專利名稱：：一種胸腺素alphal(Tal)類似物及生產(chǎn)工藝和醫(yī)用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明公開一種胸腺素alphal(Tal)類似物及生產(chǎn)工藝和醫(yī)用途，通過對天然蛋白的分子設計與基因工程改造，得到了具有更強生物學活性的天然蛋白類似物，屬于重組蛋白質(zhì)藥物生產(chǎn)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：胸腺素a1(簡稱Ta1)是一種免疫活性肽，它主要作用于胸腺細胞成熟的早期和晚期，可增加T細胞表面Thy-l,Thy-2.3和Lyt-1.2.3表達，能促進T淋巴細胞的增殖，提高淋巴細胞產(chǎn)生干擾素和白介素2等細胞因子的能力，提高機體抗菌和抗感染的能力。因此胸腺素al是一種重要的免疫調(diào)節(jié)劑和增強劑。臨床上主要作為原發(fā)性或繼發(fā)性免疫功能缺陷病，腫瘤和慢性活動性肝炎的免疫調(diào)節(jié)劑，其安全性和有效性已經(jīng)超萬例臨床應用所證實，長期使用，無蓄積性，無抗原性，并得到國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜业墓J。文獻表明，Tal是通過與其特異性受體結(jié)合從而產(chǎn)生特定的生物學效應，如果加強T(U及其相應受體間的結(jié)合力，有利于提高Tal的生物學效應，本研究針對Tal和其相應受體的三維結(jié)構(gòu)進行了計算機模擬分析，分析結(jié)果表明Ta1的11位氨基酸位點Ile突變?yōu)閂al，可以使Tal與其受體的結(jié)合力增強，從而有可能提高Tal的體內(nèi)外生物活性。針對上述結(jié)果，本發(fā)明構(gòu)建了第11位突變?yōu)閂al的Ta1類似物表達菌株，通過發(fā)酵，純化得到了該類似物純品，并對其進行了體內(nèi)外生物學活性的研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于公開一種胸腺素alphal(Tal)類似物，為新的重組蛋白。本發(fā)明還公開胸腺素alphal(Tal)類似物的生產(chǎn)工藝，通過基因工程重組表達的方法獲得。本發(fā)明另一目的是提供了胸腺素alphal(Tal)類似物醫(yī)用途。本發(fā)明公開的胸腺素alphal(Tal)類似物(SEQIDN0:1)，其氨基酸序列為01-19:Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Val-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys20-28:Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn。本發(fā)明的Ta1類似物是通過基因工程重組表達的方法獲得的，包括如下步驟1)表達載體的構(gòu)建依據(jù)Ta1類似物氨基酸序列(SEQIDN0:1)，選用大腸桿菌偏好密碼子全基因合成Tal類似物DNA序列，同時在相應于所編碼的氨基酸序列之5'端和3'端加上限制性酶切位點，并進行N—末端修飾(加入EK酶酶切位點)，得到編碼Tal類似物的核酸序列。再分別將如上述制備的Ta1類似物序列以及篩選質(zhì)粒pBSK用限制性內(nèi)切酶處理好，經(jīng)計算各樣品濃度后按一定摩爾比加入T4連接體系，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選得到正確的重組子；用限制性酶切下重組子的融合蛋白基因，再將該基因與用限制性酶處理好的Pharmacia公司質(zhì)粒pGEX連接，經(jīng)篩選得到正確的重組子。2)重組Ta1類似物的表達及分離純化將上述所含pGEX質(zhì)粒的重組子轉(zhuǎn)化到表達宿主菌，經(jīng)表達篩選出高表達基因工程菌，然后經(jīng)發(fā)酵，離心收集目的蛋白高表達的菌體。高壓均質(zhì)破碎菌體并離心得到含目的前體蛋白上清液，將上清液上樣到GST親和柱上，洗脫目的前體蛋白并用EK酶酶切后，再將樣品通過陰離子柱進一步純化，得Tal類似物，最終目的蛋白純度大于98%。一、對重組Ta1類似物的體外生物活性測定用E玫瑰藥結(jié)實驗對樣品進行生物活力測試首先分離健康人外周血單核細胞，使用小牛血清調(diào)整細胞數(shù)至2X107ml。各取200ii1細胞液加入EP管中，再分別加入等量的測試樣品Ta1類似物與陽性對照品日達仙(天然Ta1)，37。