專利名稱：一種新的人蛋白翻譯起始因子及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，內(nèi)分泌學(xué)，病毒學(xué)，蛋白學(xué)和基因工程領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種在人類下丘腦中表達(dá)的蛋白翻譯起始因子-heIF2a蛋白及其核酸序列。本發(fā)明還涉及該蛋白和核酸序列的制備方法和用途。
生物體的許多功能都是通過蛋白質(zhì)來實現(xiàn)的，對于大多數(shù)生物而言，DNA轉(zhuǎn)錄形成mRNA，以mRNA為模板翻譯成為蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)翻譯在基因表達(dá)的調(diào)控中起著相當(dāng)重要的作用。蛋白質(zhì)翻譯的起始與眾多的起始因子有關(guān)，在真核生物中，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了12個翻譯起始因子eIF1A,eIF2,eIF2B,eIF2C,eIF3,eIF4A,eIF4B,eIF4E,eIF4G,eIF5和eIF6(Int J Biochem Cell Biol.1997Oct；29(10):1127-31.Review)。
heIF2由α、β、γ三個亞基組成(J Biol Chem.1994 269(48):3415-3422.)。當(dāng)前研究結(jié)果表明，通過far-Western印跡分析可以發(fā)現(xiàn)eIF2只與eIF2B的δ亞基和ε亞基結(jié)合；而eIF2B則只與eIF2的β亞基結(jié)合。eIF2的β亞基在其C端有個約含70個氨基酸的位點(diǎn)可供eIF2B完整蛋白或者eIF2B的δ亞基和ε亞基結(jié)合(J Biol Chem.1994 Dec 2；269(48):30517-23.)。
人類翻譯起始因子2B(heIF2B)是鳥苷酸(Guanine nucleotide)轉(zhuǎn)化因子，heIF2結(jié)合的GDP在heIF2B作用下轉(zhuǎn)變?yōu)镚TP，形成具有活性的[heIF2.GTP]復(fù)合物。heIF2能與GDP和GTP結(jié)合，但只有與GTP結(jié)合后才能結(jié)合上Met-tRNA，這可能由于heIF2與GTP結(jié)合后能產(chǎn)生一個tRNA的結(jié)合位點(diǎn)。在形成[heIF2.GTP.Met-tRNA]之后，起始了肽鏈的合成。(Int J Biochem Cell Biol.1997 Oct；29(10):1127-31.Review)heIF2α可分為兩種一種是雙鏈RNA依賴的(double-stranded-RNA-dependent eIF-2 alpha kinase,PKR)，另一種是血紅素調(diào)節(jié)的(heme-regulatedeIF-2 alpha kinase,HRI)。在未成熟的紅細(xì)胞中當(dāng)血紅素缺乏時，HRI將被激活。若紅細(xì)胞中不缺乏血紅素，HRI的活性則受到血紅素的抑制。HRI在網(wǎng)質(zhì)紅細(xì)胞中的高水平表明其主要的生理功能是調(diào)節(jié)蛋白合成，尤其是血紅蛋白的合成(Trends Biochem Sci 1995 Mar；20(3):105-8),(Bio-chimie 1994；76(8):761-9)。
heIF2的α亞基的磷酸化能直接抑制heIF2B的活性，從而使蛋白合成的速率迅速降低。磷酸化的heIF2α與heIF2B具有極高的親和性，成為了heIF2B的直接競爭抑制物(Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 1996；54.165-196)。heIF2的α亞基的磷酸化與血紅素的缺陷、病毒的感染、氨基酸的缺陷以及機(jī)體響應(yīng)饑餓或者壓力狀況等等多種因素有關(guān)。(Semin Cell Biol 1994 Dec；5(6):417-26)由于蛋白質(zhì)翻譯在基因表達(dá)的調(diào)控中起著相當(dāng)重要的作用，而heIF2a在蛋白翻譯的起始過程中起著重要的作用，因此研究heIF2a結(jié)構(gòu)和活性的關(guān)系，以及了解信號傳輸途徑對heIF2a活性的控制，有助于揭示一些激素和生長因子活性機(jī)制，而這些信號傳輸途徑也成為某些疾病藥物治療潛在的靶目標(biāo)。
研究已暗示，翻譯起始因子的起始或異常與一些疾病相關(guān)，因此，為治療目的研究和開發(fā)新的人翻譯起始因子有重要意義。然而在本申請之前，尚沒有公開或報道過本發(fā)明所涉及的人heIF2a蛋白。
本發(fā)明的第一目的就是提供一種新的人翻譯起始因子heIF2a基因(GenbankAccession No.AF183414)，該基因是一個heIF2a蛋白基因。
本發(fā)明的第二目的是提供一種新的人蛋白heIF2a。
本發(fā)明的第三目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)上述的新的人heIF2a蛋白和核酸序列的方法。
本發(fā)明還提供了這種heIF2a蛋白多肽和編碼序列的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有人heIF2a蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-1891位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-1891位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-1891位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離出的人heIF2a蛋白質(zhì)多肽，它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種載體，它包含上述的DNA分子。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在一個實例中該宿主細(xì)胞是大腸桿菌；在另一實例中，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種產(chǎn)生具有人heIF2a蛋白質(zhì)活性的多肽的方法，該方法包括(1)將編碼具有人heIF2a蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人heIF2a蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-1891位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人heIF2a蛋白的重組細(xì)胞；(3)在適合表達(dá)人heIF2a蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞；(4)分離出具有人heIF2a蛋白活性的多肽。
較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.6中第2-1891位的序列。
