專利名稱：植物磷饑餓誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子OsPTF1的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種植物磷饑餓誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子OsPTF1。本發(fā)明涉及水稻OsPTF1的cDNA序列，該cDNA編碼的蛋白屬于bHLH家族類轉(zhuǎn)錄因子。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，及這些多聚核苷酸和多肽的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
磷作為植物營(yíng)養(yǎng)的必需元素，在其生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要的功能。磷既是植物體內(nèi)許多重要有機(jī)化合物的組成成分，在結(jié)構(gòu)和生理上起著重要作用，同時(shí)又以多種方式參與植物體內(nèi)的各種生理代謝過程，對(duì)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和新陳代謝，以及作物的早熟、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)都起著重要的作用。但土壤缺磷是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中普遍存在的限制因素。全世界130億公頃的土壤中，有18％是酸性土壤，25％是堿性的石灰性土壤。這兩種土壤對(duì)磷都有固定作用，都屬于缺磷性土壤。這種缺磷的現(xiàn)狀通常只能通過施用磷肥來解決。但由于磷肥施入土壤后很快就被堿性土壤中的鈣鹽和酸性土壤中的鐵和鋁的氫氧化物所固定或被土壤膠體吸附，從而轉(zhuǎn)化為不能為植物所吸收利用的固定態(tài)。再加之磷主要通過擴(kuò)散作用到達(dá)根表，而磷的擴(kuò)散系數(shù)又很低，所以施用磷肥的效率一般不超過10％。
長(zhǎng)期生長(zhǎng)在低磷脅迫的環(huán)境條件下，高等植物會(huì)形成一些耐低磷脅迫的適應(yīng)性形態(tài)及生理生化機(jī)制等自我拯救系統(tǒng)，以提高植物在缺磷條件下對(duì)磷素的吸收和利用。另外，人們通過對(duì)植物耐低磷脅迫能力的基因型差異比較研究發(fā)現(xiàn)，植物無論在種間、亞種間還是品系間都存在顯著的基因型差異，主要表現(xiàn)在植物對(duì)磷的吸收能力、利用效率及對(duì)磷的依賴程度等方面。這種植物耐低磷脅迫能力的基因型差異是我們對(duì)植物進(jìn)行遺傳基因改良的前提。通過獲得參與或調(diào)控磷吸收能力、利用效率的基因，進(jìn)行改造利用，對(duì)于提高植物耐低磷能力都有很高的價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種分離出的DNA分子，它編碼一個(gè)bHLH類轉(zhuǎn)錄因子。
本發(fā)明的目的之二是提供一種分離出的蛋白質(zhì)，該蛋白屬于bHLH類轉(zhuǎn)錄因子。
本發(fā)明的目的之三是提供一種利用分離出的DNA分子或蛋白對(duì)植物或細(xì)胞進(jìn)行改造，從而提高植物或細(xì)胞對(duì)磷饑餓耐受能力的方法。
本發(fā)明還提供了這種分離出的DNA及蛋白的應(yīng)用。
本發(fā)明第一方面是提供一種分離出的DNA分子，它包含SEQ ID NO1的1862位堿基的核酸，該核酸編碼一個(gè)水稻根系磷饑餓誘導(dǎo)增強(qiáng)表達(dá)的bHLH類轉(zhuǎn)錄因子。
本發(fā)明第二方面是提供一種分離出的蛋白質(zhì)及其等價(jià)蛋白，它具有SEQ IDNO2所示的氨基酸序列，或者與其氨基酸序列至少60％同源的或與其第313-376位氨基酸殘基至少有60％的相同性的分離的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明第三方面是提供一種分離出的DNA分子，編碼權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)的核酸。
本發(fā)明還提供了利用權(quán)利要求2和3的蛋白質(zhì)和核酸獲得耐磷饑餓的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞的方法。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，利用本發(fā)明提供的基因和技術(shù)方法可以提高植物或其細(xì)胞的耐磷饑餓能力。例如，利用過表達(dá)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)化作物如水稻、小麥等，通過提高其耐磷饑餓能力，可達(dá)到在不影響產(chǎn)量的前提情況下減少磷肥的施加，從而降低糧食生產(chǎn)成本。


