專利名稱：與b7分子發(fā)生反應的人源化免疫球蛋白及應用該免疫球蛋白的治療方法
相關申請本申請是提交于1999年6月24日的09/339596號申請的后續(xù)部分申請，后者是提交于1999年2月12日的09/249011號申請的后續(xù)部分申請。后兩個申請的所有內(nèi)容在此引入作為參考。
背景技術：
抗原特異T-細胞的激活以及免疫應答的起始，首先依賴于T-細胞受體(TCR)復合物與抗原呈遞細胞(APC)上的多肽/主要組織相容性復合體(MHC)之間的相互作用。B7分子B7-1和B7-2位于APCs上。T-細胞的激活以及隨后的免疫應答調(diào)控，需要一種“共刺激”信號，這種信號是由APC上的B7-1和B7-2與T-細胞上的配體CD28和CTLA4相互作用產(chǎn)生的。B7-1和B7-2途徑，亦即B7CD28/CTLA4途徑，需要調(diào)節(jié)。還需要開發(fā)受此途徑影響的疾病的治療方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及與B7分子有結合特異性的人源化免疫球蛋白。本發(fā)明尤其包括一種對B7-1和B7-2有結合特異性的人源化免疫球蛋白，其中的免疫球蛋白包括一個非人來源(如嚙齒類動物)的抗原結合區(qū)，以及至少人來源的一部分(如人的恒定區(qū)IgG恒定區(qū)和/或人的構架區(qū))。一個實施方案中，人源化抗B7-2免疫球蛋白或人源化抗B7-1免疫球蛋白的人的恒定區(qū)，還包含一種能降低人源化免疫球蛋白效應子功能的突變。本文所述的人源化B7-2免疫球蛋白與鼠3D1競爭結合B7-2。同樣，本文所述的人源化B7-1免疫球蛋白與鼠1F1競爭結合B7-1。特定實施方案中，人源化B7-2免疫球蛋白的抗原結合區(qū)來自于3D1單克隆抗體，而人源化B7-1免疫球蛋白的抗原結合區(qū)來自于1F1單克隆抗體。
本發(fā)明中的人源化免疫球蛋白可以包含一個人來源的恒定區(qū)以及一個抗原結合區(qū)。其中的非人來源的抗原結合區(qū)包含一個或多個嚙齒類動物來源(例如，源于3D1單克隆抗體)的與B7-2結合的互補性決定區(qū)(CDRs)，或者包含一個或多個嚙齒類動物來源(例如，源于1F1單克隆抗體)的與B7-1結合的CDRs。人來源的免疫球蛋白部分來自于人的一個構架區(qū)(FR)。
人源化B7-2抗體的抗原結合區(qū)還可以包括一條輕鏈以及一條重鏈，其中的輕鏈和重鏈都有三個來自于3D1抗體的CDRs.人源化B7-2抗體輕鏈的FR可來自于人H2F抗體輕鏈，而重鏈可來自于人I2R抗體重鏈。一個特定實施方案中，本發(fā)明中與B7-2有結合特異性的人源化免疫球蛋白，來自于由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(A.T.C.C.)(AccessionNo.CRL-12524)保藏的細胞系。
人源化B7-1抗體的抗原結合區(qū)可以包括一條輕鏈以及一條重鏈，其中的輕鏈和重鏈都有三個來自于1F1抗體的CDRs。人源化B7-1輕鏈和重鏈的FR可來自于人III-2R抗體的輕鏈和重鏈。一個特定實施方案中，本發(fā)明中與B7-1有結合特異性的人源化免疫球蛋白，來自于由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(A.T.C.C.)(Accession No.PTA-263)保藏的細胞系。
本發(fā)明也包括一個與B7-1或B7-2有特異結合性的免疫球蛋白，包括一條重鏈和/或一條輕鏈。一個實施方案中，人源化免疫球蛋白與B7-2有結合特異性，輕鏈包含至少一個與B7-2結合的非人來源抗體的CDR(例如CDR1、CDR2以及CDR3)以及一個人來源的輕鏈的FR(如H2F抗體)；重鏈包含至少一個與B7-2結合的非人來源抗體的CDR(例如CDR1、CDR2以及CDR3)以及一個人來源的重鏈的FR(如人I2R抗體)。另一實施方案中，人源化免疫球蛋白與B7-1有結合特異性，輕鏈和/或重鏈包含至少一個與B7-1結合的非人來源抗體的CDR(例如CDR1、CDR2以及CDR3)以及一個來自于人輕鏈和/或重鏈的FR(如III-2R)。免疫球蛋白還可包含輕鏈或重鏈CDR1、CDR2以及CDR3，其氨基酸序列如本文所披露，或者和本文所列氨基酸序列基本一樣，這樣的抗體能與B7-2或B7-1特異結合。本發(fā)明也涉及人源化免疫球蛋白輕鏈和人源化免疫球蛋白重鏈。本發(fā)明也涉及分離的核酸，這些核酸包括編碼本發(fā)明人源化免疫球蛋白(如一種單鏈抗體)的序列。本發(fā)明還涉及分離的核酸，這些核酸包括編碼B7-2或B7-1人源化免疫球蛋白輕鏈或重鏈的序列。
本發(fā)明的一個實施方案是一種與B7-2有結合特異性的人源化免疫球蛋白輕鏈，包括鼠3D1抗體輕鏈CDR1、CDR2和/或CDR3，以及一種人輕鏈FR(如H2F抗體)。同樣，本發(fā)明還包括一種包含鼠1F1抗體輕鏈CDR1、CDR2和/或CDR3的與B7-1有結合特異性的人源化B7-1免疫球蛋白輕鏈，還包括一種人輕鏈FR(如III-2R抗體)。另一實施方案是一種人源化B7-2或B7-1免疫球蛋白輕鏈，該免疫球蛋白輕鏈包括圖2B(SEQ ID NO8)所示的一個可變區(qū)或圖7B(SEQ ID NO28)所示的可變區(qū)。本發(fā)明也涉及一種分別編碼對B7-2或B7-1特異的人源化可變輕鏈的分離核酸，包括圖2B(SEQ ID NO7)或圖7B(SEQ ID NO27)所示的核酸序列；也涉及一種分別編碼圖2B(SEQ ID NO8)或圖7B(SEQ ID NO28)所示氨基酸序列的核酸序列；還涉及在嚴格雜交條件下能與以上序列雜交的一種核酸序列或能與以上序列互補的一種核酸序列。
本發(fā)明的另一實施方案是一種對B7-2特異并包括3D1抗體重鏈CDR1、CDR2和/或CDR3以及一種人重鏈FR(如I2R抗體)的人源化免疫球蛋白。同樣，本發(fā)明還涉及一種對B7-1特異并包括1F1抗體重鏈CDR1、CDR2和/或CDR3以及一種人重鏈FR(如III-2R抗體)的人源化免疫球蛋白重鏈。本發(fā)明涉及一種包括圖2A(SEQ ID NO6)或圖7A(SEQ ID NO26)所示可變區(qū)的人源化免疫球蛋白。本發(fā)明還涉及一種編碼對B7-2特異的人源化可變重鏈的分離核酸序列，該序列包括圖2A(SEQ ID NO5)所示的一種核酸序列；還涉及一種編碼圖2A(SEQ IDNO6)所示氨基酸序列的分離核酸序列；還涉及在嚴格雜交條件下能與以上序列雜交的核酸序列或能與以上序列互補的核酸序列。本發(fā)明涉及一種編碼對B7-1特異的人源化可變重鏈的分離核酸序列，該序列包括圖7A(SEQ ID NO25)所示的核酸序列；還涉及一種編碼圖7A(SEQ ID NO26)所示氨基酸序列的分離核酸序列；還涉及在嚴格雜交條件下能與以上序列雜交的核酸序列或能與以上序列互補的核酸序列。
本發(fā)明的一個實施方案尤其是一種與B7-2特異結合的人源化免疫球蛋白，該免疫球蛋白包含一條包括來自于鼠3D1抗體三條輕鏈CDRs在內(nèi)的人源化輕鏈，以及一條來自于人免疫球蛋白輕鏈的輕鏈可變區(qū)構架序列，以及一條包括來自于鼠3D1抗體三條重鏈CDRs在內(nèi)的人源化重鏈，以及一條來自于人免疫球蛋白重鏈的重鏈可變區(qū)構架序列。鼠3D1抗體中還可以有一個成熟輕鏈可變結構域，如

圖1B(SEQ ID NO4)所示的成熟輕鏈可變結構域；抗體中還可以有一個成熟重鏈可變結構域，如圖1A(SEQ ID NO2)所示的成熟重鏈可變區(qū)。
本發(fā)明的另一實施方案是一種與B7-1特異結合的人源化免疫球蛋白，該免疫球蛋白包含一條包括來自于鼠1F1抗體三條輕鏈CDRs在內(nèi)的人源化輕鏈，以及一條來自于人免疫球蛋白輕鏈的輕鏈可變區(qū)構架序列，以及一條包括來自于鼠1F1抗體三條重鏈CDRs在內(nèi)的人源化重鏈，以及一條來自于人免疫球蛋白重鏈的重鏈可變區(qū)構架序列。同樣，鼠1F1抗體中還可以有一個成熟輕鏈可變結構域，如圖6B(SEQ ID NO24)所示的成熟輕鏈可變結構域；抗體中還可以有一個成熟重鏈可變結構域，如圖6A(SEQ ID NO22)所示的成熟重鏈可變區(qū)。
本發(fā)明包括一個包含融合基因的表達載體，其融合基因編碼人源化B7-1和/或B7-2免疫球蛋白輕鏈和/或重鏈。融合基因包括編碼來自于對B7-2和/或B7-1有結合特異性的非人抗體的輕鏈和/或重鏈的CDR(如，分別是鼠3D1或1F1抗體)，和一個人來源輕鏈和/或重鏈的FR的核苷酸序列。
本發(fā)明也涉及一種包含本發(fā)明核酸的宿主細胞，包括一種或多種包含本發(fā)明核酸的構建體。一個實施方案中，本發(fā)明包括的宿主細胞包含編碼一條人源化B7-2免疫球蛋白輕鏈的第一種B7-2重組核酸，還包含編碼一條人源化B7-2免疫球蛋白重鏈的第二種B7-2重組核酸。第一種B7-2核酸包含編碼至少一個來自于鼠3D1抗體輕鏈的CDR和一個人來源輕鏈的FR的核酸序列。第二種B7-2核酸包含編碼至少一個來自于鼠3D1抗體重鏈的CDR和一個來自于人重鏈的FR的核酸序列。另一實施方案中，本發(fā)明包括的宿主細胞包含編碼一條人源化B7-1免疫球蛋白輕鏈的第一種B7-1重組核酸，還包含編碼一條人源化B7-1免疫球蛋白重鏈的第二種B7-1重組核酸。第一種B7-1核酸包含編碼至少一個來自于鼠1F1抗體輕鏈的CDR和一個來自于人來源輕鏈的FR的核酸序列。第二種B7-1核酸包含能編碼至少一個來自于鼠1F1抗體重鏈的CDR和一個來自于人來源重鏈的FR的核酸序列。正如本文所述，本發(fā)明還涉及一種宿主細胞，該宿主細胞內(nèi)包含一種能編碼人源化B7-1和/或B7-2免疫球蛋白的載體或核酸。
正如本文所述，本發(fā)明還涉及制備人源化免疫球蛋白的方法，包括在適合表達人源化免疫球蛋白的條件下保持能編碼對B7-2或B7-1特異的人源化免疫球蛋白的宿主細胞，其中，能表達出人源化免疫球蛋白鏈(一條或多條)并有人源化免疫球蛋白產(chǎn)生。該方法還包括人源化B7-1或B7-2免疫球蛋白的分離步驟。
正如本文所述，本發(fā)明包括能抑制有B7-2受體的第一種細胞與有B7-2的第二種細胞之間相互作用的方法，包括讓第二種細胞接觸有效量的人源化B7-2免疫球蛋白。正如本文所述，本發(fā)明還包括能抑制有B7-1受體的第一種細胞與有B7-1的第二種細胞之間相互作用的方法，包括讓第二種細胞接觸上有效量的人源化B7-1免疫球蛋白。因此，本發(fā)明還涉及抑制B7-1受體和B7-2受體與B7-1配體和B7-2配體發(fā)生相互作用的方法，包括讓有B7-1受體和B7-2受體的細胞接觸一定量的抗B7-1免疫球蛋白和抗B7-2免疫球蛋白。所以，本發(fā)明涉及多種治療方法。正如本文所述，本發(fā)明包括一種能調(diào)節(jié)個體(如病人)免疫應答或者能治療有移植器官、移植組織、移植細胞等個體的方法，包括在有或無載體存在的情況下，給個體投以有效量的人源化B7-1和/或B7-2免疫球蛋白，其中能調(diào)節(jié)個體的免疫應答。本發(fā)明涉及急性和/或慢性移植排斥的治療方法，例如能更長時間(如數(shù)日、數(shù)月或數(shù)年)的治療。正如本發(fā)明所述，本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)B7-2和/或B7-1分子來治療疾病(如自身免疫病、傳染病、炎癥失調(diào)、系統(tǒng)性紅斑性狼瘡、糖尿病、哮喘、胰島炎、關節(jié)炎、炎性腸道疾病、炎性皮炎和多發(fā)性硬化)的方法，包括在有或沒有載體存在的情況下給個體(如病人)投以有效量(如治療上的有效量)的B7-2和/或B7-1人源化免疫球蛋白。因此，正如本文所述，本發(fā)明包括一種包含B7-1和/或B7-2人源化免疫球蛋白的藥用組合物。
本發(fā)明也包括從對B7-2特異的鼠抗體中制備對B7-2特異的人源化免疫球蛋白的方法，和/或從對B7-1特異的鼠抗體中制備對B7-1特異的人源化免疫球蛋白的方法。以上方法包括鑒定或確定與B7-2或B7-1有結合特異性的非人來源(如來自鼠的)抗體的CDRs；獲得可用于移植CDRs的有構架區(qū)氨基酸序列的人抗體，以及將非人來源抗體的CDRs移植到人抗體FR上。
本發(fā)明還涉及鑒定樣品中有或無B7-2和/或B7-1的方法。該方法包括獲得待測樣品，讓樣品與對B7-1和/或B7-2特異的人源化抗體或其片段充分接觸，以便能夠分別形成B7-2和/或B7-1與抗B7-2抗體和/或抗B7-1抗體之間的復合物；以及檢測有無復合物形成。復合物的存在表明樣品中有B7-2和/或B7-1。
本發(fā)明涉及有病個體的治療方法，包括給病人投以一定量(如治療有效量)的對B7-1特異的人源化免疫球蛋白和/或一定量(如治療有效量)的對B7-2特異的人源化免疫球蛋白。本文所述疾病包括自身免疫病、傳染病、哮喘、炎癥失調(diào)、系統(tǒng)性紅斑性狼瘡、糖尿病、胰島炎、關節(jié)炎、炎性腸道疾病、炎性皮炎以及多發(fā)性硬化。該方法也涉及調(diào)節(jié)有移植器官、移植組織、移植細胞等的個體的免疫應答，包括給個體投以有效量的與B7-1結合的人源化免疫球蛋白和或有效量的與B7-2結合的人源化免疫球蛋白。該方法還包括給有移植器官、移植組織、移植細胞等的個體投以用于調(diào)節(jié)其免疫應答的藥物。例如，這些藥物可以是氨甲蝶呤、納巴霉素(rapamycin)、環(huán)孢菌素、類固醇、抗CD40途徑抑制劑(如抗CD40抗體、抗CD40配體抗體以及CD40途徑的小分子抑制劑)、移植補救途徑抑制劑(如mycophenolate mofetil(MMF))、IL-2受體拮抗劑(如Hoffmann-la Roche.Inc.公司的Zeonpax，以及Novartis Inc.的Simulet)及其類似物。這些藥物可以在人源化免疫球蛋白投藥之前投藥或者與其一起投藥，或者在人源化免疫球蛋白投藥之后投藥。
本發(fā)明還涉及給所需個體移植細胞(如骨髓細胞、血細胞、血液組分以及其它細胞)的方法，包括從供體獲得細胞(如骨髓細胞、或血細胞或血液組分)，以及讓這些細胞與對B7-1特異的免疫球蛋白和/或對B7-2特異的免疫球蛋白以及受體細胞接觸，以便獲得它們的混合物。免疫球蛋白和受體細胞需要維持一段時間，該時間應該足以誘導耐受性。然后將混合物(指的是骨髓組分或血細胞組分)導入到個體中。受體細胞可以是淋巴細胞(如能表達1類抗原(MHC I)的淋巴細胞或外周血淋巴細胞(PBL))。除用受體細胞外，本方法還包括利用能表達MHC I類抗原、B7-1和/或B7-2分子的組織、器官或細胞。這些細胞可以工程化，用來表達受體分子。來自供體的細胞可以是骨髓細胞或者是血液的細胞/組分(如干細胞或未成熟細胞)。B7免疫球蛋白與供體骨髓細胞和受體細胞之間的接觸應該能維持一段時間，這段時間足可以誘導耐受誘導的產(chǎn)生(如約1-96小時，優(yōu)選約36-48小時)。需移植的個體的疾病可受益于骨髓移植或可通過移植骨髓來治療。這些疾病包括的例子有增生病(如白血病、淋巴瘤和癌)、貧血癥(如鐮狀細胞貧血癥、地中海貧血癥以及再生障礙性貧血)、先天性代謝缺陷、先天性免疫缺陷病以及骨髓相位異常綜合癥(MDS)。該方法還包括給個體投以用于調(diào)節(jié)免疫應答的藥物(如氨甲蝶呤，納巴霉素，環(huán)孢菌素，類固醇，抗CD40途徑抑制劑如抗CD40抗體、抗CD40配體抗體以及CD40途徑的小分子抑制劑，移植補救途徑抑制劑如mycophenolatemofetil(MMF)，IL-2受體拮抗劑如Hoffmann-la Roche Inc.公司的Zeonpax以及Novartis Inc.的Simulet，或者其類似物)。
本發(fā)明尤其包括給有病(例如，增生病如白血病、淋巴瘤、癌，貧血癥如鐮狀細胞貧血癥、地中海貧血癥以及再生障礙性貧血，先天性代謝缺陷，先天性免疫缺陷病，以及骨髓相位異常綜合癥)，用骨髓移植治療的個體移植骨髓的方法，其中包括從供體中獲得骨髓，以及讓骨髓與對B7-1特異的免疫球蛋白和/或對B7-2特異的免疫球蛋白以及與受體細胞(如淋巴細胞)接觸。骨髓、免疫球蛋白和受體細胞的接觸應該能夠維持足夠長的時間(如，約1-96小時，優(yōu)選約36-48小時)，以足以誘導耐受性。該方法也包括再次給個體導入處理過的骨髓。該方法還包括給個體投以用于調(diào)節(jié)免疫應答的藥物(如氨甲蝶呤，納巴霉素，環(huán)孢菌素，類固醇，抗CD40途徑抑制劑如抗CD40抗體、抗CD40配體抗體以及CD40途徑的小分子抑制劑，移植補救途徑抑制劑如mycophenolate mofetil(MMF)，IL-2受體拮抗劑如Hoffmann-la RocheInc.公司的Zeonpax以及Novartis Inc.的Simulet，或者其類似物)。
本發(fā)明也包括通過給受體投以有效量的對B7-1特異的免疫球蛋白和/或有效量的對B7-2特異的免疫球蛋白以便治療移植受體或抑制移植受體的移植排斥的方法。對B7-1特異的免疫球蛋白的投藥量在大約1mg/kg與大約100mg/kg之間，而對B7-2特異的免疫球蛋白的投藥量在大約1mg/kg與大約100mg/kg之間?？梢栽谑荏w接受移植的當天就投給對B7-1和B7-2特異的免疫球蛋白(如投藥量可以在大約1mg/kg與大約25mg/kg之間)，也可以在受體接受移植之后再定期(如每天一次、每周一次或每月一次)投藥(如投藥量可以在大約1mg/kg與大約5mg/kg之間)。本方法還包括投以用于治療移植排斥的組合物，如鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(環(huán)孢菌素A或環(huán)孢菌素FK506)，類固醇(如甲基強的松或強的松)，或者能阻止免疫細胞生長的免疫抑制劑(如納巴霉素)，抗CD40途徑抑制劑(如抗CD40抗體、抗CD40配體抗體以及CD40途徑的小分子抑制劑)，移植補救途徑抑制劑(如mycophenolate mofetil(MMF))，IL-2受體拮抗劑(如Hoffmann-la Roche Inc.公司的Zeonpax以及Novartis Inc.的Simulet)，或者其類似物。如上文所述，本發(fā)明也涉及給需要移植的個體移植細胞、組織或器官的方法；還涉及給個體投以有效量的對B7-1特異的免疫球蛋白和有效量的對B7-2特異的免疫球蛋白。
本發(fā)明也包括在有抗原存在的情況下，通過給個體投以有效量的對B7-1特異的免疫球蛋白和/或有效量的對B7-2特異的免疫球蛋白以減弱哺乳動物對抗原產(chǎn)生的抗體應答。該方法還包括給個體投以抗原(如破傷風類毒素、因子VIII、因子IX、胰島素、生長激素或基因送遞載體)?？乖梢砸远嚯男问交蛞院怂嵝问酵端?如通過腺伴隨病毒(AAV)、反轉錄病毒、裸DNA載體等送遞的基因治療方法)。
本發(fā)明的優(yōu)點包括能夠對B7共刺激途徑進行調(diào)節(jié)或調(diào)整。用人源化抗B7-2抗體和/或抗B7-1抗體對該共刺激途徑進行操作，提供了多種疾病的治療方法。人源化抗B7-2抗體和/或抗B7-1抗體保持了同對應的鼠抗體一樣對各個B7分子的特異性，但與對應的鼠抗體相比，人源化抗體對人的免疫原性降低而且有更長的半衰期。因此，本發(fā)明在用于治療免疫相關疾病/失調(diào)或B7-2和/或B7-1發(fā)揮重要功能的疾病方面是有利的。本發(fā)明尤其涉及自身免疫病的治療方法，涉及調(diào)節(jié)有移植器官、移植組織或移植細胞的個體的免疫應答。
附圖簡述從以下對本發(fā)明優(yōu)選實施方案更具體的描述中，就能看出本發(fā)明中前述內(nèi)容和其它實施方案、特征以及其優(yōu)點，伴隨的圖表可以說明這一點。
圖1A是鼠3D1抗體重鏈可變區(qū)的核酸序列和氨基酸序列的序列表(分別為SEQ ID NOS1和2)，其中CDRs(CDR1、CDR2、CDR3)的氨基酸序列下有下劃線，而成熟重鏈的第一個氨基酸下有雙下劃線。
圖1B是鼠3D1抗體輕鏈可變區(qū)的核酸序列和氨基酸序列的序列表(分別為SEQ ID NOS3和4)，其中CDRs(CDR1、CDR2、CDR3)的氨基酸序列下有下劃線，而成熟輕鏈的第一個氨基酸下有雙下劃線。
圖2A是人源化3D1抗體重鏈可變區(qū)的核酸序列和氨基酸序列的序列表(分別為SEQ ID NOS5和6)，其中CDRs(CDR1、CDR2、CDR3)的氨基酸序列下有下劃線，而成熟重鏈的第一個氨基酸下有雙下劃線。
圖2B是人源化3D1抗體輕鏈可變區(qū)的核酸序列和氨基酸序列的序列表(分別為SEQ ID NOS7和8)，其中CDRs(CDR1、CDR2、CDR3)的氨基酸序列下有下劃線，而成熟輕鏈的第一個氨基酸下有雙下劃線。
圖3表示競爭性結合分析法分析的結果的曲線圖。該曲線表示出鼠或人源化抗人B7-2mAbs與表面能表達rhB7-2(CHO/hB7-2)的CHO競爭結合分析的結果。在有放射性標記示蹤的鼠抗人B7-2mAb存在下，濃度逐漸升高的非標記競爭抗體與CHO/hB7-2細胞一起溫浴，對結合態(tài)/游離態(tài)抗體的比例進行了測定。
圖4表示鼠或人源化抗人B7-2mAbs與CHO/hB7-2細胞直接結合分析的結果的曲線圖。濃度逐漸升高的放射形標記的抗體與CHO或CHO/hB7-2細胞一起溫浴，對與CHO/hB7-2細胞結合的特異抗體的量進行了測定。
圖5表示用T細胞增殖分析法分析的結果的曲線圖。將濃度逐漸升高的鼠或人源化抗人B7-2mAbs加到用PMA和CHO/hB7-2細胞刺激的CD28+人T細胞中，測定了這些mAbs對T細胞增殖的抑制作用。
圖6A是鼠1F1抗體重鏈可變區(qū)的核酸序列和氨基酸序列的序列表(分別為SEQ ID NOS21和22)，其中CDRs(CDR1、CDR2、CDR3)的氨基酸序列下有下劃線，而成熟重鏈的第一個氨基酸下有雙下劃線。
圖6B的鼠1F1抗體輕鏈可變區(qū)的核酸序列和氨基酸序列的序列表(分別為SEQ ID NOS23和24)，其中CDRs(CDR1、CDR2、CDR3)的氨基酸序列下有下劃線，而成熟輕鏈的第一個氨基酸下有雙下劃線。
圖7A是人源化1F1(huF1)抗體重鏈可變區(qū)的核酸序列和氨基酸序列的序列表(分別為SEQ ID NOS25和26)，其中CDRs(CDR1、CDR2、CDR3)的氨基酸序列下有下劃線，而成熟重鏈的第一個氨基酸下有雙下劃線。
圖7B是人源化1F1(huF1)抗體輕鏈可變區(qū)的核酸序列和氨基酸序列的序列表(分別為SEQ ID NOS27和28)，其中CDRs(CDR1、CDR2、CDR3)的氨基酸序列下有下劃線，而成熟輕鏈的第一個氨基酸下有雙下劃線。
圖8是競爭性結合分析法分析結果的曲線圖。該曲線表示鼠或人源化抗人B7-1mAbs與用rhB7-1(GHO/hB7-1)轉染的CHO競爭結合的分析結果。在有放射性標記示蹤的人源化1F1存在下，濃度逐漸升高的非標記競爭抗體與CHO/hB7-1細胞一起溫浴，對結合態(tài)/游離態(tài)抗體的比例進行了測定。
圖9A是用斯卡查德分析法對鼠1F1抗體與用rhB7-1轉染的CHO競爭結合分析結果的曲線圖。將放射性標記鼠1F1抗體與用rhB7-1轉染的CHO細胞一起溫浴，對結合態(tài)/游離態(tài)放射活性的比例進行了測定。
圖9B是用斯卡查德分析法對人源化1F1抗體與用rhB7-1轉染的CHO細胞結合分析結果的曲線圖。將放射性標記人源化1F1抗體與用rhB7-1轉染的CHO細胞一起溫浴，對結合態(tài)/游離態(tài)放射活性的比例進行了測定。
圖10是鼠或人源化抗人B7-1mAbs與表面能表達rhB7-1(CHO/hB7-1)的CHO競爭結合分析結果的曲線圖。在有放射性標記示蹤鼠抗人B7-1mAb的存在下，濃度逐漸升高的非標記競爭抗體與CHO/hB7-1細胞一起溫浴，對結合態(tài)/游離態(tài)抗體的比例進行了測定。
圖11是表示鼠或人源化抗人B7-1mAbs與CHO/hB7-2細胞直接結合分析結果的曲線圖。濃度逐漸升高的放射性標記的抗體與CHO或CHO/hB7-1細胞一起溫浴，對與CHO/hB7-1細胞結合的特異抗體的量進行了測定。
圖12表示T細胞增殖分析法分析結果的曲線圖。將濃度逐漸升高的鼠或人源化抗人B7-1mAbs加到用PMA和CHO/hB7-1細胞刺激的CD28+人T細胞中，對這些mAbs對T細胞增殖的抑制作用進行了測定。
圖13是表示單向混合淋巴細胞反應(MLR)分析法分析結果的曲線圖。向由人效應器PBLs和刺激物PBLs組成的混合物中加入固定濃度的鼠或人源化抗人B7-2(同型IgG2.M3)或人CTLA4Ig，在第3、4、5天通過加入放射性標記的胸苷檢測效應器PBLs的增殖情況。
圖14是表示用來自初級MLR的PBLs作為效應器并用來自同一個體或不同個體的初級MLR的PBLs作為刺激物，進行單向次級MLR分析的結果的曲線圖。僅將人源化抗人B7-1mAb加到初級MLR之中。在第3、4、5天通過加入放射性標記的胸苷檢測在次級MLR中效應器PBLs的增殖情況。
圖15是表示用來自初級MLR的PBLs作為效應器并用來自同一個體或不同個體的初級MLR的PBLs作為刺激物，進行單向次級MLR分析的結果的曲線圖。僅將人源化抗人B7-2mAb(同型IgG2.M3)加到初級MLR之中。在第3、4、5天通過加入放射性標記的胸苷檢測在次級MLR中效應器PBLs的增殖情況。
圖16是表示用來自初級MLR的PBLs作為效應器并用來自同一個體或不同個體的初級MLR的PBLs作為刺激物，進行單向次級MLR分析的結果的曲線圖。僅將人源化抗人B7-1和抗B7-2mAbs(同型IgG2.M3)加到初級MLR之中。在第3、4、5天通過加入放射性標記的胸苷檢測在次級MLR中效應器PBLs的增殖情況。
圖17是表示用PBLs作為效應器并用擴散的“B”PBL作為刺激物，進行單向初級MLR分析的結果的曲線圖。用人源化抗B7-2mAb、人源化抗B7-1mAb、組合的人源化抗B7-1與人源化抗B7-2mAbs、10μg/mlCTLA4 Ig、20μg/ml CTLA4 Ig、或者對照Ig分別對效應器和刺激物進行處理。在第3、4、5天通過加入放射性標記的胸苷檢測培養(yǎng)物的增殖情況。
圖18是表示用PBLs作為效應器并用擴散的“C”PBL作為刺激器，進行單向初級MLR分析的結果的曲線圖。用人源化抗B7-2mAb、人源化抗B7-1mAb、人源化抗B7-1與人源化抗B7-2mAbs、10μg/ml CTLA4Ig、20μg/ml CTLA4 Ig、或者對照Ig分別對效應器和刺激物進行治療。在第3、4、5天通過加入放射性標記的胸苷檢測培養(yǎng)物的增殖情況。
圖19是表示用來自于“B”刺激器初級MLR(見圖17)和新鮮“B”刺激物作為效應器，進行單向次級MLR分析的結果的曲線圖。用人源化抗B7-2mAb、人源化抗B7-1mAb、組合的人源化抗B7-1與人源化抗B7-2mAbs、10μg/ml CTLA4 Ig、20μg/ml CTLA4 Ig、或者僅有初級MLR的對照Ig分別對效應器和刺激物進行處理。次級MLR中不再加入其它物質。在第3、4、5天和第6天通過加入放射性標記的胸苷檢測培養(yǎng)物的增殖情況。
圖20是表示用來自“B”刺激器初級MLR(見圖17)和新鮮“C”刺激物作為效應器，進行單向次級MLR分析的結果的曲線圖。用人源化抗B7-2mAb、人源化抗B7-1mAb、組合的人源化抗B7-1與人源化抗B7-2mAbs、10μg/ml CTLA4 Ig、20μg/ml CTLA4 Ig、或者僅有初級MLR的對照Ig分別對效應器和刺激物進行處理。次級MLR中不再加入其它物質。在第3、4、5天和第6天通過加入放射性標記的胸苷檢測培養(yǎng)物的增殖情況。
圖21是表示用來自“B”刺激物初級MLR(見圖17)和新鮮“B”或新鮮“C”刺激物作為效應器，進行單向次級MLR分析的結果的曲線圖。用人源化抗B7-2mAb、人源化抗B7-1mAb、組合的人源化抗B7-1與人源化抗B7-2mAbs、10μg/ml CTLA4 Ig、20μg/ml CTLA4 Ig、或者僅有初級MLR的對照Ig分別對效應器和刺激物進行處理。次級MLR中不再加入其它物質。在第3、4、5天和第6天通過加入放射性標記的胸苷檢測培養(yǎng)物的增殖情況。圖21是將圖19和圖20編輯后的結果。
