩(wěn)定地表達(dá)抗體分子的細(xì)胞系。如果不使用含有病毒復(fù)制起點的表達(dá)載體，可以使用受合適表達(dá)控制元件(例如，啟動子、增強子、序列、轉(zhuǎn)錄終結(jié)子、多聚腺苷酸位點等)控制的DNA和可選擇性標(biāo)記轉(zhuǎn)錄宿主細(xì)胞。在引入外源DNA后，可以將構(gòu)建的細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長1-2天，然后轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基中。重組質(zhì)粒中的可選擇性標(biāo)記對選擇具有抗性，從而使細(xì)胞穩(wěn)定地與質(zhì)粒染色體結(jié)合，并生長形成集落，該集落隨后克隆并擴展成細(xì)胞系。這種方法可用于構(gòu)建表達(dá)抗體分子的細(xì)胞系。這種構(gòu)建的細(xì)胞系尤其適用于篩選和分析直接或間接與抗體分子相互作用的組合物。
可以使用多種選擇系統(tǒng)，包括但不限于，可分別用于tk-，hgprt-或aprt-細(xì)胞的單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，1977，Cell 11223)，次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Szybalska & Szybalski，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48202)，腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Lowy等人，1980，Cell 228-17)基因。此外，抗代謝物抗性可用作選擇下列基因的基礎(chǔ)dhfr，對甲氨蝶呤具有抗性(Wigler等人，1980，PNAS 77357；O′Hare等人，1981，PNAS781527)；gpt，對麥考酚酸具有抗性(Mulligan & Berg，1981，PNAS 782072)；neo，對氨基糖苷G-418具有抗性(Wu和Wu，1991，Biotherapy 387；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573；Mulligan，1993，Science 260926；和Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62191；May，1993，TIB TECH 11155-)和hygro，對潮霉素具有抗性(Santerre等人，1984，Gene 30147)。重組DNA技術(shù)領(lǐng)域中公知的方法通?？捎糜谶x擇所需的重組克隆，并且這種方法公開于下述文獻中，例如，Ausubel等人(編)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)；第12和13章，Dracopoli等人(eds)，CurrentProtocols in Human Genetics，John Wiley & Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin等人，1981，J.Mol.Biol.1501，在此引入這些文獻的全部內(nèi)容作為參考。
可通過載體擴增來提高抗體分子的表達(dá)水平(參見，Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for the expression ofcloned genes in mammalian cells in DNA cloning，Vol.3.(Academic Press，NewYork，1987))。當(dāng)表達(dá)抗體的載體系統(tǒng)中的標(biāo)記是可擴增的時，提高宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中存在的抑制劑水平會增大標(biāo)記基因復(fù)制的數(shù)量。由于擴增區(qū)域與抗體基因相關(guān)，因此抗體的產(chǎn)量也增大(Crouse等人，1983，Mol.Cell.Biol.3257)。
宿主細(xì)胞可以用本發(fā)明的兩個表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染，第一載體編碼重鏈衍生的多肽，第二載體編碼輕鏈衍生的多肽。這兩種載體可以包括相同的可選擇性標(biāo)記，該標(biāo)記能使重鏈和輕鏈多肽同等表達(dá)?？蛇x擇地，可以使用編碼并能夠同時表達(dá)重鏈和輕鏈多肽的單個載體。在這種情況下，輕鏈應(yīng)置于重鏈之前，以避免有毒的自由重鏈過量(Proudfoot，1986，Nature 32252；和Kohler，1980，PNAS 772197)。重鏈和輕鏈的編碼序列可以包括cDNA或基因組DNA。
一旦通過重組表達(dá)制得本發(fā)明的抗體分子，那么就可以通過純化免疫球蛋白分子領(lǐng)域內(nèi)公知的任何方法進行純化，例如，通過色譜法(例如，離子交換、親和色譜，尤其是蛋白A之后的特異性抗原親和色譜、及大小篩份(sizing)柱色譜)，離心，不同的溶解度純化或通過純化蛋白的任何其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進行純化。此外，本發(fā)明的抗體或其片段可以與本文所述或本領(lǐng)域中公知的其它異種多肽序列融合，以利于純化。
5.2預(yù)防性/治療方法本發(fā)明包括治療、預(yù)防或控制患者中與EphA2過度表達(dá)有關(guān)的疾病，優(yōu)選癌癥的方法，該方法包括給予一種或多種EphA2激動性抗體和/或暴露的EphA2表位抗體，優(yōu)選一種或多種單克隆(從其它單一抗體物種來源得到的抗體)EphA2激動性抗體和/或暴露的EphA2表位抗體。在一具體實施方案中，待治療、預(yù)防或控制的疾病是惡性癌癥。在另一具體實施方案中，待治療、預(yù)防或控制的疾病是與細(xì)胞過度表達(dá)EphA2有關(guān)的癌前狀態(tài)。在更具體的實施方案中，所述癌前狀態(tài)是高級前列腺內(nèi)皮癌(PIN)、乳腺纖維腺瘤、纖維囊腫疾病或復(fù)合痣。
在一實施方案中，本發(fā)明的抗體可以與一種或多種其它用于治療、預(yù)防或控制癌癥的治療試劑組合給予。在某些實施方案中，可將本發(fā)明的一種或多種EphA2抗體給予哺乳動物、優(yōu)選人，同時給予用于癌治療的一種或多種其它治療試劑。術(shù)語″同時″不限于將預(yù)防或治療性試劑在準(zhǔn)確的相同時間給予，還指，將本發(fā)明的EphA2抗體和其它試劑按順序在一定時間間隔內(nèi)給予至個體，使得本發(fā)明的抗體能夠與其它試劑一起起作用，從而比以其它方式給藥產(chǎn)生更大的優(yōu)點。例如，每種預(yù)防或治療性試劑可以同時給予，或以任何順序在不同時間點相繼給予；然而，如果沒有同時給予，它們應(yīng)該及時充分地給予，從而提供所需的治療或預(yù)防效果。每種治療性試劑可以以任何適合的形式并通過任何適合的方案分別給予。在其它實施方案中，本發(fā)明的EphA2抗體在外科治療之前、過程中或之后給予。優(yōu)選地，外科治療完全除去局部腫瘤或降低了大腫瘤的尺寸。外科治療也可以作為預(yù)防性措施或用于減輕疼痛。
在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的一種或多種EphA2抗體是EA2、EA3、EA4或EA5。在更優(yōu)選實施方案中，所述抗體包括但不限于人源化的EA2、EA3、EA4或EA5。在其它實施方案中，提供含有一個或多個氨基酸取代的，特別是在可變區(qū)有氨基酸取代的EA2、EA3、EA4或EA5變體，它們的活性、結(jié)合能力與EA2、EA3、EA4或EA5相比有所提高。
在各種實施方案中，預(yù)防或治療性試劑給藥的間隔時間小于1小時，為約1小時，為約1小時～約2小時，為約2小時～約3小時，為約3小時～約4小時，為約4小時～約5小時，為約5小時～約6小時，為約6小時～約7小時，為約7小時～約8小時，為約8小時～約9小時，為約9小時～約10小時，為約10小時～約11小時，為約11小時～約12小時，不超過24小時或不超過48小時。在優(yōu)選實施方案中，在患者同一次訪問時給予一種或多種組分。
術(shù)語治療有效的和預(yù)防有效的表示了給藥的劑量和頻率。該劑量和頻率通常還根據(jù)每個患者的特定因素而變化，這取決于用于給藥的特異性治療性或預(yù)防性試劑，癌癥的嚴(yán)重程度和類型，給藥方案，及患者的年齡、體重、反應(yīng)和過往病史。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員可以考慮上述因素并根據(jù)例如文獻報道和Physcian′s Desk Reference(第56版，2002)中推薦的劑量選擇適合的方案。
5.2.1患者群本發(fā)明提供了治療、預(yù)防和控制癌癥的方法，包括給予個體治療或預(yù)防有效量的一種或多種本發(fā)明EphA2抗體。在另一實施方案中，本發(fā)明的EphA2抗體可與一種或多種其它治療性試劑組合使用。該個體優(yōu)選為哺乳動物如非靈長動物(如牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)和靈長動物(如猴、如非洲綠猴(cynomolgoud monkey)和人)。在優(yōu)選實施方案中所述個體是人。
本發(fā)明方法治療的特定癌癥包括但不限于過度表達(dá)EphA2的癌癥。在另一個實施方案中，該癌是上皮起源的。這種癌的例子是肺、結(jié)腸、前列腺、乳腺及皮膚癌。其它癌舉例列出，并不限于部分5.2.1.1。在特定實施方案中，本發(fā)明的方法可用于治療和/或預(yù)防原發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明的方法和組合物包括將一種或多種本發(fā)明的EphA2抗體給予患有或可能患有癌癥的個體/患者，例如，對特定型癌癥具有易患病的遺傳體質(zhì)，接觸過致癌物質(zhì)或從特定癌癥中康復(fù)的個體/患者。本文中，″癌″指原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性癌。這種患者在之前可能進行過或未進行過癌治療。本發(fā)明的方法和組合物可以用作第一線或第二線癌治療。本發(fā)明也包括治療進行過其它癌治療的患者，本發(fā)明的方法和組合物可在任何不利作用出現(xiàn)之前使用，或在經(jīng)受這些其它癌癥治療的過程中使用。本發(fā)明也包括給予一種或多種本發(fā)明的EphA2抗體以治療或改善難于治療的患者的癥狀的方法。在某些實施方案中，難于治療的癌指，至少癌細(xì)胞的一些明顯部分未被殺死或它們的細(xì)胞分裂未受抑制。對癌細(xì)胞是否難于治療的測定可通過本領(lǐng)域的任何公知方法在體內(nèi)或體外分析癌細(xì)胞的治療效果來進行，在本文中對″難于治療″使用本領(lǐng)域可接受的含義。在各種實施方案中，如果癌細(xì)胞的數(shù)量沒有顯著降低或有所增加，那么癌癥是難于治療的。本發(fā)明也包括給予一種或多種EphA2激動性抗體以預(yù)防癌癥在易患癌癥的患者中開始和復(fù)發(fā)的方法。單克隆抗體優(yōu)選為EA2、EA3、EA4或EA5。
在特定實施方案中，將本發(fā)明的EphA2抗體或降低EphA2表達(dá)的其它治療給予對某些激素、放射和化學(xué)治療性試劑具有不利耐藥性或敏感性降低的癌細(xì)胞中，從而使癌細(xì)胞對這些試劑中的一種或多種再敏感，然后給予(或繼續(xù)給予)以治療或控制癌癥，包括預(yù)防轉(zhuǎn)移。
在可選的實施方案中，本發(fā)明提供了治療患者癌癥的方法，包括給予該患者一種或多種本發(fā)明的EphA2抗體和任何其它治療性試劑，而該患者已被證實難于用其它治療方法治療且不再使用這些治療方法。優(yōu)選地，EphA2抗體是EA2、EA3、EA4或EA5。在某些實施方案中，用本發(fā)明方法治療的患者是已經(jīng)用化學(xué)治療、放射治療、激素治療或生物治療/免疫治療來處理過的患者。其中，這些患者是難于治療的患者和難于用現(xiàn)有癌癥治療方法治療的患者。在其它實施方案中，該患者已經(jīng)過治療且不再有疾病活性，給予一種或多種本發(fā)明的激動性抗體來預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)。
在優(yōu)選實施方案中，現(xiàn)有治療是化學(xué)治療。在特定實施方案中，現(xiàn)有治療包括給予化學(xué)治療試劑，包括但不限于，甲氨蝶呤，泰素，巰嘌呤，硫鳥嘌呤，羥基脲，阿糖胞苷，環(huán)磷酰胺，異環(huán)磷酰胺，亞硝基脲，順鉑，卡鉑，絲裂霉素，達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)，procarbizine，依托泊苷，campathecins，博來霉素，多柔比星，伊達(dá)比星(idarubicin)，柔紅霉素，放線菌素D，普卡霉素，米托蒽醌，天冬酰胺酶，長春堿，長春新堿，長春瑞賓(vinorelbine)，紫杉醇，多西他賽(docetaxel)等。這些患者是經(jīng)過放射治療、激素治療和/或生物治療/免疫治療過的患者。這些患者是經(jīng)過外科手術(shù)治療過的患者。
可選擇地，本發(fā)明也包括治療正在進行或進行過放射治療的患者的方法。這些患者正在用化學(xué)治療，激素治療和/或生物治療/免疫治療治療，或已前用過它們來治療。另外，這些患者是經(jīng)過外科手術(shù)治療過的患者。
在其它實施方案中，本發(fā)明包括治療正在進行或進行過激素治療和/或生物治療/免疫治療的患者的方法。這些患者正在用化學(xué)治療和/或放射治療進行治療，或已前用過它們來治療。這些患者是經(jīng)過外科手術(shù)治療過的患者。
