核重新編程因子的制作方法
【專利摘要】作為用于不利用胚和ES細(xì)胞而誘導(dǎo)分化細(xì)胞的重新編程，簡(jiǎn)便且再現(xiàn)性強(qiáng)地建立具有與ES細(xì)胞同樣的多能性和增殖能力的誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞的方法，本發(fā)明提供了含有下述3種基因：Oct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的各基因的產(chǎn)物的體細(xì)胞的核重新編程因子。
【專利說(shuō)明】核重新編程因子
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2006年12月06日、申請(qǐng)?zhí)枮?00680048227.7的同名申請(qǐng)的
分案申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及具有使分化的體細(xì)胞重新編程來(lái)誘導(dǎo)誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞的作用的核重新編程因子(nuclear reprogramming factor)。
【背景技術(shù)】
[0003]胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)是由人和小鼠的初期胚建立的干細(xì)胞，具有能長(zhǎng)期進(jìn)行培養(yǎng)并維持可以分化成存在于生物體中的所有類型細(xì)胞的多能性的特征。人們期待利用該性質(zhì)將人ES細(xì)胞作為針對(duì)帕金森病、青少年糖尿病、白血病等多種疾病的細(xì)胞移植療法的來(lái)源。但是，存在著ES細(xì)胞的移植與臟器移植同樣會(huì)引起排斥反應(yīng)這樣的問(wèn)題。而且，對(duì)于通過(guò)破壞人胚胎建立的ES細(xì)胞的利用，出于倫理的觀點(diǎn)的反對(duì)意見(jiàn)也很多。如果能夠誘導(dǎo)患者自身的分化體細(xì)胞脫分化，建立具有接近于ES細(xì)胞的多能性和增殖能力的細(xì)胞(該細(xì)胞在本說(shuō)明書中被稱為“誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞”(iPS細(xì)胞)，但也存在被稱為“胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞”或“ES樣細(xì)胞”的情況)的話，則預(yù)期能夠利用它們作為沒(méi)有排斥反應(yīng)和倫理性問(wèn)題的理想的多能性細(xì)胞。
[0004]作為使體細(xì)胞核重新編程的方法，已報(bào)道了，例如，從將體細(xì)胞的核移植到卵細(xì)胞中制備的克隆胚中 建立ES細(xì)胞的技術(shù)(ff.S.Hwang等，Science, 303，pp.1669-74，2004 ;ff.S.Hwang等,Science, 308, pp.1777-83，2005:但是，現(xiàn)已清楚了這些論文都是捏造的，而且已于日后撤下這些論文)。然而，這些技術(shù)只是為了建立ES細(xì)胞的目的而制備克隆胚，因此與使用不孕治療中產(chǎn)生的剩余胚的常規(guī)ES細(xì)胞相比，倫理的問(wèn)題反而大。而且，現(xiàn)已報(bào)道了通過(guò)使體細(xì)胞與ES細(xì)胞相融合使體細(xì)胞核重新編程的技術(shù)(M.Tada等，Curr.Biol.，11, pp.1553-1558，2001 ;C.A.Cowan 等，Science, 309, pp.1369-73，2005)。但是，即使在該方法中也存在以下問(wèn)題:無(wú)法解決由于導(dǎo)致最終使用人ES細(xì)胞而產(chǎn)生的倫理性問(wèn)題。而且，現(xiàn)已報(bào)道了使生長(zhǎng)于人中的生殖細(xì)胞腫瘤來(lái)源的細(xì)胞株的提取物和分化細(xì)胞反應(yīng)而使細(xì)胞核重新編程的技術(shù)(C.K.Taranger 等，Mol.Biol.Cell, 16，pp.5719-35，2005)。該方法，提取物中何種成分誘導(dǎo)重新編程完全不清楚，因此在技術(shù)的可靠性和安全性上存在問(wèn)題。
