專利名稱：一種篩選酸性浸礦體系中新基因的宏基因組芯片及其篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從酸性浸礦微生物群落中快速篩選新穎基因的宏基因組芯片及篩選方法。
背景技術(shù)：
酸性浸礦體系中，浸礦微生物群落通過氧化分解礦物使金屬離子進(jìn)入溶液。了解浸礦微生物群落的代謝調(diào)控與浸出過程的關(guān)系，發(fā)掘關(guān)鍵代謝途徑相關(guān)的新穎基因有助于提高微生物冶金的效率。利用傳統(tǒng)方法研究微生物的代謝調(diào)控或者功能基因，必須先分離純化微生物，然后通過形態(tài)觀察或生理生化檢測(cè)分析其代謝調(diào)控方式。新基因的研究，則要通過體外表達(dá)和酶學(xué)測(cè)定確定其功能特性。然而，極端酸性浸礦體系中的大部分微生物難以分離純化培養(yǎng)，利用傳統(tǒng)的方法難以開展代謝調(diào)控和基因功能的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過構(gòu)建酸性浸礦微生物群落宏基因組大片段文庫(kù)，提供一種宏基因組基因芯片，以及利用該芯片快速篩選宏基因組文庫(kù)中的新穎目標(biāo)基因的方法，從而獲得不能分離純化培養(yǎng)的微生物的遺傳基因信息，解決傳統(tǒng)方法無法分析未分離純化培養(yǎng)微生物遺傳和代謝調(diào)控特性的難題。一種篩選酸性浸礦體系中新基因的宏基因組芯片，是由以下方式構(gòu)建的:利用德興酸性礦坑廢水中微生物群落的總DNA構(gòu)建大片段的宏基因組文庫(kù)，以宏基因組文庫(kù)中提取的7776個(gè)fosmid質(zhì)粒為探針，將探針通過基因芯片點(diǎn)樣儀打印在玻片表面，打印后的宏基因組芯片在室溫下干燥過夜，最后使用紫外交聯(lián)儀照射下進(jìn)行交聯(lián)即可。具體包括以下步驟:采用0.2 iim的尼龍膜過濾酸性浸礦體系中的酸性浸出液，得到生物質(zhì)富集物，液氮研磨法提取微生物群落總DNA，然后利用200 ill的小槍頭進(jìn)行切割，將總DNA修剪成40-50Kb的隨機(jī)的大片段；通過DNA的末端修飾使其末端成為兩條鏈平齊的鈍末端，利用DNA快速連接酶將DNA大片段與CopyControl pCClFOS Vector質(zhì)粒(Epicentre)連接起來構(gòu)建重組的fosmid質(zhì)粒；然后將重組的fosmid質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到EPI300_T1K Plating大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(Epicentre);將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌細(xì)胞液均勻地涂布在含有氯霉素的LB培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆子構(gòu)成含有7776個(gè)克隆子的宏基因組文庫(kù)；每個(gè)克隆子中都含有一段40-50Kb的插入DNA片段，利用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)宏 基因組文庫(kù)中的克隆子，使重組fosmid質(zhì)粒在細(xì)胞中的拷貝數(shù)達(dá)到至少50個(gè)，然后提取宏基因組文庫(kù)中每個(gè)克隆子的fosmid質(zhì)粒，用紫外吸收法測(cè)定質(zhì)粒的濃度，調(diào)節(jié)濃度為50ng/ u I儲(chǔ)存；將10 ill的fosmid DNA與40%的二甲基亞砜按體積1:1的比例混合，用芯片點(diǎn)樣儀，在相對(duì)濕度為50-55%的條件下將fosmid DNA樣品打印在硅化玻片表面；樣品點(diǎn)之間的距離為250 ym，打印好的芯片室溫干燥過夜后紫外照射使核酸分子與玻片交聯(lián)固定。將探針在芯片上排列成18行36列的亞矩陣，共排列26個(gè)亞矩陣，每個(gè)探針在芯片上有2個(gè)陣列重復(fù)。所述的酸性浸礦體系為江西德興銅礦的酸性浸礦體系。