圖22是表示在破傷風類毒素免疫的非類人靈長類中抗破傷風應答(效價的對數(shù)值)的曲線圖。用純化的破傷風類毒素免疫Cynomolgus猴之后，再用人源化抗B7-1抗體和人源化抗B7-2抗體治療Cynomolgus猴。在26周之內(nèi)，對血清抗破傷風抗體的效價(IgM & IgG)每周檢測一次。
圖23是表示在破傷風類毒素免疫的非類人靈長類中抗破傷風應答(效價的對數(shù)值)的曲線圖。在第0天時用破傷風類毒素免疫Cynomolgus猴，并在第0天分別用單一靜脈注射劑量的人源化抗B7-1抗體和人源化抗B7-2抗體的混合物、或者用載體治療Cynomolgus猴。在第14周時，在不再用人源化抗B7-1抗體和人源化抗B7-2抗體治療的情況下，用破傷風類毒素對動物進行第二次免疫。在18周之內(nèi)，對血清抗破傷風抗體的效價(IgM & IgG)每周檢測一次。
圖24是表示在破傷風類毒素免疫的非人靈長類中抗破傷風應答(效價的對數(shù)值)的曲線圖。在第0天時用破傷風類毒素免疫Cynomolgus猴，并在第0天分別僅用單一靜脈注射劑量的人源化抗B7-1抗體或者用載體治療Cynomolgus猴。在第14周時，在不再用人源化抗B7-1抗體治療的情況下，用破傷風類毒素對動物進行第二次免疫。在18周之內(nèi)，對血清抗破傷風抗體的效價(IgM & IgG)每周檢測一次。
圖25是表示在破傷風類毒素免疫的非人靈長類中抗破傷風應答(效價的對數(shù)值)的曲線圖。在第0天時用破傷風類毒素免疫Cynomolgus猴，并在第0天分別僅用單一靜脈注射劑量的人源化抗B7-2抗體或者用載體治療Cynomolgus猴。在第14周時，在不再用人源化抗B7-2抗體治療的情況下，用破傷風類毒素對動物進行第二次免疫。在18周之內(nèi)，對血清抗破傷風抗體的效價(IgM & IgG)每周檢測一次。
圖26的棒狀圖顯示出各個治療組(各組設計如下第1組載體對照，第2-4組分別是10、1、0.1mg/kg h1F1，第5-7組分別是10、1、0.1mg/kg h3D1，第8-11組分別是10、1、0.1或0.01mg/kg h1F1與h3D1的混合物)在抗破傷風抗體效價曲線(效價的對數(shù)值)之下的面積。用破傷風類毒素免疫Cynomolgus猴，并分別用單一靜脈注射劑量的人源化抗B7-1抗體和人源化抗B7-2抗體的混合物、僅用人源化抗B7-1抗體或僅用人源化抗B7-2抗體、或者用載體治療Cynomolgus猴(各組n＝3)。計算0-14周之內(nèi)的曲線下面積(AUC)值。在計算破傷風效價曲線的AUCs之前，將所有破傷風的效價校準到零基線。通過每一組中能產(chǎn)生可檢測抗體效價的動物數(shù)量的分數(shù)對上述AUC值進行加權，計算出每一組中響應動物的數(shù)量。
圖27是表示在投以10mg/kg的靜脈劑量之后不同時間內(nèi)血清中抗B7-1和抗B7-2mAbs(同型IgG2.M3)濃度的曲線圖。
圖28是表示接受腎異移植的獼猴在1年后的存活百分比的曲線圖。這些獼猴分別用人源化抗B7-1抗體和人源化抗B7-2抗體的混合物、僅用人源化抗B7-1抗體或僅用人源化抗B7-2抗體、或者用載體治療。人源化抗體的初始劑量是20mg/kg，接著的劑量是5mg/kg，隨后在60-80天之間的每周劑量是5mg/kg。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及與B7-2或B7-1有結合特異性的人源化免疫球蛋白，包括一個非人來源的抗原結合區(qū)以及人來源的免疫球蛋白的至少一部分。人源化免疫球蛋白與B7-2或B7-1結合時的親和性至少大約為107M-1，優(yōu)選至少108M-1，更優(yōu)選至少109M-1。一個實施方案中，人源化免疫球蛋白包括一個與B7-2或B7-1結合的非人來源抗原結合區(qū)，以及一個來自于人恒定區(qū)的恒定區(qū)。人恒定區(qū)的構架區(qū)(FR)中可以有非人殘基。另一個實施方案中，與B7-2或B7-1結合的人源化免疫球蛋白包括非人來源的互補性決定區(qū)(一個或多個)和來自于人的可變構架區(qū)(一個或多個)，還可以選擇性地包括一個來自于人的恒定區(qū)。免疫球蛋白的FR區(qū)可以選擇性地包括非人來源的殘基。例如，人源化免疫球蛋白可以包括一條重鏈和一條輕鏈，其中的輕鏈包括一個與B7-2結合的非人來源抗體的互補性決定區(qū)以及一個來自于人輕鏈的構架區(qū)，而其中的重鏈包括一個與B7-2結合的非人來源抗體的互補性決定區(qū)以及一個來自于人重鏈的構架區(qū)。另一個例子中，人源化免疫球蛋白可以包括一條重鏈和一條輕鏈，其中的輕鏈包括一個與B7-1結合的非人來源抗體的互補性決定區(qū)以及一個來自于人輕鏈的構架區(qū)，而其中的重鏈包括一個與B7-1結合的非人來源抗體的互補性決定區(qū)以及一個來自于人重鏈的構架區(qū)。同樣，本發(fā)明可以單獨或以功能組合的方式包括輕鏈、重鏈、可變區(qū)、可變輕鏈以及可變重鏈。
本發(fā)明涉及的一種人源化B7-2抗體由鼠B7-2抗體制取產(chǎn)生，與鼠B7-2抗體的結合特異性基本一樣，但在靈長類(如人)中的免疫原性卻有所降低。同樣，本發(fā)明也涉及的一種人源化B7-1抗體由鼠B7-1抗體制取產(chǎn)生，與鼠B7-1抗體的結合特異性基本一樣，但在靈長類(如人)中的免疫原性卻有所降低。人源化B7-2抗體或B7-1抗體的結合親和性可以比鼠抗體的小，可以基本與其一樣，也可以比其更強。見圖3、4、8、9A和9B。
天然存在的免疫球蛋白都有一個共同的核心結構，由兩條相同的輕鏈(大約24kD)和兩條相同的重鏈(大約55或70kD)形成四聚體。已知每條鏈的氨基末端部分是可變(V)區(qū)，也就是“抗原結合”區(qū)，這與每條鏈其余部分中較保守的恒定(C)區(qū)截然不同。輕鏈可變區(qū)中的C-末端部分是J區(qū)。重鏈可變區(qū)中除J區(qū)外，還有一個D區(qū)。免疫球蛋白中大多數(shù)氨基酸的變動局限在V區(qū)中三個不連續(xù)部位，也就是高變區(qū)或互補性決定區(qū)(CDRs)，它們直接參與抗原的結合?？贵w中與抗原結合的部分是可變區(qū)。恒定區(qū)有多種功能，如能與吞噬細胞、胎盤細胞、肥大細胞等上的Fc受體相結合。輕鏈和重鏈各有一個可變區(qū)和一個恒定區(qū)。因此，本發(fā)明涉及與B7-2或B7-1有結合特異性的人源化免疫球蛋白。人源化B7-1免疫球蛋白或人源化B7-2免疫球蛋白包括一條輕鏈和一條重鏈，其中由兩條輕鏈和兩條重鏈形成四聚體。
可變區(qū)還形成兩種類型的區(qū)，一個是構架區(qū)(FR)，一個是互補性決定區(qū)(CDR)。CDRs是高變區(qū)，包含免疫球蛋白之間變化的大多數(shù)氨基酸序列。由氨基末端開始，CDRs分別是CDR1、CDR2和CDR3。見圖1A-1B、2A-2B、6A-6B以及7A-7B。CDRs由較為保守的FRs連接起來。由氨基末端開始，這些FRs分別是FR1、FR2、FR3和FR4。Kabat等人(Kabat，E.A.et al.，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，F(xiàn)ifth Edition，U.S.Department of Health and HumanServices，U.S.Government Printing Office(1991)；Kabat，E.A.Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry，SecondEdition，Holt，Rinehart and Winston，New York(1976)；Kabat E.A.Sequences of Immunoglobulin ChainsTabulation and Analysis ofAmino Acid Sequences of Precursors，V-regions，C-regions，J-Chains and β2-Microglobulin，U.S.Department of Health，Education and Welfare，Public Health Service，(1979)；Kabat，E.A.Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry，Holt，Rinehart and Winston，New York(1968)；Kabat，E.A.Experimental Immunochemistry，Second Edition，Springfield，Thomas(1967).)對CDR的位置和FR的位置以及編號系統(tǒng)進行了定義。在對免疫球蛋白人源化的過程中，將非人來源的對B7-2或B7-1有特異性的抗體的一個或多個CDRs嫁接到人抗體的FRs上。此外，可以根據(jù)本文所述方法制取某些非人構架替代物。最終的人源化抗體中有來自于非人，如鼠的CDRs，以及來自于人抗體中的FRs，因此，人源化抗體保持了對B7-1或B7-2的抗原特異性和親和性。
本發(fā)明也涉及一條B7-1或B7-2人源化免疫球蛋白輕鏈，或者一條B7-1或B7-2人源化免疫球蛋白重鏈。一個實施方案中，本發(fā)明涉及一條包括一個或多個非人來源輕鏈CDRs(如CDR1(SEQ ID NO16)、CDR2(SEQ ID NO18)和/或CDR3(SEQ ID NO20))的人源化B7-2輕鏈以及一個人輕鏈構架區(qū)(見圖2B)。另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一條包括一個或多個非人來源重鏈CDRs(如CDR1(SEQ ID NO10)、CDR2(SEQ ID NO12)和/或CDR3(SEQ ID NO14))的人源化B7-2重鏈以及一個人重鏈構架區(qū)(見圖2A)。CDRs可來自于非人免疫球蛋白，如對B7-2特異的3D1抗體的鼠重可變區(qū)鏈(如SEQ IDNO1，見圖1A)和輕可變區(qū)鏈(如SEQ ID NO3，見圖1B)。
另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一條包括一個或多個非人來源輕鏈CDRs(如CDR1(SEQ ID NO36)、CDR2(SEQ ID NO38)和/或CDR3(SEQ ID NO40))的人源化B7-1輕鏈以及一個人輕鏈構架區(qū)(見圖7B)。本發(fā)明還涉及一條包括一個或多個非人來源重鏈CDRs(如CDR1(SEQ ID NO30)、CDR2(SEQ ID NO32)和/或CDR3(SEQID NO34))的人源化B7-1重鏈以及一個人重鏈構架區(qū)(見圖7A)。CDRs可來自于非人免疫球蛋白，如對B7-1特異的1F1抗體的鼠重可變區(qū)鏈(如SEQ ID NO21，見圖6A)和輕可變區(qū)鏈(如SEQ ID NO23，見圖6B)。
本發(fā)明也包括由A.T.C.C.(10801University Boulevard，Manassas，VA 02110-2209，于1998，05，05，且A.T.C.C.NoCRL-12524)所保藏的細胞系表達的人源化抗B7-2抗體。將由A.T.C.C.保藏、能表達人源化抗B7-2抗體的細胞系命名為重組CHO細胞系(PA-CHO-DUKX-1538)，該細胞系能表達IgG2.M3同型人源化抗B7-2(CD86)單克隆抗體(#HF2-3D1)。
本發(fā)明也包括由A.T.C.C.(10801 University Boulevard，Manassas，VA 02110-2209，于1999，01，22，且A.T.C.C.NoPTA-263)所保藏的細胞表達的人源化抗B7-1抗體。將由A.T.C.C.保藏、能表達人源化抗B7-1抗體的細胞系命名為重組CHO細胞系(PA-CHO-DUKX-1538)，該細胞系能表達人源化抗B7-1(CD80)單克隆抗體(#1F1)。
依據(jù)同型重鏈的不同，可將人免疫球蛋白分成類和亞類。其中的類包括IgG、IgM、IgA、IgD以及IgE，它們的重鏈分別是γ型、μ型、α型、δ型或ε型。亞類包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2，它們的重鏈分別是γ1型、γ2行、γ3型、γ4型、α1型和α2型。選定的類或亞類人免疫球蛋白分子可能包含一條κ輕鏈或一條λ輕鏈。可參照Celluar and Molecular Immunology，Wonsiewicz，M.J.，Ed.，Chapter 45，pp.41-50，W.B.Saunders Co，Philadelphia，PA(1991)；Nisonoff，A.，Introduction to Molecular Immunology，2ndEd.，Chapter 4，pp.45-65，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA(1984)。
術語“HF2.3D1”和“3D1”是指對B7-2特異的鼠免疫球蛋白。術語“人源化HF2.3D1”、“人源化3D1”、“hu3D1”、“h3D1”、“B7-2人源化免疫球蛋白”或“人源化B7-2免疫球蛋白”指的是對人B7-2特異的人源化免疫球蛋白(如鼠抗人B7-2抗體)。術語“1F1”或“鼠1F1”是指對B7-1特異的鼠免疫球蛋白。術語“人源化1F1”、“hu1F1”、“h1F1”、“B7-1人源化免疫球蛋白”或“人源化B7-1免疫球蛋白”指的是對人B7-1特異的人源化免疫球蛋白(如鼠抗人B7-1抗體)。術語“B7分子”是指B7-1分子和B7-2分子。術語“B7抗體”指的是抗人B7-1抗體和抗人B7-2抗體。
術語“免疫球蛋白”或“抗體”包括整個抗體以及其生物學功能性片段。生物學功能性片段至少保留了相應的全長抗體的一種抗原結合功能，優(yōu)選保留了抑制B7-2或B7-1與其一個或多個受體(如CD28、CTLA4)之間發(fā)生相互作用的能力。一個優(yōu)選實施方案中，生物學功能性片段能抑制B7-2和/或B7-1的結合，對共刺激途徑進行調(diào)控?？墒褂玫纳飳W功能性抗體片段的例子中包括能與B7-2或B7-1結合的片段，如單鏈抗體、Fv、Fab、Fab’以及F(ab’)2片段?？梢杂妹复倭呀饣蛑亟M技術產(chǎn)生出這些片段。例如，可以用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶分別裂解產(chǎn)生Fab片段或F(ab’)2片段?？贵w也可以多種截短形式用抗體基因來實現(xiàn)。在這些抗體基因中，在天然終止位點上游引入了一個或多個終止密碼子。例如，可以將編碼F(ab’)2片段重鏈的嵌合基因設計成能編碼重鏈CH1域和鉸鏈區(qū)的DNA序列。本發(fā)明包括的單鏈抗體(如單鏈FV)中既包括部分重鏈也包括部分輕鏈。
本文用到的術語“人源化免疫球蛋白”是指一種包括不同來源免疫球蛋白的免疫球蛋白部分，其中至少有一部分來源于人。例如，人源化抗體包括的部分可以來自于有必需特異性的非人來源，如鼠的免疫球蛋白，和來自于人來源的免疫球蛋白序列(如嵌合免疫球蛋白)?？梢酝ㄟ^傳統(tǒng)技術(如合成)將這些部分化學連接在一起，或者通過遺傳工程技術制備一條連續(xù)性多肽(例如，編碼嵌合抗體蛋白部分的基因表達以后產(chǎn)生出一條連續(xù)多肽鏈)。本發(fā)明另一個人源化免疫球蛋白例子是包含一條或多條免疫球蛋白鏈的免疫球蛋白，它包括非人來源抗體的一個CDR以及來自于人來源的輕鏈和/或重鏈的一個構架區(qū)(如有構架變化或無構架變化的CDR嫁接抗體)。嵌合或CDR嫁接單鏈抗體也包括在術語“人源化免疫球蛋白”之中。有關單鏈抗體的知識，可參見Cabilly et al.，美國專利No.4816567；Cabilly et al.，歐洲專利No.0125023 B1；Boss et al.，美國專利No.4816397；Boss etal.，歐洲專利No.0125023 B1；Neuberger，M.S.et al.，WO 86/01533；Neuberger，M.S.et al.，歐洲專利No.0194276 B1；Winter，美國專利No.5225539；Winter，歐洲專利No.0239400 B1；Padlan，E.A.etal.，歐洲專利Application No.0519596 A1。也請參照Ladner et al.，美國專利No.4946778；Huston，美國專利No.5476786；以及Bird，R.E.et al.，Science，242423-426(1988)。
正如在本發(fā)明中作為例子用的抗體所體現(xiàn)的，術語“人源化免疫球蛋白”也指包括一個人構架以及至少一個來自于非人抗體的CDR，其中的任何一個恒定區(qū)基本上都與人免疫球蛋白恒定區(qū)相同，如至少60-90％相同，優(yōu)選至少95％相同。因此，人源化免疫球蛋白中，除可能的CDRs外的所有部分，基本上都與一種或多種天然人免疫球蛋白序列的對應部分相同。在有些人源化免疫球蛋白中，在人構架區(qū)中除了有來自于非人來源抗體的CDRs外，還可能包括其它非人殘基。
設計人源化免疫球蛋白可以按如下進行。當一個氨基酸屬于以下類型時，所用的人源化免疫球蛋白(受體免疫球蛋白)的構架氨基酸將用來自于有CDR的非人免疫球蛋白(供體免疫球蛋白)的構架氨基酸來取代(a)對于人免疫球蛋白的同一位置來說，受體免疫球蛋白人構架區(qū)中的氨基酸是非正常氨基酸，而對于人免疫球蛋白的同一位置來說，供體免疫球蛋白中的對應氨基酸是典型氨基酸；(b)該氨基酸所在位置與其中一個CDRs緊密相鄰；或者(c)該氨基酸能夠以三級結構免疫球蛋白模式與CDRs相互作用(參照Queen et al.，op.cit.以及Co et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，2869(1991))。
對于人源化免疫球蛋白制備方法的詳細描述，請參照Queen etal.，op.cit以及美國專利5585089，5693762以及5530101。
通常情況下，人源化抗體的CDR區(qū)與它來源的對應鼠抗體CDR基本上相同，更優(yōu)選相同。雖然通常情況下并不需要，但有時也可能在不會顯著影響所得人源化免疫球蛋白結合親和性的前提下，可以將CDR殘基中的一個或多個保守性氨基酸替換掉。偶然情況下，CDR區(qū)的替換作用也能增強免疫球蛋白的結合親和性。
除了前面討論特定氨基酸的替換作用之外，人源化免疫球蛋白的構架區(qū)與它來源的人抗體構架區(qū)通?；鞠嗤?，更優(yōu)選相同。當然，構架區(qū)中的許多氨基酸對抗體特異性或親和性的直接貢獻很小或者根本沒有。因此，在不顯著改變所得人源化免疫球蛋白的特異性或親和性的情況下，構架中殘基的許多單一的保守替換作用是可以忍受的。
人源化B7-2免疫球蛋白的抗原結合區(qū)(非人部分)可以來自于對B7-2有特異性(如3D1抗體)或對B7-1有特異性(如1F1抗體)的非人來源的免疫球蛋白，即供體免疫球蛋白。例如，人源化B7-2抗體的一個適用的抗原結合區(qū)可以來自于HF2.3D1單克隆抗體，這是一種鼠抗人B7-2抗體。美國專利申請流水號No.08/101624提交于1993年7月26日，08/109393提交于1993年8月19日，而題為“B7-2CTLA4/CD28反受體”的08/147773提交于1993年11月3日。也請參照Freeman，et al.，WO 95/03408，“B7-2CTLA4/CD28反受體”，公開于1995年2月2日。人源化B7-1抗體的一個適用的抗原結合區(qū)可以來自于1F1單克隆抗體，這是一種鼠抗人B7-1抗體。其它B7-2或B7-1特異抗體來源可來自于非人資源，如嚙齒類動物(如鼠和大鼠)、家兔、豬、山羊或非人靈長類(如猴)或camelid動物(如駱駝和駱馬)。
此外，也可制備出其它多克隆或單克隆抗體(如Kohler et al.，Nature，256495-497(1975)；Harlow et al.，1988，AntibodiesA Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor，NY)；以及CurrentProtocols in Molecular Biology，Vol.2(Supplement 27，Summer’94)，Ausubel et al.，Eds.(John Wiley &SonsNew York，NY)，Chapter11(1991))，如能與象鼠HF2.3D1或1F1抗體一樣或類似地與抗原決定部位結合的抗體。例如，抗體可以在一個適當?shù)膭游锶缧∈?、大鼠、家兔、綿羊或camelid中針對某一種適宜免疫原產(chǎn)生?？捎米髅庖咴?如DNA或多肽免疫原)的合適例子如有B7-2或B7-1的細胞、包含有B7-2或B7-1的B7-2或B7-1免疫原性片段的膜部分以及與合適載體綴合的B7-2或B7-1多肽?？梢苑蛛x得到抗體生成細胞(如淋巴細胞)，如可以從免疫動物的淋巴結或脾中分離抗體生成細胞。這些細胞隨后與適當?shù)臒o限增殖化細胞(如骨髓瘤細胞)融合，形成雜交瘤。用選擇培養(yǎng)技術可以分離得到融合細胞?？梢杂煤线m的分析法，如ELISA篩選出能產(chǎn)生有所要特異性抗體的細胞。也可從抗體文庫，如包括非人Fab分子的噬菌體文庫中得到對B7-2或B7-1有結合特異性的非人來源的免疫球蛋白?？梢杂闷渌夹g制備人源化免疫球蛋白。
在一個實施方案中，人源化免疫球蛋白的抗原結合區(qū)包括一個非人來源的CDR。該實施方案中對B7-2或B7-1有結合特異性的人源化免疫球蛋白包括至少一個非人來源的CDR。例如，CDRs可來自于非人來源免疫球蛋白的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，因此，一個人源化B7-2免疫球蛋白基本上包括來自于一個或多個非人來源免疫球蛋白的重鏈CDR1(如SEQ ID NO10)、CDR2(如SEQ ID NO12)和/或CDR3(如SEQ ID NO14)氨基酸序列和/或輕鏈CDR1(如SEQ ID NO16)、CDR2(如SEQ ID NO18)和/或CDR3(如SEQ ID NO20)氨基酸序列，所得人源化免疫球蛋白對B7-2有結合特異性。CDRs也可來自于對B7-1特異的非人來源免疫球蛋白的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)。人源化B7-1免疫球蛋白基本上包括來自于一個或多個非人來源免疫球蛋白的重鏈CDR1(如SEQ ID NO30)、CDR2(如SEQ ID NO32)和/或CDR3(如SEQ ID NO34)氨基酸序列和/或輕鏈CDR1(如SEQ ID NO36)、CDR2(如SEQ ID NO38)和/或CDR3(如SEQ ID NO40)氨基酸序列，所得人源化免疫球蛋白對B7-1有結合特異性。所選鏈的所有三個CDRs可能與供體對應鏈的CDRs基本相同，輕鏈和重鏈中的所有三個CDRs優(yōu)選與對應供體鏈的CDRs基本相同。B7-2重鏈CDR1(如SEQ ID NO9)、CDR2(如SEQ ID NO11)和/或CDR3(如SEQ ID NO13)和/或B7-2輕鏈CDR1(如SEQ ID NO15)、CDR2(如SEQ ID NO17)和/或CDR3(如SEQ ID NO19)的核酸序列可用于將CDRs嫁接到人構架上。此外，B7-1重鏈CDR1(如SEQ ID NO29)、CDR2(如SEQ IDNO31)和/或CDR3(如SEQ ID NO33)和/或B7-1輕鏈CDR1(如SEQID NO35)、CDR2(如SEQ ID NO37)和/或CDR3(如SEQ ID NO39)的核酸序列可用于將CDRs嫁接到人構架上。
另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含一條重鏈和一條輕鏈的人源化免疫球蛋白，該蛋白對B7-2或B7-1有結合特異性。輕鏈可以包括一個與B7-2或B7-1結合、來自于非人來源抗體的CDR以及一個來自于人來源輕鏈的FR。例如，輕鏈包含的CDR1、CDR2和/或CDR3的氨基酸序列如下面所列或者其氨基酸序列同下面所列基本相同，所以抗體能特異結合B7-2CDR1 KSSQSLLNSRTRENYLA(SEQ ID NO16)，CDR2WASTRES(SEQ ID NO18)，CDR3 TQSYNLYT(SEQ ID NO20)。重鏈可以包括一個與B7-2結合、來自于非人來源抗體的CDR以及一個來自于人來源重鏈的FR。例如，B7-2重鏈包含的CDR1、CDR2和/或CDR3的氨基酸序列如下面所列或者其氨基酸序列同下面所列基本相同，所以抗體能特異結合B7-2重鏈CDR1 DYAIQ(SEQ ID NO10)，CDR2VINIYYDNTNYNQKFKG(SEQ ID NO12)，CDR3 AAWYMDY(SEQ ID NO14)。
對B7-1特異的輕鏈包含的CDR1、CDR2和/或CDR3的氨基酸序列如下面所列或者其氨基酸序列同下面所列基本相同，所以抗體能特異結合B7-1CDR1 SVSSSISSSNLH(SEQ ID NO30)，CDR2 GTSNLAS(SEQID NO32)，CDR3 QQWSSYPLT(SEQ ID NO34)。重鏈可以包括一個與B7-1結合、來自于非人來源抗體的CDR以及一個來自于人來源重鏈的FR。對B7-1特異的重鏈包含的CDR1、CDR2和/或CDR3的氨基酸序列如下面所列或者其氨基酸序列同下面所列基本相同，所以抗體能特異結合B7-1CDR1 DYYMH(SEQ ID NO36)，CDR2 WIDPENGNTLYDPKFQG(SEQ ID NO38)，CDR3 EGLFFAY(SEQ ID NO40)。
本發(fā)明的一個實施方案是一種能特異結合B7-2的人源化免疫球蛋白，包括一條人源化輕鏈，包括來自于鼠3D1抗體的三個輕鏈CDRs以及來自于人免疫球蛋白輕鏈的一個輕鏈可變區(qū)構架序列。發(fā)明還包括一條B7-2人源化重鏈，它包括來自于鼠3D1抗體的三個重鏈CDRs以及來自于人免疫球蛋白重鏈的一個重鏈可變區(qū)構架序列。鼠3D1抗體還可以有一個如圖1B(SEQ ID NO4)所示的成熟輕鏈可變結構域，以及一個如圖1A(SEQ ID NO2)所示的成熟重鏈可變結構域。
本發(fā)明的另一個實施方案是一種能特異結合B7-1的人源化免疫球蛋白，包括一條人源化輕鏈，包括來自于鼠1F1抗體的三個輕鏈CDRs以及來自于人免疫球蛋白輕鏈的一個輕鏈可變區(qū)構架序列。發(fā)明還包括一條B7-1人源化重鏈，它包括來自于鼠1F1抗體的三個重鏈CDRs以及來自于人免疫球蛋白重鏈的一個重鏈可變區(qū)構架序列。鼠1F1抗體還可以有一個如圖6B(SEQ ID NO24)所示的成熟輕鏈可變結構域，以及一個如圖6A(SEQ ID NO22)所示的成熟重鏈可變結構域。
人源化免疫球蛋白或免疫球蛋白鏈中來自于人的部分可以來自于任一種合適的人免疫球蛋白或免疫球蛋白鏈。例如，一個人恒定區(qū)或其部分(如果有的話)，可以來自于κ輕鏈或λ輕鏈和/或人抗體的γ(如γ1、γ2、γ3、γ4)重鏈、μ重鏈、α(如α1、α2)重鏈、δ重鏈或ε重鏈，包括等位變體。可以選擇特定的恒定區(qū)，如IgG2或IgG4、其變體或其部分，制作出效應子功能。例如，一個突變恒定區(qū)，即“變體”，可以引入到融合蛋白中去，以將融合蛋白與Fc受體的結合作用和/或其固定補體的能力降低到最小程度(請參照Winter etal.，美國專利No.5648260&5624821；GB 2209757B；Morrison et al.，WO 89/07142；Morgan et al，WO 94/29351，December 22，1994)。此外，可創(chuàng)造一個突變IgG2 Fc結構域，該結構域與天然Fc區(qū)相比，能降低促有絲分裂反應(參照Tso et al.，美國專利No.5834597，其內(nèi)容在此完整引入作為參考)。見實施例3中對人源化抗B7-2抗體進行的突變，并請見實施例10中對人源化抗B7-1抗體進行的突變。
