專利名稱：轉(zhuǎn)導(dǎo)肽－殺蟲晶體蛋白融合蛋白及其對應(yīng)序列與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體的涉及一種融合蛋白序列的構(gòu)建及融合蛋白的表達與應(yīng)用。本發(fā)明具體提供一種轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-殺蟲晶體蛋白融合蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)導(dǎo)肽(Protein Transduction Domain，PTD)(Schwarze SR，et al.，Science，1999，2851569-1572)是一類能自動穿透細胞膜，并能作為載體將其它生物大分子攜帶進入細胞膜內(nèi)的一段富含精氨酸的多肽。一般情況下，真核細胞的細胞膜對絕大數(shù)蛋白質(zhì)和長度超過6個氨基酸的多肽均是不可透過的。1988年Green等(Cell.1988，551179-1188)報道加入到細胞培養(yǎng)液中的來自愛滋病毒1(HIV-1)的反式激活蛋白TAT能自動地進入培養(yǎng)細胞內(nèi)反式激活LTR啟動子。隨后的研究證實，TAT能自動跨過細胞膜是由于TAT蛋白上位于47-57(YGRKKRRQRRR)位的一段多肽的作用。人工合成的TAT(47-57)(簡稱TAT肽，下同)以及利用化學(xué)合成的方法將其它大分子蛋白質(zhì)連接在它的N-端或C-端，或利用遺傳重組的方法構(gòu)建的由其它大分子蛋白質(zhì)與TAT肽組成的融合蛋白均能穿透細胞膜進入細胞內(nèi)，并且發(fā)現(xiàn)這種穿透(或轉(zhuǎn)導(dǎo))作用與培養(yǎng)的細胞種類和培養(yǎng)溫度無關(guān)(4℃和37℃均能轉(zhuǎn)導(dǎo))，而進入細胞內(nèi)的量僅與加在培養(yǎng)液中的融合蛋白質(zhì)的量有關(guān)，且代謝酶抑制劑對該轉(zhuǎn)導(dǎo)過程無任何影響。也就是說，TAT肽所引起的這種轉(zhuǎn)導(dǎo)作用是一種與目前已知的生物大分子進入細胞內(nèi)的方式，如依賴于受體、轉(zhuǎn)運蛋白或胞吞作用完全不同(Nagahara H，et al，Nature Medicine.1998，4(12)1449-1452；Xia H，Nature biotechnology.2001，19640-644)。除TAT肽外，來自果蠅觸角足同源異型轉(zhuǎn)錄因子Antp的43-58位的多肽序列(Derossi D，et al.TheJournal of Biological chemistry.1996，27(30)18188-18193.)；來自瘡疹單病毒DNA結(jié)合蛋白VP22的267-300序列(Elliott C，Ohare P.Cell.1997，88223-233)均具有與TAT肽完全相似的轉(zhuǎn)導(dǎo)功能和轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，它們也因此被統(tǒng)稱為PTD(Ford K G，et al.Gene Therapy.2001，81-4)。1999年Schwarze等第一次在活體的情況下證實了TAT肽的轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。將分子量大于120KD由β-半乳糖苷酶和TAT肽序列組成的融合蛋白在活體情況下注射入小鼠腹腔內(nèi)，4個小時后，在小鼠的所有組織，包括腦部(能穿透血腦屏障)均檢測到了β-半乳糖苷酶的活性，而沒有TAT序列的對照融合蛋白則檢測不到酶的活性。研究結(jié)果證實TAT肽奇特的生物功能，它在不破壞細胞膜生物活性的情況下，能將大分子蛋白攜帶進入細胞內(nèi)，并使大分子蛋白如酶等維持其原有的生物活性。