圖1是OsPTF1基因的半定量RT-PCR圖；圖2是OsPTF1的DNA結(jié)合分析圖；圖3是OsPTF1-GFP洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)核定位分析圖；圖4是OsPTF1的轉(zhuǎn)錄激活分析圖；圖5是增強(qiáng)表達(dá)OsPTF1轉(zhuǎn)基因擬南芥及野生型擬南芥在缺磷情況下的表型圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明闡述了一種新的水稻轉(zhuǎn)錄因子OsPTF1，它屬于basicHelix-Loop-Helix(bHLH)家族成員，該家族都含有bHLH這個(gè)結(jié)構(gòu)域，具有該結(jié)構(gòu)域的蛋白主要通過形成二聚體或異源二聚體與DNA序列結(jié)合從而調(diào)控基因的表達(dá)。此基因最初通過構(gòu)建水稻耐低磷品種Kasalath磷饑餓下的抑制性扣除雜交文庫篩選得到的。半定量RT-PCR分析顯示OsPTF1在水稻根系為磷饑餓誘導(dǎo)增強(qiáng)表達(dá)，而在葉片中為組成型表達(dá)。
OsPTF1的bHLH結(jié)構(gòu)域位于蛋白序列中部。通過重組OsPTF1-6His蛋白的體外DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究，表明該蛋白可特異性的結(jié)合E-box序列(CANNTG)。酵母雙雜交分析顯示該蛋白的氨基端與GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合能激活轉(zhuǎn)錄，表明該蛋白的氨基端具有轉(zhuǎn)錄激活功能。利用洋蔥表皮細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的OsPTF1∷smGFP4融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，表明該蛋白為核定位蛋白。這些數(shù)據(jù)表明OsPTF1為一水稻根系磷饑餓誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。
在構(gòu)建了水稻品種Kasalath磷饑餓4天的抑制性差異扣除雜交cDNA文庫后，通過利用扣除探針進(jìn)行篩選，獲得一個(gè)在水稻根系磷饑餓誘導(dǎo)增強(qiáng)表達(dá)的克隆，根據(jù)該克隆的序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)，獲得該克隆的全長(zhǎng)cDNA(SEQ ID No1)，我們命名為OsPTF1，該cDNA編碼478個(gè)氨基酸(SEQID No2)。與GeneBank相對(duì)照探查此推定的蛋白質(zhì)序列。BLAST探查表明OsPTF1是一種新的蛋白質(zhì)。此蛋白質(zhì)的中部靠近-COOH末端發(fā)現(xiàn)含有bHLH結(jié)構(gòu)域。由OsPTF1編碼的蛋白質(zhì)的剩余部分與任何已知序列無高度同源。OsPTF1的基因組結(jié)構(gòu)通過對(duì)比基因組序列與cDNA序列而分析。OsPTF1基因位于水稻染色體6上，它有8個(gè)外顯子。進(jìn)行結(jié)構(gòu)域探查而鑒別了OsPTF1的bHLH結(jié)構(gòu)域內(nèi)推定的二分核定位信號(hào)，此信號(hào)序列位于313-327位氨基酸之間。
為研究OsPTF1基因在植物磷饑餓脅迫下的作用，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性擴(kuò)增該基因cDNA序列的引物進(jìn)行半定量RT-PCR分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因在根中為磷饑餓誘導(dǎo)增強(qiáng)表達(dá)，而在葉中為組成型表達(dá)(圖1)。
如果bHLH類蛋白作為一類轉(zhuǎn)錄因子起作用，通常具有與E-box序列(CANNTG)的結(jié)合特性。為測(cè)試OsPTF1蛋白是否能特異性結(jié)合E-box序列，首先將寡聚的E-box雙鏈用32P末端標(biāo)記作為探針。同時(shí)將OsPTF1克隆入6×His融合載體pET-29b中并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中。純化重組6×His∷OsPTF1融合蛋白進(jìn)行分析以測(cè)試與DNA的特異結(jié)合，如圖2所示。OsPTF1蛋白能與E-box序列特異性結(jié)合，且該蛋白能特異性的結(jié)合CATGTG的E-box序列。