C水浴90分鐘，每支EP管中加入200tU綿羊紅細胞(2X107ml)，4'C放置3小時，涂片、染色后放于高倍鏡下計數(shù)200個，淋巴細胞中形成玫瑰花結(jié)的細胞數(shù)(結(jié)合3或以上的為一個玫瑰花結(jié))。計算玫瑰藥形成細胞的百分數(shù)。按以下公式計算激活率。激活率=樣品管藥結(jié)百分比一對照藥結(jié)百分比x100%對照管百分比經(jīng)測試，本發(fā)明生產(chǎn)的Ta1類似物體外生物活性大于天然Tal。二、重組Tal類似物的體內(nèi)生物活性測定動物模型的建立取7周大的雌性Balb/C小鼠(每組6只)連續(xù)10天腹膜內(nèi)注射0.2mL含25mg/kg的5-FU生理鹽水，同時分組注射30ug/kg的測試樣品Ta1類似物、30ug/kg的日達仙以及生理鹽水，10天后分離胸腺細胞做流式細胞儀分析CD4+、CD8+細胞數(shù)。流式細胞儀分析新分離的胸腺細胞中加入抗CD4、CD8抗體，陰性選擇獲得的CD4—CD8—細胞中加入羊抗鼠Smo抗體，用FACScan流式細胞儀分析，CellQuest軟件。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述試驗結(jié)果可以得出結(jié)論，本發(fā)明得到的Tal類似物，在單位劑量的條件下體內(nèi)外生物活性明顯優(yōu)于天然Tal.因此，本發(fā)明Tal類似物與天然的Tal相比具有較強的免疫增強功能，可以制備相應的提高免疫力的藥物。本發(fā)明的積極效果在于提供的Tal類似物為一種新的重組蛋白，與天然的Tal相比具有更高的生物活性，可以最終取代Tal的化學合成，從而減少由于化學合成生產(chǎn)Tal給自然界帶來的污染。圖1為免疫后動物的陽轉(zhuǎn)率。圖2為抗體消長規(guī)律圖。具體實施例方式為了便于理解本發(fā)明，特例舉以下實施例。其作用被理解為是對本發(fā)明的闡釋而非對本發(fā)明的任何形式的限制。實施例1.胸腺素al前體蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建與工程菌的獲得首先通過全基因和成擴增出Ta1類似物蛋白的全基因序列，設計如下:ggatccI(;at(;a(:(;atga(:.w;"ItcggatgcggccgtgBariHl酶切位點GATACCTCGTCGGAAACCACGAAAGATCTGAAAGAAAAAAAGGAAGTGGTTGAAGAGGCGGAAAATTAATGAGAATTCf:(:()R:i目的片段經(jīng)BamHI、EcoRI雙酶切后分別回收小片段，質(zhì)粒PGEX經(jīng)BamHI、EcoRI雙酶切后回收大片段，14'C在T4連接酶體系中兩段目的基因片段進行連接，經(jīng)篩選得到的重組質(zhì)粒命名為PGMT。然后用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，涂布在含有100ug/ml氨芐青霉素的LB平板，挑選陽性菌落在LA中培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8時加入IPTG0.lmM誘導3-4小時離心收集菌體，8M尿素破菌后15%SDS-PAGE電泳時出現(xiàn)一條30KD左右的蛋白帶，表達量為菌體可溶性蛋白的35%。經(jīng)胸腺素al的單克隆抗體免疫印跡檢定，顯示陽性反應。所獲得的高效表達胸腺素al前體蛋白的工程菌命名為PGMTal/BL21。2.發(fā)酵1).搖瓶表達含胸腺素al前體蛋白基因的PGMTal/BL21，在含100ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中搖瓶過夜(37°C，200rpm)，再按1:30接種含有100ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)3小時后，加入O.lmMIPTG誘導4小時。收集菌體經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)含胸腺素al融合蛋白(30KD)以可溶性表達為主，表達量占菌體可溶性蛋白的40%。2)發(fā)酵工藝a.培養(yǎng)基a)種子液培養(yǎng)基(LA):胰蛋白胨10克/升、酵母粉5克/升、氯化鈉10克/升、氨芐青霉素100微克/毫升。b)培養(yǎng)基(15升):磷酸氫二鈉375克、磷酸二氫鉀80克、氯化鈉10.克、氯化銨45克、胰蛋白胨50克。以上成分一起在罐中滅菌；下面的成分單獨滅菌后加入發(fā)酵罐。硫酸鎂15克、葡萄糖150克、補料(500克/升)葡萄糖b.