專利名稱：特異性高效親和膜ⅰ型基質(zhì)金屬蛋白酶(mt1-mmp)的多肽、蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有特定序列或基序的膜I型基質(zhì)金屬蛋白酶(MT1-MMP)的 特異性高親和力的多肽或蛋白，這種多肽或蛋白的用途，包括含有這些序列或 基序的多肽或蛋白作為靶向藥物的載體、生物標(biāo)記物和檢測手段，屬于生物技 術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
基質(zhì)金屬蛋白酶即Matrix Metalloproteinases，簡稱MMPs,是由細(xì)胞分泌的 Z^+金屬內(nèi)肽酶家族的總稱，參與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解。MMPs是一個Zn" 依賴性蛋白酶家族，主要由成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等 合成與分泌，通常在中性條件下及C^+參與下發(fā)揮作用，目前已發(fā)現(xiàn)24種人源 MMPs。這些MMP可以根據(jù)其結(jié)構(gòu)分為膜型和分泌型，其中，膜型MMP有六種。 膜I型基質(zhì)金屬蛋白酶(MT1-MMP, MMP-14)與其它膜型MMP有著很高的同源 性，它們都含有一個前肽結(jié)構(gòu)域，含有Zn"離子結(jié)合位點的催化結(jié)構(gòu)域，鉸鏈結(jié) 構(gòu)域，血紅素樣結(jié)構(gòu)域和一個胞質(zhì)尾端結(jié)構(gòu)域。而它本身又有著自身的特殊結(jié) 構(gòu)，MT1-MMP在C-末端含有一個胞漿區(qū)以及N-末端含有一個fiirin蛋白識別位 點。MT1-MMP在膜型MMP中發(fā)揮著很重要的作用，主要與正常及腫瘤細(xì)胞的 細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑相關(guān)。MT1-MMP可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中多種成分，如 I型和II型膠原，纖維連接蛋白，玻璃粘連蛋白，層粘連蛋白，纖維蛋白和蛋白 聚糖等。同時MTl-MMP還可以活化與腫瘤遷移和浸潤密切相關(guān)的MMP-2酶原和 MMP-13酶原。另外，MT1-MMP還涉及到許多細(xì)胞表面分子的裂解，如轉(zhuǎn)谷 氨酰胺酶，CD44在調(diào)控細(xì)胞外周蛋白，整和蛋白，低密度脂蛋白和L-聚糖等。
5MT1-MMP還可以介導(dǎo)細(xì)胞外的水解過程，調(diào)節(jié)細(xì)胞間的粘附和細(xì)胞的運動性， 使細(xì)胞能夠適應(yīng)不斷改變的組織微環(huán)境。MT1-MMP可以在哺乳動物中以活化形 式廣泛表達(dá)于細(xì)胞表面上，而酶原的活化卻可能是在細(xì)胞質(zhì)中完成的，然后再 運輸?shù)郊?xì)胞膜表面上的。
MT1-MMP對細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞表面粘附分子的水解在生命的許多正常生理 功能中(傷口愈合，骨骼的生長和重塑)和病理過程中(關(guān)節(jié)炎和癌癥)都發(fā) 揮著重要的作用。例如基因敲除MT1-MMP的小鼠模型中小鼠會表現(xiàn)為侏儒并且 在成年后就會發(fā)生死亡。正常情況下，MT1-MMP在組織中低表達(dá)，而在腫瘤組 織中MT1-MMP的表達(dá)均有不同程度的增加。在疾病方面，MT1-MMP在肺、結(jié) 腸、頭和頸部癌癥中表達(dá)。在不同類型的癌癥中MMP的過度表達(dá)是不同的，且 原發(fā)腫瘤與其轉(zhuǎn)移性癌中酶的表達(dá)也有差異。MT1-MMP在腫瘤中有過量的表 達(dá)，并且這種高表達(dá)同時又伴隨著腫瘤的高遷移，浸潤和轉(zhuǎn)移的增強，MT1-MMP 在腫瘤細(xì)胞從正常到具有遷移能力轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮著重要作用。MT1-MMP表達(dá) 調(diào)節(jié)主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，也可發(fā)生在mRNA穩(wěn)定性水平，以適應(yīng)腫瘤浸潤細(xì)胞 和腫瘤基質(zhì)細(xì)胞分泌的生長因子和細(xì)胞因子的需要。MT1-MMP涉及原發(fā)性腫瘤 生長和轉(zhuǎn)移性腫瘤的生成。在腫瘤遷移過程中，都涉及到MMP-2的高表達(dá)，而 MMP-2的活化又是由MT1-MMP來完成的。