專利名稱：真核起始因子5A(eIF－5A)突變體的制作方法
人免疫缺陷病毒(HIV)的復(fù)制關(guān)鍵性地依賴于病毒Rev反式激活蛋白的功能。Rev在表達(dá)細(xì)胞核區(qū)域中積累并且直接而且特異地結(jié)合一個高度構(gòu)筑的RNA序列，稱作Rev反應(yīng)元件(RRE)，它存在于所有不完全剪接的病毒mRNAs中。在結(jié)合后，Rev看來似乎在RRE上進(jìn)行多聚化，并且它與Rev反式激活所需要的一種宿主輔因子相互作用，該因子命名為真核起始因子5A(eIF-5A；過去的術(shù)語eIF-4D)。這一相互作用造成了不完全剪接的病毒mRNAs的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，隨后使得病毒結(jié)構(gòu)蛋白(例如Gag，Pol，Env)進(jìn)行表達(dá)，從而進(jìn)行病毒復(fù)制。
從前已經(jīng)描述了具有反式-顯性(顯性陰性的)表型的Rev突變體蛋白(參見例如WO90/14427)。這些Rev突變體仍然能夠結(jié)合RRE RNA，但是由于在Rev激活(效應(yīng)子)區(qū)域內(nèi)的突變，在功能上該突變體不能與其細(xì)胞的輔因子相互作用。
eIF-5A是一種為正常功能所需的內(nèi)源蛋白，已經(jīng)制備了它的幾種變體形式(例如J.Biol.Chem.26418527-18530；Mol.Cell.Biol.113105-3114)，并且這些看來似乎具有對正常的細(xì)胞功能，諸如細(xì)胞生長不利的影響。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以生產(chǎn)突變體eIF-5A蛋白，該蛋白不阻礙內(nèi)源野生型eIF-5A的功能并且通常其自身缺乏任意一種顯著的eIF-5A活性，但是該蛋白抑制Rev功能它們對于Rev功能具有一種抑制性表型。
鑒于并未料到一種在其野生型的正常細(xì)胞環(huán)境中失活的因子仍然具有對通過外部的生物體，諸如病毒起始的代謝活動的抑制作用，這是非常令人吃驚的。由于實(shí)際上eIF-5A是一種對于細(xì)胞調(diào)控而言必不可少的蛋白質(zhì)(生物因子495-104；TIBS18475-479)，從前完全沒有料到存在這樣的突變體eIF-5A蛋白以及編碼它的基因。從前預(yù)料這樣的基因與蛋白質(zhì)可能對細(xì)胞有毒，然而本發(fā)明所要求保護(hù)的基因與蛋白質(zhì)(特別地，具體而言為M13，M14與M13Δ)通常是失去活性的，無毒的并且對Rev，例如HIV Rev功能以及因此的HIV的復(fù)制而言是抑制性的。
本發(fā)明涉及eIF-5A突變體蛋白，該蛋白通常已經(jīng)喪失了其正常細(xì)胞的eIF-5A活性(此處定義為內(nèi)源eIF-5A功能)，但是它抑制Rev功能并且因此對Rev功能具有一種抑制性表型；以及相應(yīng)的編碼該蛋白的基因或DNA或cDNA。
優(yōu)選的為自身缺乏基本的內(nèi)源eIF-5A功能的突變體。此處所使用的eIF-5A優(yōu)選為人eIF-5A，并且突變體優(yōu)選為基于人的eIF-5A野生型版本。HIV優(yōu)選為HIV-1。
本發(fā)明的突變體蛋白應(yīng)被理解為多肽，該多肽包括當(dāng)其自身優(yōu)選缺乏基本的內(nèi)源eIF-5A功能時仍具有對Rev功能的抑制作用的變體如等位基因變體，或片段或衍生物。對于藥物應(yīng)用而言，它們優(yōu)選呈基本純的形式，例如基本不含來自于其內(nèi)源細(xì)胞環(huán)境中的產(chǎn)物。
一次突變或多次突變優(yōu)選涉及位于多肽上的一個區(qū)域或多個區(qū)域，它們從野生型eIF-5A基因組的大約第130個氨基酸位點(diǎn)(圖3；SEQ ID NO17)，尤其在大約第135個氨基酸位點(diǎn)與該分子的末端之間，特別在位點(diǎn)135與139之間開始。
相對應(yīng)的基因或DNA或cDNA序列為例如表示在表2中特別針對于突變體eIF-5AM13，eIF-5AM14，eIF-5AM13Δ的，或者為在嚴(yán)格條件下與該蛋白編碼區(qū)的基因或序列雜交，或者假如不是由于基因密碼的簡并性，與其雜交而優(yōu)選不與相應(yīng)的野生型基因或序列雜交的基因或序列。
本發(fā)明也包括以允許該宿主細(xì)胞表達(dá)該基因或DNA或cDNA序列的方式，采用如上面所定義的基因或DNA或cDNA序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細(xì)胞。它進(jìn)一步涉及含有如上面所定義的基因或DNA或cDNA序列的具有生物學(xué)功能的質(zhì)?；虿《綝NA載體。它也涉及采用如上面所定義的一種DNA載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細(xì)胞。
本發(fā)明也涉及用于制備如上面所定義的基因或DNA或cDNA序列的方法，該方法包括從一種合適的表達(dá)系統(tǒng)中分離出相應(yīng)的野生型基因，將這一基因插入到合適的克隆系統(tǒng)中，向該基因中引入所需要的突變以及從具有所需要的突變的克隆中分離出結(jié)果突變體。
它進(jìn)一步包括用于生產(chǎn)如上面所定義的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括以允許該宿主細(xì)胞表達(dá)該蛋白方式，在合適的營養(yǎng)條件下培養(yǎng)以如上面定義的基因或DNA或cDNA序列所轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細(xì)胞，并且可以選擇性地分離該表達(dá)所需要的多肽產(chǎn)物。
