專利名稱：含l－谷氨酰胺二肽的合成方法
技術領域：
本發(fā)明涉及L-谷氨酰胺二肽的合成方法，屬于化學合成領域。
二、技術背景L-谷氨酰胺為一種條件必需氨基酸，對機體免疫功能和創(chuàng)傷修復等具有重要作用。最近研究表明L-谷氨酰胺在機體代謝中起重要作用[Abumrad，N.N.et al，Am.J.Physiol.1989，257，E228]。由于L-谷氨酰胺的低熱穩(wěn)定性和低水溶性限制了它的使用，此外，L-谷氨酰胺在水溶液中易分解為吡咯烷酮酸和氨對機體有害。而含L-谷氨酰胺的小肽彌補了L-谷氨酰胺的不足，它具有高熱穩(wěn)定性和水溶性。
現(xiàn)在已知的制備丙氨酰-谷氨酰胺(力肽)的方法有如下三種(1)用D-2-鹵-丙酰氯與L-谷氨酰胺反應生成中間產(chǎn)物D-2-鹵-丙酰-L-谷氨酰胺，該中間產(chǎn)物氨解產(chǎn)生丙氨酰谷氨酰胺[Thierfelder et al，Phys.Chem.1919，105，58；Shinmura，CA2109482，1994；Mizutakki，JP6234715，1994，Takahiro et al.Organic Process Research & Development 2000，4，147，1522]。該法的缺陷是所合成的丙氨酰谷氨酰胺旋光低。
(2)N-羰基-L-丙氨酸酐法[Moeller et al German pat.3201511，1983]。該法雖不需要保護基，但易產(chǎn)生三肽等副產(chǎn)物，導致目的產(chǎn)物收率低。
(3)使用保護基法。這種方法包括(a)用Cbz(芐氧甲?；?保護的L-丙氨酸與γ位N被保護的L-谷氨酰胺在縮合劑DCC(二環(huán)己基碳二亞胺)作用下生成被保護的丙氨酰-谷氨酰胺中間產(chǎn)物，隨后脫除保護基生成產(chǎn)物力肽[Akabori et al，Bull.Chem.Soc.Jpn，1961，34，739.，Akabori et al，Bull.Chem.Soc.Jpn，1962，35，1966]；(b)用N-Cbz-L-丙氨酸與L-谷氨酰胺-γ-甲酯在DCC作用下縮合成一中間產(chǎn)物，該中間產(chǎn)物脫除保護基后進行氨解得到目的產(chǎn)物力肽[Shimonishi.Bull.Chem.Soc.Jpn.1964，37，200.]；(c)N-Cbz-L-丙氨酸的活化酯與L-谷氨酰胺直接作用生成Cbz基保護的力肽，該化合物脫除保護基生成力肽[Katoh et al Eur.Pat.311057，1989；趙玉芬等，CN 1164611C，2004]。

發(fā)明內(nèi)容
1.發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種合成含L-谷氨酰胺二肽的方法，該方法具有原料價格低廉、生產(chǎn)成本低、選擇性好、收率高等優(yōu)點。
2.技術方案本發(fā)明屬于上述方法(3)的范疇，但本發(fā)明采用廉價的鄰苯二甲?；鳛榘被岬谋Ｗo基制備鄰苯二甲酰氨基酸；采用混合酸酐法或活化酯法將保護的氨基酸與L-谷氨酰胺縮合成含L-谷氨酰胺的鄰苯二甲酰二肽；所用L-谷氨酰胺無需保護，只需將其溶于弱堿溶液中制成相應的鹽即可直接用于縮合反應；此外，鄰苯二甲酰基很容易用水合肼脫除。
一種含L-谷氨酰胺二肽的合成方法，其具體步驟如下(1)鄰苯二甲酰氨基酸的制備；采用熔融法制備[Billman and Harting，J.Amer.Chem.Soc.，1948，70，1473.]，將氨基酸與鄰苯二甲酸酐在熔融條件下生成鄰苯二甲酰氨基酸，反應溫度在120～180℃，氨基酸與鄰苯二甲酸酐的摩爾比為1∶1～1∶4，反應時間為20～180分鐘；或采用Nefkens法制備[G.H.L.Nefkens et al.Rec.Trav.Chim.，1960，79，688-698]，把等摩爾的鄰苯二甲酰亞胺和三乙胺溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，將這種混合溶液冷卻，在劇烈攪拌的條件下加入等摩爾氯甲酸乙酯進行反應生成N-甲酸乙酯鄰苯二甲酰亞胺，此反應溫度為0～20℃，反應時間為10～300分鐘；將要反應的氨基酸與等摩爾碳酸鈉溶于水中制成氨基酸鈉的水溶液，等摩爾地加入上述制備的N-甲酸乙酯鄰苯二甲酰亞胺，反應生成鄰苯二甲酰氨基酸；此步反應的溫度為0～20℃，反應時間為10～300分鐘；(2)鄰苯二甲酰-L-谷氨酰胺二肽的制備；將步驟(1)產(chǎn)生的鄰苯二甲酰氨基酸溶于有機溶劑中，加入等摩爾三級胺，溶液冷卻，加入等摩爾氯甲酸烷基酯，隨后滴加L-谷氨酰胺的弱堿溶液并攪拌，反應生成鄰苯二甲酰-L-谷氨酰胺二肽；或者將步驟(1)產(chǎn)生的鄰苯二甲酰氨基酸溶于有機溶劑中，與活化劑作用，形成相應的活化酯，再加入L-谷氨酰胺的鹽溶液反應生成鄰苯二甲酰-L-谷氨酰胺二肽；