本發(fā)明還提供了與heIF2a蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人heIF2a蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人heIF2a蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.6中第2-1891位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.6序列的編碼框第2-1891位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.6中第2-1891位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.7所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-1891位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-1891位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人heIF2a相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.6中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人heIF2a蛋白或多肽”指具有heIF2a蛋白活性的SEQ IDNO.7序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人heIF2a相同功能的、SEQ ID NO.7序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括heIF2a蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明人heIF2a多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與人heIF2a DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人heIF2a多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人heIF2a多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括人heIF2a多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人heIF2a多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
在本發(fā)明中，“heIF2a保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.7的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
表1
發(fā)明還包括人heIF2a蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人heIF2a多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的人heIF2a多肽時，可以將heIF2a編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成人heIF2a蛋白表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
本發(fā)明還提供了對人heIF2a特異的抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體。
在本發(fā)明中，可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來制備針對heIF2a特異的抗體。例如，將提純的人heIF2a基因產(chǎn)物或它的抗原片段注射入動物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣，表達(dá)人heIF2a或它的抗原片段的細(xì)胞也可以用來對動物致免疫而產(chǎn)生抗體。根據(jù)本發(fā)明制備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可以用雜交瘤技術(shù)制備(例如，Kohler et al.,Nature 256:495,1975；Kohleret al.,Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler et al.,Eur.J.Immunol.6:292,1976)。本發(fā)明的抗體包括可以阻抑heIF2a功能的抗體，也可以是不影響人heIF2a功能的抗體。每一類抗體都可以通過對人heIF2a基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人heIF2a基因產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進(jìn)行合成。與非修飾形式的heIF2a基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體，可以通過用在原核細(xì)胞例如E.coli中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以通過用在真核細(xì)胞如酵母或昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的來免疫動物而得到。
本發(fā)明的人heIF2a抗體可以用來鑒定表達(dá)人heIF2a蛋白或多肽的細(xì)胞，如Jurkat T細(xì)胞。例如，可以用一種可檢測的分子例如熒光素異硫氰酸(FITC)來標(biāo)記heIF2a特異抗體，然后讓人heIF2a特異抗體與細(xì)胞樣品接觸，再用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測出與heIF2a特異抗體結(jié)合的細(xì)胞。
除了在細(xì)胞表面檢測人heIF2a外，還可以用Western印跡技術(shù)分析該蛋白質(zhì)。細(xì)胞裂解液可以從培養(yǎng)細(xì)胞或取自病人的組織標(biāo)本如下丘腦中提取，并溶解在含有去污劑的裂解緩沖液中。然后用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞提取物(同時將提純的人heIF2a多肽作為陽性對照)，接著通過電泳雜交將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上。為了用Western印跡免疫探測heIF2a多肽，可以使用典型的抗體結(jié)合檢測方法，例如放射自顯影或堿性磷酸酶檢測方法。并可使用免疫接種血清或不相關(guān)的單克隆抗體作為非特異反應(yīng)的對照。
還可用Nothern印跡法技術(shù)分析heIF2a基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析人heIF2a的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。
人heIF2a DNA的Nothern印跡分析和人heIF2a特異抗體的Western印跡分析可以聯(lián)合使用，以證實人heIF2a在生物樣本中的表達(dá)。人heIF2a DNA還可以用于Southern印跡分析或原位雜交分析，以將該基因定位于染色體上，并可進(jìn)行遺傳連鎖分析以找出其它可能的疾病相關(guān)基因。