由于結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)OsPTF1具有一個(gè)二分核定位信號(hào)，表明OsPTF1可能為核定位蛋白。故將OsPTF1按通讀框架構(gòu)建到smGFP4表達(dá)載體內(nèi)，使之能表達(dá)一個(gè)OsPTF1∷smGFP4融合蛋白。提取該融合表達(dá)載體質(zhì)粒及未改造的smGFP4質(zhì)粒，用金粉分別包裹，進(jìn)行基因槍轟擊洋蔥表皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。轟擊后于暗環(huán)境下培養(yǎng)1天后，用激光共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，smGFP蛋白表達(dá)后較均勻的分布于整個(gè)洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)，而OsPTF1∷smGFP4融合蛋白則特異性的分布于核內(nèi)(圖3)。
為了檢測(cè)的OsPTF1激活結(jié)構(gòu)域，我們采用了CLONTECH公司的Matchmaker酵母雙雜交系統(tǒng)3。通過將OsPTF1構(gòu)建到含有GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的載體pGBKT7中，同時(shí)，依據(jù)bHLH結(jié)構(gòu)域所在位置將其分為P1、P2和P3三段后分別構(gòu)建到pGBKT7中，把這四個(gè)載體轉(zhuǎn)化到酵母AH109菌株內(nèi)，每種轉(zhuǎn)化子都分別在SD/-Trp和SD/-Trp/-Ade/-His的營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化有全長(zhǎng)的OsPTF1及P1段載體的酵母菌株能在SD/-Trp/-Ade/-His的營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，表明OsPTF1的激活結(jié)構(gòu)域位于N-基端(圖3)。
將由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的完整OsPTF1的編碼cDNA(SEQ ID NO1)克隆到雙元植物轉(zhuǎn)基因載體pCAMBIA1301中。通過真空浸泡方法轉(zhuǎn)化入Arabidopsisthaliana columbia生態(tài)型中。過表達(dá)轉(zhuǎn)基因品系選自含有潮霉素的培養(yǎng)基。挑選兩個(gè)純合的轉(zhuǎn)基因品系及未轉(zhuǎn)基因的野生型進(jìn)行磷饑餓實(shí)驗(yàn)。種子春化后種在1/10MS培養(yǎng)基(1mM P)上，正常培養(yǎng)15天后移栽到無磷的1/2MS培養(yǎng)基上。缺磷培養(yǎng)5天后，野生型便出現(xiàn)了缺磷的典型癥狀，葉片花色素苷沉積，而轉(zhuǎn)基因株系無此現(xiàn)象。繼續(xù)處理25天后，轉(zhuǎn)基因株系都開花結(jié)實(shí)了，而野生型已死亡。這表明過表達(dá)OsPTF1的轉(zhuǎn)基因品種比野生型具有更高的耐低磷脅迫能力。另外，將野生型和轉(zhuǎn)基因植株用MS液體培養(yǎng)基進(jìn)行液體培養(yǎng)，正常培養(yǎng)7天后，移入無磷的MS液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)5天后，野生型的植株要明顯小于轉(zhuǎn)基因植株(圖5)。
由這些結(jié)果表明，我們克隆的水稻OsPTF1基因具有很高的應(yīng)用價(jià)值。我們可以通過利用該基因?qū)Σ荒偷土椎淖魑锲贩N進(jìn)行轉(zhuǎn)基因改造，如通過外源導(dǎo)入過表達(dá)OsPTF1基因來提高作物耐低磷脅迫能力，從而減少對(duì)農(nóng)作物磷肥的施加量。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例1，水稻抑制性扣除雜交文庫的構(gòu)建水稻Kasalath品種于37℃浸種催芽后播種到黃沙缽中，7天后移栽到溶液培養(yǎng)(溶液培養(yǎng)配方為國(guó)際水稻所標(biāo)準(zhǔn)配方)。等苗培養(yǎng)到三葉期后開始分組處理，一組正常培養(yǎng)，一組磷饑餓培養(yǎng)。培養(yǎng)4天后取材，分別取根系材料用Gibco公司的Trizol提取總RNA。用Qiagen公司的Oligotex mRNA Mini Kit提取250g總RNA中的mRNA，兩份材料的mRNA各取1g用于cDNA合成，cDNA合成采用Clontech公司的SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit。取正常培養(yǎng)根組織的cDNA作為Driver，饑餓處理材料的cDNA作為Tester。采用Clontech公司的PCR-Select cDNA Subtraction Kit進(jìn)行扣除雜交，最終產(chǎn)物用該公司的PCRCloning Kit進(jìn)行克隆，并轉(zhuǎn)化TOP10F’大腸桿菌菌株。挑選轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)保菌。實(shí)施例2，水稻OsPTF1的cDNA序列的克隆和測(cè)定用構(gòu)建抑制性扣除雜交文庫的cDNA材料，采用PCR-Select DifferentialScreening試劑盒篩選抑制性扣除雜交文庫，獲得OsPTF1基因片段克隆。