(3)L-谷氨酰胺二肽的制備；將步驟(2)生成的鄰苯二甲酰-L-谷氨酰胺二肽溶于含等摩爾的弱堿水溶液中，再加入等摩爾的水合肼室溫放置48小時即可脫除保護基；或者將步驟(2)生成的鄰苯二甲酰-L-谷氨酰胺二肽溶于低級醇溶液中或低級醇-水的混合溶液中，加入等摩爾水合肼反應即可脫除鄰苯二甲?；苽銵-谷氨酰胺二肽。上述步驟(1)中所述的氨基酸是天然氨基酸，如L-亮氨酸、L-丙氨酸、L-蛋氨酸、甘氨酸等。
上述步驟(2)的反應溫度為-15～10℃，所述的有機溶劑包括乙酸乙酯、四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、1，4-二氧六環(huán)、苯、甲苯、二甲亞砜；所述的活化劑包括三苯基磷、對硝基芐醇、N-羥基琥珀酸亞胺等；所述的三級胺包括三乙胺、三甲胺、一甲基二乙基胺、二甲基一乙基胺、N-甲基嗎啡啉、N-乙基嗎啡啉；所述的氯甲酸烷基酯包括氯甲酸乙酯、氯甲酸丙酯、氯甲酸異丙酯、氯甲酸異丁酯、氯甲酸丁酯和氯甲酸芐酯；所述的L-谷氨酰胺弱堿溶液指的是可溶性碳酸鹽或碳酸氫鹽或硼酸鹽。
3.有益效果(1)本發(fā)明采用價格低廉的鄰苯二甲?；鳛榘被岬谋Ｗo基，而且，每步反應產(chǎn)物均易結(jié)晶分離，具有生產(chǎn)成本低的優(yōu)點；(2)所用谷氨酰胺無需保護，只需將其溶于弱堿溶液中制成相應的鹽即可直接用于縮合反應，避免了使用保護基，提高了收率，降低了成本；(3)本法合成的L-谷氨酰胺二肽收率高，一般達到50％。
具體實施例方式
實施例1 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺制備，其具體步驟為(1)鄰苯二甲酰-L-丙氨酸制備44.5克L-丙氨酸與74克鄰苯二甲酸酐混合放入圓底燒瓶中，油浴加熱至135～140℃，在此溫度下反應30分鐘趁熱傾入熱水中，冷卻結(jié)晶，所得晶體用30％乙醇重結(jié)晶，得到鄰苯二甲酰-L-丙氨酸102克，收率93％。
(2)鄰苯二甲酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺制備43.8克鄰苯二甲酰-L-丙氨酸與20.4克三乙胺溶于350毫升乙酸乙酯中，溶液冷卻至-5℃，然后加入21.6克氯甲酸乙酯，25分鐘后加入預冷的250毫升含有29.2克L-谷氨酰胺的碳酸氫鈉溶液，攪拌反應2小時后撤走冰鹽浴，室溫放置12小時。水相用6N鹽酸酸化，析出鄰苯二甲酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，用水—乙醇重結(jié)晶得產(chǎn)物42.3克，收率61.4％。
(3)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺制備將34.7克鄰苯二甲酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、6.25克80％水合肼和10.6克碳酸鈉溶于350毫升水中，室溫放置48小時。用6N鹽酸酸化，過濾除去鄰苯二甲酰肼，濾液減壓濃縮，加入乙醇析出L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，用水—乙醇重結(jié)晶得L-丙氨酰-L-谷氨酰胺20.0克，收率92％，熔點204～205℃，[α]D20＝+10.5°(C＝4，水)，以L-丙氨酸計總摩爾收率為51.6％。
實施例2 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺制備，其具體步驟為(1)鄰苯二甲酰-L-丙氨酸制備用72.5克鄰苯二甲酰亞胺和70毫升二甲基乙基胺溶于350毫升N，N-二甲基甲酰胺中，溶液冷卻至5～10℃，滴加50毫升氯甲酸乙酯，加樣完成后攪拌反應2小時，反應液傾入2升水中析出N-甲酸乙酯鄰苯二甲酰亞胺97克，收率88％。將17.8克L-丙氨酸和21.2克碳酸鈉溶于200毫升水中，加入45克N-甲酸乙酯鄰苯二甲酰亞胺，室溫攪拌2小時，反應液過濾，濾液用6N鹽酸酸化得鄰苯二甲酰-L-丙氨酸，用30％乙醇重結(jié)晶得產(chǎn)物42克，收率96％。