利用上述的宏基因組芯片篩選浸礦體系微生物群落中的新基因的方法，包括以下步驟:PCR擴(kuò)增待篩選目標(biāo)基因并進(jìn)行熒光標(biāo)記:將經(jīng)標(biāo)記后的PCR產(chǎn)物與宏基因組芯片雜交，獲取陽(yáng)性雜交信號(hào)數(shù)據(jù)，通過PCR驗(yàn)證，然后通過測(cè)序?qū)?yīng)宏基因組文庫(kù)中的克隆子得到目標(biāo)基因的完整序列信息。與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明芯片及方法能夠快速的篩選目標(biāo)基因，提高了基因文庫(kù)的利用效率，避免了重復(fù)建庫(kù)篩選文庫(kù)利用率低的弊端。同時(shí)，這種方法不要求微生物必須是純培養(yǎng)物，所以可以有效地篩選到未分離純化微生物的新穎基因。


圖1為16sRNA基因宏基因組雜交結(jié)果；圖2為宏基因組芯片質(zhì)粒濃度與信號(hào)關(guān)系；圖3為SAOR基因PCR擴(kuò)增電泳圖；圖4為SAOR不同基因型在群落中所占比例；圖5為SAOR基因宏 基因組芯片掃描圖；圖6為德興銅礦浸礦水中的細(xì)菌微生物SAOR基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。實(shí)施例1宏基因組文庫(kù)的制備尼龍膜(0.2 Pm)過濾江西德興銅礦酸性浸礦體系中的酸性浸出液，得到生物質(zhì)富集物，液氮研磨法提取微生物群落總DNA，然后利用200 u I的小槍頭進(jìn)行切割，將總DNA修剪成40-50Kb的隨機(jī)的大片段。通過DNA的末端修飾使其末端成為兩條鏈平齊的鈍末端，利用DNA連接酶將DNA大片段與CopyControl pCClFOS Vector質(zhì)粒連接起來。然后將重組的fosmid質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到EPI300-T1k Plating大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌細(xì)胞液均勻地涂布在含有氯霉素的LB培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆子構(gòu)成含有7776個(gè)克隆子的宏基因組文庫(kù)。每個(gè)克隆子中都含有一段40Kb左右的插入DNA片段，所以宏基因組文庫(kù)中所有序列信息可以達(dá)到240Mb。這樣的一個(gè)數(shù)據(jù)量可以對(duì)酸性浸礦體系微生物群落中各種豐度的微生物達(dá)到一個(gè)比較好的覆蓋，有利于新穎基因的篩選。宏基因組芯片的制備利用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)宏基因組文庫(kù)中的克隆子，使重組fosmid質(zhì)粒在細(xì)胞中的拷貝數(shù)達(dá)到較高水平(至少50個(gè)以上)，然后提取宏基因組文庫(kù)中每個(gè)克隆子的fosmid質(zhì)粒，用紫外吸收法測(cè)定質(zhì)粒的濃度，調(diào)節(jié)濃度為50ng/iil儲(chǔ)存。將IOiU的fosmid DNA與40%的二甲基亞砜按1:1的比例混合，用芯片點(diǎn)樣儀，在相對(duì)濕度為50-55%的條件下將fosmidDNA樣品打印在硅化玻片表面。樣品點(diǎn)之間的距離為250 iim，所有7776個(gè)樣品在芯片上排布成26個(gè)18行36列的亞陣列，每個(gè)樣品點(diǎn)在芯片上兩個(gè)重復(fù)，其余為空白對(duì)照樣。打印好的芯片室溫干燥過夜后紫外照射使核酸分子與玻片交聯(lián)固定。芯片雜交以前，先將其浸A 95°C熱水2分鐘中對(duì)DNA變性處理，在95%的酒精中浸洗5次，室溫下空氣干燥，貯存在室溫及黑暗條件下備用。PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因與熒光標(biāo)記通過生物信息學(xué)分析感興趣的目標(biāo)基因序列的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)通用引物，采用下列反應(yīng)體系進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增:1 倍 Taq 酶緩沖液(IOmM Tris-Cl [pH=9.9] ；1.5mM MgCl2 ；50mMKCl 以及 0.l%TritonX-100)；20mM dNTPs ；IOOpmol 引物，Ing 提取的微生物群落總 DNA。