所以從促進(jìn)腫瘤遷移和活化腫瘤浸潤 相關(guān)酶等方面，MT1-MMP作為關(guān)鍵因子，在科研和臨床上都占據(jù)著重要位置。 例如在人類鱗屑癌細(xì)胞A431中，MT1-MMP就有很高量的表達(dá)而同時促進(jìn)了癌細(xì) 胞的浸潤能力。同樣的，對于人纖維肉瘤細(xì)胞HT1080，采用熱激法處理后， MT1-MMP的表達(dá)減少，進(jìn)而表現(xiàn)出HT1080細(xì)胞浸潤能力的下降。在對人卵巢 癌的臨床檢測中，通過對不同時期卵巢癌病人癌變組織的免疫組化染色顯示 MT1-MMP的表達(dá)量多少，關(guān)系到卵巢癌發(fā)展的階段，MT1-MMP表達(dá)量的增多，
6也就加劇了卵巢癌的惡化，同時也促進(jìn)了這種癌癥遷移和組織學(xué)上的進(jìn)一步惡 化。在人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤方面，通過對正常人腦和患病人腦的免疫組化染色比較 顯示，在正常人腦中MT1-MMP幾乎沒有表達(dá)，而在膠質(zhì)瘤病人的腦中檢測到了 大量MT1-MMP的表達(dá)。在黑色素瘤細(xì)胞中，通過對MTl-MMP的mRNA的 Northern blot研究發(fā)現(xiàn)MTl-MMP的mRNA的含量越高黑色素瘤的遷移能力越 強。然而，并不是所有的腫瘤細(xì)胞都表達(dá)MT1-MMP，如western檢測人乳腺癌細(xì) 胞MCF-7中就觀察不到MT1-MMP的表達(dá)。
如上所述，MT1-MMP在腫瘤中有較正常組織中高的表達(dá)，那么耙向 MT1-MMP的細(xì)胞投遞藥物就可以作為一種治療癌癥的方法。而MMPs之間的同 源性要求對MT1-MMP的親和要有很高選擇性。早期的關(guān)于診斷或標(biāo)記腫瘤的方 法主要集中于對抗體或其衍生物的研究，盡管這些試劑在腫瘤成像診斷上取得 些許成功，但是它們的缺點同樣限制了抗體類試劑在腫瘤診斷上的廣泛應(yīng)用 它們半衰期短或是容易產(chǎn)生免疫原性。因此找到新的標(biāo)記腫瘤分子勢在必行， 而多肽類物質(zhì)由于其出色的藥物代謝和低或無免疫原性可能成為優(yōu)秀的藥物、 藥物載體或腫瘤標(biāo)記物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
我們發(fā)明并證明了含有特定序列或基序的多肽對MT1-MMP的特異性高親和 作用。多肽的基序His-X-His (X為任意一種氨基酸)、His-Trp、 Arg-Ser是和 MT1-MMP產(chǎn)生結(jié)合作用的關(guān)鍵的氨基酸基序。含有這些特定序列或基序的一系 列多肽或蛋白可以與MT1 -MMP選擇性特異性結(jié)合并具有高親和力。本發(fā)明公布 了含有特定序列或基序的特異性高效親和膜I型基質(zhì)金屬蛋白酶(MT1-MMP) 的多肽、蛋白及其應(yīng)用。對這些多肽和蛋白的應(yīng)用包括應(yīng)用含有這些序列或 基序的多肽或蛋白在細(xì)胞水平或組織水平標(biāo)記MT1-MMP ，定量的檢測MT1-MMP表達(dá)；含有這些序列或基序的多肽或蛋白可以用來作為一種親和試劑 定量的檢査MT卜MMP的含量和活性；含有這些序列或基序的的多肽或蛋白可作 為一種靶向藥物的載體，應(yīng)用于包括癌癥在內(nèi)的疾病的耙向治療。
一方面，本發(fā)明涉及含有特定序列的特異性高效親和膜I型基質(zhì)金屬蛋白酶 (MT1-MMP)的多肽、蛋白及在特異性親和標(biāo)記MT1-MMP中的應(yīng)用；含有特 定基序的特異性高效親和膜I型基質(zhì)金屬蛋白酶(MT1-MMP)的多肽、蛋白在 特異性親和標(biāo)記MT1-MMP中的應(yīng)用，所述的特定MT1-MMP親和多肽、蛋白 含有的基序是His-X-His (X為任意一種氨基酸)，或His-Trp，或Arg-Ser，或 包含這些基序的組合。含特定多肽序列或氨基酸基序的MT1-MMP的親和多肽 或蛋白用于檢測MT1-MMP在細(xì)胞中的位置和含量；以岌在正?；蚣膊〗M織中 MT1-MMP的表達(dá)位置和含量。
另一方面，本發(fā)明還涉及含有特定序列或基序的特異性高效親和膜I型基質(zhì) 金屬蛋白酶(MT1-MMP)的多肽、蛋白及在MT1-MMP定量方面的應(yīng)用，所述 的特定MT1-MMP親和多肽、蛋白含有的基序是His-X-His (X為任意一種氨基 酸)，或His-Trp，或Arg-Ser，或包含這些基序的組合。MT1-MMP的定量是指 對MT1-MMP的濃度或活性的定量檢測。
第二，本發(fā)明還涉及含有特定序列或基序的特異性高效親和膜I型基質(zhì)金屬 蛋白酶(MT1-MMP)的多肽、蛋白作為藥物載體的應(yīng)用，所述的特定MT1-MMP 親和多肽、蛋白含有的基序是His-X-His (X為任意一種氨基酸)，或His-Trp， 或Arg-Ser,或包含這些基序的組合。