如果有FRs的話，F(xiàn)Rs優(yōu)選來自于與抗原結合區(qū)供體的類似或等價區(qū)有序列同一性的人抗體可變區(qū)。人源化免疫球蛋白中人來源的部分中的FRs的來源包括人可變共有序列(參照Kettleborough，C.A.etal.，Protein Engineering 4773-783(1991)；Queen et al.，美國專利Nos5585089，5693762&5693761)。例如，用于獲得非人部分的抗體或可變區(qū)的序列可以與Kabat等所述的人序列(Kabat E.A.etal.，Sequences of Proteins of Immunological Interest.FifthEdition，U.S.Department of Health and Human Services，U.S.Government Printing Office(1991))相比較。一個優(yōu)選實施方案中，來自于人可變區(qū)的人源化免疫球蛋白鏈的FRs與非人供體(如鼠HF2.3D1抗體或1F1抗體)可變區(qū)的總的序列同一性至少是60％，優(yōu)選至少80％。例如，鼠HF2.3D1輕鏈可變構架區(qū)與鼠H2F輕鏈可變構架區(qū)之間的總的序列同一性是82.5％，而鼠HF2.3D1重鏈可變構架區(qū)與人I2R重鏈可變構架區(qū)之間的總的序列同一性是62.5％。而在B7-1抗體中，鼠1F1輕鏈可變構架區(qū)與人源化III-2R輕鏈可變構架區(qū)之間總的序列同一性是69％，而與鼠III-2R重鏈可變構架區(qū)之間總的序列同一性是79％。
在提及兩種核酸或兩種多肽(如編碼人源化免疫球蛋白的DNAs或人源化免疫球蛋白的氨基酸序列)時提到的“基本上相同”這一短語，指的是用以下序列比較方法和/或用肉眼觀察時，兩個或多個序列或亞序列的核苷酸或氨基酸殘基的相似性至少是80％，更優(yōu)選90-95％或更高。通常認為這些“基本上相同”的序列是同源的?！盎旧舷嗤眱?yōu)選比較的序列長度至少大約50個殘基，更優(yōu)選至少100個殘基的序列，最優(yōu)選至少150個殘基的序列。如下文所述，任何兩種抗體序列只能通過Kabat的編號方法這一種方式來比較排列。因此對于抗體來說，同一性百分比的意義既獨特又確定。
免疫球蛋白成熟重鏈和輕鏈的可變區(qū)中的氨基酸分別記作Hx和Lx，其中的數(shù)字x表示根據(jù)Kabat方法、Sequence of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，MD，1987&1991)所確定的氨基酸的位置。Kabat列舉出每一種亞類抗體的多種氨基酸序列，列舉了該亞類中在每一個殘基位點上通常出現(xiàn)最多的氨基酸。Kabat使用一種方法所列序列中每個氨基酸的殘基編號。通過考慮抗體在Kabat中的某一共有序列問題，也可將Kabat方法擴展到本綱要中并不包括的其它抗體。使用Kabat編號方法不難確定出不同抗體中同等位置的氨基酸。例如，在人抗體L50位的氨基酸占據(jù)了鼠抗體中L50氨基酸的同等位置。
已知基本的抗體結構單位包括一個四聚體。每個四聚體由兩對相同的多肽鏈組成，每對多肽鏈都有一條“輕”鏈(大約25kDa)和一條“重”鏈(大約50-70kDa)。每條鏈的氨基末端部分包括一個大約100-110個或更多個氨基酸組成的可變區(qū)，主要負責抗原識別。將每條鏈的羧基末端部分定義為恒定區(qū)，主要負責效應子功能。每條輕/重鏈對的可變區(qū)形成抗原結合部位。因此，一個完整的抗體有兩個結合位點。
輕鏈分為κ或λ型。重鏈分為γ、μ、α、δ或ε型，分別將抗體同型定義為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。輕鏈和重鏈中的可變區(qū)和恒定區(qū)由一個大約12個或更多氨基酸的“J”區(qū)連接，重鏈還包括一個大約10個或更多氨基酸的“D”區(qū)。請參照Fundamental Immunology.Paul，W.，ed，.3rded.Raven Press，N.Y.，1993，Ch.9。
輕鏈和重鏈的可變區(qū)中，從N-末端到C-末端，包括有交替出現(xiàn)的構架和CDRsFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。各區(qū)中氨基酸的排列與Kabat的定義(1987&1991)、同上和/或Chothia&Lesk，J.Mol.Biol.196901-917(1987)以及Chothia et al.，Nature 342878-883(1989)中的定義相一致。
一個實施方案中的人源化免疫球蛋白包括至少一個來自于人來源抗體一條或多條連的FRs。因此，F(xiàn)R可以包括一個來自于人來源的一個或多個抗體的FR1、FR2、FR3和/或FR4。一條選定的人源化鏈中的人部分優(yōu)選包括來自于人來源可變區(qū)(如來自于人免疫球蛋白和來自人共有序列)的FR1、FR2、FR3和/或FR4。一個優(yōu)選實施方案中，B7-2輕鏈可變區(qū)的FRs來自于H2F人抗體，而B7-2重鏈可變區(qū)的FRs來自于I2R人抗體。B7-1輕鏈和重鏈可變區(qū)的FRs來自于III-2R抗體。
本發(fā)明中用的非人來源和人來源的免疫球蛋白部分的序列與產(chǎn)生它的免疫球蛋白或免疫球蛋白部分或其變體的序列相同。所述變體中包括因添加、缺失或替換某一個或多個殘基造成的突變體。如上文所示，非人來源的CDRs與非人供體的CDRs基本一樣，而優(yōu)選與非人供體的CDRs相同。正如本文所述，F(xiàn)R的變化，如將人來源的FR的一個殘基替換成供體對應位置中的殘基。FR中可以有一個或多個突變，包括缺失、插入和替換一個或多個氨基酸。在實施例2中人源化HF2.3D1抗體和實施例9中對人源化1F1抗體的設計中，對幾種替換作用進行了描述。對于特定的人源化抗體或人源化鏈來說，其構架突變可按照此處所述進行設計。優(yōu)選B7-2和B7-1人源化免疫球蛋白分別結合B7-2和B7-1，結合的親和性與非人供體相近或比非人供體好?？梢酝ㄟ^多種適當方法產(chǎn)生變體，包括對非人供體或受體人鏈進行誘變。
本發(fā)明中的人源化免疫球蛋白對人B7-2或B7-1有結合特異性，并包括能與B7-2或B7-1的決定簇結合的人源化免疫球蛋白(包括片段)。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明人源化免疫球蛋白至少有鼠HF2.3D1或1F1抗體的一種功能特性，如結合功能(如對B7-2或B7-1有特異性，有相同或相近的表位特異性)和/或抑制功能(如能抑制有CD28或CTLA4的細胞與B7-2或B7-1配體相結合)。因此，優(yōu)選的人源化免疫球蛋白有鼠HF2.3D1或1F1抗體的結合特異性，有鼠HF2.3D1或1F1抗體的表位特異性(如能分別與鼠HF2.3D1或1F1、嵌合HF2.3D1或1F1抗體或者人源化HF2.3D1或1F1競爭結合B7-2或B7-1)和/或抑制功能。
可以通過標準免疫學方法將對B7-2或B7-1有結合特異性的人源化免疫球蛋白的結合功能缺失掉，例如可以用能檢測人源化免疫球蛋白與B7-2或B7-1之間形成復合物的方法(如包括B7-2或B7-1的膜部分或人淋巴細胞系，或者包含能表達B7-2或B7-1的核酸的重組宿主細胞)。
在鑒定和/或分離有所需特異性的人源化免疫球蛋白(如從文庫中鑒定、分離)的流程中，可以用結合和/或附著分析法或者其它適當方法(如能檢測有B7-2或B7-1受體的細胞與B7分子之間附著作用的分析法，或者其它適當方法)。
本發(fā)明中用到的非人來源和人來源的免疫球蛋白部分包括輕鏈、重鏈以及部分輕鏈和重鏈?？梢詮拿庖咔虻鞍字蝎@得或衍生以上免疫球蛋白部分(如從頭合成某一部分)，或者產(chǎn)生并表達編碼有所要特性(如能結合B7-2或B7-1、序列同一性)的免疫球蛋白或其鏈的核酸?？梢杂煤铣傻暮?或重組核酸所制備的能編碼所需人源化鏈的基因(如cDNA)產(chǎn)生出包括有所需部分(如抗原結合區(qū)、CDR、FR、C區(qū))的人源化免疫球蛋白。制備部分鏈時，可以在所需位置引入一個或多個終止密碼子。例如，使用PCR誘變方法來改變已知DNA序列，即可構建出能編碼新設計人源化可變區(qū)的核酸序列(參照Kamman，M.，et al.，Nucl.Acids Res.175404(1989))。編碼新CDRs的PCR引物可以與以同一或很相近的人可變區(qū)為基礎的以前的人源化可變區(qū)的DNA模板雜交(Sato，K.，et al.，Cancer Research 53851-856(1993)))。如果一段相似的DNA序列不能用作模板，那么可以從合成的寡核苷酸構建出包括能編碼可變區(qū)序列的核酸(參照Kolbinger，F(xiàn).，ProteinEngineering 8971-980(1993))。也可以在核酸中引入一段編碼信號肽的序列(如在合成時引入，在載體中插入)。當天然信號肽序列不能用時，可以使用另一抗體的信號肽序列(參考Kettleborough，C.A.，Protein Engineering 4773-783(1991))。使用這些方法、本文所述方法或其它適當方法很容易產(chǎn)生出變體。一個實施方案中，可以對克隆的可變區(qū)進行誘變，可以篩選出能編碼具有所需特異性變體的序列(如可從噬菌體文庫從篩選；參照Krebber et al.，U.S.5514548；Hoogengoom et al.，WO93/06213，1993年4月1日公布))。核酸及包括這些核酸的構建體本發(fā)明還涉及分離的和/或重組(如包括基本純凈的)核酸，這些核酸包括編碼本發(fā)明人源化B7-1或B7-2免疫球蛋白或人源化B7-1或B7-2免疫球蛋白輕鏈或重鏈的序列。
本文中所說的“分離的”核酸是指從它們所來源的基因組DNA或細胞RNA核酸中分離所得的核酸(如當核酸存在于細胞中或核酸混合物如文庫中時)，包括用本文所述方法或其它適當方法獲得的核酸，其中包括基本純凈的核酸、用化學合成產(chǎn)生的核酸、用組合的生物方法和化學方法產(chǎn)生的核酸，以及分離出的重組核酸(參照Daugherty，B.L.，et al.，Nucleic Acids Res.，19(9)2471-2476(1991)；Lewis，A.P.&J.S.Crowe，Gene，101297-302(1991))。
本文中所述“重組”核酸是指用重組DNA方法產(chǎn)生出的核酸，包括那些用依賴于人工重組的流程如聚合酶鏈式反應(PCR)和/或使用限制性酶將核酸克隆到載體(如質粒)上所產(chǎn)生的核酸?！爸亟M”核酸還指的是那些因為通過細胞天然機制而發(fā)生重組事件而產(chǎn)生的核酸，但這些核酸是在核酸引入到細胞中后經(jīng)過了選擇以便使所需的重組事件有可能發(fā)生。
本發(fā)明也更特別涉及分離的和/或重組核酸，核酸中包括分別編碼人源化HF2.3D1或1F1免疫球蛋白的核苷酸序列，亦即“人源化3D1”或“人源化1F1”(如本發(fā)明中其非人部分來自于鼠HF2.3D1或1F1單克隆抗體的人源化免疫球蛋白)或其鏈。一個實施方案中，輕鏈中包括來自于HF2.3D1或1F1抗體輕鏈的三個互補性決定區(qū)，而重鏈中包括來自于HF2.3D1或1F1抗體重鏈的三個互補性決定區(qū)。這樣的核酸包括，如，(a)包括能編碼包括人源化HF2.3D1或1F1免疫球蛋白重鏈可變區(qū)氨基酸序列的多肽序列的核酸(如，圖2A中的SEQ ID NO5或圖7A中的SEQ ID NO25)，(b)包括能編碼包括人源化HF2.3D1或1F1免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)氨基酸的多肽序列的核酸，(如，圖2B中的SEQ ID NO7或圖7B中的SEQ ID NO27)(c)包括能編碼人源化HF2.3D1或1F1免疫球蛋白重鏈或輕鏈可變區(qū)至少功能部分序列的核酸(如包括所述鏈的足以發(fā)揮人源化免疫球蛋白的抗原結合功能的部分)。因為遺傳密碼有簡并性，所以可以制備多種編碼特多肽的核酸。一個實施方案中，核酸中包括的可變區(qū)核苷酸序列與圖2A和/或圖2B和/或圖7A或圖7B中所列相同或與所列基本相同，其中包括雙鏈或單鏈多核苷酸。如上所述，符合這些標準的分離的和/或重組核酸可以包括能編碼與人源化HF2.3D1或人源化1F1抗體或其變體的序列相同的核酸序列的核酸。
本發(fā)明的核酸可用來產(chǎn)生對B7-2或B7-1有結合特異性的人源化免疫球蛋白。例如，可以將編碼本發(fā)明人源化免疫球蛋白的核酸(如DNA)引入到合適的構建體(如載體)中，進一步對該序列進行操作或在適當宿主細胞中生產(chǎn)編碼的多肽。對B7-2和/或B7-1有特異性的人源化免疫球蛋白的生產(chǎn)方法本發(fā)明的另一方面涉及對B7-2或B7-1有結合特異性的人源化免疫球蛋白的制備方法。如通過在適當宿主細胞中表達一種或多種編碼對B7-2或B7-1有結合特異性的人源化免疫球蛋白的重組核酸，可以獲得人源化免疫球蛋白。
本發(fā)明還提供了適合于表達對B7-2和/或B7-1有特異性的人源化免疫球蛋白的構建體或表達載體?？梢詫嫿w導入到適當宿主細胞中，可以在培養(yǎng)基中產(chǎn)生并維持能表達本發(fā)明人源化免疫球蛋白的細胞。合適的宿主細胞可以是原核細胞，包括細菌細胞如E.coli、B.subtilis和其它合適細菌，或者是真核細胞，如真菌細胞或酵母細胞(如Pichia pastoris、Aspergillus species、Saccharomycescerevisiae、Schizosacharomyces pombe、Neurospora crassa)，或者是其它低等真核細胞和高等真核生物細胞，如來自昆蟲的細胞(如Sf9昆蟲細胞(WO94/26087，O’Connor，published November 24，1994))。合適的宿主細胞也可來自于植物、轉基因動物或哺乳動物(如COS細胞、NSO細胞、SP2/0、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、HuT 78細胞、293細胞)(可參照Ausubel，F(xiàn).M.，et al.，eds.Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons Inc.)1993))。
可以用如下方法產(chǎn)生出能產(chǎn)生對B7-2和/或B7-1有結合特異性的人源化免疫球蛋白的宿主細胞。例如，可以將編碼所要人源化免疫球蛋白所有或部分編碼序列的核酸插入到核酸載體中，如DNA載體如質粒、病毒或其它適當?shù)谋磉_單位。許多載體是適用的，包括能維持單拷貝或多拷貝的載體，或者那些可以整合到宿主細胞染色體中的載體。
合適的表達載體可以包含多個組分，包括但不限于以下一個組分或多個組分一個復制起始點；一個選擇性標記基因；一個或多個表達調(diào)控元件，如一個轉錄調(diào)控元件(如啟動子、增強子、終止子)，和/或一個或多個翻譯信號；一個有膜導向或有分泌作用的信號序列或前導序列。構建體中的信號序列由載體或其它來源提供。例如，免疫球蛋白的轉錄信號和/或翻譯信號可以指導表達。
為使基因在合適宿主細胞中表達，需要有啟動子的存在。啟動子可以是組成型或者是誘導型的。例如，可以將啟動子可操作地連接到編碼人源化免疫球蛋白或免疫球蛋白鏈的核酸上，以便能夠指導所編碼多肽的表達?？梢赃x用多種適合于原核宿主(如用在E.coli中的lac、tac、T3及T7啟動子)及真核宿主(如酵母乙醇脫氫酶(ADH)以及SV40、CMV)的合適啟動子。
此外，表達載體通常包括一個選擇性標記，用于選擇帶有載體的宿主細胞，如果是可復制表達載體，將還包括一個復制起始點。編碼能賦予抗生素抗性或抗藥性的產(chǎn)物的基因是常用的選擇性標記，可用在原核細胞(如β-內(nèi)酰氨酶基因(氨芐青霉素抗性)和Tet基因(四環(huán)素抗性))和真核細胞(如新霉素(G418或基因菌素)、gpt(霉酚酸)、氨芐青霉素以及潮霉素抗性基因)中。多種宿主中二氫葉酸還原酶標記基因可以用氨甲蝶呤選擇。酵母中通常選用能編碼宿主營養(yǎng)缺陷型標記基因產(chǎn)物的基因(如LEU2、URA3以及HIS)作為選擇性標記。也可以考慮使用病毒(如桿狀病毒)載體或噬菌體載體以及能整合到宿主細胞基因組中去的載體，如逆轉錄病毒載體。本發(fā)明也涉及攜帶這些表達載體的細胞。
例如，可以用適合于所選宿主的方法(如轉化、轉染、電穿孔、感染)，將編碼對B7-2或B7-1有結合特異性的人源化免疫球蛋白重鏈和輕鏈的核酸(如一種或多種核酸)或者包含這些核酸的構建體(如一個或多個構建體)導入到合適的宿主細胞，以便核酸可操作地與一個或多個表達調(diào)控元件連接(如在載體中、由細胞中過程產(chǎn)生的構建體中、整合到宿主細胞基因組中)?？梢栽谶m合于表達的條件下維持宿主細胞(如在有誘導物存在的情況下、附加有合適鹽類、生長因子、抗生素、營養(yǎng)性添加物等的適當培養(yǎng)基)，由此產(chǎn)生出所編碼的多肽。如果需要的話，可以從宿主細胞、培養(yǎng)基或乳中將編碼蛋白(如人源化HF2.3D1或1F1抗體)分離出來。該過程包括在轉基因動物的宿主細胞中表達(參照如WO92/03918，GenPharm International，1992年3月19日公開)。
可以產(chǎn)生融合蛋白，在融合蛋白中人源化免疫球蛋白或免疫球蛋白鏈在融合蛋白的N-端部位、C-端部位或中間部位與非免疫球蛋白部分(如該部分天然情況下并不出現(xiàn)在免疫球蛋白中)相連。例如，一些實施方案中，可以將編碼免疫球蛋白序列的核酸插入到合適的表達載體中，如pET載體(如pET-15b載體，Novagen)、噬菌體載體(如pCANTAB5E，Pharmacia)或其它載體(如pRIT2T Protein A融合載體，Pharmacia)。所得構建體可以導入到合適的宿主細胞中進行表達。融合蛋白一旦表達，即可用適當親和性基質將融合蛋白從細胞溶胞物中分離或純化出來(參照Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel，F(xiàn).M.et al.，eds.，Vol.2，Suppl.26，pp.16.4.1-16.7.8(1001))。治療方法及組合物T-細胞有兩種類型輔助T-細胞和細胞毒性T-細胞。輔助T-細胞能識別與主要組織相容性復合體(MHC)相偶連的抗原?？乖蔬f細胞將抗原內(nèi)化，并重新表達具有MHC分子的抗原。一旦識別抗原，細胞因子就開始分泌。細胞因子的分泌將激活B-淋巴細胞、細胞毒性T-細胞、吞噬細胞及其它細胞。然而，細胞因子的分泌和細胞的增殖需要的不單單是抗原的識別。T-細胞的完全激活需要第二個信號即“共刺激信號”。這些共刺激信號有起始、維持及調(diào)節(jié)激活級聯(lián)的作用。其中一個重要的共刺激途徑叫作B7CD28/CTLA4途徑。
B7CD28/CTLA4途徑涉及兩個共刺激配體，B7-1(CD80)和B7-2(CD86)?？乖蔬f細胞上的B7-1和B7-1配體各自與T-細胞上的兩個受體CD28和CTLA4結合。
B7多肽、B7-1(CD80)和B7-2(CD86)的表達受到嚴格調(diào)節(jié)(Linsley，PS et al.，Immunity 1793-801(1994))。除了樹突細胞外，未被刺激的呈遞抗原細胞通常不表達B7-1和B7-2。樹突細胞、表皮朗格漢斯細胞、B細胞以及巨噬細胞在激活后，將對B7-2和B7-1的表達進行正調(diào)節(jié)。此外，B7-2可以在粒性白細胞和T-細胞分子上表達，而B7-1可以在成纖維細胞和T-細胞分子上表達(Reiser，et al.，New England J.of Med.，33518，1369-1377，1371(1996)))。
在大多數(shù)免疫應答中，B7-2的誘導比B7-1的誘導提前，并能上升到更高水平。B7-2也影響白細胞介素-4(IL-4)的產(chǎn)生以及2型輔助細胞的產(chǎn)生。在沒有CD4 T細胞的情況下，B7分子(B7-1和B7-2)也負責共刺激CD8 T細胞，CD4 T細胞在產(chǎn)生對黑素瘤的疫苗的過程中有協(xié)助作用。B7分子能共刺激天然殺傷細胞和γ/δT細胞。因此，B7分子調(diào)控作用對抗腫瘤免疫和抗微生物免疫有協(xié)助作用。
B7CD28/CTLA4途徑參與多種疾病，包括傳染病、哮喘、自身免疫病、炎癥失調(diào)的發(fā)病，移植器官的排斥作用以及移植物抗宿主疾病。該途徑也參與刺激免疫系統(tǒng)的預防及其機制。用編碼共刺激物如B7的基因進行的轉染作用，可用于產(chǎn)生抗腫瘤和抗病毒疫苗。B7分子也參與自身免疫病如系統(tǒng)性紅斑性狼瘡、糖尿病、哮喘、胰島炎、關節(jié)炎、炎性腸道疾病、炎性皮炎(如牛皮癬和遺傳過敏性皮炎)以及多發(fā)性硬化(Reiser，et al.，New England J.of Med.，335(18)1369(1996))。因此，本發(fā)明包括本文所述疾病的治療方法，包括給患者投以與B7-1和/或B7-2結合的免疫球蛋白。免疫球蛋白在投藥時要用治療有效量，免疫球蛋白可以以載體的形式投藥。
治療患病個體就是要減輕或緩和與疾病相關的一種或多種癥狀。治療有移植排斥的個體，意味著減輕或緩和與移植排斥相關的一種或多種癥狀(如發(fā)熱、腎機能喪失、膨脹腎、T細胞/APC細胞攻擊排斥)。抑制個體疾病就是抑制疾病的一種或多種癥狀的發(fā)生。抑制移植排斥意味著降低與移植排斥并發(fā)的一種或多種免疫應答。
因此，對B7分子的功能進行調(diào)整或影響，可能對治療有本文所述疾病的個體會有幫助。對B7的調(diào)整作用，對治療有免疫相關疾病或自身免疫病及有B7-2和/或B7-1參與的失調(diào)的個體也會有用。對B7-2或B7-1的調(diào)整作用，也可用于治療IL-4相關或受IL-4影響和/或2型輔助細胞產(chǎn)生相關或受其影響的疾病。這些失調(diào)/疾病可以用對B7-2和/或B7-1特異的抗體治療。該抗體優(yōu)選為對B7-2或B7-1特異的人源化抗體。共投藥抗B7-2抗體、抗B7-1抗體，包括其嵌合形式和人源化形式和/或對應于受體CD28和CTLA4的抗體，對治療這些疾病會有幫助。
除了本文所述的疾病外，能與B7-1和/或B7-2結合的免疫球蛋白可以投藥給有移植組織、移植器官或移植細胞的人。對B7途徑的抑制可以預防或減輕移植組織、移植器官或移植細胞的排斥作用。本發(fā)明涉及長期性(如幾天、幾個月、幾年)地治療急性和/或慢性移植排斥。急性移植排斥通常發(fā)生在移植的前幾個星期之內(nèi)，而慢性排斥通常發(fā)生在前幾周之后。本文中描述了抗B7-1抗體和抗B7-2抗體的投藥量。
本發(fā)明尤其涉及治療移植受體或預防移植排斥的方法。該方法包括為了預防移植后的排斥作用而投以足夠量的人源化抗B7-1抗體和人源化抗B7-2抗體。移植的可以是細胞、組織或器官?？贵w的投藥可以在移植之前和/或移植之后，也可以在移植時投藥。抗體以劑量的形式投藥(如大約在1mg/kg和大約100mg/kg之間)。具體地講，在移植當天服用較大劑量的抗體(例如，大約1-25mg/kg)，而在移植之后，定期服用較小劑量的抗體(例如，大約1-5mg/kg)。值得注意的是，這樣的投藥使針對移植排斥的免疫應答發(fā)生顯著降低，甚至能徹底預防免疫應答的發(fā)生。請參照實施例22和23。
治療方法中也涉及與人源化抗B7-2抗體和人源化抗B7-1抗體一起共投藥其它標準治療藥物(如用于調(diào)整有移植器官、組織、細胞等的個體免疫應答的藥物)。這樣的藥物包括氨甲蝶呤、能阻止免疫細胞生長或抑制細胞周期前進的免疫抑制劑(如納巴霉素)、類固醇(如強的松或其衍生物)、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(如環(huán)孢菌素或FK506)、抗CD40途徑抑制劑(如抗CD40抗體、抗CD40配體抗體以及CD40途徑的小分子抑制劑)、移植補救途徑抑制劑(如mycophenolate mofetil(MMF))、IL-2受體拮抗劑(如Hoffmann-la Roche Inc.公司的Zeonpax以及Novartis，Inc.公司的Simulet)及其類似物，或者是未來發(fā)展起來的移植排斥藥物。本文所述數(shù)據(jù)表明，當環(huán)孢菌素A、強的松以及納巴霉素這些化合物中任何一種與人源化抗B7-1抗體和人源化抗B7-2抗體一起投藥時，環(huán)孢菌素A、強的松以及納巴霉素預在防移植排斥方面尤其有效。這些化合物的投藥量有所不同。投藥量取決于個體中這些化合物的血清濃度。血清濃度越高，所需劑量就越低；而血清濃度越低，所需劑量就越高。例如，當和人源化抗B7-1抗體和人源化抗B7-2抗體一起投藥時，環(huán)孢菌素A的投藥量可以在大約150ng/ml到大約100mg/ml之間(如200-300ng/ml)，強的松的投藥量可以在大約0.2mg/kg到大約2.0mg/ml之間，甲基強的松的投藥量可以在大約0.2mg/kg到大約2.0mg/kg之間，而納巴霉素的投藥量可以在大約0.5mg/kg到大約2.0mg/kg之間。
本發(fā)明包括給需要移植的個體移植細胞(如血細胞或血液組分，或骨髓)的體內(nèi)方法。例如，需要如此移植的個體有能用這樣的移植治療的疾病(例如，增生病如白血病、淋巴瘤、癌，貧血癥如鐮狀細胞貧血癥、地中海貧血癥和再生障礙性貧血，先天性代謝失調(diào)，先天性免疫缺陷病，以及骨髓相位異常綜合癥)。該方法包括從供體獲得細胞。供體骨髓通常既包括未成熟淋巴細胞又包括成熟淋巴細胞。除骨髓細胞外，來自供體的血細胞還可以是干細胞或未成熟的血細胞。供體細胞優(yōu)選來自但并不限于與病人/受體有相似特性的人(如供體的骨髓與病人的骨髓相匹配)。通過分析確定受體是否與病人相匹配的特性有1類MHC和2類MHC(如HLA-A、HLA-B和/或HLA-DR)。該方法包括讓細胞(如骨髓或其它血液組分)接觸對B7-1特異的免疫球蛋白和/或對B7-2特異的免疫球蛋白以及受體細胞(如來自于病人的淋巴細胞)，以便獲得被稱為“治療細胞”的混合物?？贵w的用量取決于細胞的數(shù)目。細胞量越多，需要的抗體就越多；細胞量越少，需要的抗體就越少。本文所述實驗中每種抗體的用量均為10mg/ml，超出10-100倍。本實施方案中抗B7-1抗體和/或抗B7-2抗體的用量應該足以誘導無應變性的產(chǎn)生，如大約0.01-10mg/ml。供體細胞、免疫球蛋白和受體細胞的接觸時間要長到足以誘導耐受性(如大約1-96小時，優(yōu)選大約36-48小時)。耐受性誘導(如，無應變性)是指用B7-1抗體和/或B7-2抗體治療后誘導的對抗原反應性的喪失，于是T-細胞不再對抗原充分或完全應答。參照實施例18。受體細胞(如外周血淋巴細胞(PBL)、或表達I類抗原(MHC-1)的淋巴細胞)擴散后能抑制細胞分裂。受體細胞的取代物可以是能表達MHC I類抗原及B7-1和/或B7-2分子的組織、器官或工程細胞。該方法還包括將混合物(如治療細胞)或治療骨髓導入到病人體內(nèi)。該治療方法的目的是預防移植物抗宿主疾病。例如，治療骨髓中的細胞對受體同種抗原產(chǎn)生耐受性，于是就減少或根除了移植物抗宿主疾病發(fā)生，并能增強骨髓(如干細胞)的移植能力。因此，本發(fā)明的方法包括治療、預防或幫助預防移植物抗宿主疾病?？笲7-1抗體和抗B7-2抗體降低了受體對供體骨髓或供體細胞的排斥作用。然而，本方法能夠在不顯著損害病人對其它外源細胞和抗原進行檢測和產(chǎn)生免疫應答能力的情況下減少排斥反應的發(fā)生。所以，這些方法使得移植成為受體特異性，并使得在不損害移植物的情況下能對外源抗原產(chǎn)生排斥。參照實施例部分。
本發(fā)明也涉及通過給個體投以人源化抗B7-1抗體和/或人源化抗B7-2抗體來降低個體對抗原的抗體應答?？贵w可以在有抗原存在時投藥?？乖梢允巧L因子、凝血因子、細胞因子、趨化因子、基因治療載體或激素。例如，抗原尤其可以是破傷風類毒素、因子VIII、因子IX、胰島素、生長激素或基因輸送載體?？乖梢砸远嚯男问交蛞院怂嵝问?例如，基因通過腺伴隨病毒、反轉錄病毒、裸露DNA載體等送遞)投藥。抑制抗體對其抗原的應答對治療許多疾病有幫助，例如血友病患者對服用的因子VIII或因子IX產(chǎn)生抗體應答，因此導致了血液凝固問題。本文所述數(shù)據(jù)表明，給個體投以有效量的人源化抗B7-1抗體和/或人源化抗B7-2抗體及模型抗原破傷風類毒素后抑制了對破傷風類毒素的抗體應答?？贵w可以與抗原一起投藥，或者在服用抗原前后及時投藥(如之前不久即投藥或之后馬上投藥)，以便賦予個體想要的效果，如抑制抗體應答。人源化抗B7-1抗體和人源化抗B7-2抗體可以在服用抗原大約3周(抗體半衰期)之內(nèi)投藥，例如在投以抗原之前大約14天和投以抗原之后大約2天之間投藥。人源化抗B7-1抗體和人源化抗B7-2抗體的投藥量在大約0.01mg/kg和10mg/kg之間。
