專利名稱：用胸腺素β4、類似物、同型物和其他衍生物在心肌事件發(fā)生前、過程中或剛發(fā)生后治療或 ...的制作方法
背景技術(shù)：
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本發(fā)明要求2001年8月29日提交的申請(qǐng)?zhí)枮镹o.60/315,347的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的權(quán)益。
1、發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及在心肌事件(例如心肌梗塞)發(fā)生前、發(fā)生過程中或剛發(fā)生后治療或預(yù)防發(fā)生在心臟、心瓣膜和中隔壁中的炎癥、損傷和其他改變的領(lǐng)域。
2、背景技術(shù)描述心肌血管和冠狀血管和組織損傷的原因有很多，包括但不限于心肌缺血、凝塊、血管堵塞、感染、發(fā)育缺陷或畸形以及其他這類心肌事件。心肌梗塞是由于心內(nèi)的血管病變。發(fā)生在當(dāng)供給心臟部分的血液減少或停止時(shí)(由冠狀動(dòng)脈的阻塞引起)。減少的血液供給引起心肌細(xì)胞損傷并且甚至殺死心肌細(xì)胞。對(duì)心臟血液供給的減少經(jīng)常是由動(dòng)脈粥樣斑導(dǎo)致的心外膜的血管狹窄引起的。這些動(dòng)脈粥樣斑可能破裂導(dǎo)致出血、血栓形成、血纖維蛋白和血小板積聚以及血管的收縮。
在本技術(shù)領(lǐng)域中一直需要改進(jìn)在心肌事件發(fā)生前、其過程中或在其剛發(fā)生后用于治療或預(yù)防炎癥、損傷和其他改變的方法和組合物。
發(fā)明概述按照本發(fā)明，用于促進(jìn)與心肌事件相關(guān)的損傷的醫(yī)治或預(yù)防的治療方法涉及給藥于需要這種治療的患者或病人有效量的一組合物，該組合物包括一血管生成誘導(dǎo)的和抗炎的多肽，該多肽含有LKKTET的氨基酸序列或具有心肌事件抑制活性的其保守變異體。
發(fā)明詳述本發(fā)明是基于這樣一個(gè)發(fā)現(xiàn)含有LKKTET氨基酸序列或其保守變異體的諸如胸腺素β4(Tβ4)的肌動(dòng)蛋白螯合(actin-sequestering)肽和其他肌動(dòng)蛋白螯合肽或肽片段促進(jìn)與心肌事件相關(guān)的損傷和其他改變的治療或預(yù)防。包括諸如KLKKTET和LKKTETQ的N-或C-末端變異體。在嚙齒動(dòng)物模型中已提示Tβ4在血管生成中作為一個(gè)因子發(fā)揮作用。然而，迄今尚沒有已知的跡象表明這類性質(zhì)在治療諸如心肌梗塞、血管閉塞和心瓣膜缺陷和損傷的心肌血管和冠狀血管事件中有用。沒有與任何特定的理論相結(jié)合，這些多肽可能具有促進(jìn)修復(fù)的能力，通過具有誘導(dǎo)末端脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶(一種無模板指導(dǎo)的DNA聚合酶)，來降低和調(diào)控一種或多種炎性細(xì)胞素(cytokines)或化學(xué)素(chemokines)的水平，并且為內(nèi)皮細(xì)胞充當(dāng)趨化因子和/或血管生成因子的能力而醫(yī)治和預(yù)防，并因而在發(fā)生心肌事件的病人中治療和預(yù)防變性改變。
本發(fā)明提供能增強(qiáng)或下調(diào)間質(zhì)的上皮細(xì)胞分化并恢復(fù)因局部缺血、感染、老化和其他損傷或傷害導(dǎo)致的損傷的心肌組織和血管的功能。
在體外，胸腺素β4最初是作為在內(nèi)皮細(xì)胞遷移和分化的過程中上調(diào)的蛋白被鑒定。最初是從胸腺中分離的胸腺素β4，其是有43個(gè)氨基酸、4.9kDa的多肽，該多肽在各種組織中均鑒定出普遍存在。幾種角色都?xì)w于這種蛋白，包括在內(nèi)皮細(xì)胞分化和遷移、T細(xì)胞分化、肌動(dòng)蛋白隔離(sequestration)和血管形成中的角色。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，一種用于促進(jìn)與心肌事件相關(guān)的損傷和炎癥的醫(yī)治和預(yù)防的治療方法，包括給藥于需要這種治療的患者有效量的一組合物，該組合物含有一血管生成誘導(dǎo)、抗炎的肽，該肽含有LKKTET氨基酸序列或具有血管生成誘導(dǎo)、抗炎活性的其保守變異體，所述肽優(yōu)選為胸腺素β4、胸腺素β4同型物、氧化的胸腺素β4、胸腺素β4的硫氧化物、或胸腺素β4的拮抗體。