具體實施例方式
下列實施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但是并不是要將本發(fā)明限定為實施例。 我們合成了含有His-X-His (X為任意一種氨基酸)和His-Trp基序的一段氨基酸Biotin-His-Trp墨Lys陽His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe陽Leu，應(yīng)用于下列實施例。
實施例l. Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu對膜I型
基質(zhì)金屬蛋白酶有特異性選擇和高親和作用。
實驗步驟
用100-200^1 100嗎/ml的耙分子MT1-MMP, MMP-1， MMP-7， MMP-13, MMP-16, MMP-26和MMP-28 (溶于0.1 M pH 8.6 NaHC03中)包被ELISA板
的每個孔，每個待鑒定克隆一排包被孔。在密封的濕盒(如排有濕紙巾的封
口塑料盒)中4i:包被過夜。 甩出多余靶分子溶液，并倒置平板在紙巾上拍甩除去殘液。每孔加滿封阻液。
另外，每個待鑒定克隆的一排未包被孔也加入封阻液，以檢測所選序列對BSA 包被塑料板的結(jié)合力。在將多肽加入靶分子包被板前，還要再準(zhǔn)備一個微量滴 定板進(jìn)行多肽的系列稀釋，這個板也要封阻。單獨在另外一個封阻板中進(jìn)行稀 釋是為了避免稀釋過程中有多肽吸附到靶分子上。最后，所有封阻板4'C封阻 1-2 hrs。
甩出封阻液，用lxTBS〃ween洗板6次，每次均倒置平板在干凈紙巾上拍甩 去洗液，Tween濃度應(yīng)當(dāng)與淘選清洗步驟中所用濃度相同。
在單獨的封阻板中每孔預(yù)先加入200^1 TBS，稀釋各個不同多肽小肽到1/10 或1層。
用多通道移液器將每排稀釋好的多肽加入包被有靶分子的板中。室溫震蕩作 用l-2hrs。
用1 xTBSAXveen洗板6次。加入稀釋好的HRP標(biāo)記的親和素抗體，每孔加入100 pl，室溫震蕩作用1小時。
用lxTBS/Tween洗板6次。
每孔加200 nl底物溶液，室溫作用10-60 min。
每孔加入50 pl 1M H2S04終止反應(yīng)。
用讀板儀記錄450 nm處的吸光值。OD值的大小表示多肽與MMPs的結(jié) 合情況，OD值越大，多肽與MMP的結(jié)合力越強。
附圖
1 是 Biotin-His-Trp-Lys陽His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu 與 MT1-MMP， MMP-13， -16, -26結(jié)合能力圖。
附圖2是Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu與 MT1-MMP， MMP-1， -7， -28得結(jié)合能力圖。
結(jié)論測試Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu與多種 MT1-MMP同家族成員結(jié)合時，對MT1-MMP有很高的選擇性和高的親和力， 與其它MMPs結(jié)合性和選擇性很差。
實施例2. Biotin-His-Trp陽Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu對膜I型 基質(zhì)金屬蛋白酶(MT1-MMP)在酶學(xué)和細(xì)胞水平上沒有抑制作用。
實驗步驟
酶學(xué)上檢測Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu對 MT1-MMP的抑制實驗
我們所用的底物為DQ-Gelatin和P126;在室溫條件下測定，反應(yīng)總體積為 100ul。在加有抑制劑時，酶與抑制劑應(yīng)在緩沖液體系中孵育30分鐘，37°<:然后 再加底物測定。所有檢測的儀器為FLX800熒光酶標(biāo)儀(Bio-Tek)，對于DQ-Gelatin
10激發(fā)波長495nm，發(fā)射波長515nm，而對于P126,激發(fā)波長328nm,發(fā)射波長 393nm。測定反應(yīng)時間為8分鐘，取熒光值的點所組成的線的斜率為速度，其中
未加抑制劑的記為Vo，加抑制劑的為Vi,以Vi/Vo表示抑制劑的抑制程度；然后 以所加抑制劑的濃度為橫坐標(biāo)，以Vj/Vo的值為縱坐標(biāo)，做出相應(yīng)曲線；在V/Vo
為0.5處所對應(yīng)的抑制劑的濃度為IC50。