本發(fā)明涉及有或沒有載體的含有一種人源化抗B7-1抗體和/或人源化抗B7-2抗體的藥用組合物。一個優(yōu)選實施方案是投以注射形式或膠囊形式的B7-1和/或B7-2免疫球蛋白。注射形式尤其可以是靜脈注射或皮下注射。術語“藥用載體”或“載體”指的是通常所用的相對惰性和無毒性的賦形劑或給藥組合物。典型的載體包括碳酸鈣、蔗糖、右旋糖、甘露糖、清蛋白、淀粉、纖維素、硅膠、聚乙二醇(PEG)、干脫脂乳、米粉、硬脂酸鎂等等。在Remington’s PharmaceuticalSciences(17th Ed.，Mack Pub.Co.，Easton，PA)中描述了適用的制劑和附加載體。
適用載體(如藥用載體)也包括但不限于無菌水，鹽溶液(如林格液)，乙醇，聚乙二醇，明膠，糖類如乳糖、直鏈淀粉或淀粉，硬脂酸鎂，滑石粉，硅酸，粘性石蠟，脂肪酸酯，羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等。這些制劑可以滅菌，如果需要的話，還可以和輔助劑如潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽類、緩沖液、顏料和/或芳香物質等并不與免疫球蛋白發(fā)生有害反應的輔助劑一起混合。需要的時候，制劑還可以和其它活性物質如能降低代謝降解作用的酶抑制劑混合使用。載體(如藥用載體)是優(yōu)選的，但在投以免疫球蛋白時并非是必要的。
為了腸胃外的使用，尤其適用的是注射的無菌溶液，優(yōu)選油溶液或水溶液，還有懸浮液、乳液或植入劑，包括栓劑。用于腸胃外給藥的載體尤其包括右旋糖的水溶液、鹽水、純水、乙醇、甘油、丙二醇、花生油、芝麻油、聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段聚合物等。壺腹、小瓶及注射器是方便的單位劑量。
本發(fā)明的免疫球蛋白的投藥可以是經(jīng)靜脈內(nèi)的、經(jīng)腸胃外的、經(jīng)肌內(nèi)的、經(jīng)皮下的、經(jīng)口的、經(jīng)鼻的，可以通過吸入、植入、注射或栓劑方式投藥。為了賦予想要的效果，組合物可以以單一劑量方式或長期多劑量形式投藥。
免疫球蛋白的實際有效量可以根據(jù)所用的特異免疫球蛋白、設計的特定組合物、投藥方式以及病人的年齡、體重、狀況和紊亂或疾病的嚴重程度等有所不同。正如本文所用，有效量的B7-1免疫球蛋白和/或B7-1免疫球蛋白能調(diào)整或抑制B7/CD28/CTLA4途徑。本文對特定病人的劑量進行了描述，其劑量由本領域中的熟練人員通過傳統(tǒng)方法來決定(如用合適的傳統(tǒng)藥物方案)。
人源化B7-1抗體、人源化B7-2抗體和/或其它藥物的投藥可以是同時性的或順序性的。這些化合物或組合物可以在其之前、在其之后或同時投藥。所以，本文所用術語“共投藥”的意思是，人源化B7-1抗體和/或B7-2抗體和/或其它組合物在投藥時能治療本文所述疾病或能誘導耐受性(如氨甲蝶呤，納巴霉素，環(huán)孢菌素，類固醇，抗CD40途徑抑制劑如抗CD40途徑抗體、抗CD40配體抗體和CD40途徑的小分子抑制劑，移植補救途徑抑制劑如mycophenolate mofetil(MMF)，IL-2受體拮抗劑如Hoffmann-la Roche Inc.公司的Zeonpax以及Novartis，Inc.公司的Simulet及其類似物)。本發(fā)明的方法不限于抗體或組合物的投藥次序，只要它們投藥及時接近能產(chǎn)生所要的效果就行。
本發(fā)明也涉及用人源化抗B7-2抗體或抗B7-1抗體分別確定B7-2或B7-1存在、不存在或水平的方法。B7-2或B7-1存在或不存在可以用分析法(如ELISA、放射免疫測定法(RIA)、FACS或免疫組織化學)進行檢測。該分析法可以是直接進行檢測也可以是間接進行檢測(如競爭性分析法)。
例如，為了在適當樣品中用ELISA分析法鑒定B7-2或B7-1存在或不存，方法中包括將適當樣品與含有作為檢測器的人源化或鼠抗B7-2抗體或抗B7-1抗體的組合物(如生物素化的抗B7-2或B7-1mAb和HRP-鏈霉親和素或HRP綴合的抗B7-2或B7-1mAb)以及，在其上面結合有(直接或間接)抗B7-2或B7-1捕捉抗體的固相支持物(如微量滴定板)混合。在適合于抗B7-2抗體或抗B7-1抗體與B7-2或B7-1之間形成復合物的條件下，檢測(器)抗體可以分別與不同的B7-2或B7-1的表位結合，而捕獲抗體識別B7-2或B7-1的表位。方法還包括對樣品中復合物的形成進行鑒定。
也可以用放射免疫測定法或熒光分析法鑒定B7-2或B7-1的存在與否。例如，可以用免疫結合分析法評估B7-2或B7-1的存在與否，包括獲得樣品，在適合于形成標記復合物的條件下讓樣品與含有抗B7-2或B7-1抗體(如含有放射性標記或熒光標記的人源化或鼠抗B7-2或B7-1抗體；或包括一個第二個抗體結合位點的人源化或鼠抗B7-2或B7-1抗體，而第二個抗體包含放射性標記或熒光標記)的組合物接觸，其量優(yōu)選超過需要結合B7-2或B7-1的量。方法中還包括鑒定(檢測或測定)樣品中復合物的形成。同樣，使用本發(fā)明中的人源化抗B7-1或B7-2抗體，通過熒光激發(fā)細胞分類(FACS)分析法或組織的組織化學分析法鑒定B7-1或B7-2的存在、不存在或水平。
實施例現(xiàn)在將通過以下實施例闡明本發(fā)明，這些實施例并沒有要限制的意思。實施例1鼠3D1可變區(qū)cDNA的克隆和測序從雜交瘤細胞中分離的mRNA，通過錨式PGR(Co et al.，JImmunol.1481149(1992))方法克隆出了鼠3D1(亦即HF2.3D1)重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)cDNA。所用5’引物與加到cDNA上的聚-dG尾退火，而3’引物與恒定區(qū)退火。隨后將擴增出的基因片段插入到質粒pUC18中。從多個獨立克隆中對VL和VHcDNA進行了核苷酸序列的鑒定。對于輕鏈，鑒定出的兩種獨立序列都與鼠輕鏈可變區(qū)序列同源。但是其中一種序列是沒有功能的，因為丟失了一個核苷酸導致V-J結合處發(fā)生移碼，該序列被鑒定為無效等位基因。另一個序列是典型的功能型鼠κ鏈可變區(qū)。圖1A-1B中顯示出重鏈和功能型輕鏈的可變區(qū)cDNA序列以及其翻譯氨基酸序列。鼠VL序列屬于Kabat氏鼠κ鏈亞類I。鼠VH序列屬于Kabat氏重鏈亞類II(A)。實施例2人源化3D1可變區(qū)的設計為了保留人源化抗體中鼠抗體的結合親和性，參照了Queen等的一般性程序(Queen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8610029(1989)，美國專利Nos.5585089&5693762，其內(nèi)容在此完整引入作為參考)。在保留高結合親和性時構架殘基的選擇至關重要。原則上講，任一人抗體的構架序列都可以作為CDR嫁接的模板；然而研究表明，直接將CDR替換到構架中可能會導致嚴重失去對抗原的結合親和性(Tempest et al.，Biotechnology 9266(1992)；Shalaby et al.，J.Exp.Med.17217(1992))。人抗體與其來源的鼠抗體的同源性越高，人構架將畸變引入到鼠CDRs中的可能性就越小，而畸變將降低親和性。鑒于序列同源性，選擇I2R提供人源化3D1重鏈的構架，而選擇H2F提供人源化3D1輕鏈可變區(qū)(Manheimer-Lory，A.et al.，J.Exp.Med.174(6)1639-52(1991))。其它高度同源人抗體鏈也適合于提供人源化抗體構架，尤其是由Kabat定義的人亞類4的κ輕鏈以及人亞類1的重鏈。
為了降低輕鏈和重鏈兩鏈組裝時發(fā)生不相容性的可能性，通常選擇來自同一人抗體的重鏈和輕鏈提供構架序列。I2R抗體顯示出與3D1重鏈和輕鏈的高度同源性，因此可以用于提供起始人源化抗體模型的構架。然而，與其它任何構架包括I2R相比，3D1輕鏈可變區(qū)顯示出與H2F構架有顯著更高程度的同源性。因此，選擇H2F提供人源化3D1輕鏈可變區(qū)的構架，而選擇I2R提供重鏈可變區(qū)的構架。
可以用電腦程序ABMOD和ENCODE(Levitt et al.，J.Mol.Biol.168595(1983))構建一個3D1可變域分子模型，可以用該分子模型定位3D1構架中與CDRs距離足夠近的有可能與CDRs發(fā)生相互作用的氨基酸。為了設計人源化3D1重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，將鼠3D1重鏈中的CDRs嫁接到人I2R重鏈構架區(qū)中，而將鼠3D1輕鏈的CDRs嫁接到人H2F輕鏈構架區(qū)中。在電腦模型顯示出的與CDRs顯著臨近的構架位置處，將鼠抗體的氨基酸替換成人來源的構架氨基酸。對于人源化3D1抗體，替換發(fā)生在重鏈的殘基27、30、48、67、68、70和72以及輕鏈殘基22處。此外，將很少發(fā)生在人抗體數(shù)據(jù)庫位置處的構架殘基在同樣位置替換成人共有氨基酸。對于人源化3D1，替換發(fā)生在重鏈殘基113處和輕鏈殘基3處。
圖2A-2B中顯示了人源化3D1抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的序列。然而，許多可能與CDR接觸的殘基可以替換成其它氨基酸，替換后抗體仍能保留對抗原的基本親和性。表1列舉出構架處多個適合的可替換的氨基酸(LC＝輕鏈，HC＝重鏈)。表中指明的位置是從成熟鏈第一個氨基酸起氨基酸的編號，成熟鏈的第一個氨基酸由雙下劃線顯示出(圖2A-2B)。例如，位置LC-22即是從雙下劃線天冬氨酸D開始數(shù)起的第22個氨基酸(或者從起始密碼子起第42個氨基酸)。
表1.氨基酸的替換和/或可變換的氨基酸
同樣，在不使人源化抗體的親和性或非免疫原性發(fā)生顯著丟失的情況下，人源化3D1重鏈和輕鏈中許多并不與CDRs接觸的構架殘基可以替換成來自I2R和H2F構架、來自其它人抗體、來自鼠3D1抗體或來自其它鼠抗體中對應位置的氨基酸。表2列舉出構架中多個適于替換成其它氨基酸附加位置。
表2.構架區(qū)氨基酸的替換和/或可變換的氨基酸
選擇各種可替換氨基酸可以產(chǎn)生出多種人源化3D1，這些不同版本的人源化3D1在其親和性、特異性、非免疫原性、容易制備和其它合意特性等方面可以有不同的組合。因此上表中的例子只是用來舉例說明，而沒有限制的意思。實施例3人源化3D1的構建如上文所述一旦人源化可變區(qū)氨基酸序列設計好后，就要構建編碼這些序列的基因，包括信號肽、剪接供體信號以及合適的限制位點(圖2A-2B)。用8種長度為大約65-80個堿基的互相重疊的合成寡核苷酸構建和擴增輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因(參照He et al.，J.Immunol.1601029(1998))。寡核苷酸退火配對后，用DNA聚合酶I的klenow片段延伸產(chǎn)生出四個雙鏈片段。所得片段變性、退火后，用Klenow延伸產(chǎn)生兩個片段。這些片段變性、退火配對后再次延伸，產(chǎn)生出一個全長基因。所得產(chǎn)物通過聚合酶鏈式反應(PCR)用Taq聚合酶擴增，擴增產(chǎn)物通過膠純化、用Xba I消化、再用膠純化后，將其亞克隆到pVk的Xba I位點上以便表達輕鏈，而將其克隆到pVg4或pVg2.M3上以便表達重鏈。以前已經(jīng)對表達κ輕鏈的pVk載體進行了描述(參照Co et al.，J.Immunol.1481149(1992)).表達γ4重鏈的pVg4載體的構建是通過用人g4恒定區(qū)基因(Ellison & Hood，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 791984(1982))的大約2000bp的片段取代pVg1中包含γ1恒定區(qū)基因的Xba I-BamH I片段(參照Co et al.，J.Immunol.1481149(1992))。而人g4恒定區(qū)基因從γ4基因CH1外顯子前的HindIII位點一直延伸到緊接γ4基因CH4外顯子的Nsi I位點之后270bp。Cole等(Cole et al.，J.Immunol.1593613(1997))對表達γ2重鏈的pVg2.M3載體進行了描述。通過將人野生型IgG2中234位和237位的氨基酸Val和Gly替換成Ala而突變產(chǎn)生了pVg2.M3.這種變體對其Fc受體的相互作用減弱了，所以有最低程度的抗體效應子活性。
通過核苷酸測序以及限制酶切作圖對最終質粒的結構進行了核實。所有DNA操作都是按照本領域中熟練人員熟知的標準方法進行的。
制備兩個人源化3D1抗體、IgG4和IgG2.M3作比較研究。將輕鏈和相應的重鏈質粒轉染到鼠骨髓瘤細胞系Sp2/0-Ag14(ATCC CRL 1581)中，以構建一個能產(chǎn)生人源化3D1抗體(3D1抗體IgG4或IgG2.M3)的細胞系。同樣也用本領域熟知的方法用質粒轉染CHO細胞。轉染之前用限制性內(nèi)切核酸酶將包含重鏈的質粒以及包含輕鏈的質粒線性化。κ鏈和γ2鏈的線性化用Fsp I；γ4鏈的線性化用BstZ17 I。在PBS中，將大約20μg輕鏈質粒和重鏈質粒轉染到1×107個細胞中。根據(jù)廠商的指導手冊用基因脈沖發(fā)生器(BioRad)在360V和25μFD容量下通過電穿孔方法實現(xiàn)轉染。每次轉染后的細胞在四個96孔組織培養(yǎng)板上鋪平板，兩天后使用選擇培養(yǎng)基(DMEM，10％FCS，1×HT增補物(Sigma)，0.25mg/ml黃嘌呤，1μg/ml霉酚酸)。
大約兩周之后，出現(xiàn)的克隆用ELISA篩選抗體的產(chǎn)生。高產(chǎn)克隆中抗體的制備方法是，讓細胞在正常培養(yǎng)基(DMEM和10％FCS)上生長到鋪滿，然后培養(yǎng)基替換成無血清培養(yǎng)基(雜交瘤SMF；Gibco)，一直培養(yǎng)到培養(yǎng)物中抗體效價達到最大為止。培養(yǎng)物上清液通過蛋白A-Sepharose柱(Pharmacia)；用0.1M甘氨酸，100mM NaCl，pH3洗脫抗體，中和后換成磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。通過在丙烯酰胺膠上分析抗體鑒定抗體的純度，由OD280讀數(shù)確定抗體的濃度，假定1.0mg抗體蛋白的OD280讀數(shù)為1.4。實施例4人源化抗B7-2抗體的親和性競爭性結合測定用競爭性結合測定法檢測鼠和人源化3D1抗體與B7-2抗原的相對親和性。將未標記的人源化或鼠3D1抗體的三倍系列稀釋液與固定量放射性碘化鼠3D1抗體(包含2％胎牛血清的PBS中40000-50000cpm/檢測)混合。
隨后加入1×105個表達細胞表面rhB7-2(CHO/hB7-2)的CHO細胞，混合物(總體積200μl)在輕微振蕩的情況下于4℃培育2hr。然后將細胞-抗體懸浮液轉移到包含100μl的80％二丁基氨甲酰苯甲酸-20％橄欖油的Sarstedt Micro Tubes(part#72.702)中。用微量離心機離心后，將Sarstedt管放置到干冰中靜置數(shù)分鐘。檢測細胞結合態(tài)125I的方法是，將每支管(包含細胞沉淀)的尖端剪切到閃爍瓶中并在γ計數(shù)器中計數(shù)。根據(jù)Berzofsky和Berkower(J.A.Berzofsky &J.Berkower，in Fundamental Immunology 9ed.W.E.Paul，RavenPress(New York)，595(1984))的方法對結合態(tài)和游離態(tài)數(shù)值進行鑒定，并用其比例對非標記競爭抗體濃度進行作圖。細胞系能在膜表面表達hB7-2的重組中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系是從用B7-2 cDNA序列轉染且有G418抗性的細胞中克隆來的。用鼠抗B7抗體和FACS分析法對存在選擇壓的情況下細胞經(jīng)過多次傳代后CHO表面表達的hB7-2進行了檢測。125I標記的抗hB7mAb的制備及其特性根據(jù)廠商的指導手冊(Amersham Corp.，Arlington Hts，IL)，通過與125I-Bolton-Hunter試劑反應用125I標記抗hB7抗體。用NAP-25柱將蛋白與游離試劑分離開來。使用HPLC大小排阻柱核實抗體是否保留了完整性而未聚集成團，并用該柱測定抗體相對由非標記抗體制備的標準的蛋白濃度。通常得到的標記是4-8微居里/毫克蛋白，或者抗體分子中大約30-60％標記上了。結果圖3中表示競爭性結合曲線。每一數(shù)據(jù)點代表的是三次重復測定的平均值。結果顯示出人源化IgG4和人源化IgG2.M3抗人B7-2抗體都與鼠抗B7-2抗體一樣有著相似的高結合親和性(大約1×109M-1)，這表明人源化3D1中沒有丟失對B7-2的親和性。鼠抗B7-2抗體和人源化抗B7-2抗體都能高親和性地識別細胞表面表達的hB7-2.實施例5.人源化抗B7 mAbs與CHO/hB7細胞的直接結合細胞結合測定結合測定開始時以10000 CHO/hB7-2細胞/孔的密度將細胞鋪到96孔組織培養(yǎng)平板上。兩天后，貼壁細胞用包含脫脂奶粉蛋白(用于封閉非特異性結合)和疊氮鈉(用于預防細胞將抗體內(nèi)化)的測定緩沖液輕柔漂洗。對于直接結合測定來說，在測定緩沖液中將125I標記的抗B7抗體(125I-鼠抗B7-2；826cpm/fmol；人源化抗人B7-2，883cpm/fmol)進行系列稀釋并在細胞上溫浴過夜，使抗體與細胞表面的B7-2結合并達到平衡。將未結合的抗體從細胞上輕柔漂洗下來，用125I閃爍體和光檢測器系統(tǒng)對結合態(tài)125I標記抗體進行檢測。與CHO細胞的非特異性結合可以以與每一稀釋相同的方式進行檢測，而能表達B7-1分子的細胞不能被測試抗體識別。結果圖4中顯示出直接結合圖。用Graphpad PrismJ軟件分析表明，扣除掉非特異性結合后三份孔的平均值符合雙曲線飽和曲線。對應于半-最大結合的濃度定為抗體的KD，表明鼠和人源化抗B7-2mAbs對B7-2有相似的、高的結親和性(～10-9m)。鼠抗B7-2mAbs和人源化抗B7-2mAbs都能高親和性地與細胞表面表達的B7-2結合。實施例6人源化抗B7mAbs與蛋白配體的結合用BIACORE測定親和性用BIACORE生物傳感器(BIACORE；Uppsalla，Sweden)檢測鼠抗B7-2抗體和人源化抗B7-2人抗體與人B7-2Ig的結合動力學。將人B7-2Ig(hB7-2Ig)固定到BIACORE生物傳感器芯片的葡聚糖基質上。分別在200、100、50和20nM濃度檢測人源化和鼠抗人B7-2。每種稀釋在每次操作時檢測4次，共進行三次不同操作。用SurfacePlasmon Resonance(SPR)在實際時間對抗人B7-2抗體結合進行檢測，并在BIA評估軟件(3.1版本)中用二價結合模型進行全面分析。要檢測每一樣品的締合常數(shù)(ka)、解離常數(shù)(kd)以及平衡解離常數(shù)(KD)。hB7-2Ig的制備從培養(yǎng)分泌hB7-2Ig的工程化CHO細胞的培養(yǎng)基中得到可溶性hB7-2Ig。重組hB7-2Ig的衍生方式是，將對應于B7-2基因的胞外域的DNA編碼序列與人IgG1重鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域融合。用蛋白A從培養(yǎng)基中純化重組hB7-2Ig。結果表3列出來自鼠和人源化抗人B7-2mAbs的平均值。用SPR測定的鼠和人源化抗人B7-2mAbs的結合常數(shù)結果表明，鼠和人源化抗B7-2mAbs形式相似，且鼠抗B7-2mAbs與固定化hB7-2Ig的結合常數(shù)比人源化抗B7-2與固定化hB7-2Ig的結合常數(shù)稍微高些。計算出鼠抗B7-2mAb有大約2.8倍更高的親和性，這顯示出在人源化過程中鼠和人源化抗B7-2mAbs之間有實際差異但差異輕微。產(chǎn)生這種結果的另一種可能性可能是在抗體的制備、加工和分析過程中出現(xiàn)技術性變異的緣故。正如實施例4、5和7所示，在基于細胞的測定中沒有觀察到人源化hB7-2有什么差異。表3由BIACORE測定的抗B7-2mAbs的親和性
實施例7.由人源化抗B7-2產(chǎn)生對T細胞共同刺激的抑制作用。CD28+T細胞/CHO-B7增殖測定按本文所述分離CD28+T細胞漂洗一次后重懸浮在RPMI完全培養(yǎng)基中，補加2ng/ml PMA(Calbiochem)使細胞密度達到5×105細胞/毫升。將CD28+T細胞(100μl，5×104個細胞)加到抗體/CHO/hB7-2混合物中(見下文)，于37℃、5％CO2條件下溫浴3天，采用脈沖方式用1uCi的[3H]-胸苷(NEN，Boston，MA)檢測培養(yǎng)最后6小時的T細胞增殖情況。在濾器上收集細胞，用閃爍計數(shù)器測定摻入的放射性活度。材料
參照文獻(June et al.，Mol.Cell.Biol.74472-4481(1987))所述，用免疫吸收方法通過負選擇方式從人外周血淋巴細胞中分離CD28+人T細胞。通過leukophoresis從健康人供體中獲得裸外殼，通過密度梯度離心分離外周血淋巴細胞(PBL)。用塑料吸收方法將單核細胞從PBL中去除掉。用CD11、CD20、CD16和CD14的抗體(這套抗體將覆蓋所有的B細胞、單核細胞、大顆粒淋巴細胞以及CD28+T細胞)通過負選擇并用羊抗鼠免疫球蛋白包裹的磁性顆粒通過磁珠分離方法從非貼壁細胞中分離CD28+T細胞。
組織培養(yǎng)平板在無Ca2+和Mg2+的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)并有0.5mMEDTA存在的溶液中溫浴，使CHO/hB7-2細胞從組織培養(yǎng)平板上解吸下來，經(jīng)過漂洗后用新配制的低聚甲醛固定。
于37℃、5％CO2條件下，在100μl RPMI完全培養(yǎng)基(于微量滴定板(平底，96孔，Costar，Cambrige，MA)中RPMI1640培養(yǎng)基，10％胎牛血清(FBS)，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素)中將各種濃度的抗B7-2抗體(各雙份)溫浴1小時。結果圖5顯示出由鼠和人源化抗B7-2mAbs產(chǎn)生對CD28+T細胞增殖的抑制作用結果。兩種抗體都展示出對由B7-2驅動的T細胞增殖的劑量依賴性抑制作用，二者的IC50(抑制濃度的50％；50％抑制最大T細胞增殖所需的抗體量)值相近，分別是72pm(鼠抗hB7-2)和50pm(人源化抗hB7-2)。這表明兩種抗體是相近的，在抑制B7-2 T細胞刺激信號方面都非常有效。這說明高親和性抗B7-2mAbs可以通過抑制(如預防)人T細胞的激活作用和/或增殖作用封閉B7-2的功能性。這些mAbs在用于體內(nèi)抑制T細胞應答方面有可能表現(xiàn)出相近的能力。實施例8鼠1F1可變區(qū)cDNA的克隆和測序鼠1F1重鏈和輕鏈可變區(qū)cDNA是利用錨式PCR從分離自雜交瘤的mRNA中克隆來的(Co et al.，J.Immunol.1481149(1992))。所用5’引物與加到cBNA上的poly-dG尾退火，而3’引物與恒定區(qū)退火。隨后將擴增出的基因片段插入到質粒pUC19中。對于VH和VLcDNA，均從數(shù)個獨立克隆中鑒定其核苷酸序列。對于重鏈，鑒定出一個單一序列，為典型的鼠重鏈可變區(qū)。對于輕鏈鑒定出兩種序列，它們都與鼠輕鏈可變區(qū)同源。但是其中的一種序列是沒有功能的，因為丟失了一個核苷酸而導致V-J結合處發(fā)生了一個移碼，確定為非有效等位基因。另一種序列是典型的功能型鼠κ鏈可變區(qū)。在圖6A和6B中，分別顯示出重鏈可變區(qū)的cDNA序列和功能型輕鏈可變區(qū)的cDNA序列，以及翻譯出的氨基酸序列。鼠VH屬于Kabat氏重鏈亞類II(C)。鼠Vk序列屬于Kabat氏鼠κ亞類IV。實施例9人源化1F1可變區(qū)的設計為了保留人源化抗體中鼠抗體的結合親和性，參照了Queen等的一般性程序(Queen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8610029(1989)，美國專利Nos.5585089&5693762)。在保留高結合親和性方面構架殘基的選擇至關重要。原則上講，任何一個人抗體的構架序列都可以作為CDR嫁接的模板；然而研究表明，直接將CDR替換到構架中可能會導致嚴重失去對抗原的結合親和性(Tempest et al.，Biotechnology 9266(1992)；Shalaby et al.，J.Exp.Med.17217(1992))。人抗體與其來源的鼠抗體的同源性越高，人構架將畸變引入到鼠CDRs中的可能性就越小，而畸變將降低親和性。鑒于與Kabat抗體序列數(shù)據(jù)庫中的序列同源性(Kabat et al.，Sequences of Proteinsof Immunological Interest.5thed.，U.S.Department of Health andHuman Services(1991))，選擇III-2R(Manheimer-Lory，A.et al.，J.Exp.Med.176309(1992))既提供人源化1F1重鏈可變區(qū)的構架，也提供人源化1F1輕鏈可變區(qū)的構架。其它高度同源人抗體鏈也適合于提供人源化抗體構架，尤其是由Kabat定義的人亞類4的κ輕鏈以及人亞類1的重鏈。
為了降低輕鏈和重鏈兩鏈組裝時發(fā)生不相容性的可能性，通常選擇來自同一個人抗體的重鏈和輕鏈提供構架序列。III-2R抗體顯示出與1F1重鏈和輕鏈的高度同源性，因此可以選其提供人源化抗體的構架。人源化1F1重鏈可變域中87個構架殘基有69個殘基與鼠1F1重鏈構架69個殘基相同，即79％序列同一性。人源化1F1輕鏈可變域中80個構架殘基有55個殘基與鼠1F1輕鏈構架55個殘基相同，即69％序列同一性。
可以用電腦程序ABMOD和ENCODE(Levitt et al.，J.Mol.Biol.168595(1983))構建一個1F1可變域分子模型，可以用該分子模型定位1F1構架中與CDRs距離足夠接近的有可能與CDRs發(fā)生相互作用的氨基酸。為了設計人源化1F1重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，將鼠1F1重鏈中的CDRs嫁接到人III-2R重鏈構架區(qū)中，而將鼠1F1輕鏈的CDRs嫁接到人III-2R輕鏈構架區(qū)中。在電腦模型顯示出的與CDRs顯著臨近的構架位置處，將鼠抗體的氨基酸替換成人來源的構架氨基酸。對于人源化1F1抗體，替換發(fā)生在重鏈的殘基1、24、27、28、29、30、48、67和68以及輕鏈殘基47和72處。此外，將很少發(fā)生在人抗體數(shù)據(jù)庫位置處的構架殘基在同樣位置替換成人共有氨基酸。對于人源化1F1，替換發(fā)生在重鏈殘基16、74以及113處和輕鏈殘基44處。總之人源化1F1重鏈可變域有88殘基與人III-2R重鏈可變區(qū)域相同，而人源化1F1輕鏈可變域有88殘基與III-2R輕鏈可變區(qū)域相同。
圖7A和圖7B中顯示了人源化1F1抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的序列。然而，許多可能與CDR接觸的殘基可以替換成其它氨基酸，替換后抗體仍能保留對抗原的基本親和性。表4列舉出構架上多個適合的可替換的氨基酸位置(LC＝輕鏈，HC＝重鏈)。
表4.