發(fā)酵過程(a)種子培養(yǎng)從已鑒定的平皿上劃取菌種，接種到50毫升(250毫升的三角瓶)LA中，37度、200轉(zhuǎn)/分、8小時后將這50毫升種子液轉(zhuǎn)接到700毫升LA中，36度、200轉(zhuǎn)/分，過夜。(b)發(fā)酵過程將培養(yǎng)好的種子液(0D柳產(chǎn)3-4)加入罐中，調(diào)好各參數(shù)，37度、150轉(zhuǎn)、溶氧100%,開始發(fā)酵；5小時后開始以2.5速流加2小時，加入終濃度0.3mM的IPTG誘導(五小時)。3.層析(l)親和層析采用GSH-Agrose層析介質(zhì)(Sigma公司)，平衡液采用25慮Tris-HC1，pH8，上樣平衡后，裂菌的離心上清上GlutathioneS印harose層析柱，平衡后用含10mM還原型谷胱甘肽(GSH)的洗脫液洗下融合蛋白。(2)酶解上一步的洗脫液加入EK酶(5NIHU/mL)37。C酶切20小時。(3)陰離子交換層析采用Source30Q層析介質(zhì)，平衡液為20mMPB，pH7，上一步得到的樣品用水稀釋l倍進行上樣，平衡后采用20mMPB，pH7，O—lMNaCl，20個柱體積的梯度洗脫，收集目的蛋白洗脫峰。4.檢測得到的胸腺素al通過SDS-PAGE純度檢測和反相HPLC檢測，得Tal類似物，純度均大于95%。胸腺素alphal(Tal)類似物(SEQIDN0:1)，其氨基酸序列為01-19:Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Val-Thr-Thr-Lys一Asp—Leu—Lys—Glu—Lys20-28:Lys-Glu-Val-Va:L-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn。5.體外活性檢測E玫瑰藥結(jié)實驗對樣品進行生物活力測試基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)液1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基10.0g，NaHCQ.,2.2g，H印es5.9g，丙酸鈉0.llg，0.05M巰基乙醇2.0ml，ddH2O1000ml;細胞培養(yǎng)基基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基90ml,小牛血清IOml，雙抗(青霉素+鏈霉素)100U/ml，谷胱甘肽0.03g/ml;測活培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基95ml小牛血清5.0ml，雙抗及谷胱甘肽濃度與上相同。過濾滅菌；裂解液SDS10g,，DMSO25ml,ddH2019ml，調(diào)PH=4.7。方法首先分離健康人外周血單核細胞，使用小牛血清調(diào)整細胞數(shù)至2X10Vml。各取200ii1細胞液加入EP管中，再分別加入等量的測試樣品Ta1類似物與日達仙，37。C水浴90分鐘，每支EP管中加入200u1，綿羊紅細胞(2X107ml)，4。C放置3小時，涂片、染色后放于高倍鏡下計數(shù)200個，淋巴細胞中形成玫瑰花結(jié)的細胞數(shù)(結(jié)合3或以上的為一個玫瑰花結(jié))。計算玫瑰藥形成細胞的百分數(shù)。按以下公式計算激活率。激活率=樣品管藥結(jié)百分比一對照藥結(jié)百分比X100%對照管百分比樣品對E玫瑰花結(jié)形成率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>N=5，林P〈0.01,與對照比由上表可知，Tal類似物可顯著提高人外周血淋巴細胞E玫瑰花結(jié)形成數(shù)量，且作用大于日達仙(天然的Tal)。6.免疫增強試驗動物模型的建立取7周大的雌性Balb/C小鼠(每組6只)連續(xù)10天腹膜內(nèi)注射0.2mL含25mg/kg的5-FU生理鹽水，同時分組注射30ug/kg的測試樣品Ta1類似物、30ug/kg的日達仙以及生理鹽水，10天后分離胸腺細胞做流式細胞儀分析CD4+、CD8+細胞數(shù)。流式細胞儀分析新分離的胸腺細胞中加入抗CD4、CD8抗體，陰性選擇獲得的CD4—CD8—細胞中加入羊抗鼠Smo抗體，用FACScan流式細胞儀分析，CellQuest軟件。結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>上述試驗結(jié)果可以得出結(jié)論，本發(fā)明得到的Tal類似物，在單位劑量的條件下體內(nèi)外生物活性明顯優(yōu)于天然Tal.因此，本發(fā)明Tal類似物與天然的Tal相比具有較強的免疫增強功能，可以制備相應的提高免疫力的藥物。7.