此外，本發(fā)明也提供了作為代替化學(xué)治療、放射治療、激素治療和/或生物治療/免疫治療來治療癌癥的方法，其中上述各種治療已被證實或可能被證實毒性過高，即對正在治療的受試者產(chǎn)生不可接受或無法忍受的副作用。用本發(fā)明方法治療的受試者可選擇地同時用其它癌癥治療一起治療，如外科手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療、激素治療或生物治療，這取決于哪種治療被認(rèn)為是不可接受或無法忍受的。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供了給予一種或多種本發(fā)明的激動性單克隆抗體，而不需要其它任何癌癥治療方法來治療癌癥，該癌癥證實難以用該治療方法治療。在特定實施方案中，難以用其它癌癥治療方法治療的患者在沒有進行癌癥治療的情況下給予一種或多種激動性單克隆抗體。
在其它實施方案中，患有與過度表達(dá)EphA2的細(xì)胞有關(guān)的癌前狀態(tài)的患者可給予本發(fā)明的抗體，以治療疾病和降低發(fā)展成惡性癌癥的可能性。在特定實施方案中，癌前狀態(tài)是高級前列腺上皮內(nèi)腫瘤(PIN)、乳腺纖維腺瘤、纖維囊腫疾病或復(fù)合痣。
5.2.1.1癌癥可以用本發(fā)明的方法和組合物治療、預(yù)防或控制的癌癥和相關(guān)病癥包括但不限于上皮細(xì)胞起源的癌癥。這種癌的例子包括但不限于白血病，如但不限于急性白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓性白血病，如骨髓細(xì)胞、早幼粒細(xì)胞、骨髓單核細(xì)胞、單核細(xì)胞性及紅細(xì)胞白血病和骨髓增生異常綜合癥；慢性白血病，如但不限于，慢性骨髓性(粒細(xì)胞)白血病，慢性淋巴細(xì)胞白血病，發(fā)狀細(xì)胞性白血??；真性紅血球增多癥；淋巴瘤如但不限于何杰金氏病，非何杰金氏病；多發(fā)性骨髓瘤，如但不限于郁積多發(fā)性骨髓瘤，非分泌型骨髓瘤，骨硬化性骨髓瘤，漿細(xì)胞白血病，單一質(zhì)漿細(xì)胞瘤和髓外質(zhì)漿細(xì)胞瘤；Waldenstrom巨球蛋白血癥；意義未明的單克隆丙種球蛋白血癥；良性單克隆丙種球蛋白血癥；重鏈疾??；骨和結(jié)締組織肉瘤，如但不限于骨質(zhì)肉瘤，骨肉瘤，軟骨肉瘤，尤文氏肉瘤，惡性巨細(xì)胞腫瘤，骨纖維肉瘤，脊索瘤，骨膜肉瘤，軟組織肉瘤，血管肉瘤，纖維肉瘤，卡波氏肉瘤，平滑肌纖維肉瘤，脂肪肉瘤，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞肉瘤，經(jīng)鞘瘤，橫紋肌肉瘤，滑液肉瘤；大腦腫瘤，如但不限于，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，星細(xì)胞瘤，大腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤，室鼓膜瘤，寡樹突膠質(zhì)瘤，腦瘤，聽神經(jīng)瘤，顱咽管瘤，成神經(jīng)管細(xì)胞瘤，腦膜瘤，松果瘤，松果母細(xì)胞瘤，原發(fā)性大腦淋巴瘤；乳腺癌包括但不限于腺癌，小葉性(小細(xì)胞)肺癌，導(dǎo)管內(nèi)癌，髓質(zhì)乳腺癌，粘液性乳腺癌，管狀乳腺癌，乳頭狀乳腺癌，帕杰病，及炎癥乳腺癌；腎上腺癌，如但不限于嗜鉻細(xì)胞和腎上腺皮質(zhì)癌；甲狀腺癌，如但不限于乳頭狀或濾泡性甲狀腺癌，髓質(zhì)甲狀腺癌和未分化甲狀腺癌；胰腺癌，如但不限于，胰島瘤，促胃液素瘤，胰升糖素瘤，舒血管腸肽瘤，生長激素抑制素分泌腫瘤，及良性腫瘤或胰島細(xì)胞瘤；垂體癌，如但不限于庫欣氏病(Cushing’s disease)，泌乳刺激素分泌腫瘤，肢端肥大癥，及尿崩癥；眼癌，如但不限于眼黑素瘤，如虹膜黑素瘤，脈絡(luò)膜骨黑素瘤，及睫狀體黑素瘤，及成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤；陰道癌，如鱗狀上皮細(xì)胞癌，腺癌，及黑素瘤；陰門癌，如鱗狀上皮細(xì)胞癌，黑素瘤，腺癌，基細(xì)胞癌癌，肉瘤，及帕杰病；子宮頸癌，如但不限于，鱗狀上皮細(xì)胞癌，及腺癌；子宮癌，如但不限于子宮內(nèi)膜癌和子宮肉瘤；卵巢癌，如但不限于，卵巢上皮癌，邊界瘤，生殖細(xì)胞腫瘤，及胃腸道間質(zhì)腫瘤；食道癌，如但不限于，鱗狀上皮細(xì)胞癌，腺癌，淋巴組織癌，粘液表皮樣癌，腺鱗狀癌，肉瘤，黑素瘤，質(zhì)漿細(xì)胞瘤，疣狀癌，及燕麥細(xì)胞(小細(xì)胞)癌；胃癌，如但不限于，腺癌，蕈傘型(息肉型)的、潰瘍性的、表面擴散的、分布擴散的，惡性淋巴瘤，脂肪肉瘤，纖維肉瘤，及癌肉瘤；結(jié)腸癌；直腸癌；肝癌，如但不限于肝細(xì)胞癌和肝母細(xì)胞瘤；膽囊癌，如腺癌；膽管癌，如但不限于乳頭狀，結(jié)節(jié)狀，及擴散狀；肺癌，如非小細(xì)胞肺癌癥，鱗狀上皮細(xì)胞癌(表皮癌)，空腸腺癌，大細(xì)胞癌和小細(xì)胞肺癌；睪丸癌，如但不限于生殖細(xì)胞瘤，精原細(xì)胞瘤，間變型，一般型(普通型)，精母細(xì)胞型，非精原細(xì)胞瘤，胚胎癌，畸胎癌，絨毛膜癌(卵黃囊腫瘤)，前列腺癌，如但不限于，腺癌，平滑肌肉瘤，及橫紋肌肉瘤；penal癌；口腔癌，如但不限于鱗狀上皮細(xì)胞癌；基底癌；唾腺癌，如但不限于腺癌，粘膜表皮癌，及增殖腺癌；咽癌，如但不限于鱗狀上皮細(xì)胞癌癥，及疣狀癌；皮膚癌癥，如但不限于，基底細(xì)胞癌，鱗狀上皮細(xì)胞癌和黑素瘤，表面擴散黑素瘤，結(jié)節(jié)狀黑素瘤，斑點惡性黑素瘤，肢端雀斑樣黑素瘤；腎癌，如但不限于腎臟細(xì)胞癌，腺癌，腎上腺樣瘤，纖維肉瘤，移行細(xì)胞癌(腎臟骨盆和/或子宮)；魏氏腫瘤；膀胱癌，如但不限于移行細(xì)胞癌，鱗狀上皮細(xì)胞癌癥，腺癌，癌肉瘤。此外，癌包括粘液肉瘤，骨源性肉瘤，內(nèi)皮瘤，淋巴管內(nèi)皮瘤，間皮瘤，滑膜瘤，成血管細(xì)胞瘤，上皮癌，乳頭狀囊腺癌，支氣管肺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳頭狀癌和乳頭狀腺癌(對于這種紊亂，請參見，F(xiàn)ishman等人，1985，Medicine，2d Ed.，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia和Murphy等人，1997，Informed DecisiohsThe Complete Book of Cancer Diagnosis Treatment，andRecovery，Viking Penguin，Penguin Books U.S.A.，Inc.，美國)。
因此，本發(fā)明的方法和組合物也適用于治療或預(yù)防各種癌癥或其它異常性增生疾病，包括(但不限于)下述疾病癌，包括膀胱、乳腺、結(jié)腸、腎、肝、肺、卵巢、胰腺、胃、子宮頸、甲狀腺和皮膚的癌；包括鱗狀上皮細(xì)胞癌；淋巴系統(tǒng)的造血細(xì)胞腫瘤，包括白血病，急性淋巴細(xì)胞白血病，急性成淋巴細(xì)胞白血病，B細(xì)胞淋巴瘤，T細(xì)胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤；骨髓系統(tǒng)的造血細(xì)胞腫瘤，包括急性和慢性髓性白血病和前髓細(xì)胞白血病；間葉細(xì)胞樣起源的腫瘤，包括纖維肉瘤和橫紋肌肉瘤；其它腫瘤，包括黑素瘤，精原細(xì)胞瘤，tetratocarcinoma，神經(jīng)母細(xì)胞瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤；中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，包括星細(xì)胞瘤，神經(jīng)母細(xì)胞瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，及神經(jīng)鞘膜瘤；間葉細(xì)胞樣起源的腫瘤，包括纖維肉瘤，橫紋肌肉瘤，及骨肉瘤；和其它腫瘤，包括黑素瘤，著色性干皮病，keratoactanthoma，精原細(xì)胞瘤，甲狀腺卵泡癌癥和teratocarcinoma?？梢灶A(yù)期到，因細(xì)胞凋亡異常引起的癌癥也可用本發(fā)明的方法和組合物治療。這種癌癥包括但不限于卵泡淋巴瘤，具有p53突變的癌，乳腺、前列腺和卵巢的激素相關(guān)的腫瘤，及癌癥前期損害，如家族性大腸息肉癥，及骨髓增生異常綜合癥。在特定實施方案中，治療或預(yù)防皮膚、肺、結(jié)腸、乳腺、前列腺、膀胱、腎、胰腺、卵巢或子宮中的惡性或病態(tài)增生變化(如組織轉(zhuǎn)化和發(fā)育異常)，或高增生性病癥。在其它特定實施方案中，治療或預(yù)防肉瘤、黑素瘤、或白血病。
在一些實施方案中，所述癌癥是惡性的并過度表達(dá)EphA2。在其它實施方案中，待治療的疾病是與過度表達(dá)EphA2的細(xì)胞有關(guān)的癌前狀態(tài)。在具體實施方案中，所述癌前狀態(tài)是高級前列腺上皮內(nèi)腫瘤(PIN)、乳腺纖維腺瘤、纖維囊腫疾病或復(fù)合痣。
在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法和組合物用于治療和/或預(yù)防乳腺、結(jié)腸、卵巢、肺、及前列腺癌和黑素瘤，并在下文中以舉例的方式進行說明，但不起限制作用。
5.2.1.2乳腺癌的治療在特定實施方案中，患乳腺癌的患者被給予有效量的一種或多種本發(fā)明的單克隆抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體與有效量的一種或多種用于乳腺癌治療的其它試劑組合給予，這些試劑包括但不限于多柔比星，表柔比星，多柔比星和環(huán)磷酰胺(AC)的組合，環(huán)磷酰胺、多柔比星和5-氟尿嘧啶(CAF)的組合，環(huán)磷酰胺、表柔比星和5-氟尿嘧啶(CEF)的組合，赫賽汀(herceptin)，它莫西芬，它莫西芬和細(xì)胞毒性化學(xué)治療的組合，紫杉烷類(如多西他賽和紫杉醇)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體可與紫杉烷類及標(biāo)準(zhǔn)多柔比星和環(huán)磷酰胺組合給予，來輔助治療淋巴結(jié)陽性局部乳腺癌。
在特定實施方案中，患有乳腺癌前纖維腺瘤的患者被給予本發(fā)明的EphA2抗體，來治療疾病并減少其發(fā)展成為惡性乳腺癌的可能性。
5.2.1.3結(jié)腸癌治療在特定實施方案中，患有結(jié)腸癌的患者被給予有效量的一種或多種本發(fā)明的單克隆抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體可與有效量的一種或多種用于治療結(jié)腸癌的其它試劑組合給予，這些試劑包括但不限于5-FU和亞葉酸的組合，5-FU和左咪唑的組合，依立替康(CPT-11)或依立替康(irinotecan)、5-FU和亞葉酸(IFL)的組合。
5.2.1.4前列腺癌治療在特定實施方案中，患有前列腺癌的患者被給予有效量的一種或多種本發(fā)明的單克隆抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體可與有效量的一種或多種用于前列腺癌治療的其它試劑組合給予，這些試劑包括但不限于體外放射治療，放射性同位元素(即，I125、鈀、銥)間質(zhì)移植，亮丙瑞林或其它LHRH激動劑，非類固醇抗雄激素(氟他胺，里奴內(nèi)酰胺，必卡他胺)，類固醇抗雄激素(醋酸環(huán)丙氯地酮醋)，亮丙瑞林和氟他胺的組合，雌激素如DES，三對甲氧苯氯乙烯，乙炔基雌二醇，U.S.P.共軛雌激素，DES二磷酸，放射性同位元素如鍶-89，體外放射治療和鍶-89的組合，二線激素治療劑如氨魯米特，氫化可的松，氟他胺戒斷藥，孕酮及酮康唑，低劑量強的松，或可使個體的癥狀有所改善且降低PSA水平的其它化學(xué)治療方案，包括多西他賽，紫杉醇，雌莫司汀/多西他賽，雌莫司汀/依托泊苷(etoposide)，雌莫司汀/長春堿，及雌莫司汀/紫杉醇。
在一具體實施方案中，向患有癌前高級前列腺上皮內(nèi)腫瘤(PIN)的患者給予本發(fā)明的EphA2抗體來治療該疾病并降低發(fā)展成惡性前列腺癌癥的可能性。
5.2.1.5黑色素瘤治療在特定實施方案中，患有黑素瘤的患者被給予有效量的一種或多種本發(fā)明的單克隆抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體可與有效量的一種或多種用于黑素瘤癌癥治療的其它試劑組合給予，這些試劑包括但不限于達(dá)卡巴嗪(DTIC)，亞硝基脲如雙氯乙基亞硝脲(BCNU)和洛莫司汀(CCNU)，中度單試劑活性的試劑，包括長春花生物堿，鉑化合物，及紫杉烷類，Dartmouth方案(順鉑，BCNU及DTIC)，干擾素α(IFN-A)及白細(xì)胞介素-2(IL-2)。在特定實施方案中，有效量的一種或多種本發(fā)明的激動性單克隆抗體在有或沒有腫瘤壞死因素-α(TNF-α)存在下，可與高溫隔離肢體灌注化療(ILP)及苯丙酸氮芥(L-PAM)組合給予至患有多重大腦轉(zhuǎn)移瘤、骨轉(zhuǎn)移瘤及脊髓壓迫癥的患者，以減輕癥狀和使放射治療引起的腫瘤縮小。
在特定實施方案中，像患有癌前復(fù)合痣的患者給予本發(fā)明的EphA2抗體治療該疾病并降低發(fā)展成惡性黑素瘤的可能性。
5.2.1.6卵巢癌治療在特定實施方案中，患有卵巢癌的患者被給予有效量的一種或多種本發(fā)明的單克隆抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體可與有效量的一種或多種用于卵巢癌癥治療的其它試劑組合給予，這些試劑包括但不限于腹膜內(nèi)的放射治療，如p32治療，整個腹部和骨盆的放射治療，順鉑，紫杉醇或多西他賽(Taxotere)和順鉑或卡鉑的組合，環(huán)磷酰胺和順鉑的組合，環(huán)磷酰胺和卡鉑組合，5-FU和亞葉酸的組合，依托泊苷，脂質(zhì)體多柔比星，吉西他濱(gemcitabine)或拓?fù)涮婵?topotecan)?？深A(yù)期的是，有效量的一種或多種本發(fā)明的激動性單克隆抗體與紫杉醇組合給予至患有難于用鉑治療疾病的患者。治療患有難治卵巢癌的患者包括向患有難于用鉑治療的疾病的患者給予異環(huán)磷酰胺，在基于順鉑組合的治療方案失敗后用六甲基三聚氰胺(HMM)作為搶救性化學(xué)治療，及向其腫瘤上含有可檢測水平的細(xì)胞質(zhì)雌激素受體的患者給它莫西芬予。
5.2.1.7肺癌治療在特定實施方案中，患有小肺細(xì)胞癌癥的患者被給予有效量的一種或多種本發(fā)明的單克隆抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體可與有效量的一種或多種用于肺癌癥治療的其它試劑組合給予，該試劑包括但不限于胸部放射治療，順鉑，長春新堿，多柔比星，及依托泊苷，單獨或組合的；環(huán)磷酰胺，多柔比星，長春新堿/依托泊苷及順鉑(CAV/EP)的組合，用支氣管內(nèi)激光治療、支氣管內(nèi)支架和/或近接治療的局部緩解。