同樣，在不使人源化抗體的親和性或非免疫原性發(fā)生顯著丟失的情況下，人源化1F1重鏈和輕鏈中許多并不與GDRs接觸的構架殘基可以替換成來自于III-2R構架、來自于其它人抗體、來自于鼠1F1抗體或來自于其它鼠抗體中對應位置的氨基酸。表5列舉出構架中多個適于替換成其它氨基酸附加位置。
表5.
選擇各種可替換氨基酸可以產(chǎn)生出多種人源化1F1，這些不同版本的人源化1F1在其親和性、特異性、非免疫原性、容易制備和其它合意特性等方面可以有不同的組合。因此上表中的例子只是用來舉例說明，而沒有限制的意思。實施例10人源化1F1的構建一旦人源化可變區(qū)氨基酸序列設計好后，就要構建編碼這些序列的基因，包括信號肽、剪接供體信號以及合適的限制位點(圖7A和圖7B)。用8種長度為大約65-80個堿基的互相重疊的合成寡核苷酸構建和擴增重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因(參照He et al.，J.Immunol.1601029(1998))。寡核苷酸退火配對后，用DNA聚合酶I的Klenow片段延伸，產(chǎn)生出四個雙鏈片段。所得片段變性、退火配對后，用Klenow延伸，產(chǎn)生兩個片段。這些片段變性、退火配對后再次延伸，產(chǎn)生出一個全長基因。所得產(chǎn)物通過聚合酶鏈式反應(PCR)用Taq聚合酶擴增，擴增產(chǎn)物通過膠純化、用Xba I消化、再用膠純化后，將其亞克隆到pVg2.M3的Xba I位點上，以便表達重鏈，而將其克隆到pVk上，以便表達輕鏈。以前已經(jīng)對表達人γ2重鏈的pVg2.M3載體進行了描述(參照Co et al.，J.Immunol.1593613(1997))。通過將野生型人γ2恒定區(qū)中234位和237位的氨基酸Val和Gly替換成Ala而突變產(chǎn)生了pVg2.M3質粒中人γ2恒定區(qū)。這種變體對其Fc受體的相互作用減弱了，所以有最低程度的抗體效應子活性。Cole等(Cole et al.，J.Immunol.1481149(1992))對表達人κ輕鏈的pVk載體進行了描述。
通過核苷酸測序以及限制酶切作圖對最終質粒的結構進行了核實。所有DNA操作都是按照本領域中熟練人員熟知的標準方法進行的。
制備人源化1F1抗體的IgG2.M3形式進行結合研究。用輕鏈和重鏈質粒轉染鼠骨髓瘤細胞系Sp2/0-Ag14(ATCC CRL 1581)以構建一個能產(chǎn)生人源化1F1抗體的細胞系。轉染之前用限制性內(nèi)切核酸酶將重鏈質粒以及輕鏈質粒線性化。γ2重鏈質粒和κ輕鏈質粒的線性化用Fsp I。在PBS中將大約40μg重鏈質粒和20μg輕鏈質粒轉染到1×107個細胞中。根據(jù)制造商的指導手冊用基因脈沖發(fā)生器(BioRad)在360V和25μFD容量下通過電穿孔方法實現(xiàn)轉染。每次轉染后的細胞在四個96孔組織培養(yǎng)板上鋪平板，兩天后使用選擇培養(yǎng)基(DMEM，10％FCS，1xHT增補物(Sigma)，0.25mg/ml黃嘌呤，1μg/ml霉酚酸)。
大約兩周之后，出現(xiàn)的克隆用ELISA篩選抗體的產(chǎn)生。高產(chǎn)克隆中抗體的制備方法是，讓細胞在正常培養(yǎng)基(DMEM+10％FCS)上生長到鋪滿，然后培養(yǎng)基替換成無血清培養(yǎng)基(雜交瘤SMF；Gibco)，一直培養(yǎng)到培養(yǎng)物中抗體效價達到最大為止。培養(yǎng)物上清液通過蛋白A-Sepharose柱(Pharmacia)；用0.1M甘氨酸，100mM NaCl，pH3洗脫抗體，中和后換成磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。通過在丙烯酰胺膠上分析鑒定抗體的純度，由OD280讀數(shù)確定抗體的濃度，假定1.0mg抗體蛋白的OD280讀數(shù)為1.4。
按照如上所述方法也能獲得并純化出IgG4形式的人源化1F1抗體。
為使基因能在CHO細胞中高水平表達，將完整人源化人1F1(h1F1)和人3D1(h3D1)的輕鏈基因和重鏈基因分別單獨亞克隆到選擇性、擴增性表達載體pED中(Kaufman R.J.，et al.，Nucl.Acids.Res.194485-4490(1991))。對來自于pED的表達質粒進行測序，確保其能編碼適當?shù)膆1F1和h3D1輕鏈和重鏈。研究發(fā)現(xiàn)IgG2m3 CH3結構域的次末端氨基酸是絲氨酸，而在所有公開發(fā)表的IgG2和IgG1序列的這一位置是甘氨酸殘基。在pED的表達構建體中，絲氨酸用更為常見的甘氨酸代替。將h1F1輕鏈和重鏈表達質粒(pED.1F1y2KA和pED.1F1v2G2m3gly)線性化后共轉染到CHO PA-DUKX.153.8細胞系中，而CHO PA-DUKX.153.8細胞系未轉染前要在無血清懸浮培養(yǎng)基中生長以進行預適應(Sinacore M.S.et al.，Biotechnol.Bioeng.52518-528(1996))。能表達h3D1的細胞系的產(chǎn)生方式同上，用線性化的質粒pED.3D1KA和pED.3D1G2m3gly轉染細胞系。這兩種情況之中，輕鏈和重鏈基因穩(wěn)定整合到CHO細胞的基因組中，隨后用氨甲蝶呤選擇并擴增，就產(chǎn)生出重組h1F1細胞系或h3D1細胞系。表達抗B7-1或B7-2的CHO細胞系在無血清生長培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，用蛋白酶A-Sapharose層析法從條件化培養(yǎng)上清液中純化分泌出的抗體。結合態(tài)抗體在酸性緩沖液中洗脫后中和到pH7.0。將純化好的抗體的緩沖液換成PBS并無菌過濾。實施例11人源化1F1的特性通過與放射性碘化人源化1F1抗體的競爭性結合分析，來檢測鼠1F1抗體和人源化1F1抗體對B7-1抗原的親和性。在包含2％胎牛血清、0.1％疊氮化鈉的PBS中，將三倍連續(xù)稀釋的非標記鼠1F1抗體或人源化1F1抗體與固定量的放射性碘化人源化1F1抗體(40000-50000cpm/實驗)混合。隨后加入能表達細胞表面rhB7-1的3×104個CHO細胞，混合物(總體積200μl)于4℃培育2小時并輕柔振蕩。然后將細胞-抗體懸浮液轉移到包含100μl 80％二丁基鄰苯二甲酸-20％橄欖油的Sarstedt氏微量管(part#72.702)中。微量離心機中離心后，將Sarstedt管置入干冰中數(shù)分鐘。檢測細胞結合態(tài)125I的方法是，將每支(包含細胞沉淀)管的尖端剪切到閃爍瓶中并在γ計數(shù)器中計數(shù)。根據(jù)Berzofsky和Berkower(J.A.Berzofsky&J.Berkower，inFundamental Immunology，W.E.Paul，Raven Press，New York，pp.595-644(1984))的方法測定結合態(tài)和游離態(tài)計數(shù)并用其比例對非標記競爭抗體濃度進行作圖。
圖8中表示競爭性結合曲線。每一數(shù)據(jù)點代表的是三次重復測定的平均值。結果顯示出IgG2.M3抗體與鼠抗體一樣有著相近的結合親和性(大約1×109M-1)，這表明人源化1F1沒有喪失親和性。
用放射性標記抗體結合的Scatchard分析法對鼠1F1抗體和人源化1F1抗體對B7-1抗原的親和性進行核實。在包含2％胎牛血清、0.1％疊氮化鈉的總體積為200μl的PBS中，將2倍連續(xù)稀釋的放射性標記鼠1F1抗體或人源化1F1抗體與表達細胞表面rhB7-1的5×104個CHO細胞一起培養(yǎng)?；旌衔镉?℃培育6小時并輕柔振蕩。然后將細胞-抗體懸浮液轉移到包含100μl 80％二丁基鄰苯二甲酸-20％橄欖油的Sarstedt氏微量管(part#72.702)中。微量離心機中離心后，將Sarstedt管置入干冰中數(shù)分鐘。檢測細胞結合態(tài)125I的方法是，將每支(包含細胞沉淀)管的尖端剪切到閃爍瓶中并在γ計數(shù)器中計錄數(shù)值。按照Scatchard的方法(Scatchard，Ann.N.Y.Acad.Sci.51660(1949))測定結合態(tài)和游離態(tài)計數(shù)并用其比例對結合態(tài)抗體濃度進行作圖。
圖9A和9B中顯示出Scatchard曲線。每一數(shù)據(jù)點代表的是三次重復測定的平均值。結果顯示出IgG2.M3抗體與鼠抗體一樣有著相近的結合親和性(大約1×109M-1)，這證了人源化1F1沒有喪失親和性。實施例12人源化抗B7-1單克隆抗體的親和性競爭性結合測定用競爭性結合測定法檢測鼠抗B7-1(1F1)抗體和人源化抗B7-1(1F1)抗體與B7-1抗原的相對親和性。將未標記鼠抗B7-1mAbs或人源化抗B7-1mAbs的三倍連續(xù)稀釋液與固定量放射性標記鼠抗B7-1mAb(125I-抗B7-1，2800cpm/fmol；包含2％胎牛血清的PBS中40000-50000cpm/檢測)混合。隨后加入1×105個表達細胞表面rhB7-1的CHO/hB7-1細胞，混合物(總體積200μl)在輕微振蕩的情況下于4℃培育2hrs。然后將細胞-抗體混合物轉移到包含100μl的80％二丁基氨甲酰苯甲酸-20％橄欖油的Sarstedt微量管(part#72.702)中。用微量離心機離心后，將Sarstedt管放置到干冰中靜置數(shù)分鐘。檢測細胞結合態(tài)125I標記的mAb的方法是，將每支包含細胞沉淀的管的尖端剪切到閃爍瓶中并在γ計數(shù)器中計錄數(shù)值。測定結合態(tài)和游離態(tài)計數(shù)。用結合態(tài)計數(shù)對非標記競爭mAbs濃度進行作圖。CHO/hB7-1細胞系
能在其表面表達hB7-1的重組中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系是從用B7-1 cDNA序列和G418抗性標記轉染的CHO細胞中克隆來的。用鼠抗B7-1mAb和FACS分析法對存在選擇壓的情況下細胞經(jīng)過多次傳代后hB7-1在CHO細胞表面的穩(wěn)定表達進行了核實。125I標記的抗hB7-1mAbs的制備根據(jù)廠商的指導手冊(Amersham Corp.，Arlington Hts，IL)，通過與125I-Bolton-Hunter試劑反應而將鼠和人源化抗hB7 mAbs用125碘標記上。用NAP-25柱將蛋白與游離試劑分離開來。使用HPLC大小排阻層析證實抗體標記后保留了完整性及聚集狀態(tài)，并用該柱測定抗體蛋白濃度。通常得到的標記是4-8微居里125I/μg mAb，估計出抗體分子中大約有30-60％標記上了。鼠和人源化抗B7-1 mAbs的比活性分別是2800cpm/fmol和950cpm7fmol。結果圖10中用圖解表示法顯示出競爭性結合數(shù)據(jù)。每一數(shù)據(jù)點代表的是三次重復測定的平均值。結果顯示出人源化抗B7-1mAbs和其來源的鼠抗B7-1mAbs都與B7-1有著相當高的親和性(大約1×109M-1)，這表明人源化抗B7-1mAb沒有丟失親和性。鼠抗B7-1和人源化抗B7-1都能相近地和有效地與標記的鼠抗B7-1mAb競爭性地結合細胞表面表達的hB7-1。實施例13人源化抗B7-1mAb與B7-1的直接結合細胞結合測定結合鑒定法開始時在完全培養(yǎng)基中以10000細胞/孔密度將CHO/hB7-1細胞鋪到96孔組織培養(yǎng)平板上，平板于37℃溫浴兩天后，貼壁細胞用測定緩沖液(包含脫脂奶粉和疊氮鈉的PBS)輕柔漂洗。在測定緩沖液中將125I標記的鼠和人源化抗B7-1抗體進行系列稀釋并和細胞于4℃溫浴過夜，使結合達到平衡。用測定緩沖液通過一系列輕柔漂洗將未結合的抗體從細胞上去除下來，用125I閃爍體和光檢測器系統(tǒng)對結合態(tài)125I標記抗體進行檢測。除了靶CHO細胞表達既未與鼠抗B7-1mAbs結合也未與人源化抗B7-1mAbs結合的hB7-2外，與CHO細胞的非特異性結合可以以與以上所述每一標記抗體稀釋相同的方式進行檢測。結果圖11中用圖解的方式顯示出直接結合實驗的結果。用GraphpadPrismJ軟件扣除掉非特異性結合后的三次重復測定孔的平均值符合雙曲線飽和結合曲線。結合常數(shù)(KD)確定為對應于結合位點半-最大飽和抗體濃度，表明鼠抗體和人源化抗體這兩種抗體都對B7-1有相近的和高度的親和性(大約10-9M)。鼠和人源化抗B7-1mAbs都能識別細胞表面表達的人B7-1。實施例14鼠和人源化抗B7-1mAbs與蛋白配體的結合用BIACORE測定親和性用BIACORE生物傳感器(BIACORE；Uppsalla，Sweden)檢測鼠抗B7-1抗體和人源化抗B7-1單克隆抗體與人B7-1Ig(hB7-1Ig)蛋白的結合動力學。將人B7-1Ig固定到BIACORE生物傳感器芯片的葡聚糖基質上。分別用200、100、50和20nM濃度的固定化hB7-1Ig檢測人源化和鼠抗B7-1mAbs。每種mAb稀釋在一輪測定中檢測4次，共進行三輪獨立測定作。用Surface Plasmon Resonance(SPR)在實際時間對抗人B7-1Ig結合進行檢測，并在BIA評估軟件(3.1版本)中用二價結合模型進行全面分析。測定每一樣品的締合常數(shù)(ka)、解離常數(shù)(kd)以及平衡解離常數(shù)(KD)。
表6列出測定的鼠和人源化抗B7-1mAbs的平均值。用SPR檢測的鼠和人源化抗B7-1mAbs的結合常數(shù)結果表明，鼠和人源化抗B7-1mAbs形式相似，且鼠抗B7-1mAbs與hB7-1Ig蛋白的結合親和性比人源化抗B7-1mAbs與hB7-1Ig蛋白的結合親和性稍微高些。鼠抗B7-1mAb有大約5倍更高的結合親和性，這顯示出在人源化過程中鼠和人源化抗B7-1mAbs之間有實際差異但差異輕微。此外，在抗體的制備、加工和分析過程中出現(xiàn)的技術性波動可以對這些細微差異作出解釋。正如實施例12、14和19所示，在細胞結合測定和功能性測定中，沒有觀察到鼠和人源化抗B7-1mAbs有什么差異。表6.由BIACORE測定的抗B7-1mAbs的親和性
hB7-1Ig的制備從培養(yǎng)分泌hB7-1Ig的工程化CHO細胞的培養(yǎng)基中得到可溶性hB7-1Ig。重組hB7-1Ig的衍生方式是，將編碼hB7-1基因的胞外域的DNA序列與人IgG1重鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域融合。用蛋白A層析法從培養(yǎng)基中純化重組蛋白。實施例15.由人源化抗B7-1 mAbs對T細胞共同刺激的抑制作用。CD28+T細胞/CHO-B7增殖測定按本文所述分離CD28+T細胞漂洗一次后重懸浮在補加2ng/mlPMA(Calbiochem)的RPMI完全培養(yǎng)基中，使細胞密度達到5×105細胞/毫升。將CD28+T細胞(100μl，5×104個細胞)加到抗體/CHO/hB7-1細胞混合物中(見下文)，于37℃、5％CO2條件下溫浴3天，采用脈沖方式用1uCi的[3H]-胸苷(NEN，Boston，MA)檢測培養(yǎng)的最后6小時T細胞的增殖情況。在濾器上收集細胞，用閃爍計數(shù)器測定摻入的放射性活度。材料按參照文獻(June et al.，Mol.Cell.Biol.74472-4481(1987))所述，用免疫吸附方法通過負選擇方式從人外周血淋巴細胞中分離CD28+人T細胞。簡言之，通過leukophoresis從健康人供體中獲得裸外殼，通過密度梯度離心分離外周血淋巴細胞(PBL)。用塑料吸附單核細胞將其從PBLs中去除掉。用CD11、CD20、CD16和CD14的抗體(這套抗體將覆蓋所有的B細胞、單核細胞、大顆粒淋巴細胞以及CD28+T細胞)通過負選擇并用羊抗鼠免疫球蛋白包裹的磁珠通過磁珠分離方法從非貼壁細胞中分離CD28+T細胞。
組織培養(yǎng)平板在無Ca2+和Mg2+的磷酸緩沖鹽溶液并有0.5mM EDTA存在的溶液中溫浴，使CHO/hB7-1細胞從組織培養(yǎng)平板上解吸下來，細胞經(jīng)過漂洗后用新配制的低聚甲醛固定。
在微量滴定板(平底，96孔，Costar，Cambrige，MA)中，在37℃、在100μl的RPMI完全培養(yǎng)基(RPMI1640，10％FBS，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素)中將各種濃度的抗B7-1抗體(各雙份)與1×104CHO/hH7-1細胞一起溫浴1小時。結果圖12顯示出鼠和人源化抗B7-1 mAbs對人CD28+T細胞增殖的抑制作用結果。兩種單克隆抗體都表現(xiàn)出對由B7-1驅動的T細胞劑量依賴性抑制作用，二者的IC50(抑制濃度的50％；50％抑制最大T細胞增殖所需的抗體量)值相近，分別是110pm(人源化抗hB7-1)和220pm(鼠抗hB7-1)。這表明兩種抗體是相近的，它們在抑制B7-1 T細胞共同刺激信號方面都非常有效。這說明高親和性抗B7-1 mAbs可以通過抑制或預防人T細胞的激活作用和/或增殖作用來封閉B7-1的功能性。這些mAbs在用于體內(nèi)抑制T細胞應答方面有可能表現(xiàn)出相近的能力。實施例16.抗B7-1和抗B7-2 mAbs對混合淋巴細胞反應的抑制作用混合淋巴細胞反應(MLR)在5％CO2中于37℃條件下，將人正常外周血淋巴細胞(PBL)(效應器)與擴散的(2500cGy)正常供體PBL(刺激物)在包含5％熱滅活人AB血清的RPMI中一起培養(yǎng)，終濃度為106個細胞/ml。這時，分別單加入鼠抗hB7-1抗體或鼠抗B7-2抗體(10μg/ml)、二者一塊加入(濃度均為10μg/ml)、并與CTLA4Ig(10或20μg/ml)比較。在微量滴定板中分三份培養(yǎng)細胞，終體積為200μl。培養(yǎng)16小時后，用[3H]-胸苷摻入法對增殖情況進行評估。用來自于初級MLRs的細胞作為效應器進行次級MLR反應。這些細胞經(jīng)過漂洗、過夜培養(yǎng)后，用同種或不同種的第三部分刺激物PBLs進行重刺激。次級MLRs中不加入抑制劑。結果在有B7抑制劑(抗B7、CTLA4Ig)存在或沒有其存在的情況下進行初級單向MLRs反應后，所得檢測結果如圖13所示。培養(yǎng)3、4或5天后對增殖情況進行測定。
在初級MLR中，單獨附加抗B7-1 mAb并沒有產(chǎn)生抑制效果，這表明抗B7-1 mAb在驅動效應器T細胞的增殖反方面對B7-1的作用微不足道。單獨的抗B7-2在所有檢測的日子里都能抑制T細胞增殖，抑制水平與人CTLA4Ig(hCTLA4Ig)的抑制水平相當，已經(jīng)知道的是后者這種重組蛋白既與B7-1結合又與B7-2結合?？笲7-1和抗B7-2一起是T細胞增殖最有效的抑制劑，在檢測的所有時間都能徹底抑制T細胞的增殖?？笲7-1和抗B7-2一起所具有的抑制T細胞增殖的卓越能力表明，與hCTLA4Ig相比抗B7 mAbs對B7-1和B7-2有更高的親和性?？笲7-1和抗B7-2 mAbs一起與單獨的抗B7-2相比，前者是更好的T細胞增殖抑制劑，這就證明要想徹底抑制T細胞的應答需要封閉兩種刺激受體。這些結果表明，徹底封閉B7-1和B7-2共同刺激物就能更徹底地去除掉MLR中的同種異體應答。因此，這些結果說明既包括抗B7-1抗體又包括抗B7-2抗體的治療方法比單獨使用其中一種抗體更為有效，尤其是當兩種共刺激分子都有功能時。雖然說本文所述的效應器/刺激物對對單獨由B7-1引起的抑制作用并不敏感，但是某些效應器/刺激物對確實顯示出了適度(0-50％)的抗B7-1敏感性。
為了確定在初級MLR中用抗B7mAbs治療是否能導致T細胞產(chǎn)生低反應性或無應變性，用來自初級MLR的效應T細胞在次級MLR中進行檢測，其中的刺激物要么來自與初級MLR相同的供體，要么來自第三種。圖14中顯示出，沒有免疫抑制的情況下，當次級MLR中檢測時，來自初級MLR的效應T細胞僅用抗B7-1 mAbs治療后既表現(xiàn)出對起始致敏細胞有完全增殖應答也能對第三種細胞表現(xiàn)完全增殖應答，這表明僅用抗B7-1 mAb處理以封閉B7-1受體的方法對這些應答的T細胞沒有持久效果。這和當僅用抗B7-2處理初級MLR時在次級MLR中看到的對初級刺激物的應答能力喪失的結果完全不同。圖15中的結果表明來自初級MLR的效應T細胞僅用抗B7-2治療并不能對在初級MLR中用的同種刺激物作出應答，但卻保留了對第三種不相關的刺激物作出正常的增殖應答，這說明用抗B7-2處理后這些效應T細胞對起始次級PBLs產(chǎn)生耐受性，而且這種耐受性對于初級MLR中的刺激物抗原是特異性的。有這種效應器/刺激物對存在時，僅用抗B7-2治療后將對刺激細胞產(chǎn)生耐受性；然而，用其它效應器/刺激物對時，耐受性的誘導可能并不徹底。
圖16表明，來自初級MLR的效應物T細胞用抗B7-1和抗B7-2處理后，并不能對在初級MLR中用的同種刺激物作出應答，但卻保留了對第三種不相關的刺激物作出正常的增殖應答。這說明用抗B7-1和抗B7-2一起處理后，這些效應T細胞對起始次級PBLs產(chǎn)生耐受性。由這種效應器/刺激物對獲得的結果對于其它效應器/刺激物對來說是典型的，因為誘導耐受性是必需的。實施例17用人源化抗B7-1和抗B7-2處理對初級MLR和次級MLR的抑制作用摘要研究抗B7 mAbs對初級MLRs的抑制作用，研究抗B7 mAbs對特異性耐久低反應性或“耐受性”以及次級MLRs的誘導作用。初級MLRs分別用單個抗B7 mAbs或聯(lián)合的抗B7 mAbs或用CTLA4Ig處理，在第3、4和第5測定增殖。聯(lián)合的抗B7-1+抗B7-2 mAbs和CTLA4Ig能抑制增殖，而單個的抗B7 mAbs沒有多大效果。將來自初級MLRs的細胞(處理48個小時后)放到無抑制劑的次級MLRs細胞中。來自于用聯(lián)合的抗B7 mAbs或CTLA4Ig處理的初級MLRs中的細胞對次級MLRs中的起始刺激物有極微弱的應答，而用培養(yǎng)基或單個抗B7 mAbs處理的細胞能夠正常應答。所有情況的細胞都對第三種刺激物產(chǎn)生了正常應答，因而證明對于用聯(lián)合抗B7 mAbs或用CTLA4Ig治療的細胞來說，在初級MLRs中看到的低反應性既具有特異性又具有持久性。材料與方法實驗設計細胞效應器“A”細胞是從新抽取的血液中制備而來的PBLs。用菲可梯度離心法純化PBLs，用培養(yǎng)基漂洗兩次后，將細胞重懸在培養(yǎng)基中，細胞濃度為1×106個/ml。起始刺激物“B”細胞是從leukophoresis中制備而來的PBLs。用菲可分離法純化細胞，再用培養(yǎng)基漂洗兩次。對于初級MLR，將細胞重懸在培養(yǎng)基中，細胞濃度為2×106個/ml，而對于次級MLR，將細胞重懸在培養(yǎng)基中時細胞濃度為1×106個/ml。第三部分刺激物“C”細胞是從leukophoresis中制備而來的PBLs。用菲可分離法純化細胞，再用培養(yǎng)基漂洗兩次。將細胞重懸在培養(yǎng)基中，細胞濃度為1×106個/ml。“B”刺激物和“C”刺激物這兩種PBLs來源于兩種遺傳上有差異的人供體。培養(yǎng)基RPMI 1640，含有2mM谷氨酰氨、10mM HEPES、10％熱滅活的人AB血清、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸鏈霉素和5μg/ml硫酸慶大霉素。實驗物品對照Ig是嵌合型mAb，其可變域來自于鼠抗HIV包膜蛋白mAb，而其恒定域來自于人IgG1。所有的抗體、CTLA4Ig和對照Ig的溶液都是按以下濃度制備在培養(yǎng)基中的抗B7-1(40μg/ml)，抗B7-2(40μg/ml)，抗B7-1+抗B7-2(均為40μg/ml)，CTLA4Ig(40μg/ml)，對照Ig(40μg/ml)。初級MLR的方法進行以下內(nèi)容· 以3.5Gy擴散“B”細胞(刺激物)· 在96孔“U”底微量滴定板上，混合50μl的擴散“B”細胞+50μl抗體、CTLA4Ig、對照Ig或培養(yǎng)基?？傮w積＝100μl，包括1×105個B細胞(刺激物)和2×終濃度的抑制劑。冰上靜置30分鐘。
· 加入100μl的“A”細胞(效應器)· 于37℃、5％CO2中溫浴· 于第2、3和第4天，加入1μCi的[3H]-胸苷，繼續(xù)過夜溫浴· 收獲細胞，并用閃爍記數(shù)方法測定摻入的放射性。于第3、4和第5天報告結果。偶聯(lián)初級/次級MLR的方法進行以下操作內(nèi)容· 以3.5Gy擴散“B”細胞(刺激物)· 大量初級MLR。于T-25瓶中，混合2.5ml的擴散“B”細胞(2×106個/ml)+2.5ml抗體、CTLA4Ig、對照Ig或培養(yǎng)基?？傮w積＝5ml，其中包括1×106個/ml“B”細胞(刺激物)和2×終濃度的抑制劑。冰上靜置30分鐘。
· 加入5ml“A”細胞(效應器)。在T-25瓶中總體積＝10ml· 于37℃、5％CO2中溫浴～48小時· 用菲可梯度離心法收集細胞，用冰預冷的培養(yǎng)基漂洗兩次后重新懸浮在培養(yǎng)基中，細胞濃度為1×106個/ml。冰上靜置8小時。用冰預冷的培養(yǎng)基漂洗兩次后重新懸浮在培養(yǎng)基中，細胞濃度為1×106個/ml。
· 以3.5Gy擴散“C”細胞(第三部分刺激物)。以3.5Gy擴散“B”細胞(起始刺激物)?！癇”細胞和“C”細胞濃度均為1×106個/ml。
· 在96孔“U”底微量滴定板上，混合100μl的擴散“B”細胞或擴散“C”細胞和100μl來自大量MLR的細胞。
· 于37℃、5％CO2中溫浴· 于第2、3和第4天，加入1μCi的[3H]-胸苷，繼續(xù)過夜溫浴· 收獲細胞，并用閃爍記數(shù)方法測定摻入的放射性。于第3、4、5和第6天報告結果。結果用一個效應器和兩個不同刺激物進行的初級MLRs分別用單個抗B7mAbs、聯(lián)合抗B7 mAbs、CTLA4Ig或對照Ig處理，于第3、4、和第5天測定培養(yǎng)物的增殖情況。單一的抗B7-1對增殖有極其微弱的抑制效果(1-35％)。單一的抗B7-2對增殖有中等程度的抑制效果(30-50％)。聯(lián)合的抗B7 mAbs或CTLA4Ig對增殖有最大程度的抑制作用(86-92％，抗B7 mAbs；82-91％，CTLA4Ig；圖17和圖18)。
在用其中一種刺激物且包含抑制劑的初級MLRs中，溫浴48小時后漂洗細胞、靜置、然后置于無抑制劑的培養(yǎng)基中用起始刺激物和第三部分刺激物的次級MLR中。于第3、4、5和第6天檢測培養(yǎng)物的增殖情況(圖19和圖20)。圖21中匯集了來自次級MLR實驗的數(shù)據(jù)結果。
考查來自最高增殖應答的數(shù)據(jù)而不考慮最高增殖數(shù)據(jù)出現(xiàn)的時間，以下是對于來自于初級MLR的細胞的起始刺激物和第三部分刺激物的應答情況，初級MLR僅用抗B7-1處理過表7
用聯(lián)合抗B7 mAbs或CTLA4Ig處理初級MLRs時，產(chǎn)生的細胞在次級MLR中對同樣的刺激物的增殖情況難于控制。單用一種抗B7 mAbs沒有多大效果。不考慮初級MLR中的處理，來自所有處理情況的細胞都能對第三部分細胞正常應答，這說明用聯(lián)合抗B7 mAbs或CTLA4Ig處理能導致特異性、持久性的低反應性或無應變性。結論聯(lián)合使用人源化抗B7 mAbs h1F1和3D1能抑制初級MLRs。這種抑制作用是特異的和持久的，同時，來自用聯(lián)合抗B7 mAbs處理的初級MLR的效應器對沒有抑制劑存在時次級MLR中同樣的刺激物幾乎沒有應答。來自用聯(lián)合抗B7 mAbs處理的初級MLR的效應器能對次級MLR中第三部分刺激物正常應答。聯(lián)合的抗B7 mAbs在抑制初級應答和次級應答方面與CTLA4Ig一樣有效。單個的抗B7 mAbs在抑制初級MLR方面效果甚微，而用單個的抗B7 mAbs處理并不會導致次級MLR中出現(xiàn)無應變性。實施例18在非人靈長類中抗B7 mAbs對免疫應答的抑制作用；抗破傷風應答的抑制作用摘要抗B7 mAbs抑制初級抗體應答和次級(回憶)抗體應答的能力是在非人靈長類破傷風免疫模型中檢測的。在第0天和6個星期后的第42天用破傷風類毒素分別免疫四個同齡組cynomolgus猴(n＝3)。對抗破傷風效價每周評估一次。第0天用單一10mg/kg劑量聯(lián)合的人抗B7-1抗體(h1F1)和人抗B7-2抗體(h3D1)投藥的治療組中，抗破傷風抗體應答顯著受到抑制，其中，在免疫6周內(nèi)6只治療動物中有0只產(chǎn)生出顯著效價。此外，在用聯(lián)合抗體第0天治療過的動物中，不論第42天是否接受鹽水或另一劑量的h1F1和h3D1，對第42天破傷風抗原的攻擊都沒有產(chǎn)生應答。第0天接受鹽水和僅在42天接受h1F1和h3D1的動物中，對破傷風二次抗體應答的平均效價比鹽水對照同齡組中觀察到的平均效價要低。所有用h1F1和h3D1治療的同齡組動物，在最后一次劑量112天之后，h1F1和h3D1血清水平低于檢測極限時用第三劑量破傷風抗原進行二次免疫。在這一時間點處，動物通過產(chǎn)生抗破傷風抗體應答的動力學與初級抗體應答或次級抗體應答相近。這些資料表明，通過用抗B7-1抗體和抗B7-2抗體封閉B7-1和B7-2的方法對共同刺激的抑制作用，既能明顯抑制對破傷風的初次抗體應答，又能減輕二次抗體應答。此外，這些結果顯示能恢復免疫抑制，表明在該研究中不能獲得對破傷風的長期耐受性。材料與方法待測物品和對照物品抗B7-1(h1F1)用慢速靜脈灌注的方法給非人靈長類投藥抗B7-1抗體。研究中，每個治療組種的每個動物于第0天和/或第42天接受10mg/kg的抗B7-1抗體?？笲7-2(h3D1)用慢速靜脈灌注的方法給非人靈長類投藥抗B7-2抗體。研究中，每個治療組種的每個動物于第0天和/或第42天接受10mg/kg的抗B7-2抗體。鹽水對照組用慢速靜脈灌注的方法給非人靈長類投藥鹽水(9％注射用NaCl)。研究中，鹽水對照組和B組及C組的每個動物于第0天和/或第42天接受15ml鹽水。純化的破傷風類毒素抗原于第0天投藥破傷風類毒素抗原(Unversity of MassachusettsMedical Center，Biologic Laboratories)。在投藥鹽水或抗體90分鐘之后，通過肌肉注射10限制量絮狀沉淀單位(LfU)并通過皮內(nèi)(ID)注射1Lf單位去免疫所有動物。第42天，在投藥鹽水或抗體90分鐘之后，用肌肉注射10Lf單位去免疫所有動物。于第84天，通過皮內(nèi)(ID)注射1Lf單位去注射所有動物，以檢測破傷風特異的遲發(fā)型超敏反應(DTH)。在上一次劑量(第二次免疫)112天之后，通過肌肉注射10Lf單位第三次免疫治療組B、C和治療組D中的動物。實驗設計將首次用于破傷風實驗的12只4-6kg的雄性Cynomolgus獼猴(Macaca fasicularis)分成四個實驗組，每組3只動物A組；于第0天和第42天通過肌肉注射方法用10Lf單位(絮狀沉淀單位)使之免疫(對照)。
B組；于第0天肌肉注射10Lf單位破傷風類毒素至少90分鐘之前，通過靜脈注射方式接受人源化抗B7-1(1F1)和人源化抗B7-2(3D1)各10mg/kg；于第42天和第112天僅用破傷風類毒素免疫(不用mAb預治療)(用初次免疫對共同刺激進行封閉)。
C組；于第0天接受僅用破傷風類毒素的免疫(不用mAb預治療)；
于第42天和第154天肌肉注射10Lf單位破傷風類毒素至少90分鐘之前，通過靜脈注射方式接受人源化抗B7-1和人源化抗B7-2各10mg/kg(通過二次免疫進行共刺激封閉)。