按照本發(fā)明，可以使用的組合物包括胸腺素β4(Tβ4)、Tβ4同型物、氧化的Tβ4、胸腺素β4的硫氧化物、具有肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)的螯合(sequestering)的或集束(bundling)的多肽或任何其他肌動(dòng)蛋白、或具有血管生成誘導(dǎo)、抗炎活性的包含或基本由LKKTET氨基酸序列或其保守變異體組成的肽片段。No.PCT/US99/17282的國(guó)際申請(qǐng)，這里通過引用結(jié)合進(jìn)來，公開了按照本發(fā)明中可以有用的Tβ4的同型物以及LKKTET氨基酸序列和具有血管生成誘導(dǎo)、抗炎活性的其保守變異體，其可以用于本發(fā)明。No.PCT/GB99/00833(WO 99/49883)的國(guó)際申請(qǐng)，這里通過引用結(jié)合進(jìn)來，公開了按照本發(fā)明可以利用的氧化的胸腺素β4。雖然本發(fā)明后面主要是描述有關(guān)Tβ4和Tβ4同型物，應(yīng)當(dāng)理解的是下面的描述可以同樣地應(yīng)用于氨基酸序列LKKTET、LKKTETQ、含有或基本上由LKKTET或LKKTETQ組成的肽和片段、具有血管生成誘導(dǎo)、抗炎活性的其保守變異體、以及氧化的胸腺素β4。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過用有效量的血管生成誘導(dǎo)、抗炎組合物接觸損傷位點(diǎn)而醫(yī)治和預(yù)防患者的炎癥和損傷的方法，該組合物含有Tβ4或Tβ4同型物。所述接觸可以是直接的或系統(tǒng)的(systemically)接觸。接觸損傷位點(diǎn)包括用僅含有Tβ4的組合物接觸該位點(diǎn)、或以與至少一個(gè)增加Tβ4滲透、或延遲或緩釋Tβ4肽進(jìn)入要治療區(qū)域的藥劑聯(lián)合的形式。給藥形式可以包括，例如，靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)或皮下注射、或吸入、透皮或口服給予含有Tβ4或Tβ4同型物等的組合物?；颊呖梢允遣溉閯?dòng)物，最好是人。
Tβ4，或其類似物、同型物或衍生物，可以以任何適于心肌事件損傷抑制或減輕的量使用。例如，Tβ4可以以大約0.1～50微克的劑量來給予，更優(yōu)選的是以大約1～25微克的量給藥。
按照本發(fā)明的組合物可以每天、每隔一天等用單次給予或每天多次給予的形式給藥，例如每天2次、3次、4次或更多次給藥。
已鑒定了Tβ4的同型物，并具有與已知的Tβ4氨基酸序列大約70％、或大約75％、或大約80％或更高的同源性。這類同型物包括，例如，Tβ4ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14和Tβ15。與Tβ4類似，Tβ10和Tβ15同型物已顯示出螯合肌動(dòng)蛋白。Tβ4、Tβ10和Tβ15以及這類其他的同型物共同有一個(gè)氨基酸序列，LKKTET，該序列似乎與介導(dǎo)肌動(dòng)蛋白螯合或結(jié)合有關(guān)。雖然不希望與任何特定的理論結(jié)合，Tβ4同型物的活性可能部分由于調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的聚合的能力。β-胸腺素似乎通過螯合自由的G-肌動(dòng)蛋白使F-肌動(dòng)蛋白解聚。Tβ4的調(diào)控肌動(dòng)蛋白聚合的能力因此可能全部或部分由于其具有通過LKKTET序列與肌動(dòng)蛋白結(jié)合或螯合的能力。因此，就像用Tβ4，如這里闡明的，其他結(jié)合或螯合肌動(dòng)蛋白的蛋白，或調(diào)控肌動(dòng)蛋白聚合的蛋白，包括具有LKKTET氨基酸序列的Tβ4同型物，單獨(dú)或與Tβ4聯(lián)合使用似乎都有效。