對(duì)該克隆測(cè)序，并設(shè)計(jì)引物用于快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)。引物1ATTTCACAAGGGCCAACAGACAT，用于3‘端RACE擴(kuò)增，引物2CCCCCATATTTTTCCGATTTC，用于5‘端RACE擴(kuò)增。RACE擴(kuò)增采用Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit。PCR產(chǎn)物采用Clontech公司的PCRCloning Kit克隆于pT-Adv載體，轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長(zhǎng)cDNA序列，共1862bp。詳細(xì)序列見SEQ ID No.1，其中開放閱讀框位于67-1503位核苷酸。根據(jù)得到的全長(zhǎng)cDNA序列推導(dǎo)出OsPTF1的氨基酸序列，共478個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID No.2。實(shí)施例3，OsPTF1的半定量RT-PCR正常培養(yǎng)到三葉期的水稻Kasalath品種開始磷饑餓脅迫，處理方式與構(gòu)建抑制性扣除雜交文庫過程一致。脅迫4天后，分別取正常苗的根、葉及饑餓處理的苗的根、葉材料。用Gibco公司的Trizol試劑分別提取總RNA。4份材料各取5g總RNA用于逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄過程如下在1.5μl的離心管中加入5μg的RNA，1μl Oilgo(dT)15(Promega公司)，加無RNA酶水至8μl，在70℃水浴變性5分鐘，冰上冷卻5分鐘，稍離心后加入4μl 5×First Strand Buffer(Invitrogen公司)、2μl 0.1DTT(Invitrogen公司)、4μl 2.5mMdNTPs(Takara公司)、1μl Rasin(40unit/l)(Promega公司)及1μl SuperScript RTII(Invitrogen公司)，用槍混勻，42℃空氣浴1小時(shí)，70℃15分鐘，終止反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于PCR擴(kuò)增。分別采用OsPTF1的特異性引物(引物3TAGCGTGCTATCATGGACTAC，引物4TTTCTGCAGCCGTTGAGTT)，及肌動(dòng)蛋白的特異性引物(引物5GGAACTGGTATGGTCAAGGC，引物6AGTCTCATGGATACCCGCAG)。擴(kuò)增體系為在50l的反應(yīng)體積中含有50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200mol/L dNTP，10pmol引物，0.5U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司)。擴(kuò)增條件為OsPTF1 94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃90秒作33個(gè)循環(huán)； 肌動(dòng)蛋白94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃90秒作28個(gè)循環(huán)。等量的PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)。實(shí)施例4，OsPTF1原核蛋白表達(dá)及其DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)利用引物7GCTGAATTCGATGGACTACTCCGCTGGTTCCT、引物8TGTGTCGACTTTTTCAGGAGGGATTGCAGCAG擴(kuò)增含OsPTF1編碼框架的cDNA，用EcoRI/SalI雙酶切PCR產(chǎn)物，并將其克隆到EcoRI/SalI雙酶切過的pET-29b載體(Promega公司)。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中。轉(zhuǎn)化體生長(zhǎng)至OD600為0.6-0.9，然后通過加入IPTG至1mM進(jìn)行誘導(dǎo)，并在30℃表達(dá)融合蛋白5小時(shí)。收獲菌體后，用Qiagen公司的Ni-NTA agrose純化重組蛋白，按其試劑說明書中重組蛋白的活性分離方法。分離的重組蛋白用于DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)。取1g的重組蛋白與10ng32P標(biāo)記的寡聚核苷酸于15.0mM Tris，pH8.0，65.0mM NaCl，7.5％甘油，1.25mM DTT，1.8mM EDTA及100ng PolyIPolyC的溶液中室溫溫浴30分鐘，上樣于4％的聚丙烯酰氨凝膠中，于4℃按15伏/厘米的電壓電泳2小時(shí)。電泳完取出凝膠干膠后壓X-光片，結(jié)果如圖2所示。