(2)鄰苯二甲酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺制備具體操作步驟同實施例1。
(3)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺制備34.7克鄰苯二甲酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶于含有5克水合肼的50毫升水—乙醇(水與乙醇體積比為1∶1)混合溶液中，室溫放置48小時。用6N鹽酸酸化，過濾除去鄰苯二甲酰肼，濾液減壓濃縮，加入乙醇析出L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，用水—乙醇重結(jié)晶得L-丙氨酰-L-谷氨酰胺20.2克，收率93％，以L-丙氨酸計總摩爾收率為49％。
實施例3 甘氨酰-L-谷氨酰胺制備，其具體步驟為
(1)鄰苯二甲酰甘氨酸制備具體操作步驟同實施例1，收率為96％。
(2)鄰苯二甲酰甘氨酰-L-谷氨酰胺制備41克鄰苯二甲酰甘氨酸與20.4克三乙胺溶于350毫升N，N-二甲基甲酰胺中，溶液冷卻至-5℃，然后加入24.6克氯甲酸異丙酯，25分鐘后加入預冷的含有29.2克L-谷氨酰胺的碳酸氫鈉溶液250毫升，攪拌反應2小時后撤走冰鹽浴，室溫放置12小時。減壓蒸出溶劑，固體物溶于水，不溶物過濾除去，濾液用6N鹽酸酸化，析出鄰苯二甲酰甘氨酰-L-谷氨酰胺，用30％乙醇重結(jié)晶得產(chǎn)物38.6克，收率58％。
(3)甘氨酰-L-谷氨酰胺制備33.3克鄰苯二甲酰-甘氨酰-L-谷氨酰胺、6.25克80％水合肼和10.6克碳酸鈉溶于350毫升水中，室溫放置48小時，用6N鹽酸酸化，過濾除去鄰苯二甲酰肼，濾液減壓濃縮，加入乙醇析出甘氨酰-L-谷氨酰胺，用80％乙醇重結(jié)晶得產(chǎn)物18.3克，收率90％，熔點198～199℃，[α]D20＝-1.6°(C＝4，水)，以甘氨酸計總摩爾收率為50％。
實施例4 L-亮氨酰-L-谷氨酰胺制備，其具體步驟為(1)鄰苯二甲酰-L-亮氨酸制備26.2克L-亮氨酸和21.2克碳酸鈉溶于200毫升水中，加入45克N-甲酸乙酯鄰苯二甲酰亞胺，室溫攪拌2小時，反應液過濾，濾液用6N鹽酸酸化得鄰苯二甲酰-L-亮氨酸，用苯-石油醚重結(jié)晶得產(chǎn)物51.2克，收率98％。
(2)鄰苯二甲酰-L-亮氨酰-L-谷氨酰胺制備52.2克鄰苯二甲酰-L-亮氨酸與20.4克三乙胺溶于350毫升四氫呋喃中。以下操作同實施例3。得產(chǎn)物46.7克，收率60％。
(3)L-亮氨酰-L-谷氨酰胺制備38.9克鄰苯二甲酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶于含有5克水合肼的350毫升無水乙醇溶液中，室溫放置48小時。過濾收集固體物，將其溶于100毫升水中，用6N鹽酸酸化至pH為4.0，過濾除去鄰苯二甲酰肼，濾液減壓濃縮，加入乙醇析出L-亮氨酰-L-谷氨酰胺，用水—乙醇重結(jié)晶得L-亮氨酰-L-谷氨酰胺23.2克，收率90％，熔點236～237℃，[α]D20＝+14.3°(C＝4，1N鹽酸，以L-亮氨酸計總摩爾收率為53％。
實施例5 甘氨酰-L-谷氨酰胺的制備，其具體步驟為(1)鄰苯二甲酰甘氨酸制備具體操作同實施例3。
(2)鄰苯二甲酰甘氨酰-L-谷氨酰胺制備21克鄰苯二甲酰甘氨酸與11.4克N-羥基琥珀酰亞胺溶于250毫升1，4-二氧六環(huán)中，加入21克二環(huán)己基碳二亞胺，溫度維持在20～25℃，反應5小時后滴加150毫升預冷至10℃的含有14.6克L-谷氨酰胺的碳酸氫鈉溶液，攪拌反應5小時后，用1N鹽酸調(diào)pH至6.5，減壓蒸出1，4-二氧六環(huán)，再用1N鹽酸調(diào)pH至3.0，析出鄰苯二甲酰甘氨酰-L-谷氨酰胺，用水—乙醇重結(jié)晶得產(chǎn)物19.8克，收率59％。
(3)甘氨酰-L-谷氨酰胺的制備具體操作同實施例1。收率90％，熔點198～199℃，[α]D20＝-1.6°(C＝4，水)，以甘氨酸計總摩爾收率為51％。