日本京都大學(xué)Futaki研究室(Futaki S.et al.J.Bio.Chem.2001，2765836-5840)的研究成果進一步表明，除來源于天然蛋白質(zhì)的多肽序列TAT、VP22、Antp外，人工合成的由不同數(shù)目的精氨酸組成的純精氨酸多肽和其它一些來源于DNA、RNA結(jié)合蛋白上富含精氨酸的序列同樣具有PTD的性能，并且發(fā)現(xiàn)PTD還能作為DNA的載體，攜帶遺傳基因透過細胞膜而使其在細胞內(nèi)表達(Futaki S.，et al.，Bioconjugate Chem.2001，121005-1011)，并認(rèn)為PTD的轉(zhuǎn)導(dǎo)機制可能與PTD與細胞膜磷酯雙分子層的相互作用有關(guān)(Suzuki T.，et al.，J.Bio.Chem.，2002，2772437-2443)。PTD的應(yīng)用，特別在醫(yī)學(xué)上作為攜帶基因藥物或蛋白質(zhì)藥物的載體而應(yīng)用于人體疾病的基因治療和蛋白質(zhì)治療而受到了熱切期待和高度重視。
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是目前世界上用途最廣、產(chǎn)量最大的微生物殺蟲劑，占微生物殺蟲劑總量的95％以上，因其對害蟲高效、對人畜安全、對環(huán)境友好而在世界范圍內(nèi)得到廣泛的應(yīng)用。編碼Bt殺蟲晶體蛋白的基因也作為最主要的殺蟲基因轉(zhuǎn)入到了多種重要的糧棉作物中，在害蟲防治中起著巨大的作用。但目前Bt殺蟲劑的使用正面臨著致命的威脅即害蟲對Bt的抗藥性。重要的農(nóng)業(yè)害蟲如棉鈴蟲、小菜蛾均已發(fā)現(xiàn)對Bt產(chǎn)生了抗藥性的田間種群，防治效果已顯著降低。如果任害蟲對Bt抗性的發(fā)展，當(dāng)抗性水平達到一定程度時，無論是天然的Bt制劑，經(jīng)過遺傳改良的Bt工程菌，還是轉(zhuǎn)Bt的轉(zhuǎn)達基因作物都將變得毫無意義，其損失將是不可估量的。
Bt制劑或轉(zhuǎn)Bt植株表達的毒蛋白對有害生物均有著相同的作用機制，分子量約為120KD的Bt原毒素進入害蟲中腸后被水解為分子量約為60-65KD的殺蟲晶體蛋白(ICP-insecticidal crystal protein)。依據(jù)結(jié)構(gòu)與功能研究，ICP大致可以分為三個部分N端的結(jié)構(gòu)域I、C端的結(jié)構(gòu)域III和中部的結(jié)構(gòu)域II。其中結(jié)構(gòu)域II、III負(fù)責(zé)與害蟲中腸圍食膜上皮細胞上的受體結(jié)合，決定ICP的選擇性；結(jié)構(gòu)域I在ICP與受體結(jié)合后插入細胞膜內(nèi)，在膜上形成穿孔并造成細胞內(nèi)液外滲而導(dǎo)致害蟲的死亡。對于抗Bt的害蟲，因其中腸上皮細胞上的受體蛋白編碼基因發(fā)生突變，突變的受體蛋白失去了與ICP結(jié)構(gòu)域II或III結(jié)合的能力，也因此導(dǎo)致了ICP結(jié)構(gòu)域I不能與膜作用形成穿孔，ICP也就失去了其殺蟲的功效(Gahan L.G.，et al.，Science.2001，293857-860；Griffitts J.S.，et al.，Science.2001，293860-864)。這種由ICP結(jié)合位點突變所導(dǎo)致的靶標(biāo)部位敏感性降低是目前唯一已知的，害蟲對Bt產(chǎn)生抗藥性的抗性機制(Griffitts J.S.，et al.，Science.2001，293860-864)。
1981年Schnepf和Whiteley從蘇云金芽孢桿菌克隆了第一個編碼δ-內(nèi)毒素的cry基因cry1Aa1，并于1985年發(fā)表了它的核苷酸序列。1989年Hfte和Whiteley根據(jù)基因的殺蟲活性和同源性，將當(dāng)時克隆的42種基因分為5群14類。CryI對鱗翅目昆蟲、CryII對鱗翅目和雙翅目、CryIII對鞘翅目、CryIV對雙翅目、Cyt對雙翅目昆蟲具有殺蟲活性。1998年Crickmore等提出了一種新的Cry殺蟲晶體蛋白分類方法，根據(jù)氨基酸同源性進行分級分類，形成了一個開放式分類系統(tǒng)。同源性在45％以下，為第一等級，用阿拉伯?dāng)?shù)字表示；同源性在45％-78％之間，為第二等級，用大寫英文字母表示；同源性在78％-95％之間，為第三等級，用小寫英文字母表示；同源性在95％以上，為第四等級，用阿拉伯?dāng)?shù)字表示。只要滿足來自Bt的伴胞包涵體(晶體)，對目標(biāo)生物具有毒性，或者與已知的Cry或Cyt蛋白具有高同源性，就可以納入這一分類系統(tǒng)。