此外，本發(fā)明還提供了一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有heIF2a核苷酸編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼heIF2a的核酸分子。
本發(fā)明還提供了檢測樣品中是否存在heIF2a核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于heIF2a核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。
此外，根據(jù)本發(fā)明的heIF2a核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選heIF2a同源基因或同源蛋白。
為了得到與heIF2a基因相關(guān)的人cDNAs或基因組DNAs的點(diǎn)陣，可以用DNA探針篩選人cDNA或基因組DNA文庫，這些探針是在低嚴(yán)緊條件下，用32P對heIF2a的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫是來自人下丘腦組織的文庫。來自參與內(nèi)分泌的其它人體組織或特定人體細(xì)胞株的cDNA文庫也可用于篩選目的。構(gòu)建來自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech,Palo Alto,Cal.。這種篩選方法可以識別與heIF2a相關(guān)的基因家族的核苷酸序列。
根據(jù)核苷酸相似性篩選heIF2a同源物可以按如下方法完成。人體下丘腦cDNA文庫，例如Clontech Cat.#7429-1(Clontech,Palo Alto,Cal.)可以使用一段包含heIF2a基因序列的全部或部分的隨機(jī)引物化DNA探針篩選。要完成對與heIF2a序列至少有70％同源性的DNA插入序列的克隆的鑒定，可以使用雜交溫度為55℃的雜交液，然后用0.5×SSC和0.1％SDS清洗。用這種方法識別的克隆的DNA插入序列可以進(jìn)一步用DNA限制性內(nèi)切酶分析和DNA測序來評價它與heIF2a基因的相似性。組織表達(dá)的分布可以用上述的Northern印跡法技術(shù)分析。
heIF2a同源物也可以用針對heIF2a蛋白或多肽的抗體來識別。例如，可以用標(biāo)準(zhǔn)的方法對商品化的或者用已知方法構(gòu)建的，來自細(xì)胞或者組織例如下丘腦的表達(dá)文庫進(jìn)行篩選。將文庫倒入平皿，菌落轉(zhuǎn)移到一張硝化纖維素膜上，使表達(dá)的重組蛋白結(jié)合到膜上。然后就可以用特異性的人heIF2a抗體進(jìn)行典型的抗體結(jié)合和檢測。用這種方法所識別出克隆中的DNA插入序列，可以進(jìn)一步用DNA限制性內(nèi)切酶分析和DNA測序進(jìn)行分析以評價它與heIF2a基因的相似性。新識別的基因的組織表達(dá)分布可以同樣地按上述方法進(jìn)行分析。
本發(fā)明的人heIF2a核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
本發(fā)明蛋白的片段除了可用重組法產(chǎn)生之外，還可用固相技術(shù)通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis,WHFreeman Co.,San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85:2149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動進(jìn)行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(Foster City,CA)來自動合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。
本發(fā)明蛋白的編碼序列還可用于基因定位。例如，通過熒光原位雜交技術(shù)(FISH)，將cDNA克隆與分裂中期的染色體進(jìn)行雜交，可以準(zhǔn)確地進(jìn)行染色體定位。該技術(shù)可以使用短至約500bp的cDNA；也可以使用長至約2000bp或者更長的cDNA。對于該技術(shù)，可參見Verma等人，Human Chromosomes:A Manual ofBasic Techniques,Pergamon Press,New York(1988)。
一旦序列被定位于染色體上的某個精確位置，將可以將序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些遺傳圖譜數(shù)據(jù)是可以獲得的，例如通過孟德爾(Mendelian)人遺傳數(shù)據(jù)庫(可通過Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary在網(wǎng)上獲得)。然后，通過連鎖分析來鑒定基因與已定位于同一染色體區(qū)域的疾病之間的相關(guān)性。
接著，有必要確定患病個體和健康個體之間的cDNA或基因組序列方面的差異。如果某一突變存在于部分或全部患病個體但不存在于正常個體，那么該突變可能就是該疾病的致病因素。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與heIF2a發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
以本發(fā)明的人heIF2a蛋白為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的人heIF2a蛋白可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
當(dāng)本發(fā)明的人heIF2a蛋白多肽被用作藥物時，可將治療有效劑量的該多肽施用于哺乳動物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
通過同源檢索發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的新基因具有與已發(fā)表并被確認(rèn)為大鼠eIF2a蛋白的基因高度同源的序列，并且本發(fā)明的新蛋白具有大鼠eIF2a蛋白高度保守的氨基酸序列。所以，本發(fā)明的heIF2a蛋白是大鼠eIF2a蛋白的一個同源蛋白并具有相似的功能。


圖1為本發(fā)明的人heIF2a與大鼠eIF2a基因核酸序列(GenBank AccessionNo.L27707)的同源比較(FASTA)圖。其中，相同的核苷酸用“|”標(biāo)出。
圖2為本發(fā)明的人heIF2a蛋白與大鼠eIF2a蛋白的氨基酸序列(SwissProtAccession No.Q63185)的同源比較(FASTA)圖。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出，相似的氨基酸用“+”標(biāo)出。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1heIF2a基因的克隆1．組織分離(Tissue isolation)下丘腦來源于5個正常成年男性供體，在死后四小時內(nèi)取出下丘腦組織，立即置于液氮中冷凍保存。
2．mRNA的分離(mRNA isolation)取出組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至50ml新管，抽提總RNA(TRIzol Reagents,Gibco,NY,USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量。用帶Oligod(T)的纖維素柱分離總RNA中的mRNA，定量。