D組；于第0天肌肉注射10Lf單位破傷風類毒素至少90分鐘之前，通過靜脈注射方式接受人源化抗B7-1(1F1)和人源化抗B7-2(3D1)各10mg/kg；于第42天肌肉注射10Lf單位破傷風類毒素至少90分鐘之前，通過靜脈注射方式接受人源化抗B7-1和人源化抗B7-2各10mg/kg，并于第154天接受一次僅用破傷風類毒素的免疫(不用mAb預治療)(用初次免疫和二次免疫對共同刺激進行封閉)。
所有分組都于第0天和第42天接受破傷風免疫。B、C、D組在給藥抗B7后的第112天接受第三次免疫(表8)。表8. 治療組
所有分組于第0天和第42天都要接受破傷風免疫。B、C和D組在給藥抗B7后的第112天接受第三次免疫?？蛊苽L抗體的ELISA在96孔ELISA板上覆蓋4μg/ml的破傷風類毒素。對血清樣品進行4-log滴定研究，開始時用1∶100。用聯(lián)合的單克隆抗人IgG和多克隆羊抗獼猴IgM HRP-偶聯(lián)的抗體一起檢測與破傷風結合的Ab，隨后用底物TNB顯色。結果與討論圖22中表示在用破傷風類毒素免疫和用聯(lián)合的B7-1和B7-2 mAbs一起治療的猴中抗破傷風IgM+IgG應答情況。
通過靜脈注射的方法給cynomolgus猴投藥鹽水或10mg/kg抗B7-1抗體(h1F1)和10mg/kg抗B7-2抗體(h3D1)的混合物。在注射抗體或鹽水90分鐘后，用10Lf單位的純化破傷風類毒素通過肌內(nèi)注射方法和1Lf單位的破傷風類毒素通過皮內(nèi)注射方法免疫每只動物。每周測定一次抗破傷風抗體的效價。鹽水對照組中，抗破傷風抗體的效價對數(shù)平均值在第14天時升高至基線之上，第49天達到峰值，隨后整個研究過程中都能保持在基線之上(圖22)。在第0天接受h1F1和h3D1混合物的分組(B組和D組)中，6只治療動物中有0只動物在第42天具有明顯抗破傷風抗體效價。B組動物中，一旦于第42天用破傷風類毒素重新攻擊，不管是否接受附加抗B7抗體，對破傷風的抗體應答均不能上升到顯著水平(圖22)。血清學分析顯示血清中高水平h1F1和h3D1(平均血清濃度＞10mg/ml)仍能保持到第42天。D組動物用破傷風類毒素二次免疫之前，第42天再接受灌注的h1F1和h3D1混合物。該組中的所有3只動物的抗破傷風效價在整個研究過程中都保持在可檢測極限之下。僅于第0天接受鹽水和第42天接受h1F1和h3D1的C組動物，與鹽水對照組(A組)的初級抗破傷風抗體應答相近。然而，C組二次應答中觀察到的平均抗體效價，比A組二次應答中觀察到的平均抗體效價要低(圖22)。
h1F1和h3D1的血清濃度在整個研究過程中都受到監(jiān)控，當血清濃度在可檢測極限之下時用破傷風類毒素對B、C和D組進行第三次免疫。每組動物在上一次灌注抗B7抗體112天后進行再次免疫，且不再接受抗B7抗體治療?？雌饋?，在該時間點時所有分組中的動物應答產(chǎn)生的抗破傷風抗體的動力學與二次抗體應答相近。結論這些資料顯示，通過用抗B7-1抗體和抗B7-2抗體封閉B7-1和B7-2對共刺激的抑制作用，既能夠顯著抑制對破傷風的初次抗體應答，也能夠降低二次抗體應答。此外，這些結果還顯示了對免疫抑制的恢復，這表明在本研究中不能獲得對破傷風的長期耐受性。
因此，在投藥抗B7抗體的同時并接觸一種新的抗原(破傷風免疫)，就能對產(chǎn)生新的抗體應答有預防作用，并能減輕對同一抗原二次應答的強度。由于許多疾病狀態(tài)的惡化都是由這些抗體的產(chǎn)生造成的，因此用混合的抗B7 mAbs就能預防這些抗體的產(chǎn)生。其中一種疾病狀態(tài)是在血友病病人中對投藥的因子VIII或因子IX產(chǎn)生出抑制物抗體，因此就降低了這些救命化合物的有效性。用抗B7 mAbs治療血友病病人能預防或降低抑制物抗體的形成。實施例19破傷風類毒素攻擊的cynomolgus猴模型中，抗B7-1(h1F1)和抗B7-2(h3D1)以混合或單獨形式分別以0.01、0.1、1或10mg/kg劑量投藥時的藥物動力學摘要在cynomolgus猴免疫模型中，對各種劑量的單獨抗B7-1抗體或抗B7-2抗體、或混合的抗B7-1抗體或抗B7-2抗體抑制對破傷風初級應答和二次(回憶)應答的能力進行了檢測。分別給cynomolgus猴(總n＝33)投藥單一靜脈劑量10、1、0.1或0.01mg/kg h1F1和h3D1的混合物，僅投藥10、1或0.1mg/kg的h1F1或h3D1，或投藥載體對照。所有動物在投藥h1F1和3D1一個小時后，均用純化的破傷風類毒素進行免疫。為了檢測出動物們是否恢復了正常免疫功能，當h1F1和3D1的水平降至可檢測水平之下時，于第14周用破傷風類毒素再一次免疫動物。
在用單一靜脈劑量的10或1mg/kg h1F1和3D1的混合物投藥后，觀察到對初次抗破傷風抗體應答的完全抑制，而0.1mg/kg的劑量僅僅導致不完全抑制。在抑制抗破傷風抗體應答方面，僅用h1F1治療或僅用h3D1治療都不如用同等量h1F1和h3D1的混合物治療來得有效。在h1F1和h3D1濃度跌至檢測極限(＜50ng/ml)之下后用破傷風類毒素進行二次免疫，所有分組中所有的動物都產(chǎn)生出高的抗破傷風抗體效價。這表明，暫停用h1F1和3D1治療正常免疫功能得到恢復，本研究中沒有獲得對破傷風的長期耐受性。材料與方法根據(jù)表9，于第0天給動物投以單一靜脈注射劑量的待測或對照(載體)物品。用注射泵裝置以0.1ml/min/kg(最大給藥速度為1ml/min/kg)通過外周靜脈灌注待測或對照物品。于第0天t＝1小時，所有動物通過肌肉注射接受10Lf單位(絮凝極限)的純化破傷風類毒素(Maccachusetts Biologic Laboratories，Umass，Jamaica Plain，MA)并通過皮內(nèi)注射接受10Lf單位的純化破傷風類毒素。于t＝14周時，所有動物通過肌內(nèi)注射接受10Lf單位的純化破傷風類毒素并通過皮內(nèi)注射接受10Lf單位的純化破傷風類毒素以進行第二次免疫。給藥后，在長達3024個小時(126天)的特定時間點用靜脈穿刺的方法收集血樣。用ELISA測定法檢測抗破傷風抗體(IgM和IgG)的血清水平。表9 分組及其劑量水平
抗破傷風抗體的形成免疫后14天所有用載體治療的動物都開始產(chǎn)生出可檢測的抗破傷風抗體效價(表10，圖23、24和圖25)。在14周的觀察期內(nèi)，用兩種最高劑量(10mg/kg或1mg/kg)的混合h1F1和h3D1能夠完全抑制所有動物中可檢測抗體效價的形成。在用0.1mg/kg治療的動物中，觀察到抗體應答的部分抑制，三只動物中的一只動物產(chǎn)生出可檢測的抗體效價。所有用0.01mg/kg的h1F1和h3D1的混合物治療的動物都產(chǎn)生出可檢測的抗體效價；然而，當這樣的效價與載體對照組中觀察的效價相比時其在數(shù)值上要低些，表明對抗體應答有一定的抑制作用。
表10在用h1F1和h3D1治療的過程中用破傷風類毒素進行初次攻擊后產(chǎn)生出可檢測抗破傷風抗體的cynomolgus猴的數(shù)目
綜合考慮0.1、1和10mg/kg劑量組，單用h1F1(圖24)或h3D1(圖25)治療都不如用h1F1和h3D1混合物有效(圖23)。單用h1F1治療(第2、3和4組)使6/9(66％)的動物產(chǎn)生出可檢測抗破傷風抗體應答。單用h3D1治療(第5、6和7組)使5/9(55％)的動物產(chǎn)生出可檢測的抗體，而用混合的h1F1和h3D1治療(第8、9和10組)后僅僅有1/9(11％)的動物有可檢測的抗體。第11組并不包括在這些比較之中，因為h1F1和h3D1并不是分別以0.01mg/kg的劑量單獨投藥的。
在1和10mg/kg劑量下，在用混合的h1F1和h3D1治療的動物中沒有一只動物產(chǎn)生出抗破傷風抗體應答；而在這兩種劑量情況下，在單用h1F1或h3D1治療的動物中卻產(chǎn)生出可檢測的抗體。當用0.1mg/kg劑量治療動物動物時，所有三個治療組的動物都產(chǎn)生出可檢測的抗破傷風抗體；然而，混合物治療組中的出現(xiàn)率(1/3)比單用h1F1(2/3)或h3D1(3/3)的治療組中的出現(xiàn)率低。
圖26顯示出各個治療組抗破傷風抗體效價曲線下部的面積(AUC)。這些AUC值是用圖23、24和圖25中所示抗體效價曲線計算出來的。從低0周到14周計算AUC值。為了解釋各組中對應動物的數(shù)目，通過各組能產(chǎn)生可檢測抗體效價動物數(shù)目的分數(shù)來加權這些AUC值。這些圖表顯示出在14周觀察期的整個過程中抗體效價的累積量或抗體應答的強度。用10mg/kg或1mg/kg的h1F1和h3D1混合物治療的動物相對于對照組顯示出對抗體應答100％的抑制作用(AUC＝0)。相對于對照組來說，用0.1或0.01mg/kg的h1F1和h3D1混合物治療(第10組和第11組)分別抑制抗體應答78％或86％(AUC＝402或253 Log效價·hr)。相對于對照組來說，在單用h1F1或h3D1治療(第2-7組)的動物中抗體應答被抑制在8.6％到99％之間(AUC＝1640或5.04 Log效價hr)。這些資料表明在抑制抗破傷風抗體應答方面，單用h1F1或h3D1治療并不象用同等劑量h1F1和h3D1混合物治療一樣有效。
投藥h1F1和h3D1 14周后用破傷風類毒素再次免疫后，所有分組中所有動物都產(chǎn)生出高抗破傷風抗體效價(＞3 log效價)，表明在暫停用h1F1和h3D1治療后恢復了正常的免疫功能，而且在本研究中對破傷風沒有獲得長期的耐受性。用10mg/kg的h1F1和h3D1混合物治療的動物，在免疫后14天產(chǎn)生出有可檢測抗體效價的延遲型抗體應答，與初次抗體應答相似，這表明對第一次免疫的應答已被完全阻斷。所有其它動物免疫7天后都顯示出升高的抗體效價，這與記憶應答相似而不是與初次應答相似。結論在單一靜脈注射劑量的10或1mg/kg的h1F1和h3D1混合物治療后，觀察到初次抗破傷風抗體應答的完全抑制，而0.1mg/kg的劑量僅僅導致部分抑制。在抑制抗破傷風抗體應答方面，單用h1F1或h3D1治療并不象用同等劑量h1F1和h3D1混合物治療一樣有效。在h1F1和h3D1濃度跌至可檢測極限之下后用破傷風類毒素進行二次免疫，所有分組中的所有動物都產(chǎn)生出高抗破傷風抗體效價。這表明在暫停用h1F1和h3D1治療后恢復了正常的免疫功能。實施例20非人靈長類中抗B7抗體的血清半衰期。
在非人靈長類中檢測鼠抗hB7-1和鼠抗B7-2 mAbs的血清半衰期和靶細胞飽和作用。給3只cynomolgus猴投藥抗hB7-1和抗B7-2 mAbs混合物，對于每種抗體的劑量是2、8、或20mg/kg體重。分析這些猴中抗體與PBMC(增生性血單核細胞)的結合情況、血清mAb濃度以及靈長類抗鼠抗體(PAMA)應答(表11)。用流式細胞儀(FACS)檢測PBMC飽和作用，其中，從mAb給藥的靈長類的血液中分離的PBMC用羊抗鼠Ig-PE(活體內(nèi)％)顯色，或者是PBMC先與抗hB7-1和抗B7-2 mAbs反應，隨后再用羊抗鼠Ig-PE(來自活體％)檢測。于多個時間點用(活體內(nèi)％/來自活體％)×100計算出PBMC的飽和水平。研究表明，抗hB7-1和抗B7-2mAbs的PBMC飽和作用分別在4-6天(mAbs@2mg/kg)、6-8天(mAbs@8mg/kg)和13-20天(mAbs@20mg/kg)之間降至80％以下，取決于mAb的劑量。循環(huán)B7+細胞的數(shù)目并沒有明顯的降低，雖然并不曾進行直接測定。
采用特異的ELISA檢測抗hB7-1和抗hB7-2 mAbs的血清半衰期，對于每一種mAb用hB7-1Ig或hB7-2Ig作為靶而用羊抗鼠Ig HRP/ABTS檢測。這些分析法對于抗hB7-1和抗hB7-2的靈敏性分別是400ng/ml和200mg/ml。使用市售試劑盒檢測PAMA應答。兩種抗hB7 mAbs的血清濃度和PAMA應答分別以單用每種抗體水平的方式顯示。在所有三種劑量水平進行測定時，兩種抗體在大約48小時內(nèi)展示的血清半衰期相當。在所有的劑量和待測時間，通過可比較因素發(fā)現(xiàn)，升高抗體劑量能提高血清抗體濃度。當劑量為20mg/kg時，發(fā)現(xiàn)在給藥后的第6天每種抗體都有＞30μg/ml的循環(huán)抗體水平。
對抗hB7-1和抗hB7-2 mAbs的PAMA應答低下，在血清抗體水平下降到10μg/ml以下后的第10天才開始變得可以測量。
對用10mg/kg的人源化抗B7-2抗體進行一次性給藥的Cynomolgus猴(n＝6)，檢測其人源化抗人B7-2和B7-1抗體的血清半衰期。通過特異的ELISA用HRP-抗人IgG2和ABTS檢測每種抗體的血清濃度。
圖27顯示出Cynomolgus猴中在給藥后自始至終的42天過程中人源化抗B7-2 mAbs和人源化抗B7-1 mAbs的血清濃度。
Cynomolgus猴中，人源化抗B7-2和人源化抗B7-1 mAbs的血清半衰期，與投以相同劑量的鼠抗人B7-2和鼠抗人B7-1 mAbs大約兩天后的值相比，前者更為延長些。這說明人源化抗人B7 mAbs在循環(huán)中滯留的時間比鼠抗B7抗體的滯留時間要長。表11.靈長類臨床前研究結果
BQL＝低于可測定極限；NT＝未測定實施例21。超抗原(中毒性休克綜合癥毒素-1；TSST-1)對特異T細胞應答的抑制作用通過投藥108個人PBLs使人淋巴細胞“居住”在糖尿病小鼠(NODscidmouse)中。28天后，在有或沒有用人B7-1抗體和人B7-2抗體的混合物治療的情況下(500mg；靜脈注射)用TSST-1治療(10mg，腹膜內(nèi)注射)。再過14天后，用對人CD45、CD4和人Vβ2-TCR特異的抗體通過FACS對腹膜腔內(nèi)人淋巴細胞、T細胞和TSST-1特異的T細胞(Vβ2-TCR細胞)的存在與否進行測定。
表12
結果表12顯示出hu-NODscid小鼠腹膜腔內(nèi)所有的人T細胞的比例以及Vβ2+-TCRT細胞(TSST-1特異的)的比例。用TSST-1治療極大地提高了huNOD-scid小鼠中人T細胞和TSST-1特異的人T細胞(Vβ2+)的百分比。用抗人B7-1抗體和抗人B7-2抗體治療適度地減弱了所有的人T細胞應答，并完全抑制了TSST-1特異的人T細胞的擴展。這表明抗人B7抗體能有效抑制人T細胞超抗原介導的應答。實施例22對抗B7抗體h1F1(抗B7-1)和h3D1(抗b7-2)在Cynomolgus猴生命保障腎移植模型中作用的評估摘要本研究的目的是對單克隆抗體h1F1(抗B7-1)和3D1(抗B7-2)在Cynomolgus猴生命保障腎移植模型中的作用兼容性進行評估。當這些抗體以單一治療的方式給藥以及與常規(guī)免疫抑制劑如環(huán)孢菌素A(CsA)、納巴霉素和類固醇一起給藥時評估這些抗體的作用和兼容性。
24只雄性Cynomolgus猴接受了血型兼容的、混合淋巴細胞反應(MLR)失諧的腎異源移植。在6個治療組中對受體連續(xù)進行研究，包括實施后(poDay)前56天混合使用免疫抑制劑之后，沒有其它附加治療的情況下再接著研究后面的65-66天(連續(xù)期最長總計119-120天)· 1組根據(jù)A程序接受混合抗B7抗體h1F1 20mg/kg+h3D1 20mg/kg預治療，然后用h1F1 5mg/kg+h3D1 5mg/kg進行后治療，h1F15mg/kg+h3D1 5mg/kg每7天重復一次，直到poDay 56為止；給藥9次?！? 2組根據(jù)B程序接受混合抗B7抗體h1F1 5mg/kg+h3D1 5mg/kg預治療，隨后立即用h1F1 10mg/kg+h3D1 10mg/kg進行后治療，在poDay3時再進行一次后治療，然后從poDay 7開始以一周為間隔每種抗體進行8次連續(xù)5mg/kg劑量的治療，到poDay 56時結束?！? 3組根據(jù)A程序+微乳環(huán)孢菌素CsA接受混合抗B7抗體，劑量設計為使得從poDay 0到poDay 14達到24-小時波谷水平濃度200-300ng/ml，然后從poDay 15到poDay 56的最后一次劑量減少劑量以達到24-小時CsA波谷水平150-250ng/ml。· 4組根據(jù)A程序并加上漸減的類固醇劑量接受混合抗B7抗體(h1F1和h3D1)甲基強的松龍2mg/kg靜脈注射進行后治療，然后在poDay2時每日一次，隨后強的松0.5mg/kg以每三天減少0.05mg/kg的方式直到達到0.2mg/kg，0.2mg/kg一直持續(xù)到poDay 56。· 5組根據(jù)A程序并加上納巴霉素接受混合抗B7抗體(h1F1和h3D1)納巴霉素1mg/kg后治療，到poDay 13的過程中每天接受一次，隨后以每天一次0.5mg/kg的劑量一直持續(xù)到poDay 56。· 6組接受微乳狀CsA，劑量設計為使得從poDay 0到poDay 14達到24-小時波谷水平濃度200-300ng/ml，然后從poDay 15到poDay 56的最后一次劑量減少劑量以達到24-小時CsA波谷水平150-250ng/ml?！? 7組從poDay 0到poDay 13接受1mg/kg的納巴霉素，然后從poDay14一直到poDay56為止以0.5mg/kg的劑量給藥。
如果動物中肌酸酐水平上升到8.0mg/dl以上，就使動物在poDay120之前安樂死。肌酸酐水平上升到8.0mg/dl以上是終極腎排斥的證明。
表13中列出了移植、治療過的cynomolgus猴的存活情況。
表13.移植、治療過的cynomolgus猴的存活及其診斷
*每種研究方案中，宰殺存活119/120天的腎臟受體。
該項研究的結果表明非人靈長類腎同種異體移植受體用B7-1和B7-2單克隆抗體的混合物治療，能導致長期的移植存活。在50％的分組1動物中治療終止后直到66天仍能觀察到移植存活。與此形成對照的是，根據(jù)程序B在1組中用抗體給藥，并不能充分克服所治療動物中3/4動物的早期急性排斥事件，該組中只有一只動物存活了120天。聯(lián)合用程序A和微乳CsA治療能夠使所有動物長期存活，并且沒有跡象證明CsA對前面說明的抗體效能有拮抗免疫抑制效應。4組中，用高劑量類固醇和抗體共投藥時并不能拮抗該非人靈長類模型中對抗體的免疫抑制效應。5組中，用納巴霉素和抗體共投藥時并不能拮抗該非人靈長類模型中對抗體的免疫抑制效應。6組中僅用CsA治療導致多個腎臟受體發(fā)生早期排斥。該治療組所得結果比從僅用抗B7抗體治療(1組)或用混合抗體+CsA治療(4組)的動物中所得結果要差。7組中僅用納巴霉素治療導致所有腎臟受體發(fā)生早期排斥。該治療組所得結果比從僅用抗B7抗體治療(1組)或用混合抗體+納巴霉素治療(5組)的動物中所得結果要差。
因此，單克隆抗體h1F1和h3D1在避免非人靈長類生命保障腎移植模型中的早期終極排斥方面是有效的?？贵w可以與其它免疫抑制劑相容，而且通過與微乳狀CsA、納巴霉素或類固醇混合使用它們的作用似乎增強了。
下面的研究分成兩個階段進行。第一個階段的目的是，確定新的免疫抑制抗體h1F1和h3D1在作為對生命保障模型中接受腎移植的cynomolgus猴的單一治療時的作用。移植動物在沒有同時進行免疫抑制治療時，將在移植的10天之內(nèi)排斥移植物。該項研究計劃檢驗兩種不同的抗體療法程序。兩種程序中poDay 56之后都要停止用抗體治療，直到出現(xiàn)移植排斥時或直到第119-120天時再接著進行。
該研究的第二階段計劃檢測的內(nèi)容是a)當h1F1和h3D1與CsA、納巴霉素或類固醇一起給藥時，h1F1和h3D1是否拮抗CsA、納巴霉素或類固醇的免疫抑制效應，從而導致縮短的移植存活；或者b)在用CsA、納巴霉素或類固醇和抗體同時治療(從poDay 0到poDay 56)的過程中或緊接著所有免疫抑制治療都終止之后(＞poDay 56)，CsA、納巴霉素或類固醇是否拮抗h1F1和h3D1的免疫抑制效能。材料與方法動物本研究中用的動物是體重在5到8kg之間的雄性cynomolgus猴，Macaca fascicularis。這些動物經(jīng)過血型定型。供體猴和受體猴配對的基礎是，ABO血型匹配、負交互匹配以及在二向MLR中刺激指數(shù)至少為2.5。待測物品和對照物品h1F1和h3D1抗B7抗體是用與注射泵相連結的注射器投藥的。h1F1和h3D1總是同時一塊混合給藥，通過外周靜脈導管的最大灌注速度為1mg/kg/min。
抗體的投藥根據(jù)的是每組確定好的不同方案進行的。微乳狀CsA(Neoral)微乳狀CsA(Neoral；100mg/ml(Novartis))于室溫下保存，避免光照。將在所需劑量(以mg/kg計)基礎上計算出的Neoral的體積直接抽吸到最小的合適注射器中，給藥時不進行任何稀釋直接通過鼻胃管進入胃中。甲基強的松龍和強的松甲基強的松龍(Solu-Medrol，Pharmacia & Upjohon Co.，Kalamazoo，MI)以瓶裝的方式給貨，所帶的無菌水用于重建，重建時按照廠家說明進行。重建后藥物要冷凍保存，重建48小時之后應該丟棄掉。
強的松(Mutual Pharmaceutical Co.，Inc.，Philadelphia，PA)以片劑的方式給貨(5mg)。片劑溶于無菌水中，每一片片劑用5ml水溶解，溶液終濃度為1mg/ml。每天給藥結束后要將剩余的藥物丟棄掉。實驗設計在生命保障模型中總共有24只猴子接受了單側腎移植。1組h1F1和h3D1單一治療(程序A)1組根據(jù)程序A接受混合抗B7-1抗體+抗B7-2抗體的單一治療h1F1 20mg/kg+h3D1 20mg/kg進行預治療，然后是h1F1 5mg/kg+h3D15mg/kg進行后治療，h1F1 5mg/kg+h3D1 5mg/kg每7天重復一次直到poDay 56。2組h1F1和h3D1單一治療(程序B)程序A與程序B之間的主要區(qū)別是，在程序B中將首次預治療劑量從20mg/kg減少到5mg/kg，隨后的后治療劑量從5mg/kg提高到10mg/kg，在poDay 3附加10mg/kg的劑量。剩余的后治療劑量程序與程序A相同。因此，對于每只動物，無論是程序A還是程序B，在整個后治療過程中所給抗體的總量是相同的。3組h1F1和h3D1(程序A)+CsA
在3組中，伴隨著抗體治療(程序A)的是每日口服一次微乳狀CsA。3組根據(jù)程序A+微乳狀CsA接受抗體，計劃的劑量是從poDay 0到poDay14達到24-小時波谷水平濃度200-300ng/ml，隨后從poDay 15到poDay56的最后一次用藥以減少的劑量方式達到24-小時波谷水平150-250ng/ml。
在通過管飼法短時間酮亞胺鎮(zhèn)靜后，用管飼法每日投藥一次微乳狀CsA。對CsA的24-小時波谷水平每周檢測三次，調(diào)整每日劑量以適應目標CsA波谷水平。為預防體重過度丟失或當認為腎功能損傷與CsA波谷水平有關時，改變附加的CsA劑量。4組h1F1和h3D1(程序A)+類固醇4組根據(jù)A程序并加上漸減劑量的類固醇接受h1F1和h3D1甲基強的松龍2mg/kg靜脈注射進行后治療，然后在poDay 2時每周一次，隨后強的松0.5mg/kg以每三天減少0.05mg/kg的方式直到達到0.2mg/kg，0.2mg/kg一直持續(xù)到poDay 56。
動物在后治療的前3天(poDay 0一直到poDay 2)接受以2mg/kg劑量靜脈大量給藥的方式的投藥。從poDay 3到poDay 56，通過管飼法以漸減程序(參照圖4)給酮亞胺鎮(zhèn)靜的動物投藥強的松，開始時劑量為0.5mg/kg，結束時的劑量為0.2mg/kg。5組h1F1和h3D1(程序A)+納巴霉素5組根據(jù)A程序并加上納巴霉素投藥h1F1和h3D1納巴霉素1mg/kg后治療，到poDay 13的過程中每天接受一次，隨后以每天一次0.5mg/kg的劑量一直持續(xù)到poDay 56。6組僅用CsA6組接受微乳狀CsA，劑量設計為使得從poDay 0到poDay 14達到24-小時波谷水平濃度200-300ng/ml，然后從poDay 15到poDay 56的最后一次用藥以減少的劑量達到24-小時CsA波谷水平150-250ng/ml。
在用管飼法進行短時間酮亞胺鎮(zhèn)靜之后，用微乳狀CsA每天投藥一次。對CsA的24-小時波谷水平每周檢測三次，調(diào)整每日劑量以適應目標CsA波谷水平。為預防體重過度丟失或當認為腎功能損傷與CsA波谷水平有關時，改變附加的CsA劑量。7組納巴霉素在用管飼法進行短時間酮亞胺鎮(zhèn)靜之后，用納巴霉素每天投藥一次。7組從poDay 0到poDay 13接受1mg/kg的納巴霉素，然后從poDay14一直到poDay56以0.5mg/kg的劑量給藥。結果與討論歷史對照組腎移植，不經(jīng)治療歷史對照組的數(shù)據(jù)顯示，接受腎移植而不經(jīng)治療的cynomolgus猴到移植后10天為止，無一例外地排斥移植的腎臟。1組根據(jù)程序A使用h1F1和h3D1的單一治療根據(jù)程序A用混合的抗B7-1+抗B7-2 mAbs治療的4只動物中有2只動物將功能性同種異體移植一直保持到了研究結束(120天)，而另外2只在治療過程中(第9天和第48天)排斥移植來的腎臟。根據(jù)程序A治療的4個腎臟受體中有3個比歷史對照保留移植腎臟的時間更長些，顯示出抗B7治療在預防移植腎臟的排斥方面的作用。2組根據(jù)程序B使用h1F1和h3D1的單一治療與1組不同的是，在根據(jù)程序B用抗B7抗體治療的4只動物中只有1只動物在poDay 18后還保留了功能性腎移植。但是，該動物一直將功能性同種異體移植保持到了研究結束(120天)。這些數(shù)據(jù)表明，根據(jù)程序A用抗B7 mAbs治療比根據(jù)程序B治療的動物在對腎臟排斥的免疫抑制方面更為有效。這樣的結果可能是因為在根據(jù)程序A治療的動物中在移植之后更為提前地出現(xiàn)了更高濃度的抗B7 mAbs。3組根據(jù)程序A+微乳狀CsA用h1F1和h3D1治療根據(jù)程序A用抗B7 mAbs并結合CsA治療的所有動物都極大地延緩了移植腎臟的排斥，4只動物中有3只動物將功能性同種異體移植保持到了研究的結束(poDay 119)。這些結果比僅用抗B7 mAbs治療(1組)或僅用CsA治療(6組)獲得的結果要好，證明在用抗B7 mAbs和用CsA治療之間不存在拮抗作用，而且用這些藥劑共治療對延遲器官排斥提供了額外的好處。4組根據(jù)程序A+甲基強的松龍/強的松用h1F1和h3D1治療在用復合的抗B7 mAbs+類固醇治療的4只動物中，有1只動物將移植的腎臟一直保留到研究結束(poDay 119)。剩下的3個腎臟受體，其中的2只動物表現(xiàn)出對移植的腎臟有延遲的排斥作用。第三只猴子因為輸尿管壞死的緣故，所以過早地(poDay 6)排斥了移植而來的腎臟，輸尿管的壞死可能與高劑量的類固醇有關。綜合一下考慮，這些資料表明復合的抗B7 mAbs+類固醇在預防移植腎臟的排斥方面是有效的，而且這些藥劑的復合使用并不是禁忌的。5組根據(jù)程序A+納巴霉素用h1F1和h3D1治療根據(jù)程序A+納巴霉素用h1F1和h3D1治療的所有4只動物都將功能性腎同種異體移植保留到了超出治療期，持續(xù)時間從69-114poDay。這說明用復合的抗B7 mAbs+納巴霉素治療在延遲器官排斥方面是有益的，而且對僅用抗B7 mAbs治療沒有拮抗作用。6組僅用CsA治療所有僅用CsA治療的4只動物都對移植來的腎臟產(chǎn)生了排斥，4只動物中有3只在用CsA治療的治療的過程中就產(chǎn)生了排斥。這些結果比用復合的抗B7 mAbs+CsA治療的動物獲得的結果要差。7組僅用納巴霉素治療所有僅用納巴霉素治療的4只動物在治療期就對移植的腎臟產(chǎn)生了排斥。結論本研究的目的是評估新的單克隆抗體h1F1和h3D1在生命保障非人靈長類移植模型中的作用和相容性。通過評估終極急性排斥和最終同種異體移植(動物)存活的發(fā)生率對抗體的作用作出評定。所用模型中，預計未經(jīng)治療的動物中終極排斥作用發(fā)生在移植后的10天之內(nèi)。在總計7個不同的治療組中檢測抗體的相容性和作用。在越是靠后的分組中治療的結果成為研究的進展，是在前面分組結果基礎上進行的。效能評估1組h1F1和h3D1單一治療(程序A)第1個治療組中的動物僅用h1F1和h3D1治療，56天時間內(nèi)每周給藥一次，不加入附加的免疫抑制藥物進行治療。結果顯示用h1F1和h3D1單一治療能預防該組4只動物中的2只發(fā)生終極急性排斥作用，并且另一只動物中終極排斥的發(fā)生一直延遲到poDay 48。在其中一只猴子中，抗體的投藥并不能比歷史對照組中所見到的更能延長移植存活。2組h1F1和h3D1單一治療(程序B)為了預防在poDay 5到poDay 7之間1組中所見到的早期急性排斥事件的發(fā)生，2組中抗體投藥的方法和程序有了一些改動。該組中預治療劑量從每種抗體20mg/kg減少到每種抗體5mg/kg，而首次后治療劑量從每種抗體5mg/kg增加到每種抗體10mg/kg。因此，預治療投藥時抗體的總量從25mg/kg減少到15mg/kg。在poDay 3這一天給一次額外的劑量10mg/kg。這樣，1組和2組中投藥程序完全相同。
4只動物中的3只動物沒有從首次排斥事件中恢復過來。只有一只動物存活過了整個隨后的研究期。這說明了在預治療期和后治療期過程中服抗體時間和劑量的關鍵性方面。預治療劑量的減少有可能導致更強有力的排斥應答，而在poDay 3這一天給一次額外劑量的投藥并沒有影響到該結果。
在1組和2組中都有未經(jīng)額外免疫抑制治療卻能長期存活的動物。
直接比較按照程序A(1組)和程序B(2組)的移植結果，發(fā)現(xiàn)還是應該贊成程序A。下面的兩個分組根據(jù)程序A用復合抗體投藥。3組h1F1和h3D1(程序A)+CsA在3組中用微乳狀CsA投藥，使用CsA的目的是提供24-小時波谷水平200-300mg/kg。該組中的所有動物都存活了很長時間(＞56天)，而且4只動物中有3只動物直到隨后的研究期結束都沒有產(chǎn)生終末急性排斥的跡象。因此，抗B7抗體或CsA都沒有對另外一個的作用有負面影響。該組中正中的存活期是119天，而平均存活期是113天，這和1組中的存活長度(正中84天；平均74天)相比，即使不比后者長的話，至少應該一樣的好。另外一個治療組中受體僅用微乳狀CsA(6組)治療，其給藥量是為了達到與3組相近的波谷水平(治療56天)，該治療組結果顯示所有移植受體都排斥移植來的腎臟，而且4只中有3只在治療的整個過程中都有排斥。
組合使用單克隆抗體和微乳狀CsA就能避免早期急性排斥事件的發(fā)生。4組h1F1和h3D1(程序A)+類固醇4組中組合的h1F1和h3D1是與漸減劑量的類固醇同時投藥的。該模型中僅用類固醇的單一治療通常并不能足以預防終極同種異體移植排斥作用。該組中選擇高劑量的類固醇是為了確定類固醇或抗體是否能彼此影響另外一個的效力。4只用復合抗B7 mAbs+類固醇治療的動物中有1只動物一直將移植的腎臟保留到了研究的結束(poDay 119)。剩下的三個腎臟受體中，有兩個表現(xiàn)出對移植腎臟的延緩排斥。第三只猴子因為輸尿管壞死的緣故，所以過早地(poDay 6)排斥了移植來的腎臟，輸尿管的壞死可能與高劑量的類固醇有關。