在其它特定實施方案中，患有非小肺細(xì)胞癌癥的患者被給予有效量的一種或多種本發(fā)明的單克隆抗體及有效量的一種或多種用于肺癌癥治療的其它試劑，其包括但不限于減輕放射治療，順鉑、長春堿和絲裂霉素的組合，順鉑和長春瑞賓、紫杉醇、多西他賽或吉西他濱的組合，卡鉑和紫杉醇的組合，支氣管內(nèi)病變的間質(zhì)放射治療或立體定向外科治療。
5.2.2其它預(yù)防性/治療性制劑在一些實施方案中，通過給予一種或多種單克隆抗體的治療與一種或多種治療，如但不限于，化學(xué)治療、放射治療、激素治療、和/或生物治療/免疫治療組合使用。預(yù)防/治療性試劑包括但不限于蛋白性分子，包括但不限于肽、多肽、蛋白，包括翻譯后經(jīng)修飾的蛋白，抗體等；或小分子(小于1,000道爾頓)，無機或有機化合物；或核酸分子，包括但不限于，雙鏈或單鏈DNA，或雙鏈或單鏈RNA，及三螺旋核酸分子。預(yù)防/治療性試劑可源自于任何已知的有機體(包括但不限于，動物、植物、細(xì)菌、真菌及原生生物，或病毒)或合成的分子文庫。
在特定實施方案中，本發(fā)明的方法包括組合給予本發(fā)明的抗體與一種或多種是激酶抑制劑的預(yù)防/治療性試劑，該激酶例如但不限于ABL、ACK、AFK、AKT(如AKT-1、AKY-2和AKT-3)、ALK、AMP-PK、ATM、Auroral、Auroral2、bARK1、bARK2、BLK、BMX、BTK、CAK、CaM激酶、CDC2、CDK、CK、COT、CTD、DNA-PK、EGF-R、ErbB-1、ErbB-2、ErbB-3、ErbB-4、ERK(如ERK1、ERK2、ERK3、ERK4、ERK5、ERK6、ERK7)、ERT-PK、FAK、FGR(如FGF1R、FGF2R)、FLT(如FLT-1、FLT-2、FLT-3、FLT-4)、FRK、FYN、GSK(如GSK1、GSK2、GSK3-α、GSK3-β、GSK4、GSK5)、G蛋白偶聯(lián)受體激酶(GRK)、HCK、HER2、HKII、JAK(如JAK1、JAK2、JAK3、JAK4)、JNK(如JNK1、JNK2、JNK3、KDR、KIT、IGF-1受體、IKK-1、IKK-2、INSR(胰島素受體)、IRAK1、IRAK2、IRK、ITK、LCK、LOK、LYN、MAPK、MAPKAPK-1、MAPKAPK-2、MEK、MET、MFPK、MHCK、MLCK、MLK3、NEU、MK、PDGF受體α、PDGF受體β、PHK、PI-3激酶、PKA、PKC、PKG、PRK1、PRK2、P38激酶、P135tyk2、p34cdc2、p42cdc2、p42mapk、p44mpk、RAF、RET、RIP、RIP-2、PK、RON、RS激酶、SRC、SYK、S6K、TAK1、TEC、TIE1、TIE2、TRKA、TXK、TYK2、UL13、VEGFR1、VEGFR2、YES、YRK、ZAP-70和所有這些激酶的亞型(見例如，Hardie和Hanks(1995)The Protein Kinase FactsBook；I和II，Academic Press，San Diego，Calif)。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體與一種或多種是Eph受體激酶(如EphA2、EphA4)抑制劑的預(yù)防/治療性試劑一起組合給予。在最優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體與一種或多種是EphA2抑制劑的預(yù)防/治療性試劑一起組合給予。
在另一特定實施方案中，本發(fā)明的方法包括組合給予本發(fā)明的治療性抗體與一種或多種預(yù)防/治療性試劑，這些試劑是血管生成抑制劑，如但不限于血管抑素(血漿酶原片段)；抗血管增生抗凝血酶III；Angiozyme；ABT-627；Bay 12-9566；倍尼芬；Bevacizumab；BMS-275291；源自軟骨的抑制劑(CDI)；CAI；CD59補充片段；CEP-7055；Col 3；康布瑞塔卡汀A-4；血管內(nèi)皮抑制素(膠原質(zhì)XVIII片段)；纖維連結(jié)蛋白片段；Gro-β；鹵夫酮；肝膿腫；肝磷脂六糖片段；HMV833；人絨毛促性腺激素(hCG)；IM-862；干擾素α/β/γ；干擾素誘導(dǎo)蛋白(IP-10)；白細(xì)胞介素-12；Kringle 5(血漿酶原片段)；馬立馬司他；金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)；2-甲氧基雌二醇；MMI 270(CGS 27023A)；MoAb IMC-1C11；Neovastat；NM-3；Panzem；PI-88；胎盤核糖核酸酶抑制劑；血漿酶原催化劑抑制劑；血小板因子-4(PF4)；Prinomastat；泌乳刺激素16kD片段；多育曲菌素-關(guān)聯(lián)蛋白(PRP)；PTK 787/ZK 222594；類維生素A；Solimastat；角鯊胺；SS 3304；SU 5416；SU6668；SU11248；四氫可的索-S；四巰基鉬酸鹽；薩利多胺；Thrombospondin-1(TSP-1)；TNP-470；轉(zhuǎn)換生長因子-β(TGF-β)；血管抑制素；血管抑制因子(鈣網(wǎng)蛋白片段)；ZD6126；ZD6474；法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI)；和二磷酸鹽。
在另一特定實施方案中，本發(fā)明的方法包括組合給予本發(fā)明的抗體和一種或多種是抗癌試劑的預(yù)防/治療性試劑，例如但不限于阿西維辛，阿克拉霉素，鹽酸阿考達(dá)唑，阿克羅寧，阿多來新，阿地白介素，六甲蜜胺，二霉素，阿美蒽醌醋酸鹽，氨基導(dǎo)眠能，安吖啶，阿那曲唑，安曲霉素，天冬酰胺酶，曲林菌素，阿扎胞苷，阿扎替派，含氮霉素，巴馬司他，苯佐替派，必卡他胺，鹽酸比生群，二甲磺酸雙奈法德，比折來新，硫酸博來霉素，布喹那鈉，溴匹立明，白消安，放線菌素C，卡普睪酮，卡醋胺，卡貝替姆，卡鉑，卡氯芥，鹽酸卡柔比星，卡折來新，西地芬戈，苯丁酸氮芥，西羅霉素，順鉑，克拉屈濱，crisnatol mesylate，環(huán)磷酰胺，阿糖胞苷，達(dá)卡巴嗪，放線菌素D，鹽酸柔紅霉素，decarbazine，地西他濱，右奧馬鉑，地扎胍寧，甲磺酸地扎胍寧，地吖醌，多西他賽，多柔比星，鹽酸多柔比星，屈洛昔芬，檸檬酸屈洛昔芬，丙酸屈他雄酮，偶氮霉素，依達(dá)曲沙，鹽酸依氟鳥氨酸，依沙蘆星，恩洛鉑，恩普氨酯，依匹哌啶，鹽酸表柔比星，厄布洛唑，鹽酸依索比星，雌莫司汀，磷酸鹽雌莫司汀，依他硝唑，依托泊苷，磷酸依托泊苷，etoprine，鹽酸法倔唑，法扎拉濱，芬維A胺，氟尿苷，磷酸氟達(dá)拉濱，氟尿嘧啶，氟西他濱，磷喹酮，福司曲星鈉，吉西他濱，鹽酸吉西他濱，羥基脲，鹽酸伊達(dá)比星，異環(huán)磷酰胺，伊莫福新，白細(xì)胞介素2(包括重組白細(xì)胞介素2，或rIL2)，干擾素α-2a，干擾素α-2b，干擾素α-n1，干擾素α-n3，干擾素β-Ia，干擾素γ-Ib，異丙鉑，鹽酸依立替康，醋酸蘭瑞肽，來曲唑，醋酸亮丙瑞林，鹽酸利阿唑，洛美曲索鈉，洛莫司汀，鹽酸洛索蒽醌，馬索羅酚，美登素，鹽酸氮芥，醋酸甲地孕酮，醋酸甲烯雌醇，苯丙酸氮芥，美諾立爾，巰嘌呤，甲氨蝶呤，甲氨蝶呤鈉，metoprine，美妥替哌，米丁度胺，mitocarcin，mitocromin，米托潔林，絲裂馬菌素，絲裂霉素，米托司培，米托坦，鹽酸米托蒽醌，麥考酚酸，亞硝基脲，諾考達(dá)唑，諾加霉素，奧沙利鉑，奧昔舒侖，紫杉醇，培門冬酶，佩里霉素，奈莫司汀，硫酸派來霉素，培磷酰胺，哌泊溴烷，哌泊舒凡，鹽酸吡羅蒽醌，普卡霉素，普洛美坦，卟非姆鈉，紫菜霉素，潑尼莫司汀，鹽酸丙卡巴肼，嘌呤霉素，鹽酸嘌呤霉素，吡唑呋喃菌素，利波腺苷，羅谷亞胺，沙芬戈，鹽酸沙芬戈，司莫司汀，辛曲秦，sparfosatesodium，稀疏霉素，鹽酸鍺螺胺，螺莫司汀，螺鉑，鏈黑菌素，鏈佐星，磺氯苯脲，他利霉素，tecogalan sodium，替加氟，鹽酸替洛蒽醌，替莫泊芬，替尼泊苷，替羅昔隆，睪內(nèi)酪，thiamiprine，硫鳥嘌呤，塞替派，噻唑呋啉，替拉扎明，檸檬酸托瑞米芬，醋酸曲托龍，磷酸曲西立濱，三甲曲沙，葡糖醛酸三甲曲沙，曲普瑞林，鹽酸妥布氯唑，烏拉莫司汀，烏瑞替派，伐普肽，維替泊芬，硫酸長春堿，硫酸長春新堿，長春地辛，硫酸長春地辛，硫酸長春匹定，硫酸長春甘酯，硫酸長春羅新，酒石酸長春瑞賓，硫酸長春羅定，硫酸長春利定，伏氯唑，折尼鉑，凈司他丁，鹽酸佐柔比星氫氯化物。其它抗癌試劑包括但不限于20-epi-1，25二羥基維生素D3，5-乙炔基尿嘧啶，阿比特龍，阿克拉霉素，酰基富烯，adecypenol，阿多來新，阿地白介素，ALL-TK拮抗劑，六甲蜜胺，阿雌莫司汀，amidox，阿米福汀，氨基乙酰丙酸酸，氨柔比星，安吖啶，阿那格雷，阿那曲唑，穿心蓮內(nèi)酯，血管生成抑制劑，拮抗劑D，拮抗劑G，antarelix，抗背部化形態(tài)發(fā)生蛋白-1，抗雄激素，抗雌激素，腫瘤，aphidicolin glycinate，細(xì)胞凋亡基因調(diào)節(jié)劑，細(xì)胞凋亡調(diào)整器，無瞟呤核酸，ara-CDP-DL-PTBA，精氨酸脫氨基酶，asulacrine，阿他美坦，阿莫司汀，axinastatin 1，axinastatin 2，axinastatin 3，阿扎司瓊，azatoxin，氮胸腺嘧啶，漿果赤霉素III衍生物，balanol，巴馬司他，BCR/ABL拮抗劑，benzochlorins，苯甲?；鵶taurosporine，β內(nèi)酰胺衍生物，β-alethine，β-clamycin B，樺木酸，bFGF抑制劑，必卡他胺，比生群，bisaziridinylspermine，雙奈法德，bistratene A，比折來新，breflate，溴匹立明，布度鈦，丁基硫堇亞胺，鈣泊三醇，鈣磷酸蛋白C，喜樹堿衍生物，金絲雀疹I(lǐng)L-2，卡培他濱，甲酰胺-氨基-三氮雜茂，羧酰胺三唑，CaRest M3，CARN 700，源自軟骨的抑制劑，卡折來新，干酪素激酶抑制劑(ICOS)，栗樹精胺，cecropin B，西曲瑞克，氯喹喔啉磺胺藥物，西卡前列素，順式卟啉，克拉屈濱，克羅米芬類似物，克霉唑，collismycin A，collismycin B，康布瑞塔卡汀A4，康布瑞塔卡汀類似物，conagenin，crambescidin 816，crisnatol，cryptophycin 8，cryptophycin A衍生物，curacinA，環(huán)戊蒽醌，cycloplatam，cypemycin，阿糖胞苷ocfosfate，細(xì)胞因子，cytostatin，達(dá)昔單抗，地西他濱，脫氫膜海鞘素B，地洛瑞林，地塞米松，右異環(huán)磷酰胺，右雷佐生，右維拉帕米，地吖醌，didemnin B，didox，二乙基norspermine，二氫-5-氮雜胞啶，二氫紫杉醇，dioxamycin，苯基苯螺莫司汀，多西他賽，二十二烷醇，多拉司瓊，去氧氟尿苷，屈洛昔芬，屈大麻酚，duocarmycin SA，依布硒啉，依考莫司汀，依地福新，依決洛單抗，依氟鳥氨酸，欖香烯，乙嘧替氟，表柔比星，愛普列特，雌莫司汀類似物，雌激素激動劑，雌激素拮抗劑，依他硝唑，依托泊苷磷酸鹽，依西美坦，法倔唑，法扎拉濱，芬維A胺，非格司亭，非那雄胺，flavopiridol，氟卓斯汀，fluasterone，氟達(dá)拉濱，鹽酸fluorodaunorunicin，福酚美克，福美斯坦，福司曲星，福莫司汀，德卟啉釓，硝酸鎵，加洛他濱，加尼瑞克，白明膠酶抑制劑，吉西他濱，谷胱甘肽抑制劑，hepsulfam，heregulin，環(huán)己雙乙酰胺，金絲桃素，伊班膦酸，伊達(dá)比星，艾多昔芬，伊決孟酮，伊莫福新，伊洛馬司他，咪唑并吖啶酮，咪喹莫特，免疫刺激肽，類胰島素生長因子-1受體抑制劑，干擾素激動劑，干擾素，白細(xì)胞介素，碘芐胍，碘代多柔比星，蕃薯寧，伊羅普拉，伊索拉定，isobengazole，isohomohalicondrinB，伊他司瓊，jasplakinolide，kahalalide F，層狀素-N三醋酸基的，蘭瑞肽，leinamycin，來格司亭，硫酸蘑菇多糖，leptolstatin，來曲唑，白血病抑制因素，白細(xì)胞α干擾素，亮丙瑞林+雌激素+黃體酮，亮丙瑞林，左咪唑，利阿唑，線性聚胺類似物，親脂性二糖肽，親脂性鉑化合物，lissoclinamide 7，洛鉑，蚯蚓磷脂，洛美曲索，氯尼達(dá)明，洛索蒽醌，洛伐他汀，洛索立賓，勒托替康，德卟啉镥，lysofylline，溶解肽，美坦辛，mannostatin A，馬立馬司他，馬索羅酚，maspin，matrilysin抑制劑，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑，美諾立爾，麥爾巴隆，meterelin，methioninase，滅吐靈，MIF抑制劑，米非司酮，米替福新，米立司亭，不匹配雙鏈RNA，米托胍腙，二溴衛(wèi)矛醇，絲裂霉素類似物，米托萘胺，mitotoxin纖維原細(xì)胞生長因子-saporin，米托蒽醌，莫法羅汀，莫拉司亭，單克隆抗體，人絨毛促性腺激素，單磷?；椭珹+乳酸分支桿菌細(xì)胞壁sk，莫哌達(dá)醇，多耐藥性基因抑制劑，多腫瘤抑制劑1基治療，芥子氣抗癌試劑，印度洋海綿B，分枝桿菌細(xì)胞壁提取物，myriaporone，N-乙?；啬橇?