3．cDNA文庫的構(gòu)建(Construction of cDNA library)以mRNA為模板，合成雙鏈cDNA，反轉(zhuǎn)錄引物見SEQ ID NO.1。補(bǔ)平末端后，加含EcoRI切點(diǎn)的接頭，接頭序列分別見SEQ ID NO.2和3。磷酸化EcoRI末端后，用XhoI限制性內(nèi)切酶消化1.5小時，再進(jìn)行片段分離。過柱篩選長度＞500bp的片段，用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，無菌水溶解，連接至Uni-ZAP XR載體(Stratagene,CA9203,USA)，以Zap-cDNA Gigapack Ⅲ Gold Cloning Kit(Stratagene,CA9203，USA)進(jìn)行包裝，宿主菌使用XL 1-Blue MRF′(Stratagene,CA9203,USA)細(xì)菌。涂板并測定滴度。
4．測序及數(shù)據(jù)庫建立(Seqencing and Database Constructing)
挑選文庫中有外源片段插入的克隆，擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒(Qiagen,Germany)，用T3和T7作為3′端和5′端的通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye,Perkin-Elmer,USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer,USA)上進(jìn)行EST大規(guī)模測序。測序結(jié)果用FACTURA軟件去除載體序列，傳輸?shù)絊UN Ultra 450 Server上進(jìn)行下一步的處理。所有的序列信息再用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，將無同源性或同源性低于95％的序列視為新基因建立數(shù)據(jù)庫。
5．基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)在得到的新基因片段序列信息基礎(chǔ)上，進(jìn)行cDNA全長克隆，分兩階段進(jìn)行(1)“電子克隆”(Electronic Cloning)以新基因片段序列作為探針?biāo)褜bEST數(shù)據(jù)庫，將重疊序列＞50bp，同源性在98％以上的表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence Tag，簡稱“EST”)序列認(rèn)為同一序列(consensus sequence)，取出并用AUTOASSEMBLER軟件進(jìn)行拼接，部分EST可以延伸探針序列。再用STRIDER軟件分析被延伸的序列是否具有完整的開放閱讀框架(Open Reading Frame，ORF)，用BLAST搜尋Genbank或SwissProt以確定該序列在核苷酸和氨基酸水平上是否與其他物種有同源性，以幫助判別所得到的基因全長完整性如何。通過電子克隆的方法，通?？色@取heIF2a基因的全長序列。
(2)cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)如果通過“電子克隆”方法仍未得到完整的cDNA全長，則在已有序列的5′或3′端設(shè)計引物，在人類下丘腦Marathon-Ready cDNA文庫(Clontech Lab,Inc,USA)中進(jìn)行長距離PCR反應(yīng)。然后對PCR產(chǎn)物克隆、測序。用AUTOASSEMBLER及STRIDER軟件分析被延長的序列有無完整的ORF，如無，重復(fù)上述過程直至獲得全長。
(3)RT-PCR對于5′和3′端已知的序列，如果中間尚有一段間隙(gap)無法從已有的公共數(shù)據(jù)庫或自身數(shù)據(jù)庫獲得，可考慮采用RT-PCR的方法。在序列5′端設(shè)計引物，3′端引物采用Oligo-dT，在下丘腦總RNA庫中進(jìn)行擴(kuò)增。然后對產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測序。最后拼接并獲得全長。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的人heIF2a蛋白的全長編碼序列。在拼接得到全長(至少包含完整的開放讀框)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計引物R1:5′-GATGCAGGGGGGCAACTC-3′(SEQ ID NO.4)為正向引物，寡核苷酸R2:5＇-CTTGGGCAGTTACGAGGG-3′(SEQ ID NO.5)為反向引物，以下丘腦組織的總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，R1/R2的PCR條件為94℃5分鐘，隨之以94℃30秒、59℃30秒和72℃1分鐘進(jìn)行35個循環(huán)，最后以72℃延伸5分鐘。電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長度為2238bp。然后按常規(guī)方法以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測序，獲得SEQ ID NO.6所示的序列。
實施例2heIF2a基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的人heIF2a全長cDNA(GenBank Accession No.AF183414。因申請保密，故在本申請之前未對公眾公開)的長度為2238bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.6，其中開放讀框位于2-1891位核苷酸。根據(jù)全長cDNA推導(dǎo)出heIF2a的氨基酸序列，共630個氨基酸殘基，分子量71106.43,pI為5.68。詳細(xì)序列見SEQ ID NO.7。
將heIF2a的全長cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與大鼠的基因存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它與大鼠eIF2a基因的mRNA全編碼序列(GenBank Accession No.L27707)的14-1978位堿基有80.7％的相同性(圖1)，在氨基酸水平上，它與大鼠eIF2a蛋白(SwissProt Accession No.Q63185)的第1-621位氨基酸殘基有82.1％的相同性和93.5％的相似性(圖2)。由上可見，heIF2a基因與大鼠eIF2a基因無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，可以認(rèn)為兩者在功能上也有很高相似性。
本發(fā)明的人heIF2a除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人heIF2a還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人heIF2a蛋白的N端與大鼠eIF2a蛋白的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發(fā)明人heIF2a的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發(fā)明人heIF2a核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人heIF2a的表達(dá)水平或者抑制人heIF2a的過度表達(dá)。本發(fā)明的人heIF2a蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人heIF2a缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