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C變性4分種；接著是在下列條件下進(jìn)行32循環(huán)的放大:94°C變性45秒，55°C退火45秒，72°C延伸I分鐘；最后，在72°C延伸10分鐘，4°C恒溫保存。用瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小及專一性。將PCR產(chǎn)物提純。當(dāng)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)記時(shí)，500ng的DNA與1.5 y g六聚體堿基隨機(jī)引物混合(25iiL)，在95°C下變性2min，迅速在冰上冷卻。變性的DNA溶液與15 y L標(biāo)記反應(yīng)液混合，標(biāo)記反應(yīng)液的成分如下:5mmol/L dATP, dTTP, dGTP 和 2.5mmol/L dCTP;lmmol/LCy3-dCTP (熒光綠，激發(fā)波長(zhǎng)520nm ;發(fā)射波長(zhǎng)55(T600nm)或者Cy5_dCTP (熒光紅，激發(fā)波長(zhǎng)647nm ;發(fā)射波長(zhǎng)660 705鹽)；2.5mmol/L 二硫蘇糖醇(DIT) ；10U Klenow大片斷DNA聚合酶I (Invitrogen, Calsbad, CA)。反應(yīng)混合物(40 y L)在37°C下孵化2h，在100°C加熱板上變性3min，置于冰上迅速冷卻。隨后將標(biāo)記的DNA用QIAquick PCR純化柱進(jìn)行純化，純化液于40°C下濃縮lh，用適量的dH20將濃縮的標(biāo)記DNA重新溶解。宏基因組芯片雜交與 圖像和數(shù)據(jù)處理標(biāo)記好的DNA中加入芯片雜交溶液，成分如下:20ii I標(biāo)記DNA，65ii 150%的甲酰胺，19.5iU20XSSC，3.9iU10%的十二烷基磺酸鈉，9.1iil的未標(biāo)記的青魚精子DNA，
1.1 ill的DTT。配制好的雜交液98°C溫浴3分鐘，然后置于65°C備用。利用HS4800Pro雜交工作站進(jìn)行芯片雜交，雜交溫度48°C。雜交后的宏基因組芯片在分辨率5 下對(duì)基因芯片進(jìn)行掃描。激發(fā)光源為綠色HeNe或紅色HeNe (分別確定于所使用的熒光素Cy3或Cy5)，熒光素所發(fā)射的熒光由光電倍增管(PMT)在 570nm(Cy3)或 670nm(Cy5)進(jìn)行探測(cè)。對(duì)掃描獲得的圖像中的每一個(gè)雜交點(diǎn)的光素密度(或強(qiáng)度)進(jìn)行定量分析。將一個(gè)用來定義陣列中每一個(gè)DNA雜交點(diǎn)的圓圈疊加在圖像上，用以確定每一個(gè)被定量分析的熒光點(diǎn)。將每一熒光點(diǎn)所獲得的平均熒光強(qiáng)度作為其信號(hào)強(qiáng)度值，局部背景信號(hào)被自動(dòng)地從每一單獨(dú)的熒光點(diǎn)雜交信號(hào)中減去；同時(shí)，從每一個(gè)雜交信號(hào)值中減去所有人類基因(陰性對(duì)照)熒光強(qiáng)度的平均值，作為雜交強(qiáng)度最后的定量值。軟件識(shí)別并標(biāo)記質(zhì)量不好的熒光點(diǎn)。根據(jù)下列公式計(jì)算信號(hào)干擾率(Signal-to-Noise Ratio, SNR):SNR=(信號(hào)強(qiáng)度值-背景信號(hào)值)/背景標(biāo)準(zhǔn)偏差，通常將SNR=3定為信號(hào)強(qiáng)度最小閾值，并將小于最小閾值的雜交點(diǎn)從數(shù)據(jù)集中去掉。對(duì)于SNR值大于3的雜交點(diǎn)認(rèn)定為陽(yáng)性雜交點(diǎn)，利用PCR檢驗(yàn)后，進(jìn)行DNA測(cè)序，從而得到目標(biāo)基因完整的序列信息。