，N-替代苯甲脒，那法瑞林，nagrestip，納洛酮+戊唑辛，napavin，naphterpin，那托司亭，奈達(dá)鉑，奈莫柔比星，奈立膦酸，中性肽鏈內(nèi)切酶，里奴內(nèi)酰胺，nisamycin，氮氧化物調(diào)節(jié)劑，硝基氧抗氧化物，nitrullyn，O6-芐基鳥嘌呤，奧曲肽，okicenone，寡核苷酸，奧納司酮，恩丹西酮，恩丹西酮，oracin，口服細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑，奧沙利鉑，奧沙特隆，奧沙利鉑，oxaunomycin，紫杉醇，紫杉醇類似物，紫杉醇衍生物，palauamine，palmitoyl利索新，帕米膦酸，人參三醇，帕諾米芬，parabactin，帕折普汀，培門冬酶，peldesine，戊聚糖聚硫酸鈉，噴司他丁，pentrozole，全氟溴烷，培磷酰胺，芥子醇，phenazinomycin，乙酸苯酯，磷酸酶抑制劑，picibanil，鹽酸匹魯卡品，吡柔比星，吡曲克辛，placetinA，placetin B，血漿酶原活化抑制劑，合成鉑，鉑化合物，合成鉑-三胺，卟非姆鈉，甲基絲裂霉素，強的松，丙烷基二度-吖啶酮，前列腺素J2，蛋白解體抑制劑，蛋白A基免疫調(diào)節(jié)劑，蛋白激酶C抑制劑，蛋白激酶C抑制劑，微藻，蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑，嘌呤核苷磷酸化酶抑制劑，紅紫素，吡唑并吖啶，pyridoxylated血色素聚氧化乙烯結(jié)合物，raf拮抗劑，雷替曲塞，雷莫司瓊，ras法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑，ras抑制劑，ras-GAP抑制劑，脫甲基的retelliptine，依替膦酸鈉錸Re 186，利索新，核酶，RII視黃酰胺，羅谷亞胺，rohitukine，羅莫肽，羅喹美克，rubiginone B1，ruboxyl，沙芬戈，saintopin，SarCNU，sarcophytol A，sargramostim，Sdi 1模擬藥，司莫司汀，衰老源自抑制劑1，正義寡核苷酸，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑，單鏈抗原結(jié)合蛋白，西佐喃，索布佐生，硼卡鈉，苯基乙酸鈉，solverol，生長調(diào)節(jié)素結(jié)合蛋白，索納明，斯帕福斯酸，spicamycin D，螺莫司汀，splenopentin，天然物質(zhì)海綿素1，角鯊胺，干細(xì)胞抑制劑，干細(xì)胞分離抑制劑，stipiamide，基質(zhì)溶解酶抑制劑，sulf次黃苷，超活性血管活性的腸肽拮抗劑，suradista，蘇拉明，苦馬豆素，合成粘多糖，他莫司汀，它莫西芬甲碘化物，?；悄就?，紫杉醇，tazarotene，tecogalan鈉，替加氟，tellurapyrylium，端粒酶抑制劑，替莫泊芬，替莫唑胺，替尼泊苷，四氯癸烷氧化物，tetrazomine，thaliblastine，撒利多胺，thiocoraline，硫鳥嘌呤，血小板生成素，血小板生成素模擬物，胸腺法新，促胸腺生成素受體激動劑，胸腺曲南，甲狀腺刺激性激素，初乙基卟啉錫，替拉扎明，二茂鈦二氧化物，topsentin，托瑞米芬，全能干細(xì)胞因素，轉(zhuǎn)換抑制劑，維A酸，三乙?；蜍?，曲西立濱，三甲曲沙，曲普瑞林，托烷司瓊，妥羅雄脲，酪氨酸激酶抑制劑，tyrphostins，UBC抑制劑，烏苯美司，尿生殖竇性的生長抑制性因子，尿激酶受體拮抗劑，伐普肽，variolin B，載體系統(tǒng)，紅血球基因治療，維拉雷瑣，veramine，verdins，維替泊芬，長春瑞賓，vinxaltine，vitaxin，伏氯唑，扎諾特隆，折尼鉑，亞芐維C，及凈司他丁斯酯。優(yōu)選的抗癌癥藥物為5-氟尿嘧啶和亞葉酸。
在更特定實施方案中，本發(fā)明還包括給予一種或多種本發(fā)明的單克隆抗體及給予一種或多種治療劑，如但不限于如表2中所述的抗癌試劑，優(yōu)選是治療如前所述的乳腺、卵巢、黑素瘤、前列腺、結(jié)腸和肺癌。
表2
本發(fā)明還包括給予本發(fā)明的EphA2抗體及放射治療，包括使用x-射線，γ射線和其它破壞癌細(xì)胞的放射源。在優(yōu)選實施方案中，該放射治療作為外部放射或遠(yuǎn)距放射治療給予，其中該放射直接從遠(yuǎn)程源導(dǎo)入。在其它優(yōu)選實施方案中，該放射治療作為內(nèi)部治療或近接治療給予，其中放射源被置于體內(nèi)部，接近癌細(xì)胞或腫瘤部分。
癌癥治療和其劑量，給予方法和推薦的使用方法在本領(lǐng)域是公知的，且在Physician′s Desk Reference中有所描述(第56版，2002)。
5.3本發(fā)明抗體的鑒定5.3.1激動性抗體本發(fā)明的抗體優(yōu)選可以激發(fā)(即誘導(dǎo)EphA2磷酸化)并免疫特異性結(jié)合EphA2受體。當(dāng)被激發(fā)時，EphA2磷酸化并隨后降解?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的檢測EphA2磷酸化、活性或表達(dá)的方法來檢測候選的EphA2抗體以確定它們的激發(fā)活性(見例如下文的第6.2.1節(jié))。
因此本發(fā)明提供了檢測和篩選本發(fā)明的EphA2抗體的方法，包括將特異性結(jié)合EphA2，特別是結(jié)合EphA2胞外結(jié)構(gòu)域的抗體，與表達(dá)EphA2的細(xì)胞，特別是癌細(xì)胞，優(yōu)選過度表達(dá)EphA2(與相同類型的非癌細(xì)胞相比)的轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞一起培育，然后檢測EphA2磷酸化的增加和/或EphA2的降解，從而鑒定本發(fā)明的EphA2抗體。
5.3.2優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EpgA2表位的抗體本發(fā)明的抗體可以優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞(如過度表達(dá)EphA2的細(xì)胞和/或具有大量未與配體結(jié)合的EphA2的細(xì)胞)而不是非癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位，其中非癌細(xì)胞中的EphA2與配體結(jié)合。在此實施方案中，本發(fā)明的抗體針對的是在非癌細(xì)胞上不暴露而在癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位(見例如6.6章節(jié))。非癌細(xì)胞與癌細(xì)胞之間EphA2的膜分布不同，癌細(xì)胞上暴露的某些表位在非癌細(xì)胞上不暴露。例如，正常時EphA2與其配體EphrinA1結(jié)合定位于細(xì)胞-細(xì)胞接觸處。而癌細(xì)胞通常細(xì)胞-細(xì)胞間接觸減少以及EphA2過度表達(dá)超過其配體。因此，癌細(xì)胞中不定位于細(xì)胞-細(xì)胞接觸處的未結(jié)合的EphA2量增多。因此，在一實施方案中，本發(fā)明的抗體優(yōu)選結(jié)合未結(jié)合、未定位的EphA2的抗體。
本領(lǐng)域公知的用于檢測候選EphA2抗體在細(xì)胞上的結(jié)合/定位的任何方法都可用來篩選候選的具有理想結(jié)合屬性的抗體。在一個實施方案中，用免疫熒光顯微鏡來檢測抗體的結(jié)合屬性?？梢杂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)來比較抗體與體外生長的細(xì)胞的結(jié)合。在特定實施方案中，將與癌細(xì)胞結(jié)合的抗體與結(jié)合于非癌細(xì)胞的抗體進行比較。暴露的EphA2表位抗體與非癌細(xì)胞結(jié)合較差，但與癌細(xì)胞結(jié)合較好。在另一個特定實施方案中，將與解離的非癌細(xì)胞(例如，用鈣螯合劑(如EGTA)處理的)結(jié)合的抗體與結(jié)合于未解離的非癌細(xì)胞的抗體進行比較。暴露的EphA2表位抗體與未解離的非癌細(xì)胞結(jié)合較差，但與解離的非癌細(xì)胞結(jié)合較好。
另一實施方案中，采用流式細(xì)胞計數(shù)測定抗體的結(jié)合特性。在此實施方案中，在該實施方案，EphA2可與其配體EphrinA1交聯(lián)或不交聯(lián)。暴露的EphA2表位抗體與交聯(lián)的EphA2結(jié)合較差，但與未交聯(lián)的EphA2結(jié)合較好。
在另一個實施方案中，用cell-based或免疫測定法來檢測抗體的結(jié)合特征。在該實施方案中，可以用能與EphA2配體(如EphrinA1)競爭結(jié)合EphA2的抗體來替代EphA2的EphrinA1。在這種分析中用到的EphA2配體可以是可溶解的蛋白(例如，重組表達(dá)的)或在細(xì)胞上表達(dá)，從而錨定到該細(xì)胞上。
5.4治療或預(yù)防作用的表征和證明本發(fā)明的預(yù)防和/或治療方案的毒性和效果可以通過標(biāo)準(zhǔn)藥物學(xué)方法在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒炇覄游镏袦y定，例如，測定LD50(50％的致死劑量)和ED50(50％的有效治療劑量)。毒性和治療效果的劑量比是治療指數(shù)，可以表達(dá)成LD50/ED50。表現(xiàn)出較大治療指數(shù)的預(yù)防和/或治療性試劑是優(yōu)選的。盡管可以使用具有毒性副作用的預(yù)防和/或治療性試劑，但是應(yīng)該小心設(shè)計輸送系統(tǒng)，以將這種試劑輸送至受影響的組織位點，從而使未受感染的細(xì)胞的可能損害達(dá)到最小化，因而降低副作用。
細(xì)胞培養(yǎng)分析和動物研究中得到的數(shù)據(jù)可用于配制各種劑量的人用預(yù)防和/或治療性試劑。這種試劑的劑量優(yōu)選是在循環(huán)濃度范圍內(nèi)，具有ED50和較小的或沒有毒性。根據(jù)所用的劑型和使用的給藥方案，劑量可在此范圍內(nèi)變化。對于本發(fā)明方法中使用的任何試劑，其治療有效量可以根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)分析進行初步估計。配制劑量以在動物模型中達(dá)到循環(huán)血漿濃度，包括細(xì)胞培養(yǎng)檢測的IC50(即，達(dá)到最大癥狀抑制的一半時的測試化合物濃度)。這些信息可用于更精確地測定人的有用劑量。例如使用高效液相色譜可以測量血漿中的水平。
本發(fā)明所用治療的抗癌活性可以使用本領(lǐng)域公知的用于研究癌癥的各種實驗動物模型來測定，如其中的小鼠EphA2用人EphA2替換的SCID小鼠模型或轉(zhuǎn)基因小鼠，帶有人異種移植物的裸鼠，如下文第6節(jié)所述的動物模型，或本領(lǐng)域已知的和以下文獻中描述任何動物模型(包括倉鼠，野兔等)Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development(1999版，F(xiàn)iebig和Burger)；Contributions to Oncology(1999，Karger)；The NudeMouse in Oncology Research(1991版，Boven和Winograd)；和AnticancerDrug Development Guide(1997版，Teicher)，在此引入全部內(nèi)容作為參考。
5.4.1治療作用的證明本發(fā)明的方案和組合物在使用前優(yōu)選在人體外、然后在人體內(nèi)對所需的治療或預(yù)防活性進行測試。例如，體外分析可用于檢測是否給予了特定的治療方案。該分析包括體外細(xì)胞培養(yǎng)分析，其中的患者組織樣品在培養(yǎng)基中生長，暴露或給予其它方案，并觀察這種方案對組織樣品的作用，例如，EphA2的磷酸化/降解升高。接觸細(xì)胞的低水平增生或存活表明，治療性試劑對于治療患者是有效的?？蛇x擇地，不培養(yǎng)患者細(xì)胞，可以使用腫瘤或惡性細(xì)胞系的細(xì)胞來篩選治療性試劑和方法。本領(lǐng)域中有多種分析標(biāo)準(zhǔn)可用于分析這種存活和/或生長；例如，可以通過測量3H-胸苷的插入、直接細(xì)胞計數(shù)、檢測已知基因(如原癌基因(例如，fos，myc))的轉(zhuǎn)錄活性或細(xì)胞循環(huán)標(biāo)記的變化來分析細(xì)胞增生；可以通過臺盼藍(lán)染色分析細(xì)胞生存能力，基于形態(tài)變化、EphA4磷酸化或降解的提高等來可見地分析分化。
在人中進行測試之前，治療用的化合物可在適合的動物模型系統(tǒng)中進行測試，包括但不限于在大鼠、小鼠、雞、牛、猴、兔、倉鼠等，例如，上文所述的動物模型。然后在適合的臨床試驗中使用化合物。
此外，本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的任何分析都可用來評估本文所述的用于治療或預(yù)防癌癥的組合治療的預(yù)防和/或治療作用。
5.5藥物組合物本發(fā)明的組合物包括藥物組合物制造中用的原料藥組合物(例如，不純的或未消毒的組合物)和可用于制備單位劑型的藥物組合物(即，適于給予受試者或患者的組合物)。這些組合物含有預(yù)防或治療有效量的本文所述的預(yù)防和/或治療性試劑或這些試劑與藥物可接受的載體的組合。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物含有預(yù)防和/或治療有效量的本發(fā)明的一種或多種EphA2抗體和藥學(xué)上可接受的運載體。在另一實施方案中，本發(fā)明的組合物還含有其它抗癌試劑。在特定實施方案中，所述其它抗癌試劑包括但不限于化療試劑、放療試劑、激素治療試劑、生物學(xué)治療和免疫治療試劑。
在特定實施方案中，術(shù)語″藥物可接受的″是指聯(lián)邦或政府管理機構(gòu)核準(zhǔn)的或美國藥典或其它通常認(rèn)可的藥典中所列的適于動物，更具體地是人的載體。術(shù)語″載體″是指稀釋劑、佐劑(例如，F(xiàn)reund佐劑(完全和不完全)，更優(yōu)選地，從Chiron，Emeryville，CA得到的MF59C.1佐劑)，賦形劑，或通過其給予治療劑的載體。這種藥物學(xué)載體可以是消毒的液體，如水和油，包括石油，動物，植物或合成的，如花生油，大豆油，礦物油，麻油等。當(dāng)該藥物組合物通過靜脈內(nèi)給予時，水是優(yōu)選的載體。生理鹽水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液體載體，尤其是用于注射用溶液。適合的藥物學(xué)賦形劑包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，凝膠，麥芽，水稻，面粉，白堊，硅膠，硬脂酸鈉，甘油單硬脂酸酯，滑石，氯化鈉，干脫脂奶，甘油，丙烯，乙二醇，水，乙醇等。如果需要，該組合物還可以含有少量潤濕劑或乳化劑，或pH緩沖劑。這些組合物可以是溶液，懸浮液，乳狀液，片劑，丸藥，膠囊，粉末，緩釋制劑等形式。