在該分組中，好象共投藥高劑量的類固醇對抗體的作用并沒有任何負面影響。還不清楚的是，抗體的投藥對類固醇的免疫抑制作用是否有影響，因為在非類人靈長類腎移植模型中還沒有有關用類似的類固醇作單一治療時的資料。5組根據(jù)程序A+納巴霉素用h1F1和h3D1治療根據(jù)程序A+納巴霉素用h1F1和h3D1治療的所有4只動物都將功能性腎同種異體移植保留到了超過治療期，持續(xù)時間從69-114poDay。這說明用復合的抗B7 mAbs+納巴霉素治療在延遲器官排斥方面是有益的，而且對僅用抗B7 mAbs治療沒有拮抗作用。另外一個治療組中受體僅用納巴霉素治療(7組)，其給藥量是為了達到與5組相近的波谷水平，該治療組結果顯示所有的4個移植受體在治療期內(nèi)都排斥移植來的腎臟。6組僅用CsA治療所有僅用CsA治療的4只動物都對移植來的腎臟產(chǎn)生了排斥，4只動物中有3只在用CsA治療的治療的過程中就產(chǎn)生了排斥。這些結果比用復合的抗B7 mAbs+CsA治療的動物獲得的結果要差。7組僅用納巴霉素所有僅用納巴霉素治療的4只動物在治療期就對移植的腎臟產(chǎn)生了排斥。這些結果比用復合的抗B7 mAbs和納巴霉素治療的動物獲得的結果要差(5組)。實施例23用B7-1和B7-2的單克隆抗體誘導治療能延緩非人靈長類中腎同種異體移植排斥作用的開始摘要該項研究中，對單用單克隆抗體抗B7-1(h1F1)或抗B7-2(h3D1)投藥以及用二者組合投藥時延緩獼猴急性腎同種異體移植排斥作用開始的能力進行了檢測。最持久的效果是由于同時阻斷兩個B7配體所致。作用機制中并不包括T細胞或B細胞的全面衰竭。材料與方法實驗設計MHC的定型和供體-受體選擇供體-受體組合的選擇基礎是II類主要組織相容性復合體(MHC)遺傳上的不相同性。這是通過進行變性梯度凝膠電泳分析并對主要組織相容性復合體抗原HLA-DRB的第二個外顯子直接測序來確定的。用混合淋巴細胞反應(MLR)鑒定法于體外對所有供體-受體對中受體對供體的T細胞反應性進行核實。對每只動物都要檢測，看其是否是潛在的供體，以確定出移植的最高效應器對。腎的同種異體移植按照先前所述進行腎的同種異體移植(Knechtle SJ，et al.，Transplantation，631-6(1997)；Kirk AD，et al.，Pro Natl AcadSci USA.948789-8794(1997)；Kirk AD，et al.，Nature Medicine，5686-693(1999))。簡言之，從LABS of Virginia，Inc.公司(Yemassee，SC)獲得雜交繁殖的幼年獼猴(年齡從18-36個月，雄性)，對獼猴免疫缺陷病毒和皰疹B病毒的血清反應是陰性。
所有步驟都是在總體麻醉的情況下進行的。腎的移植是在由MHC分析法鑒定的遺傳上截然不同的供體-受體之間進行的。在器官收獲和移植的過程中動物要用肝素治療(100單位/kg)。在進行同種異體移植時，使用標準微血管技術使供體腎動脈和受體末端主動脈接合，并使供體腎靜脈和受體大靜脈接合。隨后進行初級輸尿管新腔膀胱手術。在關閉之前完成兩側天然腎的切除。7-10天后去除皮膚縫合線。
抗B7-1抗體和/或抗B7-2抗體按照下文詳述的劑量靜脈投藥。在腎衰竭時對動物進行安死術，腎衰竭的鑒定方法是血清肌酸酐水平上升或體重下降了移植前體重的15％，這和AAALAC標準一致。對于所有被宰殺的動物，要在尸體剖檢時進行徹底的總體分析和組織病理學分析。結果與討論I組對照動物
5只動物接受腎同種異體移植，不接收任何預防排斥的治療。所有5只動物都因為急性排斥而在8天之內(nèi)失去移植物(表14，圖28)。II組僅用h1F1單一治療2只動物僅用h1F1進行治療(表14，圖28)。在移植重新灌注之前抗體開始以20mg/kg的劑量給藥。隨后給藥的劑量為5mg/kg，每7天給藥一次，直到發(fā)生排斥為止。這2只動物的移植存活期有輕微的延長，其排斥發(fā)生在第8天和第9天。III組僅用h3D1單一治療2只動物僅用h3D1進行治療(表14，圖28)。在移植重新灌注之前抗體開始以20mg/kg的劑量給藥。隨后給藥的劑量為5mg/kg，每7天給藥一次，直到發(fā)生排斥為止。這2只動物的移植存活期有最低程度的延長，其排斥發(fā)生在第8天和第28天。IV組用h1F1和h3D1一起進行組合治療4只動物同時用h1F1和h3D1進行治療(表14，圖28)。在移植重新灌注之前抗體開始以20mg/kg的劑量給藥。其中1只動物(AT48)在移植后即刻以5mg/kg的劑量給藥。所有動物都是在固定時期內(nèi)或直到排斥發(fā)生之前每7天一次以5mg/kg的劑量給藥。IV組的4只中的3只動物，安排其抗體于60天后停止投藥。有1只動物給藥80多天(AC2B)。所有動物都有延長的移植物存活期，分別是47天、67天、227天和＞365天。有1只動物在移植后一年的時間仍能存活的很好，并且沒有發(fā)生過排斥。不宰殺這只動物；然而出于本研究的目的，終止了監(jiān)測。發(fā)生排斥的動物在宰殺前大約一周其肌酸酐水平開始超過基線。
與I組相比，同時接收h1F1和h3D1組合治療的動物顯著延長了同種異體移植的功能(p＝0.016)。與兩個單一治療組相比，組合組中存活期的延長也顯著提高了。
表14. 獼猴的存活及其診斷情況
a手術后治療80天b手術后治療60天顯示出了所有移植動物的治療方案和結果。人源化抗體給藥的起始劑量是20mg/kg，隨后是5mg/kg，然后在60-80天之間每周給藥一次，劑量是5mg/kg。動物AT48在移植后也即刻接收5mg/kg的劑量。
本文所引用的所有參考文獻、專利和/或專利申請的內(nèi)容在此完整引入作為參考。
雖然本發(fā)明以有關其優(yōu)選實施方案的方式特異顯示出來并加以描述，但是，對于本領域的熟練人員來說，不難理解的是在不違反在附加權利要求中包括的本發(fā)明范圍的情況下，形式和細節(jié)上可以有多種不同形式的變動。
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<223>來自細胞混合物<221>CDS<222>(1)...(405)<400>1atg ggt tgg aac tgt atc atc ttc ttt ctg gtt aca aca gct aca ggt 48Met Gly Trp Asn Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Thr Thr Ala Thr Gly1 5 10 15gtg cac tcc cag gtc cag ctg cag cag tct ggg cct gag ctg gtg agg 96Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg20 25 30cct ggg gaa tca gtg aag att tcc tgc aag ggt tcc ggc tac aca ttc 144Pro Gly Glu Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45act gat tat gct ata cag tgg gtg aag cag agt cat gca aag agt cta 192Thr Asp Tyr Ala Ile Gln Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu50 55 60gag tgg att gga gtt att aat att tac tat gat aat aca aac tac aac 240Glu Trp Ile Gly Val Ile Asn Ile Tyr Tyr Asp Asn Thr Asn Tyr Asn65 70 75 80cag aag ttt aag ggc aag gcc aca atg act gta gac aaa tcc tcc agc 288Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser85 90 95aca gcc tat atg gaa ctt gcc aga ttg aca tct gag gat tct gcc atc 336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile100 105 110tat tac tgt gca aga gcg gcc tgg tat atg gac tac tgg ggt caa gga 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Ala Trp Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly115 120 125acc tca gtc acc gtc tcc tca 405Thr Ser Val Thr Val Ser Ser130 135<210>2<211>135<212>蛋白質<213>人工序列<220>
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<210>3<211>396<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>來自細胞混合物<221>CDS<222>(1)...(396)<400>3atg gat tca cag gcc cag gtt ctt ata ttg ctg ctg cta tgg gta tct 48Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser1 5 10 15ggt acc tgt ggg gac att gtg ctg tca cag tct cca tcc tcc ctg gct 96Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala20 25 30gtg tca gca gga gag aag gtc act atg agc tgc aaa tcc agt cag agt 144Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser35 40 45ctg ctc aac agt aga acc cga gag aac tac ttg gct tgg tac cag cag 192Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Glu Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln50 55 60aaa cca ggg cag tct cct aaa ctg ctg atc tac tgg gca tcc act agg 240Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg65 70 75 80gaa tct ggg gtc cct gat cgc ttc aca ggc agt gga tct ggg aca gat 288Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp85 90 95ttc act ctc acc atc agc agt gtg cag gct gaa gac ctg gca gtt tat 336Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr100 105 110tac tgc acg caa tct tat aat ctt tac acg ttc gga ggg ggg acc aag 384Tyr Cys Thr Gln Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys115 120 125ctg gaa ata aaa 396Leu Glu Ile Lys130<210>4<211>132<212>蛋白質<213>人工序列<220>
<223>來自細胞混合物
<400>4Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser1 5 10 15Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala20 25 30Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser35 40 45Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Glu Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln50 55 60Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg65 70 75 80Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp85 90 95Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr100 105 110Tyr Cys Thr Gln Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys115 120 125Leu Glu Ile Lys130<210>5<211>405<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>來自細胞混合物<221>CDS<222>(1)...(405)<400>5atg ggt tgg aac tgt atc atc ttc ttt ctg gtt acc aca gct aca ggt 48Met Gly Trp Asn Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Thr Thr Ala Thr Gly1 5 10 15gtg cac tcc cag gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag 96Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys20 25 30cct ggg agc tca gtg aag gtg tcc tgc aaa gct tcc ggc tac aca ttc 144Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45act gat tat gct ata cag tgg gtg aga cag gct cct gga cag ggc ctc 192Thr Asp Tyr Ala Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60gag tgg att gga gtt att aat att tac tat gat aat aca aac tac aac 240Glu Trp Ile Gly Val Ile Asn Ile Tyr Tyr Asp Asn Thr Asn Tyr Asn65 70 75 80cag aag ttt aag ggc aag gcc aca atg act gta gac aag tcg acg agc 288Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser85 90 95aca gcc tat atg gaa ctt agt tct ttg aga tct gag gat acg gcc gtt 336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val100 105 110tat tac tgt gca aga gcg gcc tgg tat atg gac tac tgg ggt caa ggt 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Ala Trp Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly115 120 125acc ctt gtc acc gtc tcc tca 405Thr Leu Val Thr Val Ser Ser130 135<210>6<211>135<212>蛋白質<213>人工序列<220>
<223>來自細胞混合物<400>6Met Gly Trp Asn Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Thr Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys20 25 30Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45Thr Asp Tyr Ala Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60Glu Trp Ile Gly Val Ile Asn Ile Tyr Tyr Asp Asn Thr Asn Tyr Asn65 70 75 80Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser85 90 95Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Ala Trp Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly115 120 125Thr Leu Val Thr Val Ser Ser130 135<210>7<211>396<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>來自細胞混合物<221>CDS<222>(1)...(396)<400>7atg gat tca cag gcc cag gtt ctt ata ttg ctg ctg cta tgg gta tct48Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser1 5 10 15ggc acc tgt ggg gac att gtg ctg aca cag tct cca gat tcc ctg gct96Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala20 25 30gta agc tta gga gag agg gcc act att agc tgc aaa tcc agt cag agt 144Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser35 40 45ctg ctc aac agt aga acc cga gag aac tac ttg gct tgg tac cag cag 192Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Glu Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln50 55 60aaa cca ggg cag cct cct aaa ctg ctg atc tac tgg gca tcc act agg 240Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg65 70 75 80gaa tct ggg gtc cct gat cgc ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat 288Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp85 90 95ttc act ctc acc atc agc agt ctg cag gct gaa gac gtg gca gtt tat 336Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr100 105 110tac tgc acg caa tct tat aat ctt tac acg ttc gga cag ggg acc aag 384Tyr Cys Thr Gln Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys115 120 125gtg gaa ata aaa 396Val Glu Ile Lys130<210>8<211>132<212>蛋白質<213>人工序列<220>
<223>來自細胞混合物<400>8Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser1 5 10 15Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala20 25 30Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser35 40 45Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Glu Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln50 55 60Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg65 70 75 80Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp85 90 95Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr100 105 110Tyr Cys Thr Gln Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys115 120 125Val Glu Ile Lys130<210>9<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源化鼠抗人B7-2重鏈CDR1<221>CDS<222>(1)...(15)<400>9gat tat gct ata cag15Asp Tyr Ala Ile Gln1 5<210>10<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化鼠抗人B7-2重鏈CDR1<400>10Asp Tyr Ala Ile Gln1 5<210>11<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源化鼠抗人B7-2重鏈CDR2<221>CDS<222>(1)...(51)<400>11gtt att aat att tac tat gat aat aca aac tac aac cag aag ttt aag48Val Ile Asn Ile Tyr Iyr Asp Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys1 5 10 15ggc51Gly
<210>12<211>17<212>蛋白質<213>人工序列<220>
<223>人源化鼠抗人B7-2重鏈CDR2<400>12Val Ile Asn Ile Tyr Tyr Asp Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys1 5 10 15Gly<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源化鼠抗人B7-2重鏈CDR3<221>CDS<222>(1)...(21)<400>13gcg gcc tgg tat atg gac tac21Ala Ala Trp Tyr Met Asp Tyr1 5<210>14<211>7<212>蛋白質<213>人工序列<220>
<223>人源化鼠抗人B7-2重鏈CDR3<400>14Ala Ala Trp Tyr Met Asp Tyr1 5<210>15<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源化鼠抗人B7-2輕鏈CDR1
<221>CDS<222>(1)...(51)<400>15aaa tcc agt cag agt ctg ctc aac agt aga acc cga gag aac tac ttg48Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Glu Asn Tyr Leu1 5 10 15gct51Ala<210>16<211>17<212>蛋白質<213>人工序列<220>
<223>人源化鼠抗人B7-2輕鏈CDR1<400>16Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Glu Asn Tyr Leu1 5 10 15Ala<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源化鼠抗人B7-2輕鏈CDR2<221>CDS<222>(1)...(21)<400>17tgg gca tcc act agg gaa tct21Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser1 5<210>18<211>7<212>蛋白質<213>人工序列<220>
<223>人源化鼠抗人B7-2輕鏈CDR2<400>18Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser1 5
<210>19<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源化鼠抗人B7-2輕鏈CDR3<221>CDS<222>(1)...(24)<400>19acg caa tct tat aat ctt tac acg24Thr Gln Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr1 5<210>20<211>8<212>蛋白質<213>人工序列<220>
<223>人源化鼠抗人B7-2輕鏈CDR3<400>20Thr Gln Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr1 5<210>21<211>405<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>來自細胞混合物<221>CDS<222>(1)...(405)<400>21atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly1 5 10 15gtc aat tca gag gtt cac ctg cag cag tct ggg gct gag ctt gtg agg96Val Asn Ser Glu Val His Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg20 25 30cca ggg gcc tta gtc aag ttg tcc tgc aaa cct tct ggc ttc aac att144Pro Gly Ala Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Pro Ser Gly Phe Asn Ile35 40 45aaa gac tac tat atg cac tgg gtg aag cag agg cct gaa cag ggc ctg192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu50 55 60gag tgg att gga tgg att gat cct gag aat ggt aat act cta tat gac 240Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Leu Tyr Asp65 70 75 80ccg aag ttc cag ggc aag gcc agt ata aca gca gac aca tcc tcc aac 288Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Ser Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn85 90 95aca gcc tac ctg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac act gcc gtc 336Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val100 105 110tat tac tgt gct aga gag ggg ctt ttt ttt gct tac tgg ggc caa ggg 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Leu Phe Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly115 120 125act ccg gtc act gtc tct gca 405Thr Pro Val Thr Val Ser Ala130 135<210>22<211>135<212>蛋白質<213>人工序列<220>
