專(zhuān)利名稱(chēng)：異常線粒體dna、相關(guān)的融合轉(zhuǎn)錄物及其雜交探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及線粒體基因組領(lǐng)域。在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及線粒體基因組融合 轉(zhuǎn)錄物和雜交至所述線粒體基因組融合轉(zhuǎn)錄物的探針的鑒定和使用。
背景技術(shù)：
線粒體基因組線粒體基因組是緊湊但卻至關(guān)重要的核酸序列。與33億核酸堿基對(duì)(bp)的龐 大核基因組(單倍體)相反，線粒體DNA或“mtDNA”包含16,569個(gè)bp的小基因組 (Anderson等人，1981 ； Andrews等人，1999)。其遺傳互補(bǔ)體比核細(xì)胞配對(duì)物小得多 (0.0005% )0然而，個(gè)體細(xì)胞帶有IO3至IO4中任意數(shù)目的線粒體，這取決于特定的細(xì)胞 功能(Singh和Modica-Napolitano 2002)。在細(xì)胞核和線粒體基因組之間一般存在通訊或 化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Sherratt等人，1997)。而且，特定的細(xì)胞核組分負(fù)責(zé)線粒體序列的維持和 完整性(Croteau等人，1999)。一旦發(fā)生受精，由于卵細(xì)胞中線粒體的克隆擴(kuò)充，給定個(gè) 體中所有mtDNA基因組是相同的。然而，誘變事件可引起反映為體細(xì)胞突變的序列多樣 性。這些突變可在全身的不同組織中在已知為異質(zhì)性的條件下累積。線粒體蛋白質(zhì)組需要約3,000種核基因來(lái)構(gòu)建、操作和維持線粒體，其中只有37種由線粒體基 因組編碼，這表明了線粒體對(duì)核基因座的嚴(yán)重依賴(lài)。線粒體基因組編碼24個(gè)基因的互 補(bǔ)體，包括確保對(duì)于電子轉(zhuǎn)移來(lái)說(shuō)重要的其它13個(gè)基因的正確翻譯的2個(gè)rRNA和22個(gè) tRNA(參見(jiàn)

圖1)。除了 13種由線粒體基因組供應(yīng)的多肽，線粒體基因組依賴(lài)于70種核 編碼蛋白以完成對(duì)于該重要功能而言必需的氧化和還原反應(yīng)。核和線粒體蛋白形成跨越 內(nèi)線粒體膜的復(fù)合體，并且總體上產(chǎn)生80-90%的細(xì)胞代謝所需要的化學(xué)燃料腺苷三磷酸 或ATP。除了產(chǎn)生能量，線粒體在其他代謝途徑中也起到了重要作用。線粒體的重要功 能是介導(dǎo)細(xì)胞死亡或凋亡(參見(jiàn)Green和Kroemer，2005)。實(shí)質(zhì)上，存在滲透外線粒體 膜或另外也滲透內(nèi)線粒體膜的信號(hào)途徑。當(dāng)特定的線粒體蛋白釋放到細(xì)胞溶膠中時(shí)，啟 動(dòng)了不可逆的細(xì)胞死亡。該過(guò)程強(qiáng)調(diào)了一些線粒體蛋白具有的多功能作用。這些多任務(wù) (multi-tasking)蛋白表明還存在其他可具有替換功能的線粒體蛋白。線粒體融合轉(zhuǎn)錄物組線粒體基因組是不同尋常的，因?yàn)槠涫黔h(huán)狀無(wú)內(nèi)含子DNA分子。所述基因組散 布有在特定長(zhǎng)度的序列側(cè)翼的重復(fù)模體。這些重復(fù)模體之間的序列易于在未被充分理解 的情況下缺失?？紤]到線粒體基因組中的重復(fù)模體的數(shù)量，存在許多可能的缺失。最有 名的例子是4977 “常見(jiàn)缺失”。該缺失和一些據(jù)稱(chēng)的病癥與疾病相關(guān)，并且被認(rèn)為增加 衰老的頻率(Dai 等人，2004; Ro 等人，2003; Barron 等人，2001; Lewis 等人，2000; Muller-Hocker, 1998 ； Porteous等人，1998)(圖4)。在線粒體基因組領(lǐng)域中目前的觀點(diǎn) 是線粒體缺失物只是通過(guò)諸如反應(yīng)性氧物質(zhì)之類(lèi)的試劑和UVR損害線粒體基因組的有害 的副產(chǎn)物(Krishnan等人，2008，Nature Genetics)。