因此，特別預(yù)期已知的Tβ4同型物，例如Tβ4ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14和Tβ15，以及尚未鑒定的Tβ4同型物，將都在本發(fā)明的方法中有用。這類Tβ4同型物在本發(fā)明的方法中有用，該方法包括在患者中使用的方法。因此本發(fā)明進(jìn)一步提供含有Tβ4，以及Tβ4同型物Tβ4ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14和Tβ15，以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
另外，具有肌動(dòng)蛋白螯合或結(jié)合能力的其他蛋白，或那些能動(dòng)員或調(diào)控肌動(dòng)蛋白聚合的蛋白，就像以適當(dāng)?shù)仳稀⒔Y(jié)合、動(dòng)員或聚合分析所證實(shí)的，或通過諸如LKKTET的介導(dǎo)肌動(dòng)蛋白結(jié)合的氨基酸序列的存在而鑒定的，都可同樣地用于本發(fā)明方法中。這類蛋白包括例如(肌動(dòng)蛋白)凝溶膠蛋白、維生素D結(jié)合蛋白(DBP)、(肌動(dòng)蛋白)抑制蛋白、cofilin、adsevertin、前肌球蛋白(propomyosin)、fincilin、depactin、脫氧核糖核酸酶I、vilin、(肌動(dòng)蛋白)片段化蛋白、severin、(肌動(dòng)蛋白)加帽蛋白、β-輔肌動(dòng)蛋白、和acumentin。由于這類方法包括那些在患者中實(shí)施的方法，本發(fā)明進(jìn)一步提供含有上述(肌動(dòng)蛋白)凝溶膠蛋白、維生素D結(jié)合蛋白(DBP)、(肌動(dòng)蛋白)抑制蛋白、cofilin、depactin、脫氧核糖核酸酶I、vilin、(肌動(dòng)蛋白)片段化蛋白、severin、(肌動(dòng)蛋白)加帽蛋白、β-輔肌動(dòng)蛋白、和acumentin的藥物組合物。因此本發(fā)明包括含有LKKTET氨基酸序列(可以是在其最初的氨基酸序列內(nèi))的血管生成誘導(dǎo)、抗炎多肽和其保守變異體的用途。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“保守變異體”或其語(yǔ)法變化指用一個(gè)氨基酸殘基代替另一個(gè)生物學(xué)上相類似的殘基。保守變異的例子包括例如用異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸的疏水殘基代替另一個(gè)，用極性殘基代替另一個(gè)，例如用精氨酸代替賴氨酸，用谷氨酸代替天冬氨酸，或用谷氨酰胺代替天冬酰胺等等。
已將Tβ4定位于幾個(gè)組織和細(xì)胞類型，并且因此可以加入刺激Tβ4產(chǎn)生的藥劑，或該藥劑可以包含一組合物，以影響來自組織和/或細(xì)胞中的Tβ4產(chǎn)生。這類藥劑包括生長(zhǎng)因子家族的成員，例如胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、胸腺素α1(Tα1)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)。更優(yōu)選的是，該藥劑是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)或TGF-β總科的其他成員。本發(fā)明的Tβ4組合物可以通過細(xì)胞外基質(zhì)沉積、細(xì)胞的遷移和皮膚的血管形成實(shí)現(xiàn)相連接組織的生長(zhǎng)而降低心肌事件的影響。
按照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，給患者用刺激在該患者中產(chǎn)生如上述的血管生成誘導(dǎo)、抗炎的肽的藥劑治療。
另外，可將幫助或刺激醫(yī)治由心肌事件引起的損傷的藥劑與Tβ4或Tβ4同型物一起加入到組合物中。這類藥劑包括血管生成劑、生長(zhǎng)因子、指導(dǎo)細(xì)胞分化的藥劑。例如，并以非限制的方式，Tβ4或Tβ4同型物可以單獨(dú)或聯(lián)合與有效量的下述藥劑的任何一種或多種結(jié)合VEGF、KGF、FGF、PDGF、TGFβ、IGF-1、IGF-2、IL-1、前胸腺素α(prothymosinα)和胸腺素α1。