它進(jìn)一步涉及藥物組合物，該組合物含有如上面所定義的蛋白，同時伴有至少一種可藥用的載體，輔劑或稀釋劑，或者以從病人體內(nèi)取出并且在再插入之前經(jīng)處理的細(xì)胞的形式存在。它也涉及如上面所定義的蛋白或編碼該蛋白的基因或DNA或cDNA序列在治療由有賴于針對Rev功能的eIF-5A的逆轉(zhuǎn)錄病毒，諸如HIV，HTLV-I和/或HTLV-II所引起的疾病方面的用途。它也涉及它們用作一種藥物的用途，以及它們在制備一種用于治療由有賴于針對Rev功能的eIF-5A的逆轉(zhuǎn)錄病毒，諸如HIV，HTLV-I和/或HTLV-II所引起的疾病的藥物的用途。
在實(shí)施本發(fā)明的過程中將采用的步驟與技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。鑒于它們的制備并不特別地描述于此，用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明將采用的化合物，試劑，載體，細(xì)胞系等是已知的并且是公眾可以得到的或者可以按常規(guī)的方式從已知且公眾可以得到的材料得到，或者可以按常規(guī)的方式從已知且公眾可以得到的材料制備相當(dāng)?shù)牟牧稀?br> a)eIF-5A突變體的產(chǎn)生將一個編碼eIF-5A的人的cDNA(J.Cell Biol.123/6，1309-1320)作為Hind III片段克隆在M13mp18載體(Pharmacia，瑞典)的Hind III位點(diǎn)上。采用“寡核苷酸指導(dǎo)的體外誘變系統(tǒng)，第二版”(Amersham，英國)把相對應(yīng)的單鏈DNA用于誘變。采用來自于美國生物化學(xué)公司的測序酶2.0通過DNA測序以測定所有突變體的序列。隨后，在COS細(xì)胞中表達(dá)所有的eIF-5A突變體基因(參見表1)并且使其經(jīng)過eIF-5A-特異的免疫沉淀分析以證實(shí)蛋白的表達(dá)。
表1eIF-5A突變體構(gòu)建物 位點(diǎn) 突變 Rev體外 在酵母中互補(bǔ)(aa) (aa) 結(jié)合peIF-5AM14，5，6 D，L，D→E，D，L nd是peIF-5AM2 9，10 T，G→D，Lnd是peIF-5AM3 15，16，17 S，A，T→A，D，L nd是peIF-5AM4 22，23，24 C，S，A→G，D，L - 不是peIF-5AM5 43，44，45 M，S，T→I，D，L - 不是peIF-5AM6 46，47，48 S，K，T→L，D，L - 不是peIF-5AM7 64，65 F，T→D，L- 不是peIF-5AM8 69，70 Y，E→D，L- 不是peIF-5AM9 75，76 S，T→D，L- 不是peIF-5AM10 98，99，100Y，L，S→L，D，L - 不是peIF-5AM11 104，105，106 D，S，G→Q，D，L nd是peIF-5AM12126，127K，Y→D，Lnd是peIF-5AM13135，136I，T→D，L+ 不是peIF-5AM14138，139L，S，→D，L + 不是peIF-5AM15 141，142，143 M，T，E→I，D，L nd是peIF-5AM16149，150I，K→D，L- 不是peIF-5AM13Δ*135 DLCCLP-STOP + 不是*peIF-5AM13Δ是一個具有下面序列的140個氨基酸(aa)C-末端eIF-5A缺失蛋白野生型aa1-134-DLCCLP.所有其它的突變體均為氨基酸替代物。+，野生型活性；-，無活性.nd，未測定。
用于生產(chǎn)以上17種突變體的特異的寡核苷酸的核苷酸序列如下所示(表2)(分別為SEQ ID No.1至No.16)，其中最后的突變體M13Δ是采用與M13同樣的寡核苷酸得到的一個誘變反應(yīng)的錯誤結(jié)果生成了M13Δ。
應(yīng)當(dāng)知道這些特異的核苷酸序列對于所生成的17種特異的突變體而言僅僅是說明性的，并且采用許多不同的核苷酸序列，鑒于例如密碼子擺動的使用可以得到那些相同的突變體。
表2針對eIF-5A突變體的寡核苷酸M1 5′-GGC AGA TGA AGA TCT CTT CGA GAC AGG-3′M2 5′-CTT GGA CTT CGA AGA TCT AGA TGC AGG-3′M3 5′-GCA GGG GCC GCA GAT CTC TTC CCA ATG C-3′M4 5′-CCC AAT GCA GGG AGA TCT ATT ACG TAA G-3′M5 5′-CGT CGA GAT AGA TCT TTC GAA GAC TGG-3′M6 5′-CGA GAT GTC TAC TTT AGA TCT TGG CAA GCA CG-3′M7 5′-GGT ATT GAC ATA GAT CTT GGG AAG AAA TAT G-3′M8 5′-GGG AAG AAA GAT CTA GAT ATC TGC CCG-3′M9 5′-GAT ATC TGC CCA GAT CTT CAT AAT ATG G-3′M105′-GGC ATC CAG GAT GGG TTA GAT CTA CTG CTC CAG GACAGC G-3′M115′-CTG CTC CAG GAA GAT CTG GAG GTA CGA G-3′M125′-GAG ATT GAG CAA GAT CTC GAC TGT GGA G-3′M135′-GAA GAG ATC CTA GAT CTG GTG CTG TCT GCC-3′M145′-CCT GAT CAC GGT AGA TCT TGC CAT GAC AGA GG-3′M155′-GCT GTC TGC CAT AGA TCT GGA GGC AGC TG-3′M165′-GCA GCT GTT GCA GAT CTG GCC ATG GC-3′b)在釀酒酵母中為細(xì)胞的eIF-5A活性檢測eIF-5A突變體采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)在酵母穿梭質(zhì)粒pRSGAL的BamHI與Xbal位點(diǎn)之間克隆該eIF-5A編碼序列。