本發(fā)明將PTD的應(yīng)用引入到殺蟲晶體蛋白領(lǐng)域，充分利用PTD與細胞膜之間的非特異性相互作用，特別是作為載體攜帶大分子物質(zhì)透過細胞膜的能力，增加Bt殺蟲晶體蛋白ICP結(jié)構(gòu)域II或III與害蟲中腸上皮細胞的親和，特別是顯著增加ICP與抗性害蟲中腸上皮細胞的親和，克服由于受體基因突變導(dǎo)致ICP不能結(jié)合在受體細胞上所產(chǎn)生的抗藥性。本發(fā)明的供試?yán)ハx為蔬菜上的主要害蟲小菜蛾，小菜蛾是田間最早發(fā)現(xiàn)對Bt殺蟲劑產(chǎn)生抗性的害蟲種群。本發(fā)明實施例中使用兩種PTD，一種是到目前為止研究最多的TAT肽，另一種是Rev肽。人工合成的Rev肽具有比TAT肽更強的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性，它也是發(fā)明人在京都大學(xué)Futaki研究室時的主要研究對象，并已經(jīng)證實了Rev肽具有作為載體攜帶大分子蛋白的能力。

發(fā)明內(nèi)容[要解決的技術(shù)問題]1、明確PTD對微生物殺蟲晶體蛋白的增效作用；2、明確轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-殺蟲晶體蛋白融合蛋白克服害蟲抗藥性的能力。本發(fā)明提供一種含有轉(zhuǎn)導(dǎo)肽序列與殺蟲晶體蛋白序列的轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-殺蟲晶體蛋白融合蛋白序列。
本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)肽序列為人免疫缺陷病毒基因編碼的反式激活蛋白TAT的PTD序列、果蠅同源異型轉(zhuǎn)錄因子ANTP、和單純包疹病毒I型VP22轉(zhuǎn)錄因子的PTD序列，人工合成的Rev肽序列，及用于轉(zhuǎn)導(dǎo)殺蟲晶體蛋白并擴展到使用PTD的一切類似物序列。
本發(fā)明的的轉(zhuǎn)導(dǎo)肽序列是根據(jù)選擇在大腸桿菌內(nèi)高效表達的三聯(lián)體密碼子且結(jié)合構(gòu)建表達載體需要的在序列兩端引入相應(yīng)的酶切位點所設(shè)計的序列。
所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)肽序列，優(yōu)選設(shè)計合成的TAT的PTD序列為SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)肽序列，優(yōu)選設(shè)計合成的Rev肽序列為SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
本發(fā)明提供的融合蛋白序列，其中殺蟲晶體蛋白序列為來源于蘇云金芽孢桿菌的cry基因的序列。
殺蟲晶體蛋白序列是根據(jù)構(gòu)建的轉(zhuǎn)導(dǎo)肽兩端的酶切位點及構(gòu)建表達載體的需要在序列的兩端引入相應(yīng)的酶切位點。具體方法是設(shè)計相應(yīng)的引物進行擴增。
本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-殺蟲晶體蛋白融合蛋白表達載體。
本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-殺蟲晶體蛋白融合蛋白表達及分泌的方法，具體步驟如下1)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-殺蟲晶體蛋白融合蛋白基因的設(shè)計與合成；2)含轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-殺蟲晶體蛋白融合蛋白DNA片段的表達質(zhì)粒的構(gòu)建；3)含轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-殺蟲晶體蛋白融合蛋白DNA片段的融合蛋白的表達。
本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-殺蟲晶體蛋白融合蛋白用于殺蟲劑的應(yīng)用。
本發(fā)明首次將有關(guān)PTD最新的研究成果應(yīng)用于微生物殺蟲晶體蛋白領(lǐng)域，開辟PTD應(yīng)用的新領(lǐng)域和克服害蟲抗藥性的新途徑，發(fā)明結(jié)果證明融合蛋白具有比單獨的殺蟲晶體蛋白蛋白高的殺蟲活性，本發(fā)明對有害生物的防治和PTD的應(yīng)用均有重要的理論和實踐意義。