[0005]另一方面，提出了篩選具有使分化的體細(xì)胞重新編程來(lái)誘導(dǎo)誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞的作用的核重新編程因子的方法(國(guó)際公開(kāi)W02005/80598)。該方法包括以下步驟:使含有在受ECAT (ES cellassociated transcript)基因(ES細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因群:ES細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄物)的表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)域的表達(dá)調(diào)節(jié)位置上存在標(biāo)記基因的基因的體細(xì)胞與被檢物質(zhì)相接觸、研究標(biāo)記基因表達(dá)細(xì)胞的出現(xiàn)的有無(wú)，選擇使該細(xì)胞出現(xiàn)的被檢物質(zhì)作為體細(xì)胞的核重新編程因子的候選物。而且，該出版物的實(shí)施例6等中公開(kāi)了使體細(xì)胞重新編程的方法。但是，上述出版物中沒(méi)有公開(kāi)實(shí)際上鑒定核重新編程因子的報(bào)告。[0006]專利文獻(xiàn)I國(guó)際公開(kāi)TO2005/80598
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的課題在于提供核重新編程因子。更具體的是，本發(fā)明的課題在于提供用于不利用卵細(xì)胞、胚和ES細(xì)胞而誘導(dǎo)分化細(xì)胞的重新編程，簡(jiǎn)便且再現(xiàn)性強(qiáng)地建立具有與ES細(xì)胞同樣的多能性和增殖能力的誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞的方法。
[0008]本
【發(fā)明者】為了解決上述的課題進(jìn)行了積極的研究，使用國(guó)際公開(kāi)W02005/80598中記載的核重新編程因子的篩選方法嘗試鑒定核重新編程因子。其結(jié)果是，發(fā)現(xiàn)了 24種候選作為與核重新編程相關(guān)的基因，確認(rèn)了它們中的3種基因是核重新編程所必需的基因。本發(fā)明是基于上述發(fā)現(xiàn)而完成的。
[0009]也就是，根據(jù)本發(fā)明，提供了一種體細(xì)胞的核重新編程因子，其含有下述3種基因:Oct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的各基因的產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方式，提供了含有下述3種基因:0ct3/4、Klf4和c-Myc的各基因的產(chǎn)物的上述因子。
[0010]而且，根據(jù)其它的優(yōu)選方式還提供了還含有下述基因:Sox家族基因的基因產(chǎn)物的上述因子，作為更優(yōu)選的方式，提供了含有Sox2的基因產(chǎn)物的上述因子。
[0011]而且，如果根據(jù)其它的優(yōu)選方式，提供了含有細(xì)胞因子，該細(xì)胞因子和Myc家族基因的基因產(chǎn)物共同存在、或代替Myc家族基因的基因產(chǎn)物。作為更優(yōu)選方式，提供了細(xì)胞因子為堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和/或干細(xì)胞因子(SCF)的上述因子。
[0012]如果根據(jù) 特別優(yōu)選的方式，提供了除Oct家族基因、Klf家族基因、Myc家族基因、和Sox家族基因的各基因的產(chǎn)物之外，還含有TERT基因的基因產(chǎn)物的體細(xì)胞的核重新編程因子；以及除了 Oct家族基因、Klf家族基因、Myc家族基因、Sox家族基因，和TERT基因的各基因的產(chǎn)物之外，還含有從由下述的基因:SV40大T抗原、HPV16E6、HPV16E7和Bmil構(gòu)成的組中選出的一種以上的基因產(chǎn)物的因子。
[0013]除了這些因子，還提供了進(jìn)一步含有選自于下組中的I種以上的基因的基因產(chǎn)物的上述的因子:Fbxl5、Nanog、ERas、ECAT15-2、Tcll 和 β -連環(huán)素(catenin)。
[0014]而且，如果根據(jù)上述發(fā)明的其它優(yōu)選方式，還提供了進(jìn)一步含有選自于下組中的I種以上的基因的基因產(chǎn)物的上述的因子，所述組為:ECAT1、EsgU Dnmt3L、ECAT8、Gdf3,Soxl5、ECAT15-l、Fthll7、Sall4、Rexl、UTFl、Stella、Stat3和 Grb2。