在此，我們所用的底物DQ-Gelatin和P126均為熒光底物，其原理為一段MMP 切割的小肽兩端連有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。隨著MMP將其降解，熒光基團(tuán)和淬 滅基團(tuán)分離，從而發(fā)出熒光，并且在一定范圍內(nèi)，熒光密度的增強速度與酶反 應(yīng)速度稱正比關(guān)系，故可用熒光的增加速度來代表酶活性。
Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu對MTl-MMP的抑制 效果抑制都在20%以下，可以說對MT1-MMP的影響很小。
附圖3是Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu對 MT1-MMP的抑制能力圖。
結(jié)論Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu在酶學(xué)水平上對 MT1-MMP的抑制作用很弱。
實施例3.細(xì)胞水平上Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe^Leu 對幾種MT1-MMP表達(dá)量不同的細(xì)胞的標(biāo)記
實驗步驟
取出培養(yǎng)至80。/。左右的細(xì)胞，用胰酶消化下來，加入5ml培養(yǎng)基，反復(fù)吹打 細(xì)胞液，將細(xì)胞吹成單個細(xì)胞，取200ul細(xì)胞懸液滴至滅菌后的蓋玻片上，37°C 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。
PBS清洗蓋玻片三次后，加入DMEM/FBS，孵育30mins。室溫下加入Biotin-His-Trp-Lys陽His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu, 4。C孵
育過夜。
PBS洗滌二次，加入FITC-Avidin，避光孵育30min PBS洗滌二次，95%乙醇后固定，甘油封片。 熒光顯微鏡下觀察
附圖4是B iotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu對三種表
達(dá)不同量MT1-MMP的細(xì)胞的標(biāo)記圖。
其中HT1080人纖維肉瘤細(xì)胞高表達(dá)MT1-MMP， A549非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中度 表達(dá)MT-MMP, MCF-7人乳腺癌細(xì)胞不表達(dá)MT-MMP。柱形圖代表三種細(xì)胞上
的熒光強度。
附圖5是B iotin陽His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu對三種表
達(dá)不同量MT1-MMP的細(xì)胞的熒光標(biāo)記圖的量化柱形圖。
結(jié)論在高表達(dá)MT1-MMP的HT1080人纖維肉瘤細(xì)胞中，中度表達(dá)MT卜MMP 的A549非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，不表達(dá)MT1-MMP的MCF-7人乳腺癌細(xì)胞中 Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu可特異性的定量化標(biāo)記 MT1-MMP。
實施例4.熒光素異硫氰酸呱FITC標(biāo)記的肽段在標(biāo)記不同表達(dá)量MT1-MMP 方面的應(yīng)用
實驗步驟
采用同相合成法合成His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu將肽 從樹脂上切下之前，根據(jù)欲標(biāo)記的多肽總量，按每毫克蛋白加0.01mg熒光素， 用分析天平準(zhǔn)確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末。
12結(jié)合(或稱標(biāo)記)邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入蛋白溶液中，避免將熒 光素粘于二角燒瓶壁或攪拌玻棒上(大約5 10min內(nèi)加完)，加畢后，繼續(xù)攪拌 12 18h。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4'C左右，故須及時添冰去水；可將結(jié)合
裝置安放在4r冰箱或冰庫中。
透析結(jié)合完畢后，將蛋白的溶液離心(2500r/min) 20min，除去其中少量之沉 淀物，裝入透析袋中后再置于燒杯中，用pH8.0緩沖鹽水透析(0 4°C)過夜。 純化:HPLC純化熒光標(biāo)記的多肽。 .