附圖1、PTD與pET21b載體連接產(chǎn)物酶切檢測結(jié)果，其中1pET21b；2pET21bT；3pET21bR；MλDNA/Eco130I(19.3；7.7；6.2；4.2；3.5；2.7；1.9；1.5；0.92；0.42kb)。
附圖2、PTD與pET21b連接后與CryIAC功能基因連接雙酶切檢測結(jié)果，其中MλDNA/Eco130I；1pET21b；2pET-21bIAc；3pET-21bTIAc；4pET-21bRIAc。
附圖3、PTD與pET21b連接后與CryIAC功能基因連接單酶切檢測結(jié)果，其中MλDNA/Eco130I；1pET21b；2pET-21bIAc；3pET-21bTIAc；4pET-21bRIAc。
附圖4、BET21bIAc、BET21bTIAc、BET21bRIAc誘導(dǎo)表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析，其中M蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(97.4，66.2，43.0，31.0，20.1kD)1BL21(DE3)+pET21b；2BET21bIAc誘導(dǎo)蛋白沉淀；3BET21bIAc誘導(dǎo)蛋白上清；4BET21bRIAc誘導(dǎo)蛋白沉淀；5BET21bRIAc誘導(dǎo)蛋白上清；6BET21bTIAc誘導(dǎo)蛋白沉淀；7BET21bTIAc誘導(dǎo)蛋白上清。
具體實施方式

實施例1、PTD與Cry1Ac基因載體構(gòu)建方案設(shè)計TAT、Rev堿基序列時，選擇了在大腸桿菌內(nèi)高效表達的三聯(lián)體密碼子。設(shè)計好與pET21b載體EcoRI和NdeI酶切位點連接的粘性接頭，并在引物中加一BamHI酶切位點。PTD堿基序列如下Cry1Ac毒蛋白有毒區(qū)基因引物設(shè)計如下，其中Acb為帶有BamHI酶切位點的5’端上游引物，Acs為帶有SalI酶切位點的3’端下游引物，PCR調(diào)出的目的基因片段與pET21bPTD連接。Acn為帶有NdeI酶切位點的5’端上游引物，Acs為帶有SalI酶切位點的3’端下游引物，PCR調(diào)出的目的基因片段與pET21b連接，作為對照。
Acb 5′cgcggatccggataacaatccgaacatc3′Acs 3′gctgagtcactacttgcgcagctgcgca5′Acn 5′cgcgcatatggataacaatccgaacatc3′Acs 3′gctgagtcactacttgcgcagctgcgca5′實施例2、PTD與pET21b載體的連接在TAT肽與Rev肽與pET21b對應(yīng)EcoRI/NdeI酶切產(chǎn)物連接，并轉(zhuǎn)到JM110宿主菌中，提取質(zhì)粒DNA檢測，因pET21b質(zhì)粒中的BamHI位點已被切除，而在TAT與Rev肽的合成中插入了BamHI位點。所以可用BamHI限制性內(nèi)切酶檢測，結(jié)果見圖1。表明兩種PTD都成功與pET21b連接。將對應(yīng)菌種由上海申友公司與大連寶生物公司測序，與所設(shè)計合成序列一致。
實施例3、CryIAc功能基因的克隆以HD-73模式菌株質(zhì)粒為模板，進行PCR擴增，得到一條約2.2kb的擴增帶。柱回收該產(chǎn)物，經(jīng)抽提純化后BamHI/SalI酶切，以適當(dāng)體系與pET21b、pET21bT、pET21bR的BamHI/SalI產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM110。所得陽性克隆斑經(jīng)BamHI單酶切、BamHI/SalI雙酶切檢測(見圖2，3)。結(jié)果表明將CryIAc功能基因片段成功與pET21b、pET21bT、pET21bR對應(yīng)酶切產(chǎn)物連接。再以所提pET21bIAc、pET21bTIAc、pET21bRIAc質(zhì)粒DNA為模板，以CryIAc功能基因引物做PCR擴增，可以得到2.2kb的PCR產(chǎn)物，表明所插入片段應(yīng)為CryIAc功能基因。將pET21bIAc、pET21bTIAc、pET21bRIAc質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)宿主菌。得到相應(yīng)陽性克隆斑，經(jīng)相應(yīng)的酶切和PCR檢測，得到的對應(yīng)菌種BET21bIAc、BET21bTIAc、BET21bRIAc。