用于制備疫苗佐劑的應用實驗-免疫小鼠BALB/c，雌性，4-6周(19-21g)免疫用犬瘟熱病毒(CDV)為本室從疫苗中分離并保存的弱毒株。以步驟1制備的純度為99%的胸腺素a1突變體作為佐劑，免疫小鼠。120只BALB/c小鼠隨機分為4組，每組30只。各組的免疫方案如下(1)佐劑對照組胸腺素al類似物組，30ng/只；(2)病毒對照組CDV，20TCID50/只;(3)低劑量佐劑組20TCID50CDV+30ng胸腺素al類似物/只；(4)高劑量佐劑組20TCID50CDV+300ng胸腺素al類似物/只。以戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，按照上述方案肌肉注射病毒或病毒佐劑混合物免疫動物，程序為2次免疫，即初次免疫后的第14天加強免疫。自初次免疫后，每隔14天采血并分離血清，細胞中和法檢測抗CDV中和抗體效價?？贵w消長情況如圖2所示。結(jié)果表明，低劑量胸腺素al突變體起到了明顯的佐劑作用，能夠顯著增加小鼠的CDV抗體效價，與病毒對照組差異顯著。高劑量佐劑組亦具有明顯的佐劑作用，抗體水平于初免后14天達到了最高點，不過隨后即呈下降趨勢。以抗CDV抗體效價》1:%時作為抗體陽轉(zhuǎn)的標準，計算不同方案組免疫后動物的陽轉(zhuǎn)率，見圖1。結(jié)果表明，低劑量佐劑組初次免疫后14天的CDV陽轉(zhuǎn)率為83.3%，加強免疫后14天(即初免后第28天)，CDV陽轉(zhuǎn)率為86.6%;高劑量佐劑組初次免疫后2周的CDV陽轉(zhuǎn)率為83.3。/。，加強免疫后28天，CDV陽轉(zhuǎn)率為73.3%。低劑量佐劑組小鼠的CDV滴度與不加胸腺素佐劑的犬瘟熱的相比，差異顯著(P《0.05)。說明低劑量胸腺素不僅顯著提高犬瘟熱免疫小鼠的陽轉(zhuǎn)率，而且增強犬瘟熱小鼠的抗體滴度。權(quán)利要求1、一種胸腺素alpha1(Ta1)類似物(SEQIDNO1)，其氨基酸序列為01-19Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Val-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys20-28Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn。2、權(quán)利要求1所述胸腺素alphal類似物的多核苷酸序列。3、權(quán)利要求l中的胸腺素alphal類似物制備方法，包括一下步驟1)表達載體的構(gòu)建依據(jù)Ta1類似物氨基酸序列，選用大腸桿菌偏好密碼子全基因合成Ta1類似物DNA序列，同時在相應于所編碼的氨基酸序列之5'端和3'端加上限制性酶切位點，并進行N—末端修飾，加入EK酶酶切位點，得到編碼Ta1類似物的核酸序列；再分別將如上述制備的Ta1類似物序列以及篩選質(zhì)粒pBSK用限制性內(nèi)切酶處理好，經(jīng)計算各樣品濃度后按一定摩爾比加入T4連接體系，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選得到正確的重組子；用限制性酶切下重組子的融合蛋白基因，再將該基因與用限制性酶處理好的Pharmacia公司質(zhì)粒pGEX連接，經(jīng)篩選得到正確的重組子；2)重組Td1類似物的表達及分離純化將上述所含pGEX質(zhì)粒的重組子轉(zhuǎn)化到表達宿主菌，經(jīng)表達篩選出高表達基因工程菌，然后經(jīng)發(fā)酵，離心收集目的蛋白高表達的菌體；高壓均質(zhì)破碎菌體并離心得到含目的前體蛋白上清液，將上清液上樣到GST親和柱上，洗脫目的前體蛋白并用EK酶酶切后，再將樣品通過陰離子柱進一步純化，得Tdl類似物，最終目的蛋白純度大于98%。4、權(quán)利要求1所述的胸腺素alphal類似物在制備治療免疫力低下及病毒病藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明公開一種胸腺素alpha1(Ta1)類似物及生產(chǎn)工藝和醫(yī)用途，通過對天然蛋白的分子設計與基因工程改造，與天然的Ta1相比具有更高的生物活性，可以最終取代Ta1的化學合成，從而減少由于化學合成生產(chǎn)Ta1給自然界帶來的污染，用于制備治療免疫力低下及病毒病藥物。文檔編號A61K38/32GK101302252SQ20081005044公開日2008年11月12日申請日期2008年3月7日優(yōu)先權(quán)日2008年3月7日發(fā)明者李樹民,禹江,趙翠波申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所