通過生物信息學(xué)分析，在40Kb的DNA大片段上定位目標(biāo)基因序列和與其相鄰的基因序列，并注釋生物學(xué)信息，推斷目標(biāo)基因可能的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)位置。實(shí)施例2宏基因組芯片雜交特異性和靈敏度探索設(shè)計(jì)16s RNA 通用引物(正向引物 27F5' -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3';反向引物1492R5' -GGYTACCTTGTTACGACTT-3')，以德興樣品總DNA為模板PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物分別用Cy3或Cy5熒光染料標(biāo)記，與宏基因組芯片在雜交儀中雜交。雜交之前，芯片放入95°C去離子水中煮2分鐘，然后迅速拿出并放入無水乙醇中反復(fù)拿出5次，晾干，備用。雜交溫度為48°C，探針濃度50ng時(shí)，雜交點(diǎn)飽滿圓潤(rùn)，信噪比及特異性效果良好，結(jié)果見圖1。探針濃度為50ng — 250ng/iil時(shí)，信噪比與探針濃度成正相關(guān)。結(jié)果如圖2所示。實(shí)施例3宏基因組芯片篩選新功能基因的應(yīng)用利用宏基因組芯片來獲取一些感興趣且未培養(yǎng)細(xì)菌的基因。挑選亞硫酸鹽受體氧化還原酶(SAOR)基因的YedY亞基，從數(shù)據(jù)庫(kù)中下載同源序列，比對(duì)后設(shè)計(jì)通用引物(正向引物 5' -CTACAACAACTTCTACGAATTC-3';反向引物 5' -CACGTTGGAATAGAAGCC-3')，然后將德興銅礦中獲得的總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物片段約為500bp (圖3)。為驗(yàn)證樣品中細(xì)菌含有的SAOR基因類型，構(gòu)建其克隆文庫(kù)并進(jìn)行RFLP分析，發(fā)現(xiàn)8種不同的基因型，各基因型的比例各不相同，以Acidiphilium-1ike為最多高達(dá)59%，其次是 Azotobacter-1ike 和 chromobacterium-like,分別占 13% 和 10% (圖 4)。將SAOR基因的PC R產(chǎn)物純化后熒光標(biāo)記，與芯片雜交，獲得陽(yáng)性信號(hào)點(diǎn)(圖5)。挑選圓潤(rùn)光滑、信號(hào)清晰，信噪比5以上的6個(gè)雜交點(diǎn):2295，2478，5046，5378，7040和2800分析。取出相應(yīng)的保存質(zhì)粒，擴(kuò)增后測(cè)序得知其中的四種為Acidiphilium菌屬,而2800則為一未知菌屬。將其序列做系統(tǒng)發(fā)育樹分析(圖6)，發(fā)現(xiàn)其基因大致分為三個(gè)組，第一組在總樣品中含量較少，只占21%比例，他們與Deinococcus菌屬相近，但其相似度也只有75%左右，而第二組則與Acidiphilium相近，且相似度極高，達(dá)95%以上，可初步斷定就是為Acidiphilium。而且其所占比例也高達(dá)59%。第三組出現(xiàn)的比例為20%，且與其他菌屬的相似度不高，不到70%。通過454焦磷酸測(cè)序，獲得未知菌屬2800克隆子fosmid的完整序列，其中SAOR基因的完整氨基酸序列如下:MTTRIPRIAPSEITPPETYFNRRAFLSAALAAGAGAAVVPAAAGAPLQYRYDAADSVAALVHAPDQDETPNTffEQ I THYNNFYEFGTGKGDPARYAGELQTRPWNLTVAGEAEVTGSFPLEKFLNPYALEERIYRFRCVEAWSMVIPWVGFPLAALLKQFKPTSRAKYVTFETLYRPSQMPGQRVPILKWPYLEGLRIDEAMNPLAFMVVGLYGRVLPNQNGAPLRLIVPWKYGFKSIKSIVRIAFTEQQPETTWSLAAPNEYGFYANVNPQVPHPRWSQASERRIGASLFHERQATLMFNGYAHEVAYLYKGMNLHKYF
權(quán)利要求
1.一種篩選酸性浸礦體系中新基因的宏基因組芯片，其特征在于，是由以下方式構(gòu)建的: 利用德興酸性礦坑廢水中微生物群落的總DNA構(gòu)建大片段的宏基因組文庫(kù)，以宏基因組文庫(kù)中提取的7776個(gè)fosmid質(zhì)粒為探針，將探針通過基因芯片點(diǎn)樣儀打印在玻片表面，打印后的宏基因組芯片在室溫下干燥過夜，最后使用紫外交聯(lián)儀照射下進(jìn)行交聯(lián)即可。
2.如權(quán)利要求1所述的宏基因組芯片，其特征在于:構(gòu)建具體包括以下步驟: 采用0.2pm的尼龍膜過濾酸性浸礦體系中的酸性浸出液，得到生物質(zhì)富集物，液氮研磨法提取微生物群落總DNA，然后利用200 u I的小槍頭進(jìn)行切割，將總DNA修剪成40_50Kb的隨機(jī)的大片段；通過DNA的末端修飾使其末端成為兩條鏈平齊的鈍末端，利用DNA快速連接酶將DNA大片段與CopyControl pCClFOS Vector質(zhì)粒連接起來構(gòu)建重組的fosmid質(zhì)粒；然后將重組的fosmid質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 EPI300-T1k Plating大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌細(xì)胞液均勻地涂布在含有氯霉素的LB培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆子構(gòu)成含有7776個(gè)克隆子的宏基因組文庫(kù)；每個(gè)克隆子中都含有一段40-50Kb的插入DNA片段； 利用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)宏基因組文庫(kù)中的克隆子，使重組fosmid質(zhì)粒在細(xì)胞中的拷貝數(shù)達(dá)到至少50個(gè)，然后提取宏基因組文庫(kù)中每個(gè)克隆子的fosmid質(zhì)粒，測(cè)定質(zhì)粒的濃度，調(diào)節(jié)其濃度為50ng/ u I儲(chǔ)存；將10 ill的fosmid DNA與40%的二甲基亞砜按體積1:1的比例混合，用芯片點(diǎn)樣儀，在相對(duì)濕度為50-55%的條件下將fosmid DNA樣品打印在硅化玻片表面；樣品點(diǎn)之間的距離為250 ym，打印好的芯片室溫干燥過夜后紫外照射使核酸分子與玻片交聯(lián)固定。
3.如權(quán)利要求2所述的宏基因組芯片，其特征在于:將探針在芯片上排列成18行36列的亞矩陣，共排列26個(gè)亞矩陣，每個(gè)探針在芯片上有2個(gè)陣列重復(fù)。
4.如權(quán)利要求1所述的宏基因組芯片，其特征在于:所述的酸性浸礦體系為江西德興銅礦的酸性浸礦體系。
5.利用權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的宏基因組芯片篩選浸礦體系微生物群落中的新基因的方法，其特征在于，包括以下步驟=PCR擴(kuò)增待篩選目標(biāo)基因并進(jìn)行熒光標(biāo)記:將經(jīng)標(biāo)記后的PCR產(chǎn)物與宏基因組芯片雜交，獲取陽(yáng)性雜交信號(hào)數(shù)據(jù)，通過PCR驗(yàn)證，然后通過測(cè)序?qū)?yīng)宏基因組文庫(kù)中的克隆子得到目標(biāo)基因的完整序列信息。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩選酸性浸礦體系中新基因的宏基因組芯片及其篩選方法。該方法構(gòu)建了由7776個(gè)含有浸礦體系微生物群落DNA大片段的fosmid質(zhì)粒組成的基因芯片，通過芯片與待篩選目標(biāo)基因PCR產(chǎn)物雜交，篩選到未分離純化培養(yǎng)的微生物的功能基因。與基于功能表達(dá)篩選基因的傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明極大地提高了克隆文庫(kù)的利用效率。同時(shí)，這一新方法也為研究利用未分離純化培養(yǎng)的微生物遺傳和代謝提供了一條可行的途徑。
文檔編號(hào)C40B50/14GK103103272SQ201310028300
公開日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月25日
發(fā)明者劉學(xué)端, 邱冠周, 覃文慶, 梁伊麗, 尹華群, 郭雪, 申麗, 劉新星 申請(qǐng)人:中南大學(xué)