通常，本發(fā)明組合物的成分可以分別供應(yīng)或混合成單位劑型，例如作為在密封容器中(如表明活性試劑量的安瓿或小袋)的凍干粉末或無水濃縮物。如果通過灌輸給予該組合物，那么可以用裝有消毒藥物級水或生理鹽水的灌輸瓶分散。如果通過注射給予該組合物，那么可以提供注射用消毒水或生理鹽水安瓿，以在給予之前混合成分。
本發(fā)明組合物可配制成中性或鹽形式。藥物學(xué)上可接受的鹽包括用陰離子形成的鹽，如衍生于鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些鹽，還包括用陽離子形成的鹽，如衍生于鈉、鉀、銨、鲺、氫氧化鐵、異丙基胺、三乙基胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的鹽。
各種運輸系統(tǒng)是公知的，并可用于給予本發(fā)明的激動性單克隆抗體或本發(fā)明的激動性單克隆抗體與用于預(yù)防或治療癌癥的預(yù)防性或治療性試劑的組合，例如脂質(zhì)體膠囊，微粒，微膠囊，能夠表達(dá)抗體或抗體片段的重組細(xì)胞，受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(參見，例如，Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.2624429-4432)，作為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體等一部分的核酸結(jié)構(gòu)。給予本發(fā)明預(yù)防或治療性試劑的方法包括但不限于，腸胃外給予(例如，皮層內(nèi)，肌肉內(nèi)，腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)和皮下)，腦膜外，及粘膜(例如，鼻內(nèi)，吸入，及口服路線)。在特定實施方案中，本發(fā)明的預(yù)防或治療性試劑通過肌肉內(nèi)，靜脈內(nèi)，或皮下給予。預(yù)防或治療性試劑可以通過任何常規(guī)路線給予，例如通過灌輸或丸藥注射，通過上皮或粘膜皮膚襯層吸附(例如，口服粘膜，直腸和腸內(nèi)粘膜等)，也可以與其它生物活性試劑組合給予。給予可以是系統(tǒng)性的或局部的。
在特定實施方案中，可能需要將本發(fā)明的預(yù)防或治療性試劑局部給予至需要治療的區(qū)域；這可以通過例如但不限于局部灌輸、注射、或通過移植物來進行，所述移植物可以是帶孔的、非孔的或凝膠狀材料，包括膜，如硅橡膠膜，或纖維。
在另一個實施方案中，預(yù)防或治療性試劑可通過控制釋放或緩釋系統(tǒng)輸送。在一個實施方案中，可使用泵進行控制釋放或緩釋(參見，Langer，見上文；Sefton，1987，CRC Crit.Ref Biomed.Eng.1420；Buchwald等人，1980，Surgery 88507；Saudek等人，1989，N.Engl.J.Med.321574)。在另一個實施方案中，聚合物材料可用于對本發(fā)明的抗體或其片段進行控制釋放或緩釋(參見例如，Medical Applications of Controlled Release，Langer和Wise(編)，CRC Pres.，Boca Raton，F(xiàn)lorida(1974)；Controlled DrugBioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen和Ball(eds.)，Wiley，New York(1984)；Ranger和Peppas，1983，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361；也參見Levy等人，1985，Science 228190；During等人，1989，Ann.Neurol.25351；Howard等人，1989，J.Neurosurg.71105)；美國專利5,679,377；5,916,597；5,912,015；5,989,463；5,128,326；國際公開WO 99/15154和WO 99/20253。緩釋制劑中所用的聚合物例子包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羥基乙基酯)，聚(甲基丙烯酸甲基酯)，聚(丙烯酸)，聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)，聚(甲基丙烯酸)，聚乙醇酸(PLG)，聚酸酐，聚(N-乙烯吡咯烷酮)，聚(乙烯醇)，聚丙烯酰胺，聚(乙烯乙二醇)，聚交酯(PLA)，聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)，及聚原酸酯。在優(yōu)選實施方案中，緩釋制劑中所用的聚合物是惰性的，不含可濾去雜質(zhì)，貯存穩(wěn)定，消毒，及可生物分解的。在另一個實施方案中，控制釋放或緩釋系統(tǒng)置于接近預(yù)防或治療目標(biāo)處，因此僅需要系統(tǒng)性劑量的一部分(參見，例如，Goodson，Medical Applications of Controlled Release，見上文，vol.2，pp.115-138(1984))。
控制釋放系統(tǒng)公開在Langer(1990，Science 2491527-1533)的綜述中。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的任何技術(shù)可用于制備包含一種或多種本發(fā)明治療性試劑的緩釋制劑。參見，例如，美國專利4,526,938；國際公開WO91/05548和WO 96/20698；Ning等人，1996，Radiotherapy & Oncology 39179-189；Song等人，1995，PDA Journal of Pharmaceutical Science &Technology 50372-397；Cleek等人，1997，Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24853-854；和Lam等人，1997，Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24759-760，在此引入每一文獻的全部內(nèi)容作為參考。
5.5.1制劑本發(fā)明所用的藥物組合物可以使用一種或多種生理學(xué)上可接受的載體或賦形劑以常規(guī)方式配制。
因此?？蓪⒈景l(fā)明的EphA2抗體和其生理學(xué)上可接受的鹽和溶劑化物配制成通過吸入或吹入(通過口腔或鼻子)、或口服、腸胃外或粘膜(如口腔，陰道，直腸，舌下)給藥。在優(yōu)選實施方案中，使用局部或系統(tǒng)性腸胃外給藥。
對于口服給藥而言，上述藥物組合物例如可以通過用常規(guī)方式與藥物學(xué)上可接受的賦形劑一起制成片劑或膠囊，該賦形劑如結(jié)合劑(例如，預(yù)凝固的玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如，乳糖，微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂，滑石或氧化硅)；崩解劑(例如，土豆淀粉或淀粉乙醇酸鈉)；或潤濕劑(例如，月桂基硫酸鈉)?？梢杂帽绢I(lǐng)域公知的方法包被片劑。口服給藥用的液體制劑可以是例如溶液，糖漿或懸浮液，或它們以干產(chǎn)物的形式存在以在使用之前與水或其它適合載體組合。這種液體制劑可以通過用常規(guī)方法用藥物學(xué)上可接受的添加劑制備，該添加劑如懸浮劑(例如，山梨醇糖漿，纖維素衍生物或氫化食用脂肪)；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯樹膠)；非水性載體(例如，杏仁油，油狀酯，乙醇或分餾的植物油)；和防腐劑(例如，甲基或丙基-p-羥基苯甲酸酯或山梨酸)。在需時，該制劑也可以含有緩沖鹽、調(diào)味劑、著色劑和甜味劑。
口服給藥用的上述制劑可以配制成使活性化合物可控制地釋放。
對于口腔給藥，上述組合物可以以常規(guī)方式配制成片劑或止咳糖的形式。
對于吸入給藥，本發(fā)明所用的預(yù)防或治療性試劑方便地從壓縮包或噴霧器中以氣霧噴劑形式輸送，該輸送需要使用適合的推進劑，例如，二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它適合氣體。對于壓縮的氣霧劑，可以使用閥來測定劑量單位以實現(xiàn)定量輸送。吸入器或吹入器中所用的凝膠膠囊和藥管可配制成含有化合物和合適粉末基質(zhì)(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
可以將預(yù)防或治療性試劑配制成通過注射進行腸胃外給藥，例如，通過彈丸注射或連續(xù)灌輸給藥。注射用制劑可以是單位劑型，例如，在安瓿中或在多次劑量容器中的單位劑型，其中加入了防腐劑。該組合物在油性或水性載體中可以呈現(xiàn)出懸浮液、溶液或乳狀液形式，并可以含有配方試劑，如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?？蛇x擇地，所述的活性成分可以在使用前與適合載體例如消毒的無熱原水配制成粉末形式。
預(yù)防或治療性試劑也可以配制成直腸組合物，如栓劑或灌腸劑，例如，含有常規(guī)栓劑基質(zhì)，如可可油或其它甘油酯的栓劑或灌腸劑。
除了上述制劑外，上述預(yù)防或治療性試劑也可以配制成貯存制劑。這種長時間作用制劑可通過植入(例如皮下或肌肉內(nèi))來給予或通過肌肉內(nèi)注射給予。因此，例如，該預(yù)防或治療性試劑可用合適的聚合或疏水材料配制(例如在可接受油中作為乳狀液)或用離子交換樹脂配制，或配制成微溶的衍生物，例如，微溶的鹽。
本發(fā)明也提供包裝在密封容器中(如表明活性試劑量的安瓿或小袋)的預(yù)防或治療性試劑。在一個實施方案中，該預(yù)防或治療性試劑可作為密封容器中的干消毒凍干粉末或無水濃縮物提供，并可例如用水或生理鹽水重建成適合濃度，以給予個體。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，各種化學(xué)治療、生物治療/免疫治療和激素治療性試劑的配制和給予是本領(lǐng)域公知的，通常公開在Physician′s DeskReference，第56版(2002)中。例如，在本發(fā)明的某些特定實施方案中，配制本發(fā)明的治療性試劑，并以表2形式供應(yīng)。
在本發(fā)明其它實施方案中，可以以膠囊中的液體或飲品形式口服給予放射治療性試劑，如放射性同位素。放射性同位素也可配置成靜脈內(nèi)注射。腫瘤學(xué)家可以測定優(yōu)選的制劑和給藥路徑。
在某些實施方案中，本發(fā)明的激動性單克隆抗體以1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml及25mg/ml配制，以進行靜脈內(nèi)注射，和以5mg/ml、10mg/ml及80mg/ml配制，以進行重復(fù)皮下給予和肌肉內(nèi)注射。
如果需要，可以將上述組合物置于包裝或分配裝置中，其可包括一種或多種含有活性成分的單元劑型。這種包裝例如包括金屬或塑料箔，如泡罩包裝。該包裝或分配裝置可以附有給藥說明書。
5.5.2劑量可有效治療、預(yù)防或控制癌癥的本發(fā)明的組合物的量可以通過標(biāo)準(zhǔn)研究技術(shù)來確定。例如，可有效治療、預(yù)防或控制癌癥的組合物的劑量可通過將該組合物給予動物模型來確定，例如，用本文所述或本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的動物模型。此外，任選地可以使用體外分析方法來幫助確定最佳的劑量范圍。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于幾種因素的考慮，來確定優(yōu)選有效劑量(例如通過臨床試驗)。這些因素包括待治療或預(yù)防的疾病、癥狀、患者體重、患者免疫狀態(tài)和本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的影響給予的藥物組合物的精確度的其它因素。
使用的精確劑量也取決于給藥途徑及癌癥的嚴(yán)重度，并根據(jù)每個醫(yī)生的判斷和患者情況來決定?？梢愿鶕?jù)體外或動物模型測試系統(tǒng)的劑量反應(yīng)曲線外推出有效劑量。
對于抗體，給予患者的劑量通常為0.1mg/kg～100mg/kg患者體重。優(yōu)選地，給予患者的劑量為0.1mg/kg～20mg/kg患者體重，更優(yōu)選為1mg/kg～10mg/kg患者體重。通常，人和人源化抗體在人體中比從其它物種得到的抗體有更長的半衰期，這是由于對外源多肽有免疫反應(yīng)。因此，通?？梢越o予較少劑量的人抗體和給予次數(shù)減少。
對于給予患者的其它癌癥治療性試劑而言，本領(lǐng)域公知的各種癌癥治療的通常劑量列于表2中。在本發(fā)明中，某些優(yōu)選實施方案包括在組合治療中給予的劑量比單一試劑給予的劑量低。
本發(fā)明提供了用已知預(yù)防或治療性試劑給藥的任何方法，其給予計量比以前認(rèn)為的預(yù)防、治療、控制或改善癌癥有效劑量要低。優(yōu)選地，將較低劑量的公知抗癌癥治療劑與較低劑量的本發(fā)明的激動性單克隆抗體組合給藥。
5.6試劑盒本發(fā)明提供藥物包或試劑盒，其包括填充有本發(fā)明的EphA2抗體的一個或多個容器。此外，一種或多種用于治療癌癥的其它預(yù)防或治療性試劑也可以包含在這種藥物包或試劑盒中。本發(fā)明還提供一種藥物包或試劑盒，其包括填充有本發(fā)明的藥物組合物的一種或多種組分的一個或多個容器。任選地，這種容器含有一個通知，其以政府機構(gòu)規(guī)定的形式規(guī)定藥物或生物產(chǎn)品的制造、使用或銷售，這種通知反映了允許制造、使用或銷售以用于人給藥。
本發(fā)明提供了可在上述方法中使用的試劑盒。在一個實施方案中，該試劑盒含有一種或多種本發(fā)明的EphA2抗體。在另一個實施方案中，該試劑盒還含有在一個或多個容器中的一種或多種用于治療癌癥的其它預(yù)防或治療性試劑。在某些實施方案中，該其它預(yù)防或治療性試劑是化學(xué)治療性的。在其它實施方案中，該預(yù)防或治療性試劑是生物治療性或激素治療性的。
6.實施例6.1單克隆抗體的制備抗原的制備用RIPA緩沖液提取Ras-轉(zhuǎn)化的MCF-10A細(xì)胞。用固定的PY20抗體部分純化酪氨酸磷酸化蛋白(Kanner等.，1989，J Immunol Meth.120115-124)。用25mM苯基磷酸競爭性洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。用磷酸酪氨酸特異性抗體作western印染分析驗證含PY20反應(yīng)蛋白的組分。