利用FITC-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu標(biāo)記細(xì)胞中 MTl-MMP的實驗步驟如利用Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu標(biāo)記細(xì)胞中MT1 -MMP—致。
結(jié)論利用FITC-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu可以用于標(biāo)記 細(xì)胞中MT1-MMP。
實施例5.利用花青素Cy5FITC標(biāo)記的肽段在標(biāo)記不同表達(dá)量MTl-MMP方面
的應(yīng)用
實驗步驟
固相合成法合成His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu后，切割下 來溶于50mM Tris一HCl， pH 7.4中與1.4倍摩爾濃度過量的溶于DMSO中的Cy5 亞胺混合，孵育20分鐘后，采用分子篩純化。
用Cy5-His-Trp-Lys-His-Leu陽His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu標(biāo)記細(xì)胞中 MTl-MMP的實驗步驟如利用Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu標(biāo)記細(xì)胞中MT1 -MMP—致。
結(jié)論利用Cy5-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu可以用于標(biāo)記細(xì)胞中MT1-MMP。
實施例6.利用Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu檢測MT1-MMP的濃度
實驗步驟
用100-200 nl 100嗎/ml的靶分子(溶于0.1 M pH 8.6 NaHC03中)Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu包被ELISA板的每個孔，每個待鑒定克隆一排包被孔。在密封的濕盒(如排有濕紙巾的封口塑料盒)中4'C包被過夜。
甩出多余靶分子溶液，并倒置平板在紙巾上拍甩除去殘液。每孔加滿封阻液。
甩出封阻液，用lxTBS/Tween洗板6次，每次均倒置平板在干凈紙巾上拍甩去洗液，Tween濃度應(yīng)當(dāng)與淘選清洗步驟中所用濃度相同。
用多通道移液器將每排稀釋好的已知濃度的MT1-MMP加入包被有耙分子Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu的板中。室溫震蕩作用1-2 hrs。
用lxTBS汀ween洗板6次。
加入稀釋好的HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗，每孔加入100pl，室溫震蕩作用l小時。
用1 x丁BSATween洗板6次。
每孔加200 ^底物溶液，室溫作用10-60 min。
每孔加入50 pi 1M H2S04終止反應(yīng)。
用讀板儀記錄450 nm處的吸光值。以O(shè)D值和MT1-MMP做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)要測定某 一 未知濃度的MT1-MMP 時，單獨以Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu包被兩個復(fù)孔，力Q入待測樣品，其他步驟與測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟一致，顯色測定OD450后，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上可以確定MT1-MMP的濃度。
附圖6是Biotiti-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu對不同量MT1-MMP的濃度測定圖。
我們有包被了另一個己知濃度的MT1-MMP來驗證標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性，結(jié)果表明MT1-MMP濃度為0.045uM時，它的OD450為0.022 ，這與我們制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線相符。