為了檢測在一個eIF-5A-缺陷型釀酒酵母中不同的eIF-5A突變體的互補(bǔ)能力，采用如在Mol.Gen.Genet.244，646-652(1994)中所描述的質(zhì)粒改組技術(shù)。將結(jié)果總結(jié)于表1中；幾種eIF-5A突變體，即peIF-5AM4至peIF-5AM10，peIF-5AM13，peIF-5AM14，peIF-5AM16與peIF-5AM13Δ鑒定為非功能的eIF-5A突變體蛋白。
c)采用凝膠阻滯分析在體外結(jié)合非功能eIF-5A突變體蛋白至HIV-1Rev反式激活蛋白采用PCR技術(shù)在原核生物表達(dá)載體pGEX-3X(Pharmacia)的BamHI與EcoRI位點(diǎn)之間克隆該野生型與所有的非功能eIF-5A基因，在大腸桿菌中將該基因表達(dá)為谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)-融合蛋白并且純化。然后，如在生物化學(xué)32，1497-10505(1993)中所描述的把不同的GST-eIF-5A融合蛋白隨后用于凝膠阻滯分析，該分析方法組合使用了32P-標(biāo)記的RRE RNA與重組Rev蛋白(自然342，816-819)。
首先，檢測GST-eIF-5A野生型蛋白對RRERev復(fù)合物的影響。如在圖1A中所顯示的，向含有RRE RNA的Rev結(jié)合反應(yīng)中加入GST-eIF-5A造成了檢測到具有明顯降低移動性的更高分子量的復(fù)合物(圖1A，泳道5對泳道4)。當(dāng)用GST或GST-eIF-5A單獨(dú)溫育RRE RNA時，這一特殊的記號是檢測不到的(圖1A，泳道2與泳道3)。
接下來檢測所觀察到的eIF-5A-特異的信號是否依賴于在Rev反式激活蛋白中激活域的存在。為此，在這種分析方法中采用近來所描述的突變體蛋白Rev9Δ14與Rev11Δ14(生物化學(xué)32，8945-8954)。兩種Rev蛋白都通過內(nèi)部C-末端缺失來表示其特征，與野生型Rev相比它們都呈現(xiàn)出對RRE RNA的結(jié)合親和力與特異性。重要的是，在Rev9Δ14中激活域完全被除去，而在Rev11Δ14蛋白中仍然存在。兩種更低分子量的蛋白都造成了在凝膠阻滯分析中難于分辨的RRE蛋白復(fù)合物的條帶移位。但是，該數(shù)據(jù)明顯表明激活域缺失突變體Rev9Δ14是不能與GST-eIF-5A相互作用的(圖1A，泳道6對泳道7)?？墒牵騌RERev11Δ14結(jié)合反應(yīng)中加入GST-eIF-5A造成一個新的信號(圖1A，泳道8對泳道9；在泳道9中更緩慢的移動點(diǎn))，這表明eIF-5A與Rev激活域的相互作用。
最后，以同樣的分析方法檢測不同的非功能eIF-5A突變體蛋白的結(jié)合能力。如在圖1B中所顯示的，大多數(shù)的GST-eIF-5A突變體蛋白喪失了其識別RRERev復(fù)合物的能力(泳道4至泳道10以及泳道13)。但是，三種非功能突變體蛋白GST-eIF-5AM13，GST-eIF-5AM14以及GST-eIF-5AM13Δ顯示出與eIF-5A野生型蛋白類似的結(jié)合能力(圖1B，泳道3對泳道11，泳道12與泳道14)。
總而言之，該數(shù)據(jù)表明eIF-5AM13，eIF-5AM14以及eIF-5AM13Δ突變體達(dá)到了對HIV-1Rev功能的抑制劑的要求，即(1)內(nèi)源eIF-5A功能的喪失(參見酵母互補(bǔ)作用；表1)；并且(2)對HIV-1Rev蛋白的結(jié)合活性(參見Rev體外結(jié)合；表1與圖1B)。
d)通過在反式-顯性的eIF-5A突變體的逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化，組成型抑制在人T-細(xì)胞中HIV-1的復(fù)制為了檢測eIF-5AM13，eIF-5AM14以及eIF-5AM13Δ的HIV-1抑制性表型，分別在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBC140的Xho I位點(diǎn)上克隆eIF-5A編碼區(qū)，在體外采用Am12細(xì)胞系進(jìn)行包裝并且將該編碼區(qū)送遞至人CEMT-細(xì)胞以用于如在Proc.Natl.Acad.Sci.89.，9870-9874(1992)中所描述的組成型表達(dá)。在這些實(shí)驗(yàn)中，eIF-5A野生型基因的表達(dá)，編碼eIF-5AM9的基因以及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體單獨(dú)作為對照。