[0015]從其它的觀點(diǎn)出發(fā)，本發(fā)明提供了通過(guò)體細(xì)胞的核重新編程制備誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞的方法，該方法包括使上述的核重新編程因子與體細(xì)胞接觸的步驟。
[0016]如果根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方式，提供了包括在體細(xì)胞的培養(yǎng)物中添加上述的核重新編程因子的步驟的上述方法；包括在體細(xì)胞中導(dǎo)入編碼上述的核重新編程因子的基因的步驟的上述方法；包括使用含有至少I種以上的編碼上述核重新編程因子的基因的重組載體將該基因?qū)塍w細(xì)胞中的步驟的上述方法；和使用從患者中采集的體細(xì)胞作為體細(xì)胞的上述方法。
[0017]再?gòu)钠渌挠^點(diǎn)出發(fā)，本發(fā)明提供了由上述方法獲得的誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞。而且，本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)上述的誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞分化而得到的體細(xì)胞。
[0018]而且，根據(jù)本發(fā)明，還提供了一種干細(xì)胞療法，該方法包括將對(duì)誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)而獲得的體細(xì)胞移植到該患者中的步驟，所述誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞是通過(guò)使用從患者中分離和采集的體細(xì)胞用上述方法獲得的。
[0019]而且，本發(fā)明還提供了使用對(duì)由上述方法獲得的誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)而獲得的各種細(xì)胞來(lái)評(píng)價(jià)化合物、藥物、毒物等的生理作用和毒性的方法。
[0020]而且，本發(fā)明提供了一種改善細(xì)胞的分化能力和/或增殖能力的方法，該方法包括使上述的核重新編程因子與細(xì)胞接觸的步驟，以及提供了由上述方法獲得的細(xì)胞和對(duì)由上述方法獲得的細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)而得到的體細(xì)胞。
[0021]通過(guò)使用由本發(fā)明提供的核重新編程因子，不利用胚和ES細(xì)胞就可以簡(jiǎn)便且再現(xiàn)性強(qiáng)地誘導(dǎo)分化細(xì)胞核的重新編程，可以建立與ES細(xì)胞具有同樣的分化和多能性和增殖能力的未分化細(xì)胞-誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞。例如、使用本發(fā)明的核重新編程因子能夠由患者自身的體細(xì)胞制備具有高增殖能力和分化多能性的誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞，通過(guò)使該細(xì)胞分化而獲得的細(xì)胞(例如心肌細(xì)胞、胰島素產(chǎn)生細(xì)胞、或神經(jīng)細(xì)胞等)可以應(yīng)用于針對(duì)心力衰竭、胰島素依賴性糖尿病、帕金森病和脊髓損傷等多種疾病的干細(xì)胞移植療法中，由此可以回避使用人胚的倫理問(wèn)題以及移植后的排斥反應(yīng)，因此極為有用。而且，可以使誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞分化的各種細(xì)胞(例如心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等)，作為用于評(píng)價(jià)化合物、藥物、毒物等的藥效和毒性的系統(tǒng)極為有用。
附圖簡(jiǎn)述
[0022]圖1是表示使用在Fbx15基因中敲入了 β geo的小鼠的胎兒成纖維細(xì)胞(MEF)的重新編程因子的篩選方法的圖。
[0023]圖2是表示通過(guò)導(dǎo)入表1中所示的24個(gè)基因而獲得的iPS細(xì)胞的形態(tài)的照片。還顯示了分化細(xì)胞(MEF)和正常的胚胎干細(xì)胞(ES)的形態(tài)作為對(duì)照。
[0024]圖3是表示iPS細(xì)胞中標(biāo)記基因的表達(dá)的圖。顯示了以從iPS細(xì)胞、ES細(xì)胞和MEF細(xì)胞中提取的總RNA作為模板進(jìn)行RT-PCR獲得的結(jié)果。