結(jié)論利用含有親和MT1-MMP的親和基序得小肽，可以用于親和測定MT1-MMP的濃度。
實施例7.以His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe^Leu為載體連接具有放射性治療性的mI，在對腫瘤成像診斷及治療方面的應(yīng)用
實驗步驟
放射性標(biāo)記多肽的合成我們采用氯胺-T法在N —末端達(dá)到連接放射同位素'3'1的R的。Fmoc法固相合成His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu后，從樹脂上切割下來純化前在連接mI，用SephdexG-25柱純化后，質(zhì)譜檢測
分子量。
動物模型的構(gòu)建采用35只體重在237g左右的昆明小鼠做為實驗對象檢測合成的1311標(biāo)記的親和多肽在腫瘤成像和治療方面的應(yīng)用。無菌條件下，取HT1080黑色素瘤細(xì)胞懸液0. 5ml(l(^細(xì)胞)，注射至昆明純系小鼠右前肢腋下,定期觀察瘤組織生長與荷瘤小鼠狀況，10天后，待腫瘤直徑至500mm左右，供體內(nèi)實驗用。
成像過程及對腫瘤殺傷效果分析輕微麻醉后，鼠尾靜脈注射50-100uCi的
15標(biāo)記后多肽。成像前，每只小鼠按13mg/mg喂食甲苯噻嗪鎮(zhèn)痛小鼠。在注射標(biāo)記多肽后的1至2小時后，對小鼠全身利用gamma射線相機拍攝小鼠全身，之后在注射標(biāo)記的多肽后每隔一天，三天，五天和六天后分別對小鼠拍照，分析mI標(biāo)記的親和多肽在體內(nèi)分布及腫瘤大小的變化。結(jié)論'311標(biāo)記的親和多肽可以用在腫瘤成像方面和殺死腫瘤細(xì)胞方面。本發(fā)明所涉及的氨基酸序列
序列號MT1-MMP特異性高效親和多肽的氨基酸序列
1His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu
2Ala-Ser-Ala-Lys-Met-Pro-His-Leu-His-His-Arg-Ser
3His-Tyr-Ala-His-Asn-His-Ala-Arg-Leu-His陽phe-Arg
4His-Met-Leu-Ser隱Arg-His-Asp-His-Ser-Tyr-Ser-Leu
His-Gly-Lys-Tyr-Leu-Gly-Ala-His-Leu-His-Lys-Tyr
6Lys-His-Met-His-Trp-His-Pro-Pro-Ala-Leu-Asn-Thr
Val-Ser-Arg-His-Gln-Ser-Trp-His-Pro-His-Asp-leu
8Leu-His-Lys-His-His墨Ser-Asn-Pro-Val-Phe-Ser-Asp
9Ala-His-Ile-His-Trp-Lys-Pro-Arg-Pro-Pro-Pro-Leu
10Leu-Pro-Gly-His-Arg-His-Pro-His-His-Pro-Pro-Pro
11His-Gly-Lys-His-Ser-His-Thr-Ile-Pro-Asn-Arg-Tyr
12Ser-His-His-His-His-His-Thr-Ser-Ser-Gly-Ser-Ser
13Gly-His-Arg-His-Ile-His-His-Ala-Lys-Leu陽Asn-Thr
14Ser-Pro-His-His-His-Ala-Asn-Pro-Pro-Pro-Arg-Ser
15Ser-Gln-Ser陽His-Ser-His-Gly-Ala-Val-Gly-Ser-Arg
16Ala-Leu-Arg-His-His-Ser-His-Thr-Gly-Leu-Ser-Met
17His-Ser-Gly-Asn-His-Ser-Lys-Ser-His-Pro-Gln-Arg
權(quán)利要求
1. 含有特定序列的特異性高效親和膜I型基質(zhì)金屬蛋白酶(MT1-MMP)的多肽、蛋白及其應(yīng)用；含有特定基序的特異性高效親和膜I型基質(zhì)金屬蛋白酶(MT1-MMP)的多肽、蛋白及其應(yīng)用，所述的特定MT1-MMP親和多肽、蛋白含有的基序是His-X-His(X為任意一種氨基酸)，或His-Trp，或Arg-Ser，或包含這些基序的組合。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中含有特定序列或基序的特異性親 和MTl-MMP的多肽或蛋白被用于檢測MTl-MMP在細(xì)胞以及正 ?；蚣膊〗M織中表達(dá)的位置和含量。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中含有特定序列或基序的特異性親 和MTl-MMP的多肽或蛋白經(jīng)過化學(xué)修飾后，如生物素化，連接 FITC或其它可用于分子標(biāo)記的發(fā)光基團(tuán)，在體內(nèi)或體外對 MTl-MMP在細(xì)胞以及正?；蚣膊〗M織水平上的標(biāo)記。