采用HIV-1SF2菌株的2000/毫升TCID進(jìn)行HIV-1攻擊實(shí)驗(yàn)。在SF2感染后的第10天，采用抗原捕獲分析法(ELISA)收集培養(yǎng)基的等分試樣以測定作為p24 Gag蛋白的HIV-1的復(fù)制。如在圖2中所顯示的，當(dāng)與表達(dá)eIF-5AM9突變體蛋白的CEM細(xì)胞(CEM-eIF-5AM9；圖2B)進(jìn)行比較時，在表達(dá)或?yàn)閑IF-5AM13，eIF-5AM14或?yàn)閑IF-5AM13Δ的三個單獨(dú)克隆的CEM細(xì)胞系(稱作A，B，C)的每個細(xì)胞系(分別為圖2C，2D與2E；左欄)中，HIV-1的復(fù)制均顯著降低。在表達(dá)親本pBC140載體(CEM-載體；圖2A)或eIF-5A野生型蛋白(CEM-eIF-5Awt；圖2A)的CEM細(xì)胞中檢測到最多的病毒復(fù)制。所觀測到的抑制性作用并不是由于如在該實(shí)驗(yàn)中由類似的細(xì)胞總數(shù)所表明的細(xì)胞增殖通常的抑制作用(圖2；右欄)。
總之，這些實(shí)驗(yàn)表明(1)eIF-5AM13，eIF-5AM14或eIF-5AM13Δ蛋白的組成型表達(dá)在人CEM T-細(xì)胞中是無毒的，以及(2)該eIF-5AM13，eIF-5AM14與eIF-5AM13Δ為HIV-1復(fù)制的抑制劑。
HIV為AIDS(獲得性免疫缺損綜合癥)主要的病原介質(zhì)。HTLV-I尤其導(dǎo)致ATL(成人T-細(xì)胞白血病)；在一些情況下HTLV-II在病原學(xué)上與變體T-細(xì)胞多毛細(xì)胞白血病相關(guān)。現(xiàn)已表明HIV Rev與HTLV-IRex反式激活蛋白對于培養(yǎng)中病毒的復(fù)制是必不可少的。此外也證實(shí)了HTLV-I Rex在功能上能夠代替HIV中的Rev蛋白。因此，Rev與Rex是用于患病病人治療干預(yù)潛在的靶點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的eIF-5A突變體作為野生型Rev有效的競爭性抑制劑，和/或由于Rex在功能上具有代替HIV中的Rev的潛力，該突變體作為野生型Rex功能的有效競爭性抑制劑。因此，這些eIF-5A突變體也充當(dāng)HIV和/或HTLV-I和/或HTLV-II復(fù)制的有效的抑制劑。它們因此可以用于保護(hù)暴露于感染的病人的淋巴和/或骨髓細(xì)胞，并且因此表明它們可用于治療由HTLV-I或HTLV-II所引起的疾病，或者分別地用于治療由HIV-引發(fā)的包括AIDS與ARS或ARC(與AIDS有關(guān)的綜合癥或復(fù)合癥)的疾病。進(jìn)一步，由于它們能夠抑制HTLV-I Rex與HIV Rev蛋白的活動，因此表明它們可以用于治療由HIV-引發(fā)的疾病。在被一種以上的這些病毒病原體共感染的病人中，或者其感染未被在以上的兩種介質(zhì)間辨別的那些感染病人中，這一性質(zhì)可能是特別有價值的。
因此，表明本發(fā)明可以用于預(yù)防和治療病毒，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒疾病，諸如ATL，AIDS，ARS(或ARC)，象SIVmac的SIV(猴免疫缺損病毒)，F(xiàn)IV(豬免疫缺損病毒)，EIVA(馬感染貧血病毒)，綿羊髓鞘脫落病毒與牛免疫缺損病毒的感染，具體是人的逆轉(zhuǎn)錄病毒疾病，更具體的是由通過rex或rev基因或其等價物調(diào)控的病原體所引起的人的逆轉(zhuǎn)錄病毒疾病，諸如ATL，AIDS，ARS(或ARC)。由于它有利于治療由病毒引起的多重，尤其是雙重感染，諸如在由HIV與HTLV-I共感染的iv藥物使用者中經(jīng)常看到的感染，或者有利于在伴有更高風(fēng)險的再次感染的單一感染的情況下(諸如在HIV感染中)進(jìn)行治療，或者有利于通過不同病毒種類的譜系在需要保護(hù)免遭感染的情況下進(jìn)行預(yù)防，因此其特別的益處在于阻抑物作用的多個方面。
由于例如HTLV-I的Rex功能與HIV的Rev功能的阻抑阻礙了病毒的復(fù)制，從而降低了由阻止感染病毒顆粒的形成而帶來的病毒負(fù)荷，因此本發(fā)明的治療潛能是非常明顯的，并且從而期望這種潛能使感染的潛伏階段永遠(yuǎn)存在。因此已經(jīng)被HIV病毒感染但是也具有被整合到其基因組中的eIF-5A突變體阻抑物的基因的研究對象的細(xì)胞會仍然維持其功能，并且該研究對象會無限期地沒有疾病的癥狀而無需長期的治療。
由此看來，根據(jù)本發(fā)明的基因其自身為藥物，它們可優(yōu)選作為載體(例如一個逆轉(zhuǎn)錄病毒或質(zhì)粒載體)的一部分、以適合于實(shí)現(xiàn)在一個功能形式下向靶哺乳動物細(xì)胞送遞的形式、用于一次或多次地體內(nèi)直接或者體外間接地給藥；例如通過將編碼這種病毒復(fù)制抑制劑的基因直接地植入到從受到感染的個體得到的淋巴和/或骨髓細(xì)胞的基因組中，可以實(shí)現(xiàn)在體外將該基因插入病人細(xì)胞，并且在插入實(shí)現(xiàn)后可以將這些細(xì)胞施用于供體病人。由于HTLV-I與HTLV-II以及HIV在不同類型的T-細(xì)胞中復(fù)制，看來似乎特別適合于由這些病毒引起的疾病。因此，T-細(xì)胞成為對于采用根據(jù)本發(fā)明的基因進(jìn)行基因修飾所合乎需要的靶細(xì)胞。此外，對于修飾而言作為HIV感染目標(biāo)的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞也是合適的細(xì)胞。優(yōu)選修飾造血干細(xì)胞，從而在重復(fù)多次的造血譜系的子代細(xì)胞中提供持續(xù)時間長的保護(hù)。