`[0025]圖4是表示iPS細(xì)胞中DNA甲基化狀態(tài)的圖。對(duì)從iPS細(xì)胞、ES細(xì)胞、和MEF細(xì)胞提取的基因組DNA進(jìn)行亞硫酸鹽處理，對(duì)目的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，插入于質(zhì)粒。每個(gè)基因分離出10個(gè)克隆的質(zhì)粒，測(cè)定序列。甲基化CpG用黑點(diǎn)表示，非甲基化CpG用白點(diǎn)表示。
[0026]圖5是表示通過(guò)24個(gè)基因的群、和從24個(gè)基因的群中每次除去I個(gè)基因后的23個(gè)基因的群的導(dǎo)入獲得的G418細(xì)胞的克隆數(shù)的圖。圖下側(cè)表示G418選擇后一周內(nèi)獲得的集落數(shù)，圖上側(cè)表示3周內(nèi)獲得的集落數(shù)。當(dāng)除去用四方形圍起來(lái)的基因(基因的編號(hào)與表I所示的相同)時(shí)，完全沒(méi)有獲得集落，或是在3周后只發(fā)現(xiàn)少數(shù)集落。
[0027]圖6是表示通過(guò)10個(gè)基因的群、和從10個(gè)基因的群中每次除去I個(gè)基因后的9個(gè)基因的群的導(dǎo)入而獲得的G418細(xì)胞的集落數(shù)的圖。除了 #14、#15、或#20的各基因時(shí)一個(gè)集落都沒(méi)有獲得。當(dāng)除去#22的基因時(shí)，獲得了少數(shù)的G418抗性集落，但是細(xì)胞呈現(xiàn)出分化的形態(tài)，其明顯與iPS細(xì)胞不同。
[0028]圖7是表示由10個(gè)基因的群、4個(gè)基因的群、3個(gè)基因的群、或2個(gè)基因的群產(chǎn)生的G418抗性集落(重新編程集落)的出現(xiàn)數(shù)的圖。顯示了各集落的代表性形態(tài)及大小。
[0029]圖8是表示對(duì)將MEF來(lái)源的iPS細(xì)胞移植到裸鼠皮下形成的腫瘤進(jìn)行蘇木精一曙紅(H&E)染色的結(jié)果的照片。發(fā)現(xiàn)了三胚層系向各種組織的分化。
[0030]圖9是表示通過(guò)將成體皮膚成纖維細(xì)胞來(lái)源的iPS細(xì)胞移植到小鼠胚泡中，移植到假孕小鼠的子宮中制備的胎兒的照片。由上圖可知在左側(cè)的胎兒中來(lái)源于iPS細(xì)胞的細(xì)胞(發(fā)出綠色熒光)分布于全身。在下圖中清楚了同一胎兒的心臟、肝臟、脊髓的幾乎全部細(xì)胞為GFP陽(yáng)性，其源于iPS細(xì)胞。
[0031]圖10是表示通過(guò)RT-PCR確認(rèn)ES細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)的結(jié)果的照片。圖中，Sox2minus表示在MEF中導(dǎo)入3個(gè)基因而建立的iPS細(xì)胞，4ECAT表示在MEF中導(dǎo)入4個(gè)基因而建立的iPS細(xì)胞，10ECAT表示在MEF中導(dǎo)入10個(gè)基因而建立的iPS細(xì)胞，10ECAT皮膚成纖維細(xì)胞表示在皮膚成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入10個(gè)基因而建立的iPS細(xì)胞，ES細(xì)胞表示小鼠ES細(xì)胞，MEF表示沒(méi)有進(jìn)行基因?qū)氲腗EF細(xì)胞。其下的編號(hào)表示克隆編號(hào)。
[0032]圖11是表示在由MEF建立iPS細(xì)胞中bFGF的效果的圖。在常規(guī)的飼養(yǎng)細(xì)胞(ST0細(xì)胞)(左)和導(dǎo)入了 bFGF表達(dá)載體的STO細(xì)胞(右)上培養(yǎng)的Fbxl50ge°/ege°小鼠來(lái)源的MEF中通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入4個(gè)因子(上部分)或c-Myc以外的3個(gè)因子(下部分)。2周內(nèi)通過(guò)G418進(jìn)行選擇，經(jīng)晶體藍(lán)染色后，拍照。數(shù)字表示集落數(shù)。
[0033]圖12是對(duì)采用Nanog-EGFP-1RES-Puro小鼠的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行說(shuō)明的圖。A.分離在中心含有小鼠Nanog基因的大腸桿菌人工染色體(BAC)，在Nanog的編碼環(huán)形區(qū)域的上游通過(guò)重組插入EGFP-1RES-Puro盒。B.用改良的BAC制備轉(zhuǎn)基因小鼠。發(fā)現(xiàn)GFP的表達(dá)局限于胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)塊和生殖腺中。