實施例6甘氨酰-L-谷氨酰胺的制備，其具體步驟為(1)鄰苯二甲酰甘氨酸的制備具體操作同實施例3。
(2)鄰苯二甲酰甘氨酰-L-谷氨酰胺的制備26.2克三苯基磷溶于100毫升苯中，該溶液滴加到250毫升含有20.3克鄰苯二甲酰甘氨酸的1，4-二氧六環(huán)中，于5℃反應4小時，滴加到含有14.6克L-谷氨酰胺的100毫升水和300毫升石油醚的混合溶液中，反應液用5N氫氧化鈉維持pH為12.0，反應溫度為10℃，反應時間為2小時。用6N鹽酸酸化至pH2.0，水相濃縮后加入500毫升乙醚，析出固體，將固體用甲醇—水重結(jié)晶得產(chǎn)物18.7克，收率56％。
(3)甘氨酰-L-谷氨酰胺的制備具體操作同實施例1。收率90％，熔點198～199℃，[α]D20＝-1.6°(C＝4，水)，以甘氨酸計總摩爾收率為48％。
實施例7 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的制備，其具體步驟為(1)鄰苯二甲酰-L-丙氨酸制備具體操作同實施例1。
(2)鄰苯二甲酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺制備具體操作步驟同實施例6。收率60％。
(3)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺制備具體操作步驟同實施例2。收率90％，熔點204～205℃，[α]D20＝+10.5°(C＝4，水)，以L-丙氨酸計總摩爾收率為50.2％。
實施例8 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的制備，其具體步驟為(1)鄰苯二甲酰-L-丙氨酸制備具體操作步驟同實施例1。
(2)鄰苯二甲酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺制備具體操作步驟同實施例5，收率62％。
(3)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺制備具體操作步驟同實施例1。收率90％，熔點204～205℃，[α]D20＝+10.5°(C＝4，水)，以L-丙氨酸計總摩爾收率為51.9％。
實施例9 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的制備，其具體步驟為(1)鄰苯二甲酰-L-丙氨酸制備具體操作步驟同實施例1。
(2)鄰苯二甲酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺制備43.8克鄰苯二甲酰-L-丙氨酸與20.4克的N-甲基嗎啡啉溶于350毫升的乙酸乙酯中，溶液冷卻至-5℃，然后加入27.3克的氯甲酸異丁酯，以下操作步驟同實施例1，得產(chǎn)物45.8克，收率66.4％。
(3)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺制備具體操作步驟同實施例1。以L-丙氨酸計總摩爾收率為56.8％。
實施例10 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的制備，其具體步驟為(1)鄰苯二甲酰-L-丙氨酸制備具體操作步驟同實施例1。
(2)鄰苯二甲酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺制備21.9克鄰苯二甲酰-L-丙氨酸與15.3克對硝基芐醇溶于250毫升1，4-二氧六環(huán)中，以下操作步驟同實施例5，產(chǎn)物收率58％。
(3)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺制備具體操作步驟同實施例2。以L-丙氨酸計總摩爾收率為50％。
權(quán)利要求