因此，本發(fā)明的一種用途類似于基因治療原理，該原理公開在例如T.Friedmann，科學(xué)244(1989) 第1275頁或者P.M.Lehn，骨髓移植1(1987)第243頁從例如AIDS/ATL病人中提取出造血干細(xì)胞并且在體外進(jìn)行培養(yǎng)，采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將根據(jù)本發(fā)明經(jīng)突變的編碼待阻抑功能(即Rev/Rex功能)的抑制劑的基因植入到這些細(xì)胞中；現(xiàn)在將病毒-抗性干細(xì)胞返回到原來病人的免疫系統(tǒng)中，此處鑒于該干細(xì)胞所得到的選擇性的益處超出了未處理的干細(xì)胞而期望細(xì)胞的增殖；在適當(dāng)?shù)臅r間里，造血細(xì)胞的群體將完全由生產(chǎn)該阻抑物因子與呈病毒-抗性的細(xì)胞所組成。
關(guān)于如何影響該過程的方法在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，參見例如USP4’868’116。用于把根據(jù)本發(fā)明的突變基因送遞到靶哺乳動物細(xì)胞(諸如骨髓細(xì)胞)的載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒或質(zhì)粒載體已在例如科學(xué)244(1989)第1275頁中公開或涉及。因此把例如不同的Rev和/或Rex反式顯性的基因克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)中。在逆轉(zhuǎn)錄病毒-介導(dǎo)的基因送遞至例如HIV-感染的人細(xì)胞系中之后，通過病毒生成的抑制作用易于確定該突變體的抑制性作用。上面的治療原理為如在D.Baltimore，自然335(1988)第395頁中所設(shè)想的胞內(nèi)免疫的一個實(shí)例。簡單地說，該原理涉及將編碼被選定病毒的一些活體功能的阻抑物的基因插入到該病毒感染的具體的靶細(xì)胞中(例如在病毒引起AIDS的情況下某些T-細(xì)胞以及的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞)。這種采用任何一種病毒的阻抑物治療途徑的用途取決于建立對編碼這些突變體蛋白的基因可能的載體以及把這些載體插入到合適的細(xì)胞中的可能的方法，其中在模型系統(tǒng)，對人或動物的應(yīng)用組成有效且安全的胞內(nèi)送遞系統(tǒng)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了這些細(xì)胞。僅僅鑒于目前存在阻止基因治療的道德障礙上的困難，因此該原理可以用于檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。但是，現(xiàn)在已經(jīng)開始了首次這樣的同時具有安全性與治療目的的人體基因?qū)嶒?yàn)[參見例如G.T.Nabel，人體基因治療5(1994)79-82]?？梢灶A(yù)料到在表明該方法無毒之后非常短的時間里，具有治療目的的類似試驗(yàn)首先在威脅生命的條件(諸如AIDS病)下會沿著這些開拓性的實(shí)驗(yàn)繼續(xù)進(jìn)行，并且本發(fā)明看來似乎非常適于在這樣的試驗(yàn)中采用(參見例如T.Friedmann，科學(xué)2441279，第二欄，“感染疾病”)。
采用本發(fā)明更進(jìn)一步的方法包括把不是一個基因而是一種根據(jù)本發(fā)明的阻抑蛋白插入到靶細(xì)胞中。按照常規(guī)的方式以允許胞內(nèi)滲透的形式(諸如通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的送遞)影響例如口服或腸胃外給藥。針對這些用途而言，精確的劑量當(dāng)然有賴于所使用的化合物，給藥方式以及所需要的治療而變化；在特定的情況下確定最適宜的劑量是在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的技巧范圍內(nèi)的。
應(yīng)當(dāng)了解到可以對如上所描述的本發(fā)明在形式與細(xì)節(jié)上進(jìn)行不同的組合與變化，而沒有脫離本發(fā)明的范圍。也應(yīng)當(dāng)了解到如上所描述的更進(jìn)一步的突變體，其中包括在本文中已經(jīng)構(gòu)建并公開的特異的突變體中卻尚未被表征、但是在更為細(xì)致的研究基礎(chǔ)上可以稱為是抑制性的和/或多價的突變體，以及按照如上所描述的原理但卻沒有在本文中具體公開的更進(jìn)一步的突變體也落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。


圖1體外RNA凝膠-移位實(shí)驗(yàn)。
圖2HIV-1攻擊實(shí)驗(yàn)。p24Gag水平顯示在左側(cè)。同一實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞總數(shù)顯示在右側(cè)ACEM-載體/eIF-5A wtBCEM-eIF-5AM9CCEM-eIF-5AM13DCEM-eIF-5AM14ECEM-eIF-5AM13Δ圖3(SEQ ID No17)對于野生型人的eIF-5A的cDNA與氨基酸編碼序列(J.Biol.Chem.264 1581)(SEQID No17)；把顯示在氨基酸位點(diǎn)50上的賴氨酸在翻譯后轉(zhuǎn)化為hypusine。如在表1中所顯示的被突變的野生型eIF-5A的氨基酸以斜體書寫。所使用的特異的寡核苷酸(表2；SEQ ID No.1至No.16)對應(yīng)于以下在圖3(SEQ IDNo.17)中的核苷酸位點(diǎn)M13-29(27個核苷酸)M212-38(27個核苷酸)M334-61(28個核苷酸)M454-81(28個核苷酸)M5120-146(27個核苷酸)M6123-154(32個核苷酸)M7178-208(31個核苷酸)M8196-222(27個核苷酸)M9211-238(28個核苷酸)M10277-316(40個核苷酸)M11301-328(28個核苷酸)M12364-391(28個核苷酸)M13391-420(30個核苷酸)M14399-430(32個核苷酸)M15411-439(29個核苷酸)M16433-458(26個核苷酸)