4. 含有特定序列的特異性高效親和膜I型基質(zhì)金屬蛋白酶(MTl-MMP)的多肽、蛋白作為檢測MTl-MMP含量的定量試劑 方面的應(yīng)用；含有特定基序的特異性親和MTl-MMP的多肽或蛋 白作為檢測MTl-MMP含量的定量試劑方面的應(yīng)用，所述的特定 MTl-MMP親和多肽、蛋白含有的基序是His-X-His (X為任意一 種氨基酸)，或His-Trp，或Arg-Ser，或包含這些基序的組合。
5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中含有特定序列或基序的特異性親 和MTl-MMP的多肽或蛋白作為檢測MTl-MMP含量的定量試劑 方面的應(yīng)用是作為檢測MTl-MMP活性和濃度方面的應(yīng)用。
6. 含有特定序列的特異性親和MT1-MMP的多肽或蛋白作為特異性親和MT1-MMP的藥物載體中的應(yīng)用；含有特定基序的特異性親和MTl-MMP的多肽或蛋白作為特異性親和MTl-MMP的藥物載體中的應(yīng)用，所述的特定MTl-MMP親和多肽、蛋白含有的基序是His-X-His (X為任意一種氨基酸)，或His-Trp，或Arg-Ser，或包含這些基序的組合。
7. 如權(quán)利要求6中所述的應(yīng)用，其中含有特定序列或基序的特異性親和MTl-MMP的多肽或蛋白作為藥物載體可經(jīng)過化學(xué)修飾連接各種放射性同位素、化合物或藥物。
8. 如權(quán)利要求7中所述的應(yīng)用，其中含有特定序列或基序的特異性親和MTl-MMP的多肽或蛋白作為藥物載體所連接的基團(tuán)或化合物是對MTl-MMP活性有抑制作用，或?qū)δ鼙磉_(dá)MTl-MMP的細(xì)胞或腫瘤有抑制或毒性作用，或是其它對表達(dá)MTl-MMP的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞有抑制或毒性的基團(tuán)或化合物。
9. 如權(quán)利要求1至8中所述的任何一項應(yīng)用，其中含有特定序列的特異性親和MTl-MMP的多肽、蛋白所含的序列是His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu;Ala-Ser-Ala-Lys-Met-Pro-His-Leu-His-His-Arg-Ser;His-Tyr-Ala-His-Asn-His-Ala-Arg-Leu-His-phe-Arg;His-Met-Leu-Ser-Arg-His-Asp-His-Ser-Tyr-Ser-Leu;His-Gly-Lys-Tyr-Leu-Gly-Ala-His-Leu-His-Lys-Tyr;Lys-His-Met-His-Trp-His-Pro-Pro-Ala-Leu-Asn-Thr;<formula>formula see original document page 4</formula>
全文摘要
本發(fā)明公開了特異性高效親和膜I型基質(zhì)金屬蛋白酶(MT1-MMP)的多肽序列；同時公開了特異性高效親和膜I型基質(zhì)金屬蛋白酶的多肽含有的基序。含有特異性高效親和膜I型基質(zhì)金屬蛋白酶(MT1-MMP)的多肽序列或基序的多肽或蛋白可以經(jīng)過化學(xué)修飾直接或間接連接發(fā)光基團(tuán)，用來特異性高親和的標(biāo)記MT1-MMP或表達(dá)MT1-MMP的細(xì)胞或組織。同時，含有特異性高效親和膜I型基質(zhì)金屬蛋白酶(MT1-MMP)的多肽序列或基序的多肽或蛋白可以用于MT1-MMP分子的定量檢測。此外，含特異性高效親和膜I型基質(zhì)金屬蛋白酶(MT1-MMP)的多肽序列或基序的多肽或蛋白還可以作為靶向藥物的載體，應(yīng)用于MT1-MMP過度表達(dá)的疾病的治療。
文檔編號A61K47/42GK101497878SQ20081005035
公開日2009年8月5日 申請日期2008年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月30日
發(fā)明者房學(xué)迅, 雷 朱, 惟 李, 王麗萍, 王會玲 申請人:房學(xué)迅