抗體的篩選作為EphA2免疫反應(yīng)性的初步篩選，篩檢大量培養(yǎng)的雜交瘤上清液對EphA2的免疫反應(yīng)性。設(shè)計免疫策略來鑒定活的腫瘤細(xì)胞上的胞外EphA2表位。因此采用熒光ELISA方法(FluorELISA)選擇抗體對活細(xì)胞的反應(yīng)性。這種篩選方法適合免疫印染分析，傾向于篩選能識別構(gòu)型限制性表位的抗體。
用報導(dǎo)的分析方法的改進方法監(jiān)測抗EphA2抗體與EphA2受體的細(xì)胞表面結(jié)合(Kilpatrick等.，1998.Hybridoma.17576)。用0.1M磷酸鈉(pH 8.0)將氫溴酸聚-L-賴氨酸鹽(Sigma，St，Louis，MO)稀釋至10μg/ml，取100微升處理96孔平底組織培養(yǎng)板(Costar，Cambridge，MA)1小時。除去孔中的聚-L-賴氨酸鹽，然后加入100μl的MDA-MB-231(EphA2陽性)或BT474(陰性對照)細(xì)胞懸液，濃度為每孔3×104細(xì)胞。37℃，5％CO2培養(yǎng)過夜，輕輕除去培養(yǎng)液，將100μl雜交瘤上清液加到細(xì)胞上室溫培養(yǎng)1小時。用1×Dulbecco磷酸緩沖鹽水(pH 7.1)(GIBCO，Grand Island，NY)洗滌樣品三次。加入用PBS稀釋至2μg/ml的羊抗鼠Alexa Fluor 488抗體(100μl；分子探針，Eugene，OR)，室溫培育1小時。用PBS洗滌細(xì)胞后，各孔加入50μl含2％FCS的PBS，然后用倒置熒光顯微鏡(Model DM-IRB，Leica，Deerfield，IL)觀察。
FluorELISA鑒定出著染的44批雜交瘤，其著染EphA2過度表達(dá)的腫瘤細(xì)胞(MDA-MB-231)，但不著染EphA2缺乏的細(xì)胞(BT474)(數(shù)據(jù)未顯示)。用免疫熒光顯微鏡證實了免疫反應(yīng)性，顯示為彌散性膜染色模式，這與我們先前的EphA2亞細(xì)胞定位研究(如Zelinski等.，2001，Cancer Res.612301和Zantek等.，1999，Cell Growth Diff.10629)相一致?；陉栃园屑?xì)胞強免疫染色而缺陷性細(xì)胞無免疫染色，用流式細(xì)胞儀先選出用于亞克隆的多批雜交瘤培養(yǎng)物。然后將多批雜交瘤培養(yǎng)物用流式細(xì)胞儀亞克隆，并對亞克隆的雜交瘤上清液重復(fù)進行FluorELISA。
6.2EphA2單克隆抗體降低了腫瘤細(xì)胞的代謝性能6.2.1EphA2的磷酸化和降解EphA2抗體促進了MDA-MB-231細(xì)胞的EphA2酪氨酸磷酸化和降解(圖1A-1C)。在存在EA5(圖1A-1B。泳道2，3)或EA2(圖1A-1B，泳道4，5)或?qū)φ?圖1A-1B，泳道1)時37℃培養(yǎng)細(xì)胞單層8分鐘。然后用EphA2特異性抗體(D7，購自Upstate Biological，Inc.Lake Placid，NY和予2000年12月8日保存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type TissueCollection)，ATCC編號是PTA2755)免疫沉淀細(xì)胞裂解液，用SDS-PAGE溶解并用磷酸酪氨酸特異性抗體(4G10，購自Upstate Biological，Inc.LakePlacid，NY)作western印染分析(圖1A)。膜切成條，采用免疫沉淀所用的EphA2特異性抗體(D7)作為對照再檢測。
如前文所述(Zantek等.，1999，Cell Growth Diff.10629-38)進行western印染分析和免疫沉淀。簡而言之，用含1％Triton X-100(Sigma，St，Louis，MO)的Tris緩沖鹽水抽提細(xì)胞單層得到洗滌劑提取物。測定蛋白質(zhì)濃度(BioRad，Hercules，CA)后，免疫沉淀獲得1.5mg細(xì)胞裂解物，用SDS-PAGE溶解后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Protran，Schleicher and Schuell，Keene，NH)上。用增強的化學(xué)發(fā)光(Pierce，Rockford，IL)和放射自顯影(KodakX-OMAT，Rochester，NY)檢測抗體的結(jié)合。
與EphA2拮抗性EA5和EA2抗體培育后發(fā)現(xiàn)EphA2的磷酸化提高(圖1B)。在存在30ug/ml EA5(圖1C，泳道2、3)或EA2(圖1C，泳道4、5)或?qū)φ?圖1C，泳道1)時37℃培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞單層24小時。然后用SDS-PAGE溶解細(xì)胞裂解物并用EphA2特異性(D7)進行western印染分析。與抗體一起培育EphA2蛋白水平提高。
用A549細(xì)胞進行相似的試驗。在存在EA5或EA2或?qū)φ?PBS)時37℃培養(yǎng)A549細(xì)胞單層10分鐘(圖2A-2B)或5小時(圖2C-2D)。然后用EpgA2特異性抗體(D7)免疫沉淀細(xì)胞裂解液，用SDS-PAGE溶解并用磷酸酪氨酸特異性抗體(4G10，購自Upstate Biological，Inc.Lake Placid，NY)進行western印染分析(圖2A，2C)。膜切成條，采用免疫沉淀所用的EphA2特異性抗體(D7)作為對照再檢測(圖2B，2D)?？贵w培育10分鐘導(dǎo)致磷酸化提高(圖2A)。培育5小時，這些抗體導(dǎo)致EphA2蛋白降解(圖2D)。
6.2.2軟瓊脂培養(yǎng)將腫瘤細(xì)胞懸浮于軟瓊脂中。按Zelinski等(2001，CancerRes.612301-6)所述檢測軟瓊脂中形成的細(xì)胞集落。在底部和頂部瓊脂液中培育抗體或?qū)φ杖芤?PBS)。從懸浮時開始計算，在存在純化抗體或?qū)φ杖芤?PBS)的軟瓊脂中37℃懸浮培養(yǎng)細(xì)胞7天。用帶有40×目鏡的Olympus CK-3倒置相差顯微鏡觀察形成的集落并評分。至少含三個細(xì)胞的集落評為陽性。標(biāo)出每個高倍視野的平均集落數(shù)。在每次實驗中將10個不同的顯微鏡高倍視野平均化，所顯示的結(jié)果代表至少三次不同的實驗。
用10μg/ml或2.5μg/ml的EA5或EA2單克隆抗體或?qū)φ?PBS)培育A549惡性肺癌細(xì)胞。所用的所有抗體量均抑制了軟瓊脂中細(xì)胞的生長(圖3A)。良性MCF-7乳腺上皮細(xì)胞因過度表達(dá)EphA2而轉(zhuǎn)變成惡性細(xì)胞(MCF-7EphA2)。用EA5單克隆抗體或?qū)φ?PBS)培養(yǎng)二種腫瘤細(xì)胞。EA5抑制了MCF-7EphA2細(xì)胞在軟瓊脂中的生長。良性MCF-7細(xì)胞與或不與此抗體一起培養(yǎng)均不能在軟瓊脂中形成集落(圖3B)。結(jié)果報告為每個高倍視野(HPF)下的集落數(shù)。對照實驗證實，針對EphA2胞內(nèi)表位的同型-匹配抗體(IgG1)或?qū)φ湛贵w(如抗樁蛋白抗體)均不能減少軟瓊脂中的集落形成(數(shù)據(jù)未顯示)。
6.2.3MATRIGELTM中管狀網(wǎng)絡(luò)的形成在三維環(huán)境中，如MATRIGELTM中腫瘤細(xì)胞的行為可可靠地預(yù)測乳腺上皮細(xì)胞的分化狀態(tài)和侵襲性。在存在EphA2抗體(10μg/ml)或?qū)φ杖芤?PBS)的MATRIGELTM上培養(yǎng)單層良性(MCF-10A)或惡性(MDA-MB-231)乳腺上皮細(xì)胞。按Zelinski等(2001，Cancer Res.612301-6)所述分析細(xì)胞在MATRIGELTM上的行為。簡而言之，將組織培養(yǎng)皿37℃用MATRIGELTM(Collaborative Biomedical Products，Bedford，MA)包被，然后加入已在冰上與EphA2拮抗性抗體或?qū)φ杖芤?PBS)培育了1小時的1×105個MDA-MB-231或MCF-10A細(xì)胞。37℃在MATRIGELTM上培育細(xì)胞24小時，用Olympus IX-70倒置顯微鏡評估細(xì)胞行為。所有影象記錄在35mm膠片(T-Max-400，Kodak，Rochester，NY)上。
24小時內(nèi)，在MATRIGELTM上沒有轉(zhuǎn)化的MCF-10A上皮細(xì)胞形成腺泡樣小球，而MDA-MB-231細(xì)胞迅速裝配成管狀網(wǎng)絡(luò)。這些網(wǎng)絡(luò)高級侵入所有的MATRIGELTM。加入EphA2拮抗性抗體阻止了該管狀網(wǎng)絡(luò)的形成。
6.2.4體內(nèi)生長EA5可抑制體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長。在無胸腺小鼠的同位或皮下植入5×106個MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞，并皮下植入5×106個A549肺癌細(xì)胞。腫瘤長到平均體積100mm3時給予小鼠6mg/kg的EA5或陰性對照(PBS或1A7抗體)，腹腔注射每周二次共三周。最后一次處理后至少二周或腫瘤超過2,000mm3后處死小鼠。評估腫瘤的生長，表示為腫瘤體積除以原先腫瘤(100mm3)之比或腫瘤的總體積。EA5抑制了同位植入的MDA-MB-231細(xì)胞的生長(圖4A)。皮下植入的A549細(xì)胞也受到EA5的抑制(圖4C)。
6.3乳腺癌細(xì)胞中的雌激素依賴性用人EphA2(MCF-7EphA2)(T Hunter，Scripps Institute博士提供的pNeoMS-EphA2)轉(zhuǎn)染雌激素敏感性乳腺癌MCF-7細(xì)胞并使其穩(wěn)定地過度表達(dá)人EphA2(MCF-7EphA2)。Western印染分析證實與匹配的對照細(xì)胞相比，EphA2在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中異常過度表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。
EphA2的過度表達(dá)提高了惡性生長(圖5A-5B)。如下進行生長分析。將MCF-7neo(對照細(xì)胞)或MCF-7EphA2細(xì)胞接種在96孔板中。用Alamar蘭(Biosouce International，Camarillo，CA)按制造商的建議測定細(xì)胞的生長。如前所述(Zelinski等，2001，Cancer Res.612301-6)在軟瓊脂中形成集落，用顯微鏡評分，將至少三個細(xì)胞的組定義為陽性。數(shù)據(jù)代表了每份樣品10個不同高倍視野的平均值，并代表至少三次不同的實驗結(jié)果。誤差條代表至少三次不同實驗的平均值的標(biāo)準(zhǔn)差，用Microsoft Excel軟件測定。
雖然MCF-7細(xì)胞大都不能在軟瓊脂中形成集落(平均每視野0.1個集落)，但MCF-7EphA2細(xì)胞形成了更大更多的集落(每視野4.7個集落；P＜0.01)，并維持至少三周(圖5A，數(shù)據(jù)未顯示)。盡管軟瓊中集落增加，但MCF-7EphA2細(xì)胞在單層培養(yǎng)時的生長與匹配的對照不同(圖5B)，這表明在模仿非錨定依賴性(惡性)細(xì)胞生長的試驗條件下EphA2的生長促進活性最為顯著。
與軟瓊脂集落增加相一致，同位植入的MCF-7EphA2細(xì)胞在體內(nèi)形成了更大、生長更快的腫瘤。6-8周齡的無胸腺(nu/nu)小鼠購自Harlan SpraqueDawley(Indianapolis，IN)。如所示，在腫瘤植入后24小時通過無菌14號套管針皮下注射控釋的雌二醇片(0.72mg 17β-雌二醇，60天配方)，藥片每隔60天換一次，這些實驗持續(xù)60天以上。在直視下將1×106個MCF-7neo或MCF-7EphA2細(xì)胞注射到乳腺脂肪墊中。通過口飼管每周6天給予所示的它莫西芬(1mg)。
在存在輔助的雌激素(17β-雌二醇，購自Sigma)的情況下，MCF-7EphA2細(xì)胞與匹配的對照相比顯示出腫瘤體積增加二倍(圖6A)。EphA2過度表達(dá)腫瘤在表型上與對照腫瘤不同，它們在切除時具有更多的脈管且局部侵入更廣(數(shù)據(jù)未顯示)。為了驗證這些腫瘤表達(dá)的EphA2，對切除腫瘤的全細(xì)胞裂解物用EphA2特異性抗體作western印染分析(圖6B)。將膜切成條，用β連環(huán)蛋白抗體再檢測以證實樣品的加載量相等。腫瘤樣品比輸入細(xì)胞中的EphA2的相對量要高(植入前)，這表明腫瘤產(chǎn)生高水平的EphA2細(xì)胞。體外和體內(nèi)模型的比較研究表明，EphA2的過度表達(dá)產(chǎn)生更具侵襲性的表型。
在不存在外源雌激素的情況下進行平行研究。實驗性除去雌激素擴大了對照與MCF-7EphA2細(xì)胞之間的差異。雖然MCF-7EphA2細(xì)胞在軟瓊脂中比匹配的對照仍然更有效地形成集落，但是這些細(xì)胞在沒有外源雌激素存在時也生長(圖7B)。相反，對照細(xì)胞的單層生長要求加入雌激素(圖7B)。此外，MCF-7EphA2細(xì)胞在不存在輔助的雌激素時保留了產(chǎn)生腫瘤的能力。對照的MCF-7細(xì)胞幾乎不形成明顯的腫瘤，而MCF-7EphA2細(xì)胞形成的腫瘤可持續(xù)12周以上(圖7C，數(shù)據(jù)未顯示)。因此體外和體內(nèi)試驗系統(tǒng)均證實了EphA2的過度表達(dá)減少了對外源性雌激素的需求。
檢測MCF-7EphA2細(xì)胞對它莫西芬的敏感性。它莫西芬(4-羥基它莫西芬，購自Sigma)減少了對照MCF-7細(xì)胞在軟瓊脂上形成的集落的至少60％。它莫西芬對MCF-7EphA2細(xì)胞的抑制作用較弱(25％抑制，圖8A)。顯然，過量的雌二醇消除了它莫西芬的抑制作用，這為本發(fā)現(xiàn)的特異性提供了額外的證據(jù)。相似地，MCF-7EphA2細(xì)胞相對于對照(MCF-7neo細(xì)胞)對它莫西芬具有較低的敏感性(圖8)。