M13Δ391-421(30個核苷酸，位點(diǎn)409未翻譯，后面有在位點(diǎn)422-424上的終止密碼子)并且導(dǎo)致顯示在表1中、針對野生型蛋白在序列上的氨基酸的變化。序列表(1)一般信息(i)申請人(A)姓名Sandoz有限公司(B)街道Lichtstrasse35(C)城市Basle(E)國家瑞士(F)郵政編碼(ZIP)CH-4002(G)電話61-324 5269(H)傳真61-322 7532(A)姓名Hauber，Joachim(B)街道Nothartgasse21/10(C)城市維也納(D)州(E)國家匈牙利(F)郵政編碼(ZIP)A-1130(ii)發(fā)明名稱突變體蛋白(iii)序列數(shù)17(iv)計算機(jī)可讀形式(A)存儲媒體類型軟磁盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件(v)目前申請信息申請?zhí)朩O PCT/EP96/.....(vi)在先申請信息(A)申請?zhí)朑B 9502771.0(B)申請日1995年2月13日(A)申請?zhí)朑B 9513505.9(B)申請日1995年7月3日(2)SEQ ID NO1(M1)信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型(C)鏈雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定非(iv)反義非(vi)最初來源(A)生物體合成的(x)出版信息(H)文獻(xiàn)號-(I)文件遞交日-(J)出版日-(xi)序列描述SEQ ID NO1GGC AGA TGA AGA TCT CTT CGA GAC AGG(3)SEQ ID NO2(M2)信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型(C)鏈雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定非(iv)反義非(vi)最初來源(A)生物體合成的(x)出版信息(H)文獻(xiàn)號-(I)文件遞交日-(J)出版日-(xi)序列描述SEQ ID NO2CTT GGA CTT CGA AGA TCT AGA TGC AGG(4)SEQ ID NO3(M3)信息(i)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型(C)鏈雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定非(iv)反義非(vi)最初來源(A)生物體合成的(x)出版信息(H)文獻(xiàn)號-(I)文件遞交日-(J)出版日-(xi)序列描述SEQ ID NO3GCA GGG GCC GCA GAT CTC TTC CCA ATG C(5)SEQ ID NO4(M4)信息(i)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型(C)鏈雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定非(iv)反義非(vi)最初來源(A)生物體合成的(x)出版信息(H)文獻(xiàn)號-(I)文件遞交日-(J)出版日-(xi)序列描述SEQ ID NO4CCC AAT GCA GGG AGA TCT ATT ACG TAA G(6)SEQ ID NO5(M5)信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型(C)鏈雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定非(iv)反義非(vi)最初來源(A)生物體合成的(x)出版信息(H)文獻(xiàn)號-(I)文件遞交日-(J)出版日-(xi)序列描述SEQ ID NO5CGT CGA GAT AGA TCT TTC GAA GAC TGG(7)SEQ ID NO6(M6)信息(i)序列特征(A)長度32個堿基對(B)類型(C)鏈雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定非(iv)反義非(vi)最初來源(A)生物體合成的(x)出版信息(H)文獻(xiàn)號-(I)文件遞交日-(J)出版日-(xi)序列描述SEQ ID NO6CGA GAT GTC TAC TTT AGA TCT TGG CAA GCA CG(8)SEQ ID NO7(M7)信息(i)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型(C)鏈雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定非(iv)反義非(vi)最初來源(A)生物體合成的(x)出版信息(H)文獻(xiàn)號-(I)文件遞交日-(J)出版日-(xi)序列描述SEQ ID NO7GGT ATT GAC ATA GAT CTT GGG AAG AAA TAT G(9)SEQ ID NO8(M8)信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型(C)鏈雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定非(iv)反義非(vi)最初來源(A)生物體合成的(x)出版信息(H)文獻(xiàn)號-(I)文件遞交日-(J)出版日-(xi)序列描述SEQ ID NO8GGG AAG AAA GAT CTA GAT ATC TGC CCG(10)SEQ ID NO9(M9)信息(i)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型(C)鏈雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定非(iv)反義非(vi)最初來源(A)生物體合成的(x)出版信息(H)文獻(xiàn)號-(I)文件遞交日-(J)出版日-(xi)序列描述SEQ ID NO9GAT ATC TGC CCA GAT CTT CAT AAT ATG G(11)SEQ ID NO10(M10)信息(i)序列特征(A)長度40個堿基對(B)類型(C)鏈雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定非(iv)反義非(vi)最初來源(A)生物體合成的(x)出版信息(H)文獻(xiàn)號-(I)文件遞交日-(J)出版日-(xi)序列描述SEQ ID NO10GGC ATC CAG GAT GGG TTA GAT CTA CTG CTC CAG GACAGC G(12)SEQ ID NO11(M11)信息(i)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型(C)鏈雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定非(iv)反義非(vi)最初來源(A)生物體合成的(x)出版信息(H)文獻(xiàn)號-(I)文件遞交日-(J)出版日-(xi)序列描述SEQ ID NO11CTG CTC CAG GAA GAT CTG GAG GTA CGA G(13)SEQ ID NO12(M12)信息(i)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型(C)鏈雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定非(iv)反義非(vi)最初來源(A)生物體合成的(x)出版信息(H)文獻(xiàn)號-(I)文件遞交日-(J)出版日-(xi)序列描述SEQ ID NO12GAG ATT GAG CAA GAT CTC GAC TGT GGA G(14)SEQ ID NO13(M13)信息(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型(C)鏈雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定非(iv)反義非(vi)最初來源(A)生物體合成的(x)出版信息(H)文獻(xiàn)號-(I)文件遞交日-(J)出版日-(xi)序列描述SEQ ID NO13GAA GAG ATC CTA GAT CTG GTG CTG TCT GCC(15)SEQ ID NO14(M14)信息(i)序列特征(A)長度32個堿基對(B)類型(C)鏈雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定非(iv)反義非(vi)最初來源(A)生物體合成的(x)出版信息(H)文獻(xiàn)號-(I)文件遞交日-(J)出版日-(xi)序列描述SEQ ID NO14CCT GAT CAC GGT AGA TCT TGC CAT GAC AGA GG(16)SEQ ID NO15(M15)信息(i)序列特征(A)長度29個堿基對(B)類型(C)鏈雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定非(iv)反義非(vi)最初來源(A)生物體合成的(x)出版信息(H)文獻(xiàn)號-(I)文件遞交日-(J)出版日-(xi)序列描述SEQ ID NO15GCT GTC TGC CAT AGA TCT GGA GGC AGC TG(17)SEQ ID NO16(M16)信息(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型(C)鏈雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定非(iv)反義非(vi)最初來源(A)生物體合成的(x)出版信息(H)文獻(xiàn)號-(I)文件遞交日-(J)出版日-(xi)序列描述SEQ ID NO16GCA GCT GTT GCA GAT CTG GCC ATG GC(18)SEQ ID NO17(wt)信息(i)序列特征(A)長度465個堿基對(與154個氨基酸殘基)(B)類型cDNA(C)鏈鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定非(iv)反義非(vi)最初來源(A)生物體人類(x)出版信息(H)文獻(xiàn)號J.Biol.Chem.264(1989)1578-1583(I)文件遞交日-(J)出版日1989(xi)序列描述SEQ ID NO17