實施例4、融合蛋白的誘導(dǎo)表達及活性測定將相應(yīng)陽性克隆子BET21bIAc、BET21bTIAc、BET21bRIAc，轉(zhuǎn)接在含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中活化，210r/min，37℃培養(yǎng)12h。按1％接種量接到大量LB液體培養(yǎng)基中210r/min，30℃培養(yǎng)2h后加入0.7mmol/IPTG，150r/min，25℃誘導(dǎo)26h，各樣品進行SDS-PAGE電泳檢測(見圖4)，結(jié)果表明融合基因能通過表達載體pET21b在大腸桿菌中較高效的表達72kD左右的蛋白。其中，BET21bTIAc表達量較高，CK和BET21bRIAc表達量較低。而且沉淀的表達量較上清量多。
實驗例1、融合基因表達產(chǎn)物的生物活性用3齡小菜蛾(武漢敏感品系和深圳抗性品系)幼蟲作殺蟲試驗，將經(jīng)超聲波處理過的BET21bIAc、BET21bTIAc、BET21bRIAc基因表達產(chǎn)物溶入一定量10mmoltris-HCl(pH＝8)中。取新鮮甘藍葉片，用打孔器制成直徑5cm的圓葉片。在以上蛋白液中浸葉10S，自然涼干。接入各品系小菜蛾生測，見表1?？芍诿舾蟹N群中，各蛋白的上清或沉淀都有較高的活性；在抗性種群的測定中，加PTD結(jié)構(gòu)的蛋白殺蟲率較對照具有更高的活性。
表1 表達產(chǎn)物的生物活性測定結(jié)果
實驗例2、表達產(chǎn)物的純化及活性測定pET系列載體最初由Studier等人構(gòu)建，表達cry1I基因時所用載體pET-21b是在pET載體基礎(chǔ)上由Novagen公司生產(chǎn)的高效表達載體。具有T7lac啟動子是T7RNA聚合酶指導(dǎo)的λDE3 lysogens的lacUV5啟動子，是一極強啟動子。緊鄰其下游是lac操縱子，可以用來防止毒性基因的過早表達。表達融合蛋白N端具有11個T7Tag氨基酸，C端為HisTag氨基酸，可以用于目的蛋白質(zhì)的純化。帶有AmpR抗性篩選標(biāo)記。pET所用受體菌E.coli BL21缺失了lon蛋白酶和ompT膜外蛋白酶，可以增加表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性。在pET21b載體中有6個組氨酸標(biāo)簽，在蛋白表達時會在C端表達出，用固化Ni2吸收色譜純化帶組氨酸標(biāo)簽的蛋白(具體方法參考分子克隆三)。純化后蛋白活躍測定結(jié)果見下表2。生測實驗表明，帶有Tat和REV轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的融合蛋白殺蟲活性明顯增強。加Tat的融合蛋白的LC50為4.25ug/mL，加Rev融合蛋白的LC50為16.13ug/mL，而對照的CryIAc蛋白LC50為20.55ug/mL，加轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的蛋白對抗性品系的殺蟲活性也要優(yōu)于對照CryIAc蛋白。
表2 純化蛋白生測結(jié)果
序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所<120>轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-殺蟲晶體蛋白融合蛋白及其應(yīng)用<160>4<210>1<211>43<212>DNA<213>人工序列<400>1TATGTATGGA AGAAAAAAAC GTAGGCAACG AAGACGGGAT CCG 43<210>2<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>1ACATACCTTC TTTTTTTGCA TCCGTTGCTT CTGCCCTAGG CTTAA 45<210>3<211>61<212>DNA<213>人工序列<400>1TATGACCAGA CAAGCTAGAC GTAATCGAAG AAGGAGATGG AGAGAGAGAC 50AACGGGATCC G61<210>4<211>63<212>DNA<213>人工序列<400>1ACTGGTCTGT TCGATCTGCA TTAGCTTCTT