泳道1，32P標(biāo)記的寡核苷酸雙鏈(ATATNNNNCANNTGNNNNATAT)；泳道2，32P標(biāo)記的寡核苷酸雙鏈(ATATNNNNCANNTGNNNNATAT)加OsPTF1-6His蛋白；泳道3，32P標(biāo)記的寡核苷酸雙鏈(ATATNNNNCAATTGNNNNATAT)加OsPTF1-6His蛋白；泳道4，32P標(biāo)記的寡核苷酸雙鏈(ATATNNNNCATGTGNNNNATAT)加OsPTF1-6His蛋白。實(shí)施例5，OsPTF1的自激活結(jié)構(gòu)域分析采用Clontech公司的MATCHMAKER Library Construction & Screening Kit進(jìn)行OsPTF1的自激活結(jié)構(gòu)域分析。依據(jù)OsPTF1的bHLH結(jié)構(gòu)域所在位置將其編碼區(qū)分為三段如圖3A。P1段是將實(shí)施例4中構(gòu)建好的原核表達(dá)載體用NcoI/PstI切出的片段構(gòu)建到相應(yīng)酶切過的PGBKT7(BD)載體中，而P2、P3是以引物9(GCTGAA TCC GCC ACC ACT TCC TTC AAA GAT)和引物10(TGT GTC GAC TCA AAC CGAGTG CCA TAG TAA)、引物11(GCT GAA TCC CCT GGA GCA GTT CTT CCC CTT)和引物12(TGT GTC GAC TTT GAC GAG GGA TTA CAG CAG)分別做PCR，PCR產(chǎn)物和PGBKT7(BD)載體分別用EcoRI/SalI進(jìn)行雙酶切，分別將酶切后的P2、P3和PGBKT7載體連接，轉(zhuǎn)化。把這三個(gè)構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化到酵母菌株AH109內(nèi)，每種轉(zhuǎn)化子都分別在色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型(SD/-Trp)和色氨酸、組氨酸、腺嘌呤營(yíng)養(yǎng)缺陷型(SD/-Trp/-Ade/-His)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(如圖3)。結(jié)果含P1-BD的轉(zhuǎn)化子能在SD/-Trp/-Ade/-His培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而含P2-BD、P3-BD的轉(zhuǎn)化子不能在SD/-Trp/-Ade/-His培養(yǎng)基生長(zhǎng)。這說明P1-BD有自激活能力，而P2-BD、P3-BD沒有，所以O(shè)sPTF1的激活域位于P1段即氨基端。實(shí)施例6，OsPTF1的核定位實(shí)驗(yàn)包含有OsPTF1全長(zhǎng)編碼框架的cDNA按閱讀框架克隆到smGFP4質(zhì)粒載體的啟始密碼子ATG前，提取構(gòu)建好的質(zhì)粒及smGFP4質(zhì)粒各2g用金粉包裹，用Bio-rad公司的PDS-1000/He型基因槍進(jìn)行轟擊，采用1100psi的氦壓轟擊洋蔥表皮。轟擊后于暗培養(yǎng)1天后，用激光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果如圖4。圖4A為smGFP4質(zhì)粒轟擊結(jié)果，4B為OsPTF1-smGFP4質(zhì)粒結(jié)果。實(shí)施例7，轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建及植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建好CaMV 35S啟動(dòng)子(一類強(qiáng)表達(dá)的組成型啟動(dòng)子)驅(qū)動(dòng)的OsPTF1元件后再加上NOS終止子，將其亞克隆入pCAMBIA1301中。構(gòu)建好的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中。再采用真空浸潤(rùn)轉(zhuǎn)化法對(duì)擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)基因(Bechtold等，1993，CR Acad Sci 3161194)。實(shí)施例8，植物培養(yǎng)條件和方法擬南芥種子用雙蒸水浸泡30分鐘后用95％乙醇浸泡5分鐘，再用20％次氯酸鈉漂白7分鐘，最后用雙蒸水洗滌5次。種子于4℃春化處理48小時(shí)。處理好的種子于1/10MS(1mM P)上培養(yǎng)15天后移栽到無磷的1/2MS培養(yǎng)基上，并進(jìn)行觀察。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)磷饑餓癥狀要遲于野生型，缺磷培養(yǎng)5天后，野生型便出現(xiàn)了缺磷的典型癥狀，葉片花色素苷沉積，而轉(zhuǎn)基因株系無此現(xiàn)象。