由于本發(fā)明的人heIF2a蛋白具有源自人的天然氨基酸序列，因此，與來源于其他物種(如大鼠)的同族蛋白相比，預(yù)計在施用于人時將具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人體內(nèi)的免疫原性更低或沒有)。
實施例3heIF2a蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究1．將heIF2a蛋白的氨基酸序列在PROSITE數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址為http://www.motif.genome.ad.jp/)中檢索基序(motif)，得到以下結(jié)果1 MQGGNSGVRK REEEGDGAGA VAAPPAIDFP AEGPDPEYDE SDVPAEIQVL51 KEPLQPTFP FAVANQLLLV SLLEHLSHVH EPNPLRSRQV FKLLCQTFIK101 MGLLSSFTCS DEFSSLRLHH NRAITHLMRS AKERVRQDPC EDISRIQKIR151 SREVALEAQT SRYLNEFEEL AILGKGGYGR VYKVRNKLDG QYYAIKKILI201 KGATKTVCMK VLREVKVLAG LQHPNIVGYH TAWIEHVHVI QPRADRAAIE251 LPSLEVLSDQ EEDREQCGVK NDESSSSSII FAEPTPEKEK RFGESDTENQ301 NNKSVKYTTN LVIRESGELE STLELQENGL AGLSASSIVE QQLPLRRNSH351 LEESFTSTEE SSEENVNFLG QTEAQYHLML HIQMQLCELS LWDWIVERNK401 RGREYVDESA CPYVMANVAT KIFQELVEGV FYIHNMGIVH RDLKPRNIFL451 HGPDQQVKIG DFGLACTDIL QKNTDWTNRN GKRTPTHTSR VGTCLYASPE501 QLEGSEYDAK SDMYSLGVVL LELFQPFGTE MERAEVLTGL RTGQLPESLR551 KRCPVQAKYI QHLTRRNSSQ RPSAIQLLQS ELFQNSGNVN LTLQMKIIEQ601 EKEIAELKKQ LNLLSQDKGV RDDGKDGGVG(1)在氨基酸序列中，存在以下功能基序(ⅰ)斜體區(qū)(438-450)絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶活化信號位點(diǎn)(Serine/Threonine protein kinases active-site signature.)(ⅱ)黑體區(qū)(173-197)蛋白激酶ATP結(jié)合區(qū)信號位點(diǎn)(Protein kinases ATP-binding region signature)(2)功能分析這些位點(diǎn)說明本申請所給蛋白的確有多種蛋白激酶所特有、也是共有的序列，而蛋白序列決定了蛋白的功能，說明此蛋白確實有相應(yīng)功能。
2．將heIF2a蛋白的氨基酸序列在blocks數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址為http://www.blocks.fhcrc.org)中檢索結(jié)構(gòu)域，得到以下結(jié)果1 MQGGNSGVRK REEEGDGAGA VAAPPAIDFP AEGPDPEYDE SDVPAEIQVL51 KEPLQQPTFP FAVANQLLLV SLLEHLSHVH EPNPLRSRQV FKLLCQTFIK101 MGLLSSFTCS DEFSSLRLHH NRAITHLMRS AKERVRQDPC EDISRIQKIR151 SREVALEAQT SRYLNEFEEL AILGKGGYGR VYKVRNKLDG QYYAIKKILI201 KGATKTVCMK VLREVKVLAG LQHPNIVGYH TAWIEHVHVI QPRADRAAIE251 LPSLEVLSDQ EEDREQCGVK NDESSSSSII FAEPTPEKEK RFGESDTENQ301 NNKSVKYTTN LVIRESGELE STLELQENGL AGLSASSIVE QQLPLRRNSH351 LEESFTSTEE SSEENVNFLG QTEAQYHLML HIQMQLCELS LWDWIVERNK401 RGREYVDESA CPYVMANVAT KIFQELVEGV FYIINMGIYH RDLKPRNIFL451 HGPDQQVKIG DFGLACTDIL QKNTDWTNRN GKRTPTHTSR VGTCLYASPE501 QLEGSEYDAK SDMYSLGVVL LELFQPFGTE MERAEVLTGL RTGQLPESLR551 KRCPVQAKYI QHLTRRNSSQ RPSAIQLLQS ELFQNSGNVN LTLQMKIIEQ601 EKEIAELKKQ LNLLSQDKGV RDDGKDGGVG(1)在氨基酸序列中，存在以下加框表示的結(jié)構(gòu)域區(qū)黑體區(qū)(432-462)蛋白激酶ATP結(jié)合區(qū)功能模塊(Protein kinases ATP-binding region proteins.)(2)功能分析這也說明本申請所給蛋白的確有多種蛋白激酶所特有、也是共有的序列，進(jìn)一步證明本蛋白確實有相應(yīng)功能。
綜上所述，從heIF2a蛋白的結(jié)構(gòu)和理化特性進(jìn)一步證實了該基因與大鼠eIF2a蛋白的相似性。由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)決定了功能特異性的生物化學(xué)原理，因此本發(fā)明的人heIF2a具有大鼠eIF2a相似或相同的功能。該基因在參與啟動蛋白翻譯從而調(diào)控基因表達(dá)過程中發(fā)揮著重要作用。
實施例4heIF2a基因的組織表達(dá)譜1．電子Northern表達(dá)譜。按Ton C.等人的方法(Ton C et al.,BiochemBiophys Res Commun 1997 Dec 18；241(2):589-594；Hwang DM,et al.,Circulation 1997 Dec 16；96(12):4146-4203)，將heIF2a cDNA序列在GCG軟件包中的dbEST數(shù)據(jù)庫中做BLAST檢索，在得到的人類EST中，概率值＜10e-10、相同性＞95％的EST有上百個，可視為該基因在組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)本，由此得出表達(dá)該基因的組織譜，發(fā)現(xiàn)其在肝、脾臟、間膠質(zhì)瘤等等器官或組織中均有表達(dá)，表明它在人體許多組織器官中都發(fā)揮著重要作用。
實施例5heIF2a多肽的制備和提純在該實施例中，將全長的heIF2a編碼序列或片段構(gòu)建入商品化的蛋白質(zhì)融合表達(dá)載體之中，以表達(dá)和提純重組蛋白。
1．將heIF2a多肽以GST融合蛋白的形式在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)。