1.一種含L-谷氨酰胺二肽的合成方法，其具體步驟如下(1)鄰苯二甲酰氨基酸的制備；將氨基酸與鄰苯二甲酸酐在熔融的條件下生成鄰苯二甲酰氨基酸，或者把等摩爾的鄰苯二甲酰亞胺和三乙胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，將溶液冷卻，在劇烈攪拌的條件下加入等摩爾氯甲酸乙酯進行反應生成N-甲酸乙酯-鄰苯二甲酰亞胺，將氨基酸與等摩爾的碳酸鈉溶于水中制成氨基酸鈉水溶液，等摩爾地加入上述制備的N-甲酸乙酯-鄰苯二甲酰亞胺，反應生成鄰苯二甲酰氨基酸；(2)鄰苯二甲酰-L-谷氨酰胺二肽的制備；將步驟(1)產(chǎn)生的鄰苯二甲酰氨基酸溶于有機溶劑中，加入等摩爾的三級胺，溶液冷卻，加入等摩爾的氯甲酸烷基酯，隨后滴加L-谷氨酰胺的弱堿溶液并攪拌，反應生成鄰苯二甲酰-L-谷氨酰胺二肽；或者將步驟(1)產(chǎn)生的鄰苯二甲酰氨基酸溶于有機溶劑中，與活化劑作用生成相應的活化酯，再加入L-谷氨酰胺的鹽溶液反應生成鄰苯二甲酰-L-谷氨酰胺二肽；(3)L-谷氨酰胺二肽的制備；將步驟(2)生成的鄰苯二甲酰-L-谷氨酰胺二肽溶于含等摩爾的弱堿水溶液中，再加入等摩爾的水合肼室溫放置48小時即可脫除保護基；或者將步驟(2)生成的鄰苯二甲酰-L-谷氨酰胺二肽溶于低級醇溶液中或低級醇-水混合溶液中，加入等摩爾的水合肼進行反應，即可脫除鄰苯二甲?；苽銵-谷氨酰胺二肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含L-谷氨酰胺二肽的合成方法，其特征在于上述步驟(1)中所述的氨基酸是天然氨基酸，如L-亮氨酸、L-丙氨酸、L-蛋氨酸、甘氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含L-谷氨酰胺二肽的合成方法，其特征在于上述步驟(1)中氨基酸與鄰苯二甲酸酐的摩爾比為1∶1～1∶4，反應溫度在120～180℃，反應時間為20～180分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含L-谷氨酰胺二肽的合成方法，其特征在于上述步驟(1)中生成N-甲酸乙酯鄰苯二甲酰亞胺和生成鄰苯二甲酰氨基酸的反應溫度均為0～20℃，反應時間均為10～300分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含L-谷氨酰胺二肽的合成方法，其特征在于上述步驟(2)的反應溫度為-15～10℃。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含L-谷氨酰胺二肽的合成方法，其特征在于上述步驟(2)中所述的有機溶劑包括乙酸乙酯、四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、1，4-二氧六環(huán)、苯、甲苯、二甲亞砜。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含L-谷氨酰胺二肽的合成方法，其特征在于上述步驟(2)中所述的活化劑包括三苯基磷、對硝基芐醇、N-羥基琥珀酰亞胺。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含L-谷氨酰胺二肽的合成方法，其特征在于上述步驟(2)中所述的三級胺包括三乙胺、三甲胺、一甲基二乙基胺、二甲基一乙基胺、N-甲基嗎啡啉、N-乙基嗎啡啉。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含L-谷氨酰胺二肽的合成方法，其特征在于上述步驟(2)中所述的氯甲酸烷基酯包括氯甲酸乙酯、氯甲酸丙酯、氯甲酸異丙酯、氯甲酸異丁酯和氯甲酸丁酯和氯甲酸芐酯。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含L-谷氨酰胺二肽的合成方法，其特征在于上述步驟(2)中所述的L-谷氨酰胺弱堿溶液指的是可溶性的碳酸鹽或碳酸氫鹽或硼酸鹽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含L－谷氨酰胺二肽的合成方法，采用廉價的鄰苯二甲?；鳛榘被岜Ｗo基，制備鄰苯二甲酰氨基酸。采用混合酸酐法或活化酯法將保護的氨基酸與L－谷氨酰胺縮合成含鄰苯二甲酰－L－谷氨酰胺的二肽，所用L－谷氨酰胺無需保護，只需將其溶于弱堿溶液中制成相應的鹽直接用于縮合反應，用水合肼脫除鄰苯二甲酰保護基制備L－谷氨酰胺二肽。該合成方法原料價格低廉、生產(chǎn)成本低、反應速度快、選擇性好、收率高，達到50％左右。
文檔編號C07K5/00GK1651456SQ20041006611
公開日2005年8月10日 申請日期2004年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月8日
發(fā)明者焦慶才, 錢紹松, 陳然, 吳曉燕, 劉毅 申請人:南京大學