繼續(xù)處理25天后，盡管轉(zhuǎn)基因植株也出現(xiàn)了花色素苷沉積，但轉(zhuǎn)基因株系都能正常開花結(jié)實(shí)了，而野生型已死亡；另處理好的種子各取30棵用MS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，于25℃100rpm光照培養(yǎng)7天后，再轉(zhuǎn)到無磷的液體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5天。圖5為此時(shí)植物生長(zhǎng)情況圖，A為正常培養(yǎng)時(shí)的情況，野生型(左)和轉(zhuǎn)基因(右)植株生長(zhǎng)基本一致。B為饑餓培養(yǎng)5天后情況，饑餓培養(yǎng)下的植株都要小于正常培養(yǎng)的植株但轉(zhuǎn)基因植株(右)比野生型植株(左)明顯生長(zhǎng)得大。
序列表<110>浙江大學(xué)<120>植物磷饑餓誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子OsPTF1<130><140><141><160>2<170>PatentIn Version3.1<210>1<211>Length1862SequenceNameOsPTF1<212>TypeDNA<213>水稻(Oryza sativa)<221>CDS<222>LocationFrom67<222>LocationTo1503<400>1acactttctg tttctagagg ccattctctg taacactttg gagcatcaat tttgtagcgt 60gctatcatgg actactctgc tggttcctac atgtggcctg gcaattcagg ttctgagaac 120tataattttg ttgacggttc gtcggaatca tatgcagaag aaggaagcct accaccttca 180ggctatttca tgggagctgg atcagatcgc agtttaaaga tcacggagaa tgaaaggaac 240cccactatgc ttgcaaatgg atgcttgcca tacaacaccc aggctcatcc attatctggc 300cagattctac ctaagggtga gctccctaac aatcttctgg atcttcaaca gctacagaac 360agcagcaatc tgcgaagcaa ttcaattccc ccaggggttc ttcagtgcaa ttcaacatct 420ggaacatttg atgcgaaatt ggatacacct ggtcttgcag aactgcctca tgctttgtcc 480agttcaattg atagcaatgg tagtgacatt tctgcttttc ttgctgatgt gcatgccgtt 540tcttcagccc cgacgttgtg ttcagcattc caaaacgttt cctccttcat ggaaccagta 600aatctagatg ctttcggttt ccaaggggca caaaatgttg ctatgttgaa caaaacaagt 660cttccaaatg ggaatccctc gctgtttgat aatgctgcca tagcatcact acatgatagc 720aaagagtttc tcaatggtgg ttccatccct tcgtttggta ctgtcctgca ggcactagga 780gcgggtggtt tgaaggctgc tcaacaggag caaaatatcc ggaatatacc tctccctaca 840ttcacatctg gtagtcattt ggcagttact gatgcacaag ggccaccact tccttcaaag 900ataccaccat tgatccatga ccataatagt gagtacccta ttaaccattc ttctgatgtg 960gaaccccaag caaattcagc tcctggaaat agtgccaatg cgaagccacg tacaagggct1020cgccgtggac aggcaactga tcctcacagt attgctgaac ggcttcgccg agagaaaatt1080tcagaaagga tgaaaaatct ccaagtcctt gtcccaaact ccaataaggc agataaggca1140tcaatgcttg atgaaataat tgattatgtg aaatttcttc agcttcaggt caaggtattg1200agcatgagca ggctaggagc tcctggagca gttcttcccc ttcttaggga atctcaaacc1260gagtgccata gtaatccatc tctatcagct tcaaccattt cacaagggcc aacagacatg1320ccagactcag aagacagctc tgcctttgag caagaggtag tgaagctgat ggaaacgagc1380atcatcagcg cgatgcagta tcttcagaac aagggtctct gcctgatgcc cattgctctc1440gcttcggcca tatccaacca gaaaggcatg gctgctgctg