原核表達(dá)載體的構(gòu)建，以及轉(zhuǎn)化大腸桿菌根據(jù)人heIF2a的全長編碼序列(SEQ ID NO.6)，設(shè)計擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物(分別對應(yīng)于編碼序列5′和3′端的約20個以上核苷酸)，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這根據(jù)選用的pGEX-2T載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將heIF2a基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pGEX-2T載體(Pharmacia,Piscataway,NJ)。鑒定好的表達(dá)載體利用CaCl2方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，篩選鑒定得到含有pGEX-2T-heIF2a表達(dá)載體的工程菌DH5 α-pGEX-2T-heIF2a。
表達(dá)GST-heIF2a重組蛋白的工程菌的分離鑒定挑取單菌落的DH5α-pGEX-2T-heIF2a工程菌于3ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)過夜，按1∶100的濃度吸取培養(yǎng)液于新的LB培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)約3小時，至OD600達(dá)0.5后，加入IPTG至終濃度1mmol/L繼續(xù)于37℃分別培養(yǎng)0,1,2,3小時。取培養(yǎng)時間不同的1ml菌液離心，在細(xì)菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上樣緩沖液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細(xì)菌沉淀，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預(yù)期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導(dǎo)時間增加而增加的菌株即為表達(dá)GST-heIF2a融合蛋白的工程菌。
GST-heIF2a融合蛋白的提取純化按上述方法誘導(dǎo)表達(dá)GST-heIF2a融合表達(dá)蛋白的工程菌DH5α-pGEX-2T-heIF2a。誘導(dǎo)后的細(xì)菌離心沉淀，按每400ml菌加入20ml PBS重懸細(xì)菌，超聲破碎細(xì)菌。破菌完全的超聲液按每毫升加入20微升的量加入PBS飽和的50％谷胱苷肽Sepharose 4B,37℃振搖結(jié)合30分鐘，10000 rpm離心10分鐘沉淀結(jié)合了GST-heIF2a的谷胱苷肽Sepharose 4B，棄上清。按每毫升超聲液所得沉淀加入100μl PBS的量清洗兩次，而后按每毫升超聲液所得沉淀加入10μl還原型谷胱苷肽洗脫液，室溫置10分鐘，10000 rpm離心10分鐘，上清即為洗脫的融合蛋白。重復(fù)洗脫兩次。洗脫的上清保存于-80℃，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測純化效果。在71kDa處的蛋白質(zhì)條帶即為heIF2a蛋白。
實施例6heIF2a蛋白或多肽在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)1．heIF2a桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞株根據(jù)人heIF2a的全長編碼序列(SEQ ID NO.6)，設(shè)計擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將heIF2a cDNA在保證閱讀框架的前提下克隆至pVL1392載體(Invitrogen,Carlsbad,CA)。鑒定好的表達(dá)載體3μg，野生型線性桿狀病毒DNA(BaculoGoldTMACMNPV DNA,Pharmingen,San Diego,CA)1μg和Lipofection(Gibco-BRL,NY)25μl，加入1ml無血清的昆蟲培養(yǎng)基中，振蕩15秒混勻，室溫孵育15分鐘備用。取1ml(2×106)Sf9昆蟲細(xì)胞懸液于60mm組織培養(yǎng)板中，貼壁1小時后換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，室溫孵育15分鐘后棄培養(yǎng)基，加入前面制備好的DNA載體轉(zhuǎn)染混合物，Parafilm密封培養(yǎng)板，于室溫27℃振搖培養(yǎng)4小時，而后換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，收集上清備用。
2．轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體的昆蟲細(xì)胞株的篩選鑒定轉(zhuǎn)染3天后的昆蟲細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液(2×106/1ml)，取1ml細(xì)胞懸液置于60mm組織培養(yǎng)皿中，加入3ml培養(yǎng)基，100μl收集的培養(yǎng)上清，貼壁1小時，棄2ml培養(yǎng)基，繼續(xù)室溫培養(yǎng)1小時，棄去所有的培養(yǎng)基，加入預(yù)熱的含20μl4％X-gal的3ml半固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)5-7天后挑取白色細(xì)胞克隆于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)3-5天，而后吸取上清感染Sf9昆蟲細(xì)胞。
收集感染的細(xì)胞進(jìn)行Western鑒定。將細(xì)胞裂解后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后的膠于Pharmacia的Multiphor Ⅱ半干電轉(zhuǎn)移儀中將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，將硝酸纖維膜置于封閉液中封閉1小時，而后于抗heIF2a的抗體溶液中封閉1小時，TBS液振搖清洗5分鐘共2次，而后將膜置于生物素標(biāo)記的抗heIF2a一抗的第二抗體溶液中振搖1小時，TBS清洗，加入親和素-堿性磷酸酶復(fù)合物反應(yīng)30分鐘，TBS清洗2次，加入新鮮配制的顯色液顯色觀察蛋白條帶。
挑取高表達(dá)heIF2a的Sf9細(xì)胞克隆。
3．heIF2a蛋白的提取純化用高表達(dá)heIF2a的Sf9細(xì)胞克隆的上清大量感染Sf9細(xì)胞，感染48小時后收集細(xì)胞，PBS洗滌。每2×108細(xì)胞加入20ml細(xì)胞裂解液(0.5％TritonX-100，20mM Na3PO4(磷酸鈉，pH7.8),500mM NaCl,1mM Na3VO4(釩酸鈉)，1mM Pefabloc,1μg/ml胃蛋白酶抑制劑，亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)破細(xì)胞，12000×g離心20min去除細(xì)胞碎片，上清按每2×108細(xì)胞加入2ml NTA-瓊脂糖(Qiagen,Germany)，4℃吸附1小時。而后用含100nM咪唑的His緩沖液洗滌兩次，用含20mM N,N＇-二哌嗪，500mM NaCl，300mM咪唑的緩沖液洗脫以得到純化的蛋白。洗脫液保存于4℃，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測提取的heIF2a蛋白的純度。在71kDa處的蛋白質(zhì)條帶即為heIF2a蛋白。