因為它莫西芬的敏感性常與雌激素受體表達(dá)有關(guān)，因此檢測了MCF-7EphA2細(xì)胞中的雌激素受體的表達(dá)和活性。Western印染分析表明，在對照和MCF-7EphA2細(xì)胞中ERα和ERβ的水平相當(dāng)(圖9A-9B)(ERα和ERβ抗體購自Chemicon Temecula，CA)。而且在對照與MCF-7EphA2細(xì)胞中測得的雌激素受體活性相當(dāng)，并且此酶活性仍對它莫西芬敏感(圖9E-9F)。用ERE-TK-CAT載體(其編碼單一ERE；為Indiana大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Nakshatri博士饋贈)測定了在非刺激狀態(tài)下、雌二醇(10-8M)刺激后和它莫西芬(10-6M)抑制時雌激素受體的活性。在無酚紅、木碳剝離了血清的培養(yǎng)基中接種細(xì)胞，培養(yǎng)二天，用磷酸鈣法以ERE-TK-CAT轉(zhuǎn)染細(xì)胞。共轉(zhuǎn)染β-半乳糖苷酶表達(dá)載體RSV/β-半乳糖苷酶(2μg，Nakshatri博士饋贈)作為對照。轉(zhuǎn)染后24小時加入新鮮的含有適當(dāng)選擇性藥物的培養(yǎng)基。24小時后收集細(xì)胞，如(Nakshatri等.，1997，Mol Cell Biol.17；3629-39)所述評價CAT活性。這些結(jié)果表明在MCF-7EphA2細(xì)胞中的雌激素受體得到表達(dá)并保持對它莫西芬的敏感性，因而表明了MCF-7EphA2細(xì)胞對雌激素的依賴性降低是因為雌激素的下游信號。
在軟瓊脂中測試了EphA2表達(dá)水平得到降低的MCF-7EphA2細(xì)胞。EphA2單克隆抗體EA5誘導(dǎo)了EphA2活化和隨后的降解。在EA5處理后二小時內(nèi)EphA2的表達(dá)水平降低，在隨后的至少24小時內(nèi)EphA2保持檢測不到(圖10A)。對照MCF-7細(xì)胞的軟瓊脂集落形成對它莫西芬敏感(圖10C)，而EA5不能進一步改變這種應(yīng)答(因為這些細(xì)胞缺乏內(nèi)源性EphA2)。與匹配的對照(它莫西芬產(chǎn)生75％抑制)相比，MCF-7EphA2細(xì)胞對它莫西芬不大敏感(它莫西芬產(chǎn)生25％抑制)。而EA5減少了軟瓊脂中的集落形成(達(dá)19％)，EA5和它莫西芬聯(lián)用使軟瓊脂中的集落形成大大減少(＞80％)。因此，EA5處理恢復(fù)表型與對照MCF-7細(xì)胞相當(dāng)。這些發(fā)現(xiàn)表明，EphA2的抗體處理可使乳腺腫瘤細(xì)胞重新對它莫西芬敏感。
用Microsorft Exel(Seattle，WA)作Student檢驗進行了所有的統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05定義為顯著差異。用GraphPad軟件(San Diego，CA)進行了體內(nèi)腫瘤生長的分析。
6.4前列腺上皮內(nèi)腫瘤中EphA2的表達(dá)EphA2免疫反應(yīng)可區(qū)分瘤性前列腺上皮細(xì)胞和其非瘤性細(xì)胞。從Indiana大學(xué)醫(yī)學(xué)中心外科病歷擋案中獲得93例根治性前列腺切除術(shù)?；颊叩哪挲g為44-77歲(平均＝63歲)。按照Gleason系統(tǒng)對根治性前列腺切除術(shù)樣品的原發(fā)腫瘤進行分級(Bostwick“Neoplasms of the prostate”，Bostwick和Eble編.，1997，Urologic Surgical Pathology.St LouisMosby，343-422頁；Gleson和Mellinger，1974，J Urol.11158-64)。該Gleason級數(shù)為4-10級。根據(jù)1977 TNM(腫瘤、淋巴節(jié)和轉(zhuǎn)移)標(biāo)準(zhǔn)(Fleming等.，1977，AJCC CancerStaging Manul PhiladephiaRaven和Lippincott)評估病理學(xué)階段。病理學(xué)階段是T2a(n＝9位患者)、T2b(n＝43)、T3a(n＝27)、T3b(n＝14)。手術(shù)時有13位患者淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移。
采用福爾馬林固定的根治性前列腺切除樣品的一系列5微米厚切片作免疫熒光染色。選出含有最大數(shù)目腫瘤和最高Gleason等級的組織段。分析各病例的一張代表性切片。用二甲苯給切片脫蠟二次共5分鐘，通過分級乙酸和蒸餾水再水合。在EDTA(pH8.0)中加熱切片30分鐘回收抗原。用3％H2O2培育15分鐘使內(nèi)源性過氧化物酶失活。用蛋白質(zhì)封閉劑(DAKO)封閉非特異性位點20分鐘。然后用小鼠抗人EphA2單克隆抗體(IgG1，1∶100稀釋)室溫培育組織切片過夜，然后加入生物素化第二抗體(DAKO公司，Carpintera，CA)和過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，并在存在過氧化氫時將3，3-二氨基聯(lián)苯胺作為生色原。每次試驗同時設(shè)陽性和陰性對照。
評價了各病倒同一切片的良性上皮、高級前列腺上皮內(nèi)腫瘤(PIN)和腺癌的著色范圍和強度。選擇具有最高程度的免疫反應(yīng)的顯微鏡視野進行分析。各病倒分析至少1,000個細(xì)胞。從0至95％以5％的遞增半定量評價各病倒顯示著色的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。強度評分設(shè)為0-3級(0不著色，1弱著色，2中度著色和3強著色)(Jiang等.，Am J Pathol.160667-71；Cheng等.，1996，Am J Pathol.1481375-80)。
用Wilcoxon配對秩和檢驗比較了良性上皮、高級前列腺上皮內(nèi)腫瘤(PIN)和腺癌中免疫反應(yīng)細(xì)胞的平均百分?jǐn)?shù)。用Cochran-Mantel-Haenszel檢驗比較了良性上皮、高級前列腺上皮內(nèi)腫瘤(PIN)和腺癌中EphA2著色的強度獲得校正的有序確切數(shù)據(jù)。如果ANOVA顯示有顯著差異，則進行配對比較。P值＜0.05認(rèn)為有顯著性，所有P值都是雙側(cè)性的。
在所有高級前列腺上皮內(nèi)腫瘤(PIN)和癌腫都觀察到EphA2免疫反應(yīng)，但在良性上皮細(xì)胞癌中沒有觀察到。例如，在高級前列腺上皮內(nèi)腫瘤(PIN)和癌中，EphA2表達(dá)(免疫反應(yīng)細(xì)胞平均百分?jǐn)?shù)和著色強度)相對于良性上皮細(xì)胞增加(表3和4)。相似地，與高級PIN相比，前列腺癌中的EphA2免疫反應(yīng)(免疫反應(yīng)細(xì)胞平均百分?jǐn)?shù)和著色強度)增加(表3和4)。此免疫反應(yīng)顯示位于瘤性上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和胞漿中(數(shù)據(jù)未顯示)。相反，腫瘤附近的基底細(xì)胞中未觀察到EphA2免疫反應(yīng)。在高級PIN組中，22％顯示1級著色強度，73％顯示2級著色強度，5％顯示3級著色強度(表3)。在腺癌組中，13％病例顯示1級著色強度，50％顯示2級著色強度，37％顯示3級著色強度。相反，正常上皮組66％病例顯示1級，其余病例未顯示有EphA2蛋白免疫反應(yīng)(0級著色強度)(表3)。正常上皮細(xì)胞中EphA2免疫反應(yīng)細(xì)胞的平均百分率為12％，高級PIN中為67％，前列腺腺癌中為85％(表4)。
雖然高水平的EphA2不能區(qū)分瘤性和良性前列腺上皮細(xì)胞，但是EphA2與疾病嚴(yán)重程度的其它組織學(xué)和病理學(xué)參數(shù)的確無關(guān)。例如，在大多數(shù)前列腺癌中都觀察到高水平的EphA2，且高水平的EphA2與Gleason等級、病理階段、淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移、前列腺外延伸、手術(shù)邊界、血管入侵、外周神經(jīng)入侵或前列腺其它區(qū)域中是否存在高級PIN無關(guān)(表5)。
表3
a表示用Wilcoxon配對秩和檢驗，著色強度百分率在統(tǒng)計學(xué)上低于正常細(xì)胞，P值＝0.0001。b著色強度顯著高于高級PIN(P＜0.01，Cochran-Mantel-Henszel檢驗。)表4
a表示用Wilcoxon配對秩和檢驗，著色百分率在統(tǒng)計學(xué)上低于正常細(xì)胞，P值＝0.0001。
b著色百分率在統(tǒng)計學(xué)上高于高級PIN(p＜0.01，ANOVA)。
表5
6.5轉(zhuǎn)移癌患者的治療設(shè)計了一項研究來評估本發(fā)明的激動性單克隆抗體在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中的藥物動力學(xué)性能和安全性。癌患者目前接受紫彬醇或Taxotere治療?；颊吣壳敖邮艿闹委熢试S繼續(xù)采用這些藥物。
給予患者單一靜脈注射劑量的本發(fā)明的單克隆抗體，在開始4周后每周重復(fù)給予相同劑量的靜脈劑量，持續(xù)12周，然后分析。評估用本發(fā)明的激動性單克隆抗體靜脈注射26周治療的安全性和該疾病活動的可能變化。不同組患者接受1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg或8mg/kg劑量治療并作類似評價。
為靜脈內(nèi)注射將本發(fā)明的抗體配成5mg/ml和10mg/ml。為了進行該研究，本發(fā)明抗體也要配成100mg/ml給藥。
按腫瘤生長的進展測定或確定變化。
6.6EphA2抗體的表位分析表征了EphA2抗體的表位。EA5和EA2選擇性結(jié)合惡性細(xì)胞。如免疫熒光染色所示，抗EphA2單克隆抗體EA5和EA2結(jié)合惡性MDA-MB-231乳腺上皮腫瘤細(xì)胞(圖11A-11B)強于結(jié)合良性MCF-10A乳腺上皮腫瘤細(xì)胞(圖11C-11D)。此外EA5對惡性前列腺細(xì)胞有免疫反應(yīng)性?？笶phA2單克隆抗體EA5鑒定出了福爾馬林固定、石蠟包埋的臨床標(biāo)本中的惡性前列腺癌細(xì)胞。
EA5優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞而不是非癌細(xì)胞上暴露的表位。用3％福爾馬林液固定并用偶聯(lián)有熒光的抗小鼠IgG免疫標(biāo)記后，4℃將來轉(zhuǎn)化的MCF-10A細(xì)胞或轉(zhuǎn)化的MDA-MB-231細(xì)胞與10μg/ml EA2培育30分鐘。EA5優(yōu)先結(jié)合轉(zhuǎn)化細(xì)胞上的EphA2(圖13D)。相反，另一種EphA2抗體Eph099B-233.152(ATCC登記號PTA-5194；見2003年5月12日提交的題為“EphA2 Monoclonal Antibodies amd Methods of Use Thereof”的未決美國專利申請10/436,782，此抗體結(jié)合在轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化細(xì)胞上表達(dá)的EphA2(圖13A-13B)。用4mM EGTA處理未轉(zhuǎn)化MCF-10A細(xì)胞20分鐘，使該細(xì)胞解離。EA5結(jié)合EGTA解離細(xì)胞而不是未處理細(xì)胞上的EphA2(圖14A-14B)。
用MCF-10A或MDA-MB-231細(xì)胞進行同樣實驗。用流式細(xì)胞儀測定結(jié)合EphA2的EA5的量(圖14C-14D)。細(xì)胞在冰上在4mM EGTA中培育處理10-15分鐘(上圖)，或在不用EGTA處理(中圖)，接著與10μg/ml EA5一起培育。然后用3％福爾馬林固定，并用熒光標(biāo)記的驢抗小鼠IgG標(biāo)記。對照細(xì)胞僅在不存在第一抗體(EA5)的情況下與第二抗體(熒光標(biāo)記的驢抗小鼠IgG)一起培育(下圖)。然后用流式細(xì)胞儀(Becto Dikinson FACSStarPlus)評價樣品。EGTA處理不影響EA5與轉(zhuǎn)化細(xì)胞的結(jié)合(圖14D，上、中圖)相反，在EGTA中培育不提高EA5與未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的結(jié)合(圖14C，上、中圖)。
EA5不結(jié)合與EphA2配體EphrinA1相同的表位。4℃用10mg/ml EphrinA1-Fc包被微量滴定板過夜。將含有與人IgG1恒定區(qū)相連接的EphA2胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白(EphA2-Fc)與固定的Ephrin A1-Fc一起培育并結(jié)合。將生物素化的EphrinA1-Fc與EphA2-Ephrin A1-Fc復(fù)合物一起培育并測定結(jié)合的量。只有非常少的EphrinA1-Fc與EphA2-EphrinA1-Fc復(fù)合物結(jié)合，而相反，相當(dāng)水平的EA5與該EphA2-EphrinA1-Fc復(fù)合物結(jié)合(圖15A)。
如上所述制備EphA2-EphrinA1-Fc復(fù)合物。將生物素化EA5(10μg/ml)與該復(fù)合物一起培育30分鐘。以所示量將非標(biāo)記的競爭物與EphA2-EphrinA1-Fc-EA5復(fù)合物一起培育。未標(biāo)記的EA5替換了濃度為10ng/ml或更高的標(biāo)記的EA5。未標(biāo)記的EphrinA1-Fc明顯不能替換標(biāo)記的EA5(圖15B)。
7等價物無需經(jīng)過更多的常規(guī)實驗，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道或能夠確定，有許多本文所述的本發(fā)明的具體實施方案的等同物。這些等同物都包括在以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本說明書中所提及的所有出版物、專利和專利申請均納入本文作為參考，如同各出版物、專利或?qū)＠暾執(zhí)囟ɑ騻€別地納入作為參考一樣。
序列表<110>醫(yī)學(xué)免疫公司.