本發(fā)明也包括在藥學(xué)上可接受的載體中含有治療有效量的Tβ4或Tβ4同型物的藥物組合物。這類載體包括那些列舉在腸胃外投藥的參考資料中的載體。
醫(yī)治或預(yù)防與心肌事件相關(guān)的炎癥、損傷和退化的實(shí)際劑量、配方或組成成分可以取決于許多因素，包括患者的體型和健康狀況。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以運(yùn)用在PCT/US99/17282(見前)中公開的，和其中引用的參考文獻(xiàn)中描述的用于確定臨床劑量的方法和技術(shù)的教導(dǎo)來確定使用的適當(dāng)劑量。
合適的配方包括Tβ4或Tβ4同型物重量濃度范圍在大約0.001-10％，更優(yōu)選在大約0.01-0.1％重量濃度范圍內(nèi)，最優(yōu)選為大約0.05％重量濃度。
在這里描述的治療途徑涉及含有Tβ4和本發(fā)明其他化合物的試劑或組合物的各種途徑的給藥或輸送，包括任何常規(guī)的對(duì)患者的給藥技術(shù)?？梢园凑帐褂玫姆椒?，通過與藥學(xué)上可接受的無毒性賦形劑或載體混合，將含有Tβ4和本發(fā)明其他化合物的組合物配制成藥物組合物。
本發(fā)明包括與Tβ4肽或其功能片段相互作用的抗體的用途。提供基本由具有不同表位特異性的混合的單克隆抗體以及性質(zhì)不同的(distinct)單克隆抗體制劑組成的抗體。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，如在PCT/US99/17282(見前)中公開的方法，由含有蛋白片段的抗原制備單克隆抗體。在本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)抗體意在包括單克隆抗體和多克隆抗體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供給予患者有效量的調(diào)控Tβ4基因表達(dá)的藥劑的治療方法。術(shù)語(yǔ)“調(diào)控”指當(dāng)Tβ4過量表達(dá)時(shí)，Tβ4表達(dá)的阻礙或抑制，而在Tβ4表達(dá)不足時(shí)，其表達(dá)的誘導(dǎo)。術(shù)語(yǔ)“有效量”意為在有效治療中，調(diào)控Tβ4基因表達(dá)中的Tβ4藥劑的量。調(diào)控Tβ4或Tβ4同型物基因表達(dá)的藥劑可以是例如一多核苷酸。該多核苷酸可以是反義(核酸)、三螺旋(triplex)劑、或核糖酶。例如，可以使用直接針對(duì)結(jié)構(gòu)基因區(qū)域或針對(duì)Tβ4啟動(dòng)子區(qū)域的反義(核酸)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供使用調(diào)控Tβ4活性的化合物的方法。影響Tβ4活性(例如拮抗劑和促效劑)的化合物包括肽、肽模擬物(peptidomimetics)、多肽、化學(xué)化合物、例如鋅的礦物、以及生物藥劑。
不與任何特定的理論結(jié)合，本發(fā)明可以通過誘導(dǎo)末端脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶(一種無模板指導(dǎo)的DNA聚合酶)促進(jìn)與心肌事件相關(guān)的炎癥或損傷的醫(yī)治或預(yù)防，通過誘導(dǎo)末端脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶以降低一種或多種炎性細(xì)胞素或化學(xué)素的水平，并且在內(nèi)皮細(xì)胞中作為趨化性因子，因而促進(jìn)在由心肌事件或其他變性或環(huán)境因子導(dǎo)致的、發(fā)生在心血管和組織中的變性改變的醫(yī)治或預(yù)防。
下面的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)作為其限制。