實施例7抗人heIF2a抗體的制備1．免疫小鼠和脾細(xì)胞的制備將實施例5和實施例6中獲得的heIF2a蛋白用層析法進(jìn)行分離后備用，也可以用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中割下，并用等體積的完全Freund′s佐劑乳化。取6-8周齡Balb/C雌鼠，用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund′s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量再加強(qiáng)免疫一次，3-5天后用于融合。其中，脾細(xì)胞制備見鄂征主編，《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》，北京出版社，第210頁。
2．按《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》(同上)，第630頁中的方法，制備飼養(yǎng)細(xì)胞。
3．按《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》(同上)，第213頁中的方法，進(jìn)行細(xì)胞融合。
4．抗體的檢測在細(xì)胞融合10-15天后，需逐孔進(jìn)行檢查，一旦發(fā)現(xiàn)旺盛的雜交細(xì)胞集落生長，就應(yīng)用heIF2a蛋白做抗體活性的初步篩選，常用的方法有免疫熒光試驗、發(fā)射免疫試驗(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。檢查出抗體活性的孔后，立刻進(jìn)行克隆培養(yǎng)，并分離出抗體。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人國家人類基因組南方研究中心(ⅱ)發(fā)明名稱一種新的人蛋白翻譯起始因子及其編碼序列(ⅲ)序列數(shù)目7(2)SEQ ID NO.1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度50bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(?、?序列描述SEQ ID NO.1GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA ACTAGTCTCG AGTTTTTTTT TTTTTTTTTT 50(2)SEQ ID NO.2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度13bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅰⅹ)序列描述SEQ ID NO.2AATTCGGCAC GAG 13(2)SEQ ID NO.3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9bp(B)類型核苷酸
(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(?、?序列描述SEQ ID NO.3GCCGTGCTC 9(2)SEQ ID NO.4的信息(ⅰ)．序列特征(A)長度18bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)．分子類型寡核苷酸(ⅰⅹ)．序列描述SEQ ID NO.4GATGCAGGGG GGCAACTC 18(2)SEQ ID NO.5的信息(ⅰ)．序列特征(A)長度18bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)．分子類型寡核苷酸(?、?．序列描述SEQ ID NO.5CTTGGGCAGT TACGAGGG 18(2)SEQ ID NO.6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度2238bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核苷酸(?、?序列描述SEQ ID NO.6GATGCAGGGG GGCAACTCCG GGGTCCGCAA GCGCGAAGAG GAGGGCGACG GGGCTGGGGC 60TGTGGCTGCG CCGCCGGCCA TCGACTTTCC CGCCGAGGGC CCGGACCCCG AATATGACGA 120ATCTGATGTT CCAGCAGAAA TCCAGGTGTT AAAAGAACCC CTACAACAGC CAACCTTCCC 180TTTTGCAGTT GCAAACCAAC TCTTGCTGGT TTCTTTGCTG GAGCACTTGA GCCACGTGCA 240TGAACCAAAC CCACTTCGTT CAAGACAGGT GTTTAAGCTA CTTTGCCAGA CGTTTATCAA 300AATGGGGCTG CTGTCTTCTT TCACTTGTAG TGACGAGTTT AGCTCATTGA GACTACATCA 360CAACAGAGCT ATTACTCACT TAATGAGGTC TGCTAAAGAG AGAGTTCGTC AGGATCCTTG 420TGAGGATATT TCTCGTATCC AGAAAATCAG ATCAAGGGAA GTAGCCTTGG AAGCACAAAC 480TTCACGTTAC TTAAATGAAT TTGAAGAACT TGCCATCTTA GGAAAAGGTG GATACGGAAG 540AGTATACAAG GTCAGGAATA AATTAGATGG TCAGTATTAT GCAATAAAAA AAATCCTGAT 600TAAGGGTGCA ACTAAAACAG TTTGCATGAA GGTCCTACGG GAAGTGAAGG TGCTGGCAGG 660TCTTCAGCAC CCCAATATTG TTGGCTATCA CACCGCGTGG ATAGAACATG TTCATGTGAT 720TCAGCCACGA GCAGACAGAG CTGCCATTGA GTTGCCATCT CTGGAAGTGC TCTCCGACCA 780GGAAGAGGAC AGAGAGCAAT GTGGTGTTAA AAATGATGAA AGTAGCAGCT CATCCATTAT 840CTTTGCTGAG CCCACCCCAG AAAAAGAAAA ACGCTTTGGA GAATCTGACA CTGAAAATCA 900GAATAACAAG TCGGTGAAGT ACACCACCAA TTTAGTCATA AGAGAATCTG GTGAACTTGA 960GTCGACCCTG GAGCTCCAGG AAAATGGCTT GGCTGGTTTG TCTGCCAGTT CAATTGTGGA 1020ACAGCAGCTG CCACTCAGGC GTAATTCCCA CCTAGAGGAG AGTTTCACAT CCACCGAAGA 1080ATCTTCCGAA GAAAATGTCA ACTTTTTGGG TCAGACAGAG GCACAGTACC ACCTGATGCT 1140GCACATCCAG ATGCAGCTGT GTGAGCTCTC GCTGTGGGAT TGGATAGTCG AGAGAAACAA 1200GCGGGGCCGG GAGTATGTGG ACGAGTCTGC