ctgcaatccc tcctgaaaaa1500tgaaaaaaaa aatgaaatcg gaaaaatatg gggggaacaa ctgcagaaga cataataact1560caacggctgc agaaatgtgc tggacactgc aggttttgtg aatgaagtga aatccaatcc1620agggggtcat aaaacatagg aagttatctg actaattcag gcttatgaca caatctactc1680tatagtctat agctattgtg tgcctgttgc acatcagttg atgtgtattc ttttgttttt1740tttgtattgc atccggatgc taattaggta gtagtgtttc ctttgatgta catgagtatt1800atctatgcgg ttttatctaa tgtgcatata aagtaaaatc tggtaaaaaa aaaaaaaaaa1860aa 1862<210>2<211>478<212>PRT<213>水稻(Oryza sativa)<400>2MDYSAGSYMW PGNSGSENYN FVDGSSESYA EEGSLPPSGY FMGAGSDRSL KITENERNPT 60MLANGCLPYN TQAHPLSGQI LPKGELPNNL LDLQQLQNSS NLRSNSIPPG VLQCNSTSGT120FDAKLDTPGL AELPHALSSS IDSNGSDISA FLADVHAVSS APTLCSAFQN VSSFMEPVNL180DAFGFQGAQN VAMLNKTSLP NGNPSLFDNA AIASLHDSKE FLNGGSIPSF GTVLQALGAG240GLKAAQQEQN IRNIPLPTFT SGSHLAVTDA QGPPLPSKIP PLIHDHNSEY PINHSSDVEP300QANSAPGNSA NAKPRTRARR GQATDPHSIA ERLRREKISE RMKNLQVLVP NSNKADKASM360LDEIIDYVKF LQLQVKVLSM SRLGAPGAVL PLLRESQTEC HSNPSLSAST ISQGPTDMPD420SEDSSAFEQE VVKLMETSII SAMQYLQNKG LCLMPIALAS AISNQKGMAA AAAIPPEK 478
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，包含SEQ ID NO1的1862位堿基的核酸，該核酸編碼一個(gè)水稻根系磷饑餓誘導(dǎo)增強(qiáng)表達(dá)的bHLH類轉(zhuǎn)錄因子。
2.一種分離出的水稻bHLH類蛋白，其特征在于，它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或者與其氨基酸序列至少60％同源的或與其第313-376位氨基酸殘基至少有60％的相同性的分離的蛋白質(zhì)。
3.一種分離出的DNA分子，其特征在于編碼權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)的核酸。
4.一種轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于包含權(quán)利要求3的核酸的轉(zhuǎn)基因植物。
5.一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其特征在于包含權(quán)利要求3的核酸的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
6.一種培養(yǎng)植物的方法，其特征在于包括用權(quán)利要求3的核酸轉(zhuǎn)化所述植物，并培養(yǎng)所述植物，其中所述植物耐受磷饑餓能力要強(qiáng)于野生型植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物磷饑餓誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子OsPTF1。它是從水稻中分離的一種新基因OsPTF1，由1862位堿基組成，該核酸編碼一個(gè)水稻根系磷饑餓誘導(dǎo)增強(qiáng)表達(dá)的bHLH類轉(zhuǎn)錄因子。數(shù)據(jù)顯示該基因在水稻葉片中為組成型表達(dá)，在根部為磷饑餓誘導(dǎo)表達(dá)。OsPTF1參與植物磷的利用過程。過表達(dá)所述基因的轉(zhuǎn)基因植株耐磷饑餓能力要高于野生型植株。故利用本發(fā)明提供的基因和技術(shù)方法可以提高植物或其細(xì)胞的耐磷饑餓能力。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1436848SQ02160719
公開日2003年8月20日 申請(qǐng)日期2002年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月31日
發(fā)明者吳平, 易可可, 吳忠長(zhǎng), 吳運(yùn)榮, 周潔, 杜黎明 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)