[0034]圖13是表示對(duì)使用Nanog-EGFP-1RES-Puro小鼠的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行說(shuō)明的圖。從Nanog-EGFP-1RES-Puro小鼠的胎兒(受精后13.5日)中除去頭部、內(nèi)臟和生殖腺，建立MEF。用細(xì)胞分選器進(jìn)行分析的結(jié)果是，即使在Nanog-EGFP-1RES-Puro小鼠來(lái)源的MEF (Nanog)中，與Fbxl50ge°/ ege。小鼠來(lái)源的MEF (Fbxl5)和野生型小鼠來(lái)源的MEF (Wild)同樣，幾乎不存在GFP陽(yáng)性細(xì)胞。
[0035]圖14 是由 Nanog-EGFP-1RES-Puro 小鼠 MEF(左)和 Fbxl5ege°/fige。小鼠 MEF(右)建立的iPS細(xì)胞的照片。分別用嘌呤霉素和G418進(jìn)行選擇。
[0036]圖15是表示iPS細(xì)胞的增殖的結(jié)果的圖。表示將ES細(xì)胞、Nanog-EGFP-1RES-Puro小鼠MEF (左)來(lái)源的iPS細(xì)胞(Nanog iPS)和Fbx150 geo/0 geo小鼠MEF來(lái)源的iPS細(xì)胞(FbxiPS)各10萬(wàn)個(gè)分別接種于24孔板中，每3天進(jìn)行一次傳代，測(cè)定細(xì)胞數(shù)的結(jié)果。數(shù)字表示加倍時(shí)間的平均。
[0037]圖16是表示iPS細(xì)胞的基因表達(dá)的圖。用RT-PCR分析標(biāo)記基因在MEF、ES細(xì)胞、Nanog-EGFP-1RES-Puro 小鼠 MEF(左)來(lái)源的 iPS 細(xì)胞(Nanog iPS)和 Fbxl50geo/figeo 小鼠MEF來(lái)源的iPS細(xì)胞(Fbx iPS)中的表達(dá)。下面的數(shù)字表示傳代數(shù)。
[0038]圖17是表示由Nanog iPS細(xì)胞形成畸胎瘤的圖。顯示在裸鼠的背部皮下注射100萬(wàn)個(gè)ES細(xì)胞或Nanog iPS細(xì)胞，3周后產(chǎn)生的腫瘤的外觀(左)和組織圖像(右:H&E染色)。
[0039]圖18是表示用Nanog iPS細(xì)胞制備嵌合體小鼠的圖。將Nanog iPS細(xì)胞(克隆NPMF4EK-24，傳代數(shù)6)移植于胚泡中，誕生出嵌合體小鼠。由90個(gè)移植胚誕生出4只嵌合體小鼠。
[0040]圖19是表示由Nanog iPS細(xì)胞出發(fā)的種系傳遞(germline transmission)的圖。對(duì)通過(guò)圖18所示的嵌合體小鼠與C57BL/6小鼠的交配所誕生的小鼠進(jìn)行基因組DNA的PCR分析時(shí)，根據(jù)在所有的小鼠中存在0ct3/4和Klf4的轉(zhuǎn)基因，確認(rèn)了種系傳遞。
[0041]圖20是表示由iPS細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)的圖。顯示由來(lái)源于皮膚成纖維細(xì)胞的iPS細(xì)胞在體外分化成的神經(jīng)細(xì)胞(上:β III微管蛋白陽(yáng)性)、寡突膠質(zhì)細(xì)胞(左:04陽(yáng)性)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(右:GFAP陽(yáng)性)。
[0042]圖21是表示對(duì)不使用藥物選擇的iPS細(xì)胞的建立進(jìn)行說(shuō)明的圖。在每個(gè)IOcm皿中接種I萬(wàn)至10萬(wàn)個(gè)MEF，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入4個(gè)因子。對(duì)照(Mock)中沒(méi)有產(chǎn)生集落(左)，而導(dǎo)入了 4個(gè)因子的皿中，除了扁平的轉(zhuǎn)化集落，還獲得了與膨脹的iPS細(xì)胞相類似的集落(中央)。一旦將這些細(xì)胞傳代培養(yǎng)，就獲得了與iPS細(xì)胞相類似的細(xì)胞(右)。