<223>來自細胞混合物<400>22Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly1 5 10 15Val Asn Ser Glu Val His Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg20 25 30Pro Gly Ala Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Pro Ser Gly Phe Asn Ile35 40 45Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu50 55 60Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Leu Tyr Asp65 70 75 80Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Ser Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn85 90 95Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Leu Phe Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly115 120 125Thr Pro Val Thr Val Ser Ala130 135<210>23<211>390<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>來自細胞混合物<221>CDS<222>(1)...(390)<400>23atg gat ttt cat gtg cag att ttc agc ttc atg cta atc agt gtc aca 48Met Asp Phe His Val Gln Ile Phe Ser Phe Met Leu Ile Ser Val Thr1 5 10 15gtc ata ttg tcc agt gga gaa att gtg ctc acc cag tct cca gca ctc 96Val Ile Leu Ser Ser Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu20 25 30atg gct gca tct cca ggg gag aag gtc acc atc acc tgc agt gtc agc 144Met Ala Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser35 40 45tca agt ata agt tcc agc aac ttg cac tgg tac cag cag aag tca gaa 192Ser Ser Ile Ser Ser Ser Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Glu50 55 60acc tcc ccc aaa ccc tgg att tat ggc aca tcc aac ctg gct tct gga 240Thr Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly65 70 75 80gtc cct gtt cgc ttc agt ggc agt gga tct ggg acc tct tat tct ctc 288Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu85 90 95aca atc agc agc atg gag gct gaa gat gct gcc act tat tac tgt caa 336Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln100 105 110cag tgg agt agt tac cca ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag 384Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu115 120 125ctg aaa 390Leu Lys130<210>24<211>130<212>蛋白質<213>人工序列<220>
<223>來自細胞混合物<400>24Met Asp Phe His Val Gln Ile Phe Ser Phe Met Leu Ile Ser Val Thr1 5 10 15Val Ile Leu Ser Ser Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu20 25 30Met Ala Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser35 40 45Ser Ser Ile Ser Ser Ser Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Glu50 55 60Thr Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly65 70 75 80Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu85 90 95Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln100 105 110Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu115 120 125Leu Lys130<210>25<211>405<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>來自細胞混合物<221>CDS<222>(1)...(405)<400>25atg aaa tgc agc tgg gtc atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg 48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly1 5 10 15gtc aat tca gag gtt cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtt aag aag 96Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys20 25 30cca ggg gcc tca gtc aag gtg tcc tgc aaa cct tct ggc ttc aac att 144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Pro Ser Gly Phe Asn Ile35 40 45aaa gac tac tat atg cac tgg gtg agg cag gcg cct gga cag ggc ctc 192Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60gag tgg att gga tgg att gat cct gag aat ggt aat act cta tat gac 240Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Leu Tyr Asp65 70 75 80ccg aag ttc cag ggc aag gcc act ata act gca gac aca tcc acc agc 288Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser85 90 95aca gcc tac atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac act gcc gtc 336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val100 105 110tat tac tgt gct aga gag ggg ctt ttt ttt gct tac tgg ggc caa ggt 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Leu Phe Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly115 120 125acc ctg gtc act gtc tct tca 405Thr Leu Val Thr Val Ser Ser130 135<210>26<211>135<212>蛋白質<213>人工序列<220>
<223>來自細胞混合物<400>26Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly1 5 10 15Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys20 25 30Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Pro Ser Gly Phe Asn Ile35 40 45Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Leu Tyr Asp65 70 75 80Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser85 90 95Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Leu Phe Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly115 120 125Thr Leu Val Thr Val Ser Ser130 135<210>27<211>390<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>來自細胞混合物<221>CDS<222>(1)...(390)<400>27atg gat ttt cat gtg cag att ttc agc ttc atg cta atc agt gtc aca48Met Asp Phe His Val Gln Ile Phe Ser Phe Met Leu Ile Ser Val Thr1 5 10 15gtc ata ttg tcc agt gga gat att cag atg acc cag tct cca tca tcc96Val Ile Leu Ser Ser Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser20 25 30ctg tct gca tct gta ggg gat agg gtc acc atc acc tgc agt gtc agc 144Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser35 40 45tca agt ata agt tcc agc aac ttg cac tgg tac cag cag aag cca ggc 192Ser Ser Ile Ser Ser Ser Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly50 55 60aag gcc ccc aaa ccc ttg att tat ggc aca tcc aac ctg gct tct gga 240Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly65 70 75 80gtc cct agt cgc ttc agt ggc agt gga tct ggg acc gat tat act ctc 288Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu85 90 95aca atc agc agc ttg cag cct gaa gat gtt gcc act tat tac tgt caa 336Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln100 105 110cag tgg agt agt tac cca ctc acg ttc ggt caa ggg acc aag gtg gag 384Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu115 120 125atc aaa 390Ile Lys130<210>28<211>130<212>蛋白質<213>人工序列<220>
<223>來自細胞混合物<400> 28Met Asp Phe His Val Gln Ile Phe Ser Phe Met Leu Ile Ser Val Thr1 5 10 15Val Ile Leu Ser Ser Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser20 25 30Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser35 40 45Ser Ser Ile Ser Ser Ser Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly50 55 60Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly65 70 75 80Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu85 90 95Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln100 105 110Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu115 120 125Ile Lys130
<210>29<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源化鼠抗人B7-1重鏈CDR1<221>CDS<222>(1)...(15)<400>29gac tac tat atg cac15Asp Tyr Tyr Met His1 5<210>30<211>5<212>蛋白質<213>人工序列<220>
<223>人源化鼠抗人B7-1重鏈CDR1<400>30Asp Tyr Tyr Met His1 5<210>31<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源化鼠抗人B7-1重鏈CDR2<221>CDS<222>(1)...(51)<400>31tgg att gat cct gag aat ggt aat act cta tat gac ccg aag ttc cag48Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Leu Tyr Asp Pro Lys Phe Gln1 5 10 15ggc51Gly<210>32<211>17<212>蛋白質
<213>人工序列<220>
<223>人源化鼠抗人B7-1重鏈CDR2<400>32Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Leu Tyr Asp Pro Lys Phe Gln1 5 10 15Gly<210>33<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源化鼠抗人B7-1重鏈CDR3<221>CDS<222>(1)...(21)<400>33gag ggg ctt ttt ttt gct tac21Glu Gly Leu Phe Phe Ala Tyr1 5<210>34<211>7<212>蛋白質<213>人工序列<220>
<223>人源化鼠抗人B7-1重鏈CDR3<400>34Glu Gly Leu Phe Phe Ala Tyr1 5<210>35<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源化鼠抗人B7-1輕鏈CDR1<221>CDS<222>(1)...(36)<400>35agt gtc agc tca agt ata agt tcc agc aac ttg cac36Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser Asn Leu His1 5 10<210>36<211>12<212>蛋白質<213>人工序列<220>
<223>人源化鼠抗人B7-1輕鏈CDR1<400>36Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser Asn Leu His1 5 10<210>37<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源化鼠抗人B7-1輕鏈CDR2<221>CDS<222>(1)...(21)<400>37ggc aca tcc aac ctg gct tct 21Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser1 5<210>38<211>7<212>蛋白質<213>人工序列<220>
<223>人源化鼠抗人B7-1輕鏈CDR2<400>38Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser1 5<210>39<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源化鼠抗人B7-1輕鏈CDR3
<221>CDS<222>(1)...(27)<400>39caa cag tgg agt agt tac cca ctc acg 27Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr1 5<210>40<211>9<212>蛋白質<213>人工序列<220>
<223>人源化鼠抗人B7-1輕鏈CDR3<400>40Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr1 權利要求
1.一種與B7分子有結合特異性的人源化免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包括一個非人來源的抗原結合區(qū)以及人來源免疫球蛋白的至少一部分。
2.權利要求1的人源化免疫球蛋白，其中所述B7分子是B7-1和/或B7-2。
3.一種包括人源化B7-1抗體和人源化B7-2抗體的藥用組合物。
4.一種包括能編碼人源化B7-1抗體和/或人源化B7-2抗體的核酸的宿主細胞。
5.一種與B7-1分子有結合特異性的人源化免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包括一個非人來源的抗原結合區(qū)以及人來源免疫球蛋白的至少一部分。
6.權利要求5的人源化免疫球蛋白，其中所述人來源免疫球蛋白部分來自于人恒定區(qū)。
7.權利要求6的人源化免疫球蛋白，其中所述人恒定區(qū)包括一個IgG恒定區(qū)。
8.權利要求7的人源化免疫球蛋白，其中所述人恒定區(qū)包括的一個突變能降低該免疫球蛋白的效應子功能。
9.權利要求8的人源化免疫球蛋白，其中所述人恒定區(qū)包括一個IgG2恒定區(qū)，234位的纈氨酸由丙氨酸取代，和/或237位的甘氨酸由丙氨酸取代。
10.權利要求7的人源化免疫球蛋白，其中所述IgG恒定區(qū)選自IgG4恒定區(qū)和IgG2恒定區(qū)。
11.權利要求5的人源化免疫球蛋白，其中所述抗原結合區(qū)來自嚙齒類動物。
12.權利要求5的人源化免疫球蛋白，其中所述抗原結合區(qū)包括一個嚙齒類動物來源的互補性決定區(qū)，人來源的免疫球蛋白部分來自人構架區(qū)。
13.權利要求12的人源化免疫球蛋白，其中所述互補性決定區(qū)來自1F1單克隆抗體。
14.一種對B7-1有結合特異性的人源化免疫球蛋白，來自由ATCC保藏的細胞系，Accession No.PTA-263。
15.一種對B7-1有結合特異性的人源化免疫球蛋白輕鏈，包括鼠1F1抗體輕鏈的CDR1、CDR2和CDR3以及一個人輕鏈構架區(qū)。
16.權利要求15的人源化免疫球蛋白輕鏈，其中所述輕鏈包括一個SEQ ID NO28的可變區(qū)。
17.一種包括選自以下核酸的分離核酸a)SEQ ID NO27，b)編碼SEQ ID NO28的氨基酸序列的核酸，c)在嚴格雜交條件下能與a)或b)的核酸雜交的核酸，以及d)與a)或b)核酸互補的核酸。
18.一種與B7-1有特異性的人源化免疫球蛋白重鏈，包括1F1抗體重鏈的CDR1、CDR2和CDR3以及一個人重鏈構架區(qū)。
19.權利要求18的人源化免疫球蛋白重鏈，其中所述重鏈包括一個SEQ ID NO26的可變區(qū)。
20.一種包括選自以下核酸的分離核酸a)SEQ ID NO25，b)編碼SEQ ID NO26的氨基酸序列的核酸，c)在嚴格雜交條件下能與a)或b)的核酸雜交的核酸，以及d)與a)或b)核酸互補的核酸。
21.一種包括編碼權利要求5中人源化免疫球蛋白的核酸的宿主細胞。
22.一種編碼人源化免疫球蛋白輕鏈或重鏈的融合基因，包括a)第一種核酸序列，編碼來自鼠1F1單克隆抗體的抗原結合區(qū)；以及b)第二種核酸序列，編碼人來源免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。
23.一種抑制有B7-1受體的第一種細胞與有B7-1的第二種細胞之間發(fā)生相互作用的方法，包括讓所述第一種細胞接觸有效量的權利要求5的人源化免疫球蛋白。
24.一種治療有移植器官、移植組織或移植細胞的個體的方法，包括投藥治療有效量的權利要求5的人源化抗體。
25.一種治療由B7-1調(diào)節(jié)的疾病的方法，包括投藥治療有效量的權利要求5的人源化抗體。
26.一種制備與B7-1有結合特異性的人源化免疫球蛋白的方法，所述免疫球蛋白包括一個非人來源的抗原結合區(qū)，以及人來源免疫球蛋白的至少一部分，該方法包括以下步驟a)鑒定與B7-1有結合特異性的非人來源抗體的互補性決定區(qū)；b)獲得一種人抗體，該抗體的構架區(qū)氨基酸序列適合于(a)中鑒定的互補性決定區(qū)的嫁接，以及c)將(a)的互補性決定區(qū)嫁接到(b)中人抗體的構架區(qū)中，其中，制備與B7-1有結合特異性的人源化免疫球蛋白。
27.一種鑒定樣品中B7-1存在與否的方法，包括以下步驟a)讓所述樣品與B7-1特異的人源化抗體充分接觸，以便形成B7-1與抗B7-1抗體之間的復合物，以及b)檢測所述復合物存在與否。
28.一種與B7-2分子有結合特異性的人源化免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包括一個非人來源的抗原結合區(qū)以及人來源免疫球蛋白的至少一部分。
29.權利要求28的人源化免疫球蛋白，其中所述人來源免疫球蛋白部分來自人恒定區(qū)。
30.權利要求29的人源化免疫球蛋白，其中所述人恒定區(qū)包括一個IgG恒定區(qū)。
31.權利要求30的人源化免疫球蛋白，其中所述人恒定區(qū)包括的一個突變能降低免疫球蛋白的效應子功能。
32.權利要求31的人源化免疫球蛋白，其中所述人恒定區(qū)包括一個IgG2恒定區(qū)，234位的纈氨酸由丙氨酸取代，和/或237位的甘氨酸由丙氨酸取代。
33.權利要求30的人源化免疫球蛋白，其中所述IgG恒定區(qū)選自IgG4恒定區(qū)和IgG2恒定區(qū)。
34.權利要求28的人源化免疫球蛋白，其中所述抗原結合區(qū)來自嚙齒類動物。
35.權利要求28的人源化免疫球蛋白，其中所述抗原結合區(qū)包括一個嚙齒類動物來源的互補性決定區(qū)，而人來源的免疫球蛋白部分來自人構架區(qū)。
36.權利要求35的人源化免疫球蛋白，其中所述互補性決定區(qū)來自3D1單克隆抗體。
37.一種對B7-2有結合特異性的人源化免疫球蛋白，來自由ATCC保藏的細胞系，Accession No.CRL-12524。
38.一種對B7-2有結合特異性的人源化免疫球蛋白輕鏈，包括鼠3D1抗體輕鏈的CDR1、CDR2和CDR3以及一個人輕鏈構架區(qū)。
39.權利要求38的人源化免疫球蛋白輕鏈，其中所述輕鏈包括一個SEQ ID NO8的可變區(qū)。
40.一種包括選自以下核酸的分離核酸a)SEQ ID NO7，b)編碼SEQ ID NO8氨基酸序列的核酸，c)在嚴格雜交條件下能與a)或b)的核酸雜交的核酸，以及d)與a)或b)的核酸互補的核酸。
41.一種與B7-2有結合特異性的人源化免疫球蛋白重鏈，包括3D1抗體重鏈的CDR1、CDR2和CDR3以及一個人重鏈構架區(qū)。
42.權利要求41的人源化免疫球蛋白重鏈，其中所述重鏈包括一個SEQ ID NO6的可變區(qū)。
43.一種包括選自以下核酸的分離核酸a)SEQ ID NO5，b)編碼SEQ ID NO6氨基酸序列的核酸，c)在嚴格雜交條件下能與a)或b)核酸雜交的核酸，以及d)與a)或b)核酸互補的核酸。
44.一種包括編碼權利要求28中人源化免疫球蛋白的核酸的宿主細胞。
45.一種編碼人源化免疫球蛋白輕鏈或重鏈的融合基因，包括a)第一種核酸序列，編碼來自鼠3D1單克隆抗體的抗原結合區(qū)；以及b)第二種核酸序列，編碼人來源免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。
46.一種抑制有B7-2受體的第一種細胞與有B7-2的第二種細胞之間發(fā)生相互作用的方法，包括讓所述第一種細胞接觸有效量權利要求28的人源化免疫球蛋白。
47.一種治療有移植器官、移植組織或移植細胞的個體的方法，包括投藥治療有效量的權利要求28的人源化抗體。
48.一種治療由B7-2調(diào)節(jié)的疾病的方法，包括投藥治療有效量的權利要求28的人源化抗體。
49.一種制備與B7-2有結合特異性的人源化免疫球蛋白的方法，所述免疫球蛋白包括一個非人來源的抗原結合區(qū)，以及人來源免疫球蛋白的至少一部分，該方法包括以下步驟a)鑒定與B7-2有結合特異性的非人來源抗體的互補性決定區(qū)；b)獲得一種人抗體，該抗體的構架區(qū)氨基酸序列適合于(a)中鑒定的互補性決定區(qū)的嫁接，以及c)將(a)的互補性決定區(qū)嫁接到(b)中人抗體的構架區(qū)中，其中，制備與B7-2有結合特異性的人源化免疫球蛋白。
50.一種鑒定樣品中B7-2存在與否的方法，包括以下步驟a)讓所述樣品與B7-2特異的人源化抗體充分接觸，以便形成B7-2與抗B7-2抗體之間的復合物，以及b)檢測所述復合物存在與否。
51.一種將細胞移植到需要它的個體上的方法，包括a)從供體獲得細胞，b)讓所述細胞與對B7-1特異的免疫球蛋白、對B7-2特異的免疫球蛋白和來自所述個體的細胞接觸足夠長的一段時間，以便誘導耐受性，從而獲得一種混合物，以及c)將所述混合物導入所述受體中。
52.權利要求51的方法，其中所述供體細胞來自骨髓或血液。
53.權利要求51的方法，其中所述受體細胞是淋巴細胞。
54.權利要求51的方法，其中所述時間是大約12小時到大約96小時之間。
55.權利要求54的方法，其中所述時間是大約36小時到大約48小時之間。
56.權利要求55的方法，其中所述受體的疾病選自增生病、貧血癥、先天性代謝障礙、先天性免疫缺陷病以及骨髓相位異常綜合癥。
57.權利要求56的方法，其中所述增生病選自白血病、淋巴瘤以及癌癥。
58.權利要求57的方法，其中所述貧血癥選自于鐮狀細胞貧血、地中海貧血以及再生障礙性貧血。
59.權利要求51的方法，包括給所述個體投以一種用于調(diào)節(jié)免疫反應的藥物。
60.權利要求59的方法，其中所述藥物選自氨甲蝶呤、納巴霉素、環(huán)孢菌素、類固醇、CD40途徑抑制劑、移植補救途徑抑制劑、IL-2受體拮抗物及其類似物。
61.一種治療移植受體或預防移植受體發(fā)生移植排斥的方法，包括給受體投以有效量的對B7-1特異的免疫球蛋白和有效量的對B7-2特異的免疫球蛋白。
62.權利要求61的方法，還包括投以一種選自以下的組合物鈣調(diào)磷酸酶抑制劑、類固醇、能阻斷免疫細胞生長的免疫抑制劑、氨甲蝶呤、CD40途徑抑制劑、移植補救途徑抑制劑、IL-2受體拮抗物及其類似物。
63.權利要求62的方法，其中所述鈣調(diào)磷酸酶抑制劑是環(huán)孢菌素A或FK506。
64.權利要求62的方法，其中所述類固醇是甲基強的松或強的松。
65.權利要求62的方法，其中所述能阻斷免疫細胞生長的免疫抑制劑是納巴霉素。
66.權利要求61的方法，其中所述對B7-1特異的免疫球蛋白的投藥量在大約1mg/kg到大約25mg/kg之間，而所述對B7-2特異的免疫球蛋白的投藥量在大約1mg/kg到大約25mg/kg之間。
67.權利要求66的方法，其中所述對B7-1特異的免疫球蛋白和對B7-2特異的免疫球蛋白是在受體接受移植的當天就投藥的。
68.權利要求67的方法，其中所述對B7-1特異的人源化免疫球蛋白的投藥量在大約1mg/kg到大約25mg/kg之間，對B7-2特異的人源化免疫球蛋白的投藥量在大約1mg/kg到大約25mg/kg之間，受體接受移植的當天就投藥。
69.權利要求68的方法，其中在受體接受移植之后所述對B7-1特異的人源化免疫球蛋白和對B7-2特異的人源化免疫球蛋白還要定期投藥。
70.權利要求69的方法，其中在受體接受移植之后所述對B7-1特異的人源化免疫球蛋白和對B7-2特異的人源化免疫球蛋白至少還要每周投藥一次。
71.權利要求70的方法，其中所述對B7-1特異的人源化免疫球蛋白的投藥量在大約1mg/kg到大約5mg/kg之間，對B7-2特異的人源化免疫球蛋白的投藥量在大約1mg/kg到大約5mg/kg之間，受體接受移植之后至少每周投藥一次。
72.一種治療患有選自自身免疫病、傳染病、炎性失調(diào)、系統(tǒng)性紅斑性狼瘡、糖尿病、胰島炎、哮喘、關節(jié)炎、炎性腸道疾病、炎性皮炎和多發(fā)性硬化等疾病的個體的方法，包括投以治療有效量的對B7-1特異的人源化免疫球蛋白和/或投以治療有效量的對B7-2特異的人源化免疫球蛋白。
73.一種調(diào)節(jié)有移植器官、移植組織、移植細胞等的個體的免疫應答的方法，包括投以有效量的存在于載體中的對B7-1特異的人源化免疫球蛋白和有效量的對B7-2特異的人源化免疫球蛋白。
74.權利要求73的方法，包括投以用于調(diào)節(jié)有移植器官、移植組織、移植細胞等的個體的免疫應答的藥物，其中所述藥物選自氨甲蝶呤、納巴霉素、環(huán)孢菌素、類固醇、CD40途徑抑制劑、移植補救途徑抑制劑、IL-2受體拮抗物及其類似物。
75.一種減輕哺乳動物對抗原的抗體應答的方法，包括在存在所述抗原的情況下給個體投以有效量的對B7-1特異的人源化免疫球蛋白和/或有效量的對B7-2特異的人源化免疫球蛋白。
76.權利要求75的方法，還包括給所述個體投以所述抗原。
77.權利要求75的方法，其中所述抗原選自破傷風類毒素、因子VIII、因子IX、胰島素、生長激素和基因送遞載體。
78.對B7-1和/或B7-2有結合特異性的人源化免疫球蛋白的用途，用于治療自身免疫病、傳染病、炎性失調(diào)、系統(tǒng)性紅斑性狼瘡、糖尿病、胰島炎、哮喘、關節(jié)炎、炎性腸道疾病、炎性皮炎和多發(fā)性硬化，包括權利要求1的組合物。
79.對B7-1和/或B7-2有結合特異性的人源化免疫球蛋白的用途，可用于生產(chǎn)藥劑，可用于給個體移植細胞、組織或器官。
80.在有抗原的情況下對B7-1和/或B7-2有結合特異性的人源化免疫球蛋白的用途，可用于生產(chǎn)用于降低哺乳動物中對抗原的抗體應答藥劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及人源化抗B7－2抗體和人源化抗B7－1抗體,其中每種抗體均包含一個非人來源的可變區(qū),以及至少人來源免疫球蛋白的一部分。本發(fā)明還涉及自身免疫病、移植排斥、炎癥失調(diào)和傳染病等多種疾病的治療方法,給病人投的藥物是人源化抗B7－2抗體和/或人源化抗B7－1抗體。
文檔編號C07K16/00GK1360596SQ00806200
公開日2002年7月24日 申請日期2000年2月9日 優(yōu)先權日1999年2月12日
發(fā)明者M·S·科, M·瓦斯奎茨, B·卡雷諾, A·C·塞爾尼克, M·科林斯, S·戈爾德曼, G·S·格雷, A·奈特, D·奧哈拉, B·魯普, G·M·維爾德曼, G·瓦納, S·弗里德里希 申請人:遺傳研究所有限公司