1030 50ATG GCA GAT GAC TTG GAC TTC GAG ACA GGA GAT GCA GGG GCC TCA GCC ACCMet Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala Thr1 107090TTC CCA ATG CAG TGC TCA GCA TTA CGT AAG AAT GGC TTT GTG GTG CTC AAAPhe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val Leu Lys20110130 150GGC CGG CCA TGT AAG ATC GTC GAG ATG TCT ACT TCG AAG ACT GGC AAG CACGly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His40 50170190GGC CAC GCC AAG GTC CAT CTG GTT GGT ATT GAC ATC TTT ACT GGG AAG AAAGly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys60210230250TAT GAA GAT ATC TGC CCG TCA ACT CAT AAT ATG GAT GTC CCC AAC ATC AAATyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys70 80270290AGG AAT GAC TTC CAG CTG ATT GGC ATC CAG GAT GGG TAC CTA TCA CTG CTCArg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu90 100310 330350CAG GAC AGC GGG GAG GTA CGA GAG GAC CTT CGT CTC CCT GAG GGA GAC CTTGln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu110370 390 4GGC AAG GAG ATT GAG CAG AAG TAC GAC TGT GGA GAA GAG ATC CTG ATC ACGGly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr120 13010430 450GTG CTG TCT GCC ATG ACA GAG GAG GCA GCT GTT GCA ATC AAG GCC ATG GCAVal Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala140 150AAA TAALys End
權(quán)利要求
1.一種eIF-5A突變體蛋白，該蛋白抑制Rev功能并且因此對Rev功能具有一種抑制性表型，或者編碼該蛋白的基因或DNA或cDNA。
2.一種如在權(quán)利要求1中定義的蛋白，該蛋白缺乏基本的內(nèi)源eIF-5A功能，或者編碼該蛋白的基因或DNA或cDNA。
3.一種如在權(quán)利要求1或2中定義的蛋白，該蛋白為eIF-5AM13，eIF-5AM14或者eIF-5AM13Δ蛋白，或者編碼該蛋白的基因或DNA或cDNA。
4.一種原核或真核宿主細(xì)胞，該細(xì)胞被如在權(quán)利要求1或2中定義的基因或DNA或cDNA序列，以允許該宿主細(xì)胞表達(dá)該基因或DNA或cDNA序列的方式轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
5.一種生物功能質(zhì)?；虿《綝NA載體，它包括如在權(quán)利要求1或2中定義的基因或DNA或cDNA序列。
6.一種原核或真核的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞被包括如在權(quán)利要求1或2中定義的基因或DNA或cDNA序列的生物功能質(zhì)?；虿《綝NA載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
7.一種制備如在權(quán)利要求1或2中定義的基因或DNA或cDNA序列的方法，該方法包括從一種合適的表達(dá)系統(tǒng)中分離出相應(yīng)的野生型基因，將這一基因插入到一個合適的克隆系統(tǒng)中，向該基因中引入所需要的突變以及從具有所需要的突變的克隆中分離出結(jié)果突變體。
8.一種用于生產(chǎn)如在權(quán)利要求1或2中定義的蛋白的方法，該方法包括在合適的營養(yǎng)條件下培養(yǎng)以允許該宿主細(xì)胞表達(dá)該蛋白的方式以如在權(quán)利要求1或2中定義的基因或DNA或cDNA序列所轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細(xì)胞，并且可以選擇性地分離該表達(dá)所需要的多肽產(chǎn)物。
9.一種藥物組合物，該組合物含有如在權(quán)利要求1或2中定義的蛋白，同時伴有至少一種可藥用載體，輔劑或稀釋劑，或者以從病人體內(nèi)取出并且在再插入之前經(jīng)處理的細(xì)胞的形式存在。
10.一種如在權(quán)利要求1或2中定義的蛋白或者編碼該蛋白的基因或DNA或cDNA序列在治療由有賴于針對Rev功能的eIF-5A的逆轉(zhuǎn)錄病毒所引起的疾病的用途。
11.一種如在權(quán)利要求1或2中定義的蛋白或者編碼該蛋白的基因或DNA或cDNA序列在治療由HIV，HTLV-I和/或HTLV-II所引起的疾病的用途。
12.一種如在權(quán)利要求1或2中定義的蛋白或者編碼該蛋白的基因或DNA或cDNA序列，它們用作一種藥物。
13.一種如在權(quán)利要求1或2中定義的蛋白在制備一種用于治療由有賴于針對Rev功能的eIF-5A的逆轉(zhuǎn)錄病毒所引起的疾病的藥物的用途。
全文摘要
eIF－5A突變體蛋白,它通常缺乏基本的eIF－5A活性并且抑制Rev功能,從而對Rev功能具有一種抑制性表型,以及編碼該蛋白的基因或DNA或cDNA。
文檔編號C12N15/09GK1173897SQ96191901
公開日1998年2月18日 申請日期1996年2月12日 優(yōu)先權(quán)日1995年2月13日
發(fā)明者J·豪伯爾 申請人:諾瓦蒂斯有限公司