CTGTCCTTAT GTTATGGCCA ATGTTGCAAC 1260AAAAATTTTT CAAGAATTGG TAGAAGGTGT GTTTTACATA CATAACATGG GAATTGTGCA 1320CCGAGATCTG AAGCCAAGAA ATATTTTTCT TCATGGCCCT GATCAGCAAG TAAAAATAGG 1380AGACTTTGGT CTGGCCTGCA CAGACATCCT ACAGAAGAAC ACAGACTGGA CCAACAGAAA 1440CGGGAAGAGA ACACCAACAC ATACGTCCAG AGTGGGTACT TGTCTGTACG CTTCACCCGA 1500ACAGTTGGAA GGATCTGAGT ATGATGCCAA GTCAGATATG TACAGCTTGG GTGTGGTCCT 1560GCTAGAGCTC TTTCAGCCGT TTGGAACAGA AATGGAGCGA GCAGAAGTTC TAACAGGTTT 1620AAGAACTGGT CAGTTGCCGG AATCCCTCCG TAAAAGGTGT CCAGTGCAAG CCAAGTATAT 1680CCAGCACTTA ACGAGAAGGA ACTCATCGCA GAGACCATCT GCCATTCAGC TGCTGCAGAG 1740TGAACTTTTC CAAAATTCTG GAAATGTTAA CCTCACCCTA CAGATGAAGA TAATAGAGCA 1800AGAAAAAGAA ATTGCAGAAC TAAAGAAGCA GCTAAACCTC CTTTCTCAAG ACAAAGGGGT 1860GAGGGATGAC GGAAAGGATG GGGGCGTGGG ATGAAAGTGG ACTTAACTTT TAAGGTAGTT 1920AACTGGAATG TAAATTTTTA ATCTTTATTA GGGTATAGTT GGTACAATGC TTCGTTGTAT 1980TTAGTAAGCC TTTACAAGAC TTGTTAAAGA TGTCAGAGTG CCCCAAGCTG CCGTTCCTTC 2040CCTTCCTGCC CCACAAGCTC CTTTTCCTGA ATTTCCTACC TAAATATTAA CCATATGCCT 2100AGTCTCTGAA ACTAAAAACT TGGACCTCAT CCTCAATTAT TTTCTCCTTT CAACTCTGTT 2160GACCCTCTGT CTGGTCTTCC TCTAGAAGGT TCTACCGCAG AAATTGATGT GTGCTCCCTG 2220CCCTCGTCAC TGCCCAAG2238(2)SEQ ID NO.7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度630氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅰⅹ)序列描述SEQ ID NO.7MQGGNSGVRK REEEGDGAGA VAAPPAIDFP AEGPDPEYDE SDVPAEIQVL KEPLQQPTFP 60FAVANQLLLV SLLEHLSHVH EPNPLRSRQV FKLLCQTFIK MGLLSSFTCS DEFSSLRLHH 120NRAITHLMRS AKERVRQDPC EDISRIQKIR SREVALEAQT SRYLNEFEEL AILGKGGYGR 180VYKVRNKLDG QYYAIKKILI KGATKTVCMK VLREVKVLAG LQHPNIVGYH TAWIEHVHVI 240QPRADRAAIE LPSLEVLSDQ EEDREQCGVK NDESSSSSII FAEPTPEKEK RFGESDTENQ 300NNKSVKYTTN LVIRESGELE STLELQENGL AGLSASSIVE QQLPLRRNSH LEESFTSTEE 360SSEENVNFLG QTEAQYHLML HIQMQLCELS LWDWIVERNK RGREYVDESA CPYVMANVAT 420KIFQELVEGV FYIHNMGIVH RDLKPRNIFL HGPDQQVKIG DFGLACTDIL QKNTDWTNRN 480GKRTPTHTSR VGTCLYASPE QLEGSEYDAK SDMYSLGVVL LELFQPFGTE MERAEVLTGL 540RTGQLPESLR KRCPVQAKYI QHLTRRNSSQ RPSAIQLLQS ELFQNSGNVN LTLQMKIIEQ 600EKEIAELKKQ LNLLSQDKGV RDDGKDGGVG 630
權(quán)利要求
1．一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人heIF2a蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-1891位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-1891位的核苷酸序列雜交。
2．如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼具有SEQ IDNO.7所示的序列的多肽。
3．如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-1891位的核苷酸序列。
4．一種分離出的人heIF2a蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5．如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。
6．一種載體，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA。
7．一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8．一種產(chǎn)生具有人heIF2a蛋白質(zhì)活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(1)將編碼具有人heIF2a蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人heIF2a蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-1891位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人heIF2a蛋白的重組細(xì)胞；(3)在適合表達(dá)人heIF2a蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞；(4)分離出具有人heIF2a蛋白活性的多肽。
9．一種能與權(quán)利要求7所述的人heIF2a蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
10．一種探針分子，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在人體正常下丘腦組織中表達(dá)的新的蛋白翻譯起始因子,即人heIF2a蛋白及其編碼序列,本發(fā)明還提供了該蛋白和核酸序列的制備方法和用途,以及在樣品中檢測heIF2a核酸序列和多肽的方法。
文檔編號C07H21/00GK1307133SQ00111560
公開日2001年8月8日 申請日期2000年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月27日
發(fā)明者彭永德, 吳堂明, 屠越峰, 陳竺, 韓澤廣 申請人:國家人類基因組南方研究中心