[0043]圖22是表示通過(guò)無(wú)藥物篩選建立的細(xì)胞的基因表達(dá)的圖。從圖21中所示的建立的細(xì)胞中提取RNA，用RT-PCR分析ES細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)。
[0044]圖23是表示人成纖維細(xì)胞來(lái)源的iPS細(xì)胞樣細(xì)胞的圖。顯示了通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒將4個(gè)因子的人同源基因?qū)胗谌颂簛?lái)源的成纖維細(xì)胞中而獲得的集落(左)、和2次傳代后的細(xì)胞(右)。
[0045]圖24是表示由人成體皮膚成纖維細(xì)胞建立iPS細(xì)胞的圖。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒將左邊部分所示的因子導(dǎo)入到用慢病毒感染了小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒受體的人成體皮膚成纖維細(xì)胞中。照片表示病毒感染后第8天的相位差圖像(物鏡X 10)。
[0046]用于實(shí)施發(fā)明的最佳方式
[0047]本發(fā)明的核重新編程因子的特征在于含有下述3種基因:0ct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的各基因的產(chǎn)物，在優(yōu)選方式中，特征在于除了上述的3種基因之外還含有Sox家族基因的基因產(chǎn)物。
[0048]作為確認(rèn)本發(fā)明的核重新編程因子的方法，可以利用例如、國(guó)際公開(kāi)W02005/80598中記載的核重新編程因子的篩選方法。通過(guò)參照上述出版物的所有公開(kāi)的內(nèi)容，包含于本說(shuō)明書的公開(kāi)內(nèi)容中。本領(lǐng)域人員參照上述出版物篩選核重新編程因子，可以確認(rèn)本發(fā)明的重新編程因子的存在和作`用。
[0049]例如,可以利用Fbxl5基因座中敲入了 Pgeo ( β半乳糖苷酶和新霉素抗性基因的融合基因)的小鼠作為容易觀察重新編程現(xiàn)象的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。詳細(xì)內(nèi)容示于本說(shuō)明書的實(shí)施例中。小鼠Fbxl5基因是在ES細(xì)胞和早期胚等的分化多能性細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因。在小鼠Fbxl5基因中敲入Pgeo的且缺失Fbxl5的功能的同源變異小鼠中，通常沒(méi)有觀察到包括分化多能性或發(fā)生在內(nèi)的異常的表現(xiàn)型。在該小鼠中，Pgeo受到Fbxl5基因的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的表達(dá)控制，Pgeo在分化的體細(xì)胞中不表達(dá)，顯示出對(duì)G418的敏感性。另一方面，敲入了 β geo的同源變異ES細(xì)胞顯示出對(duì)極高濃度(12mg/ml以上)的G418的抗性。利用該現(xiàn)象，可以構(gòu)建使體細(xì)胞的重新編程可視化的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。
[0050]利用上述實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，可以首先從敲入了 Pgeo的同源變異小鼠的胎兒(受精后13.5天)中分離成纖維細(xì)胞(Fbxl50ge°/ege°的MEF)。由于MEF不表達(dá)Fbxl5基因，因此也不表達(dá)β geo，表現(xiàn)出對(duì)G418的敏感性。可是，一旦該MEF與沒(méi)有進(jìn)行基因操作的ES細(xì)胞(仍然呈現(xiàn)對(duì)G418的敏感性)相融合，MEF的核進(jìn)行重新編程的結(jié)果是，表達(dá)β geo而形成G418抗性。因此，通過(guò)利用該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，可以置換成G418抗性使重新編程現(xiàn)象可視化。