CCTCTACCTC TCTCTCTGTT 50GCCCTAGGCT TAA 6權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-殺蟲晶體蛋白融合蛋白序列，其特征在于該序列含有轉(zhuǎn)導(dǎo)肽序列與殺蟲晶體蛋白序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白序列，其中轉(zhuǎn)導(dǎo)肽序列為人免疫缺陷病毒基因編碼的反式激活蛋白TAT的PTD序列、果蠅同源異型轉(zhuǎn)錄因子ANTP和單純包疹病毒I型VP22轉(zhuǎn)錄因子的PTD序列、人工合成的Rev肽序列，及用于轉(zhuǎn)導(dǎo)殺蟲晶體蛋白并擴展到使用PTD的一切類似物序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白序列，其特征在于選擇在大腸桿菌內(nèi)高效表達的三聯(lián)體密碼子且結(jié)合構(gòu)建表達載體的需要在序列兩端引入相應(yīng)的酶切位點所設(shè)計的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)肽序列，其中設(shè)計合成的TAT的PTD序列為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)肽序列，其中設(shè)計合成的Rev肽序列為SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白序列，其中殺蟲晶體蛋白序列為來源于蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)的cry基因的序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的殺蟲晶體蛋白序列，其特征在于根據(jù)構(gòu)建的轉(zhuǎn)導(dǎo)肽兩端的酶切位點及構(gòu)建表達載體需要在序列的兩端引入相應(yīng)的酶切位點。
8.一種轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-殺蟲晶體蛋白融合蛋白表達載體，其特征在于含有權(quán)利要求1～7之任一所述的融合蛋白基因序列。
9.一種轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-殺蟲晶體蛋白融合蛋白表達及分泌的方法，其特征在于通過以下步驟實現(xiàn)1)設(shè)計與合成轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-殺蟲晶體蛋白融合蛋白基因；2)含轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-殺蟲晶體蛋白融合蛋白DNA片段的表達質(zhì)粒的構(gòu)建；3)含轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-殺蟲晶體蛋白融合蛋白DNA片段的融合蛋白的表達。
10.一種轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-殺蟲晶體蛋白融合蛋白用于殺蟲劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體的涉及一種蛋白融合蛋白序列的構(gòu)建及融合蛋白的表達與應(yīng)用。本發(fā)明具體提供一種轉(zhuǎn)導(dǎo)肽－殺蟲晶體蛋白融合蛋白及其應(yīng)用，首次將有關(guān)PTD的研究成果應(yīng)用于微生物殺蟲晶體蛋白領(lǐng)域，開辟PTD應(yīng)用的新領(lǐng)域和克服害蟲抗藥性的新途徑，發(fā)明結(jié)果證明融合蛋白具有比單獨的殺蟲晶體蛋白高的殺蟲活性。本發(fā)明對有害生物的防治和PTD的應(yīng)用均有重要的理論和實踐意義。
文檔編號C07K19/00GK1683415SQ20041000600
公開日2005年10月19日 申請日期2004年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月13日
發(fā)明者張友軍, 楊峰山, 張文吉, 吳青君, 徐寶云 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所