<120>EphA2激動性單克隆抗體及其使用方法<130>10271-119-228<140>
<141>
<150>60/524,177<151>2003-11-20<160>32<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>107<212>PRT<213>智人(Homo Sapiens)<400>1Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr20 25 30Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile35 40 45Tyr Arg Ala Asn Arg Lau Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr65 70 75 80Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Lys Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105<210>2<211>11<212>PRT<213>智人(Homo Sapiens)<400>2Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Ser1 5 10
<210>3<211>7<212>PRT<213>智人(Homo Sapiens)<400>3Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp1 5<210>4<211>9<212>PRT<213>智人(Homo Sapiens)<400>4Leu Lys Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr1 5<210>5<211>115<212>PRT<213>智人(Homo Sapiens)<400>5Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85 90 95Thr Arg Glu Ala Ile Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr100 105 110Val Ser Ala115<210>6<211>10<212>PRT<213>智人(Homo Sapiens)
<400>6Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ser1 5 10<210>7<211>17<212>PRT<213>智人(Homo Sapiens)<400>7Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys1 5 10 15Gly<210>8<211>6<212>PRT<213>智人(Homo Sapiens)<400>8Glu Ala Ile Phe Thr Tyr1 5<210>9<211>321<212>DNA<213>智人(Homo Sapiens)<400>9gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact60atcacttgca aggcgagtca ggacattaat aactatttaa gctggttcca gcagaaacca120gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca180aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat240gaagatatgg gaatttatta ttgtctgaaa tatgatgagt ttccgtacac gttcggaggg300gggaccaagc tggaaataaa a 321<210>10<211>30<212>DNA<213>智人(Homo Sapiens)<400>10gcgagtcagg acattaataa ctatttaagc 30
<210>11<211>21<212>DNA<213>智人(Homo Sapiens)<400>11cgtgcaaaca gattggtaga t 21<210>12<211>21<212>DNA<213>智人(Homo Sapiens)<400>12aaatatgatg agtttccgta c 21<210>13<211>345<212>DNA<213>智人(Homo Sapiens)<400>13gacgtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc60tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatacca tgtcttgggt tcgccagact120ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtactta cacctactat180ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac240ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtac aagagaagct300atctttactt actggggcca agggactctg gtcactgtct ctgca345<210>14<211>30<212>DNA<213>智人(Homo Sapiens)<400>14ggattcactt tcagtagcta taccatgtct 30<210>15<211>51<212>DNA<213>智人(Homo Sapiens)<400>15
accattagta gtggtggtac ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg c 51<210>16<211>21<212>DNA<213>智人(Homo Sapiens)<400>16agagaagcta tctttactta c 21<210>17<211>112<212>PRT<213>智人(Homo Sapiens)<220>
<223>EA5.12輕鏈可變區(qū)<400>17Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly1 5 10 15Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser20 25 30Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly85 90 95Ser His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110<210>18<211>16<212>PRT<213>智人(Homo Sapiens)<220>
<223>EA5.12的VL CDR1<400>18Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn1 5 10 15
<210>19<211>7<212>PRT<213>智人(Homo Sapiens)<220>
<223>EA5.12的VL CDR2<400>19Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser1 5<210>20<211>9<212>PRT<213>智人(Homo Sapiens)<220>
<223>EA5.12的VL CDR3<400>20Val Gln Gly Ser His Phe Pro Trp Thr1 5<210>21<211>115<212>PRT<213>智人(Homo Sapiens)<220>
<223>EA5.12重鏈可變區(qū)<400>21Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Thr Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr20 25 30Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Tyr Ile Ser Cys Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Phe Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Ser His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr100 105 110
Val Ser Ser115<210>22<211>5<212>PRT<213>智人(Homo Sapiens)<220>
<223>EA5.12的VH CDR1<400>22Gly Tyr Tyr Met His1 5<210>23<211>17<212>PRT<213>智人(Homo Sapiens)<220>
<223>EA5.12的VH CDR2<400>23Tyr Ile Ser Cys Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys1 5 10 15Gly<210>24<211>6<212>PRT<213>智人(Homo Sapiens)<220>
<223>EA5.12的VH CDR3<400>24Ser His Ala Met Asp Tyr1 5<210>25<211>336<212>DNA
<213>智人(Homo Sapiens)<220>
<223>EA5.12輕鏈可變區(qū)<400>25gatgtkgtka tgacbcagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctct 60atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatagtaatg gaaaaaccta tttgaattgg 120ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggaa cagattttac actgaaaatc 240agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattactgcg tgcaaggttc acattttccg 300tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa336<210>26<211>43<212>DNA<213>智人(Homo Sapiens)<220>
<223>EA5.12的VL CDR1<400>26aagtcagagc ctcttatata gtaatggaaa aacct atttg aat 43<210>27<211>21<212>DNA<213>智人(Homo Sapiens)<220>
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<212>DNA<213>智人(Homo Sapiens)<220>
<223>EA5.12重鏈可變區(qū)<400>29gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctagtgaaga ctggggcttc agtgaagata60tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggttactaca tgcactgggt caagcagagc120catggaaaga gccttgagtg gattggatat attagttgtt acaatggtgt tactagctac180aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattt actgtagaca catcctccag cacagcctac240atgcagttca acagcctgac atctgaagac tctgcggtct attactgtgc aagatctcat300gctatggact actggggtca aggaacctca gtcaccgtct cctca345<210>30<211>16<212>DNA<213>智人(Homo Sapiens)<220>
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<223>EA5.12的VH CDR3<400>32tctcatgcta tggactac 18
權(quán)利要求
1.治療有此需要的患者中的癌癥的方法，所述方法包括向所述患者用治療有效量的EphA2抗體給藥，該抗體是EphA2激動性抗體或暴露的EphA2表位抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的給藥相對于未治療的癌細(xì)胞中的EphA2磷酸化水平提高了癌細(xì)胞中的EphA2磷酸化。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的給藥相對于未治療的癌細(xì)胞中的EphA2表達(dá)水平降低了癌細(xì)胞中的EphA2表達(dá)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的EphA2抗體結(jié)合在細(xì)胞上而不是細(xì)胞-細(xì)胞接觸處表達(dá)的EphA2。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的暴露的EphA2表位抗體是EA5的人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的EphA2抗體結(jié)合不能與其配體穩(wěn)定地相互作用的EphA2。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的EphA2抗體結(jié)合不與其配體結(jié)合的EphA2。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的癌癥是上皮細(xì)胞源的。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的癌癥包括相對于非癌細(xì)胞過度表達(dá)EphA2的細(xì)胞，該非癌細(xì)胞具有所述癌細(xì)胞的組織類型。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的癌癥是皮膚癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌或胰腺癌，或是腎細(xì)胞癌或黑色素瘤。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的癌癥是轉(zhuǎn)移性癌。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的EphA2抗體是單克隆抗體。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的EphA2抗體是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體并與EA5競爭結(jié)合EphA2。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的EphA2抗體是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的EphA2抗體是EA5的人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，該方法包括給予不是EphA2抗體的其它抗癌治療。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的其它癌癥治療選自化療、生物學(xué)治療、免疫治療、放療、激素治療和手術(shù)治療。
18.治療有此需要的患者中的用第一種治療方法完全或部分地難于治療的癌癥的方法，所述方法包括給予所述患者第二種治療，該第二種治療包括用治療有效量的EphA2抗體給藥，該抗體是EphA2激動性抗體或暴露的EphA2表位抗體。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的第一種治療方法是化療、激素治療、生物學(xué)治療或放療。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的第二種治療還包括給予化療、激素治療、生物學(xué)治療或放療。
21.如權(quán)利要求18所述的方法，該方法包括給予所述第一種治療的同時給予所述的第二種治療。
22.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的暴露的EphA2表位抗體結(jié)合不是位于細(xì)胞-細(xì)胞接觸處的EphA2。
23.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的暴露的EphA2表位抗體結(jié)合不能與其配體穩(wěn)定地相互作用的EphA2。
24.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的暴露的EphA2表位抗體結(jié)合相對于其配體過量的EphA2。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述的EphA2抗體是EA5的人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
26.含有治療有效量EphA2抗體和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，該EphA2抗體是激動性抗體或暴露的EphA2表位抗體。
27.如權(quán)利要求26所述的藥物組合物，其中所述的EphA2抗體是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體并與EA5競爭結(jié)合EphA2。
28.如權(quán)利要求26所述的藥物組合物，其中所述的EphA2抗體是單克隆抗體。
29.如權(quán)利要求26所述的藥物組合物，其中所述的EphA2抗體是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
30.如權(quán)利要求26所述的藥物組合物，其中所述的EphA2抗體是EA5的人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
31.如權(quán)利要求26所述的藥物組合物，該組合物包含不是EphA2抗體的抗癌試劑。
32.如權(quán)利要求31所述的藥物組合物，其中所述的抗癌試劑是化療試劑、放療試劑、激素治療試劑、生物學(xué)治療或免疫學(xué)治療試劑。
33.免疫特異性結(jié)合EphA2的分離抗體，其結(jié)合激發(fā)EphA2的至少一種活性。
34.如權(quán)利要求33所述的分離抗體，其中所述的EphA2的活性是EphA2磷酸化或EphA2降解。
35.分離抗體，該抗體是暴露的EphA2表位抗體。
36.如權(quán)利要求35所述的分離抗體，其中所述的暴露的EphA2表位抗體是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體并與EA5競爭結(jié)合EphA2。
37.如權(quán)利要求33或35所述的分離抗體，該抗體是單克隆抗體。
38.如權(quán)利要求33或35所述的分離抗體，其中所述的抗體是人抗體。
39.如權(quán)利要求33或35所述的分離抗體，其中所述的抗體是人源化抗體。
40.如權(quán)利要求33或35所述的分離抗體，其中所述的抗體是嵌合抗體。
41.如權(quán)利要求33或35所述的分離抗體，其中所述的抗體是衍生物。
42.如權(quán)利要求41所述的分離抗體，該抗體相對于不是衍生物抗體的抗體，體內(nèi)的半衰期延長。
43.如權(quán)利要求33或35所述的抗體，該抗體是EA5的人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
44.產(chǎn)生權(quán)利要求43所述的抗體的細(xì)胞系。
45.免疫特異性結(jié)合EphA2并具有至少一種以下CDR的抗體包含氨基酸序列SEQ ID NO18的VL CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO19的VL CDR2；包含氨基酸序列SEQ ID NO20的VL CDR3；包含氨基酸序列SEQ ID NO22的VH CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO23的VH CDR2；或包含氨基酸序列SEQ ID NO24的VH CDR3，其中所述抗體與EphA2的結(jié)合激發(fā)EphA2的至少一種活性。
46.如權(quán)利要求45所述的抗體，其中所述的EphA2活性是EphA2磷酸化或EphA2降解。
47.如權(quán)利要求45所述的抗體，該抗體含有VL和VH CDR的至少二個、至少三個、至少四個、至少五個或所有六個CDR。
48.包含具有氨基酸序列SEQ ID NO17的VL區(qū)的抗體，其中所述的抗體免疫特異性結(jié)合EphA2。
49.如權(quán)利要求48所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO21的VH區(qū)。
50.包含具有氨基酸序列SEQ ID NO18的VL CDR1的抗體，其中該抗體能免疫特異性結(jié)合EphA2。
51.如權(quán)利要求50所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO19的VL CDR2。
52.如權(quán)利要求50所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO20的VL CDR3。
53.如權(quán)利要求50所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO19的VL CDR2和具有氨基酸序列SEQ ID NO20的VL CDR3。
54.如權(quán)利要求50所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO22的VH CDR1。
55.如權(quán)利要求50所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO23的VH CDR2。
56.如權(quán)利要求50所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO24VH CDR3。
57.如權(quán)利要求50所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO22的VH CDR1和具有氨基酸序列SEQ ID NO23的VH CDR2。
58.如權(quán)利要求50所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO22的VH CDR1和具有氨基酸序列SEQ ID NO24的VH CDR3。
59.如權(quán)利要求50所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO23的VH CDR2和具有氨基酸序列SEQ ID NO24的VH CDR3。
60.如權(quán)利要求57所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO24的VH CDR3。
61.包含具有氨基酸序列SEQ ID NO19的VL CDR2和具有氨基酸序列SEQ ID NO22的VH CDR1的分離抗體。
62.包含具有氨基酸序列SEQ ID NO19的VL CDR2和具有氨基酸序列SEQ ID NO23的VH CDR2的抗體。
63.包含具有氨基酸序列SEQ ID NO19的VL CDR2和具有氨基酸序列SEQ ID NO24的VH CDR3的抗體。
64.如權(quán)利要求61所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO23的VH CDR2。
65.如權(quán)利要求61所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO24的VH CDR3。
66.如權(quán)利要求62所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO24的VH CDR3。
67.如權(quán)利要求64所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO24的VH CDR3。
68.如權(quán)利要求51所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO22的VH CDR1。
69.如權(quán)利要求51所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO23的VH CDR2。
70.如權(quán)利要求51所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO24的VH CDR3。
71.如權(quán)利要求51所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO22的VHCDR1和具有氨基酸序列SEQ IDNO23的VH CDR2。
72.如權(quán)利要求51所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO22的VH CDR1和具有氨基酸序列SEQ ID NO24的VH CDR3。
73.如權(quán)利要求51所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO23的VHCDR2和具有氨基酸序列SEQ IDNO24的VH CDR3。
74.如權(quán)利要求71所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO24的VH CDR3。
75.如權(quán)利要求52所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO22的VH CDR1。
76.如權(quán)利要求52所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO23的VH CDR2。
77.如權(quán)利要求52所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO24的VH CDR3。
78.如權(quán)利要求52所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO22的VH CDR1和具有氨基酸序列SEQ ID NO23的VH CDR2。
79.如權(quán)利要求52所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO22的VH CDR1和具有氨基酸序列SEQ ID NO24的VH CDR3。
80.如權(quán)利要求52所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO23的VH CDR2和具有氨基酸序列SEQ ID NO24的VH CDR3。
81.如權(quán)利要求78所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO24的VH CDR3。
82.如權(quán)利要求61所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO20的VL CDR3。
83.如權(quán)利要求62所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO20的VL CDR3。
84.如權(quán)利要求63所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO20的VL CDR3。
85.如權(quán)利要求64所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO20的VL CDR3。
86.如權(quán)利要求65所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO20的VL CDR3。
87.如權(quán)利要求66所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO20的VL CDR3。
88.如權(quán)利要求85所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO24的VH CDR3。
89.如權(quán)利要求53所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO22的VH CDR1。
90.如權(quán)利要求53所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO23的VH CDR2。
91.如權(quán)利要求53所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO24的VH CDR3。
92.如權(quán)利要求53所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO22的VH CDR1和具有氨基酸序列SEQ ID NO23的VH CDR2。
93.如權(quán)利要求53所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO22的VH CDR1和具有氨基酸序列SEQ ID NO24的VH CDR3。
94.如權(quán)利要求53所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO23的VH CDR2和具有氨基酸序列SEQ ID NO24的VH CDR3。
95.如權(quán)利要求92所述的抗體，該抗體還包含具有氨基酸序列SEQID NO24的VH CDR3。
96.如權(quán)利要求45所述的抗體，該抗體含有人的框架區(qū)。
97.如權(quán)利要求96所述的抗體，該抗體含有一、二、三、四或五個突變，所述的突變位于框架區(qū)中。
98.如權(quán)利要求45所述的抗體，該抗體含有恒定區(qū)。
99.如權(quán)利要求96或98所述的抗體，該抗體含有恒定區(qū)，該恒定區(qū)是人的恒定區(qū)。
100.包含編碼人的、人源化的或嵌合的如權(quán)利要求45所述的抗體的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列的分離的核酸。
101.含有如權(quán)利要求100所述的核酸的載體。
102.含有如權(quán)利要求101所述的載體的宿主細(xì)胞。
103.治療有此需要的患者中的癌癥的方法，所述方法包括向所述患者用治療有效量的如權(quán)利要求45所述的抗體給藥。
104.如權(quán)利要求103所述的方法，其中所述的給藥相對于未治療的癌細(xì)胞中的EphA2磷酸化水平提高了癌細(xì)胞中的EphA2磷酸化。
105.如權(quán)利要求103所述的方法，其中所述的癌癥是上皮細(xì)胞源的。
106.如權(quán)利要求105所述的方法，其中所述的癌癥包括相對于非癌細(xì)胞過度表達(dá)EphA2的細(xì)胞，該非癌細(xì)胞具有所述癌細(xì)胞的組織類型。
107.如權(quán)利要求105所述的方法，其中所述癌癥是皮膚癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌或胰腺癌，或是腎細(xì)胞癌或黑色素瘤。
108.如權(quán)利要求103所述的方法，其中所述的癌癥是轉(zhuǎn)移性癌。
109.如權(quán)利要求103所述的方法，其中所述的抗體是如權(quán)利要求115或118所述的抗體。
110.如權(quán)利要求103所述的方法，該方法包括給予不是EphA2抗體的其它抗癌治療。
111.如權(quán)利要求110所述的方法，其中所述的其它癌癥治療選自化療、生物學(xué)治療、免疫治療、放療、激素治療和手術(shù)治療。
112.治療有此需要的患者中的用第一種治療方法完全或部分地難于治療的癌癥的方法，所述方法包括給予所述患者第二種治療，該第二種治療包括用治療有效量的如權(quán)利要求45所述的抗體給藥。
113.如權(quán)利要求112所述的方法，其中所述的第一種治療方法是化療、激素治療、生物學(xué)治療或放療。
114.如權(quán)利要求112所述的方法，其中所述的第二種治療還包括給予化療、激素治療、生物學(xué)治療或放療。
115.如權(quán)利要求112所述的方法，該方法包括給予所述的第一種治療的同時給予所述的第二種治療。
116.含有治療有效量的如權(quán)利要求45所述的抗體和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
117.含有治療有效量的如權(quán)利要求96或98所述的抗體和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
118.如權(quán)利要求116所述的藥物組合物，該組合物含有不是EphA2抗體的抗癌試劑。
119.如權(quán)利要求118所述的藥物組合物，其中所述的抗癌試劑是化療試劑、放療試劑、激素治療試劑、生物學(xué)治療或免疫學(xué)治療試劑。
120.如權(quán)利要求33、35或45所述的抗體，該抗體不是EA2或EA5。
121.如權(quán)利要求33、35、45、47、96、97或98所述的抗體，其中所述的抗體與異源多肽偶聯(lián)。
122.如權(quán)利要求33、35、45、47、96、97或98所述的抗體，其中所述的抗體與治療性試劑或藥物部分偶聯(lián)。
123.如權(quán)利要求33、35、45、47、96、97或98所述的抗體，其中所述的抗體與診斷性或檢測性試劑偶聯(lián)。
全文摘要
本發(fā)明涉及設(shè)計來治療、控制或預(yù)防癌癥，特別是轉(zhuǎn)移性癌的方法和組合物。本發(fā)明的方法包括給予有效量的一種或多種結(jié)合并激發(fā)EphA2的抗體，從而提高細(xì)胞中EphA2的磷酸化和降低已激發(fā)的EphA2的水平。本發(fā)明也包括能優(yōu)先結(jié)合在癌細(xì)胞而不是非癌細(xì)胞上暴露的EphA2表位的抗體。本發(fā)明還提供了只含有本發(fā)明的一種或多種EphA2抗體，或該抗體與一種或多種用于治療癌癥的其它藥物組合的藥物組合物。
文檔編號C07H21/04GK1905899SQ200480040720
公開日2007年1月31日 申請日期2004年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月20日
發(fā)明者邁克爾·S·金奇, 凱利·卡爾斯-金奇, 簡·C·斯圖爾特 申請人:醫(yī)學(xué)免疫公司, 普渡研究基金會