[0051]可以使用上述的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)選擇核重新編程因子。作為與核重新編程因子相關(guān)的基因的候選物，選擇出多個(gè)顯示出在ES細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因和提示在ES細(xì)胞的分化多能性維持中起重要作用的基因，通過(guò)這些候選物單獨(dú)或適當(dāng)組合可以確認(rèn)是否引出核重新編程。例如，通過(guò)組合所有的選擇出的初次候選物，確認(rèn)可以將分化細(xì)胞重新編程誘導(dǎo)至接近ES細(xì)胞的狀態(tài)后、制備從前述組合中每次除去I個(gè)基因的組合，確認(rèn)同樣的作用，可以選擇該基因不存在時(shí)重新編程誘導(dǎo)能力減弱，或重新編程誘導(dǎo)能力喪失的二次候選物。對(duì)于這樣選擇出的二次候選物，通過(guò)重復(fù)同樣的步驟，可以選擇出必需的核重新編程基因的組合，可以確認(rèn)Oct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的3種基因的基因產(chǎn)物的組合作為核重新編程因子起作用，除了這3種基因的基因產(chǎn)物，還可以確認(rèn)Sox家族基因的基因產(chǎn)物的組合作為核重新編程因子具有極好的性質(zhì)。核重新編程因子的選擇方法的具體例子具體示于本說(shuō)明書的實(shí)施例中，本領(lǐng)域技術(shù)人員參照上述的一般的說(shuō)明和實(shí)施例的具體性說(shuō)明可以容易地確認(rèn)這3種基因的組合誘導(dǎo)體細(xì)胞的重新編程，和這3種基因產(chǎn)物的組合對(duì)于核重新編程是必需的。
[0052]由本發(fā)明提供的核重新編程因子至少含有Oct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的基因產(chǎn)物的組合，包括例如0ct3/4、Klf4和c-Myc這3種基因的基因產(chǎn)物的組合。作為Oct家族基因，可以例舉例如0ct3/4、0ctlA和0ct6等。0ct3/4是屬于POU家族的轉(zhuǎn)錄因子，據(jù)報(bào)道其是未分化標(biāo)記(K.0kamoto等，Cell, 60，pp461-72，1990)。而且，還有報(bào)告指出0ct3/4與多能性維持相關(guān)(J.Nichols等，Cell, 95，pp379_91，1998)。作為Klf家族基因，可以例舉 Klfl、Klf2、Klf4 和 Klf5 等。據(jù)報(bào)道 Klf4 (Kruppel like factor-4)是腫瘤抑制因子(A.M.Ghaleb等，Cell Res.，15，pp92_6，2005)。作為Myc家族基因，可以例舉c-Myc>N-Myc和L-Myc等。有報(bào)道指出c_Myc是與細(xì)胞的分化和增殖相關(guān)的轉(zhuǎn)錄控制因子(S.Adhikary, M.Eilers, Nat.Rev.Mol.Cell Biol.，6，pp635_45, 2005)，且與多能性維持相關(guān)(P.Cartwright 等,Development, 132, pp885_96, 2005)。0ct3/4、Klf4 和 c-Myc 以外的各家族基因的NCBI登錄號(hào)如下所示。
[0053]表1
[0054]小鼠人
[0055]
【權(quán)利要求】
1.制備誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞的方法，其包括下述步驟(1) - (3): (I)從下面選擇基因的組合: (1)在胚胎干細(xì)胞表現(xiàn)出特異性或者聞表達(dá)的基因； (ii)編碼由fct信號(hào)或LIF信號(hào)激活的因子的基因； (iii)在胚胎干細(xì)胞的分化多能性維持中起重要作用的基因；和 (iv)上述基因的豕族基因； 其中，當(dāng)將所述的基因的組合導(dǎo)入到體細(xì)胞的時(shí)候，該基因的組合造成內(nèi)源性O(shè)ct3/4基因、Nanog基因在體細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)； (2)將步驟(1)中選擇的基因的組合導(dǎo)入到體細(xì)胞中，并且 (3)培養(yǎng) 步驟(2)獲得的細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N5/074GK103773804SQ201410006027
【公開(kāi)日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2006年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2005年12月13日
【發(fā)明者】山中伸彌 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人京都大學(xué)