實(shí)施例合成的Tβ4和抗Tβ4抗體由RegeneRx生物制藥公司(3 Bethesda MetroCenter，Suite 700，Bethesda，MD 20814)提供，并在膠原蛋白凝膠分析測(cè)試以測(cè)定它們由心內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的效果。已充分證實(shí)通過上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化形成心瓣膜和其他心臟組織的發(fā)育，并證實(shí)在此過程中的缺陷可在發(fā)育過程中和終生導(dǎo)致嚴(yán)重的心血管畸形和損傷。在膠原蛋白凝膠分析中，生理濃度的Tβ4明顯增強(qiáng)心內(nèi)細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。而且，抗Tβ4抗體抑制并阻斷這種轉(zhuǎn)化。在正常心臟組織形成和維護(hù)過程中和心瓣膜形成過程中，房室的心內(nèi)膜向侵入的間葉細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是關(guān)鍵的。
權(quán)利要求
1.一種用于促進(jìn)冠狀組織損傷的醫(yī)治或預(yù)防的治療方法，包括給予需要這種治療的患者有效量的含有LKKTET氨基酸序列或其保守變異體的多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述損傷來自有害的心肌事件。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述多肽包括KLKKTET或LKKTETQ的氨基酸序列、胸腺素β4(Tβ4)、Tβ4的N-末端變異體、Tβ4的C-末端變異體、Tβ4的同型物、氧化的Tβ4或Tβ4硫氧化物。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將所述組合物系統(tǒng)地給藥。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將所述組合物直接給藥于所述冠狀組織。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述多肽是重組的或合成的。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述多肽是抗體。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述抗體為多克隆抗體或單克隆抗體。
9.一種用于促進(jìn)冠狀組織損傷的醫(yī)治或預(yù)防的治療方法，包括給予需要這種治療的患者有效量的一組合物，所述組合物含有一藥劑，所述藥劑刺激血管生成誘導(dǎo)、抗炎多肽產(chǎn)生，所述多肽含有LKKTET氨基酸序列，或含有具有血管生成誘導(dǎo)、抗炎活性的其保守變異體。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述多肽為胸腺素β4。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述藥劑為胸腺素β4的拮抗劑。
12.一種用于促進(jìn)冠狀組織損傷的醫(yī)治或預(yù)防的組合物，含有一有效量的組合物，所述組合物包括一血管生成誘導(dǎo)、抗炎多肽，所述多肽含有LKKTET氨基酸序列或具有血管生成誘導(dǎo)、抗炎活性的其保守變異體。
13.如權(quán)利要求12所述的組合物，其特征在于，所述組合物含有LKKTET的N-末端或C-末端變異體。
14.如權(quán)利要求12所述的組合物，其特征在于，所述組合物含有KLKKTET或LKKTETQ。
15.如權(quán)利要求12所述的組合物，其特征在于，所述多肽包括Tβ4、Tβ4的同型物、氧化的Tβ4或Tβ4硫氧化物。
全文摘要
通過給予諸如胸腺素β4、胸腺素β4的同型物或氧化的胸腺素β4的血管生成誘導(dǎo)、抗炎肽，治療或預(yù)防與心肌事件相關(guān)的炎癥或損傷。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1547480SQ02816688
公開日2004年11月17日 申請(qǐng)日期2002年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月29日
發(fā)明者艾倫·L·戈?duì)柕滤固? 艾倫 L 戈?duì)柕滤固? 芬科爾斯坦, 小杰克·芬科爾斯坦 申請(qǐng)人:雷根內(nèi)克斯生物制藥有限公司