此外，盡管認(rèn)識(shí)到由于缺少細(xì)胞修復(fù)所必需的基因序列，因此高水平的mtDNA缺失可對(duì)于細(xì)胞產(chǎn)生ATP形式的能量的能量產(chǎn) 生嚴(yán)重的后果，但是沒(méi)有預(yù)期到這些缺失的線粒體分子可以是下游途徑的組分，具有期 望的功能作用，并且可能可以更適合被認(rèn)為是本申請(qǐng)人已經(jīng)預(yù)期的的線粒體的識(shí)別的基 因的替換天然形式。mtDNA的序列動(dòng)力學(xué)是重要的診斷工具。mtDNA中的突變通常是正在發(fā)生的 疾病的初步指示物。例如，已經(jīng)證實(shí)線粒體基因組中的點(diǎn)突變是前列腺中的腫瘤病灶的 特征。這種趨勢(shì)還延伸至和腫瘤組織相鄰與遠(yuǎn)離的表現(xiàn)正常的組織(Parr等人，2006)。 這表明線粒體突變?cè)趷盒赞D(zhuǎn)化途徑早期發(fā)生。例如，3.4kb線粒體缺失的頻率在識(shí)別良性和惡性前列腺組織中具有優(yōu)異的實(shí)用 性(Maki 等人，2008)。線粒體融合轉(zhuǎn)錄物之前在文獻(xiàn)中首先在大豆中報(bào)道過(guò)(Morgens等人，1984)， 然后在患有Keams-Sayre綜合癥(罕見(jiàn)的神經(jīng)肌肉障礙)的兩個(gè)患者中報(bào)道過(guò)(Nakase等 人，1990)。重要地，這些轉(zhuǎn)錄物未被發(fā)現(xiàn)和任何人的癌癥相關(guān)(或未對(duì)于和任何人類(lèi)癌 癥的相關(guān)進(jìn)行研究)。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供異常線粒體DNA、及其相關(guān)的融合轉(zhuǎn)錄物和雜交探針。依照本發(fā)明的方面，提供一種和癌癥相關(guān)的分離的線粒體融合轉(zhuǎn)錄物。依照本發(fā)明的方面，提供一種線粒體融合蛋白，其對(duì)應(yīng)于上述融合轉(zhuǎn)錄物，并 且具有SEQ ID NO 34至49和52中的任一者所闡述的序列。依照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種編碼本發(fā)明的融合轉(zhuǎn)錄物的分離的 mtDNA ο依照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種雜交探針，其具有和本發(fā)明的線粒體融合 轉(zhuǎn)錄物或者mtDNA中的至少一部分互補(bǔ)的核酸序列。依照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種檢測(cè)哺乳動(dòng)物中的癌癥的方法，該方法包 括通過(guò)使樣品和至少一種雜交探針雜交來(lái)測(cè)定來(lái)自所述哺乳動(dòng)物的組織樣品中存在和癌 癥相關(guān)的至少一種線粒體融合轉(zhuǎn)錄物，所述至少一種雜交探針具有和根據(jù)本發(fā)明的線粒 體融合轉(zhuǎn)錄物中的至少一部分互補(bǔ)的核酸序列。依照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種檢測(cè)哺乳動(dòng)物中的癌癥的方法，該方法包 括通過(guò)使樣品和至少一種雜交探針雜交來(lái)測(cè)定來(lái)自所述哺乳動(dòng)物的組織樣品中存在和癌 癥相關(guān)的至少一種異常mtDNA，所述至少一種雜交探針具有和根據(jù)本發(fā)明的mtDNA中 的至少一部分互補(bǔ)的核酸序列。依照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種用于進(jìn)行測(cè)定以檢測(cè)哺乳動(dòng)物中存在癌癥 的試劑盒，所述試劑盒包含和本發(fā)明的融合轉(zhuǎn)錄物或者mtDNA中的至少一部分互補(bǔ)的至 少一種雜交探針。依照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種篩選工具，其包含具有10、100或1000種 線粒體融合轉(zhuǎn)錄物的微陣列以鑒定和癌癥相關(guān)的那些線粒體融合轉(zhuǎn)錄物。依照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種篩選工具，其包含具有10、100或1000種 對(duì)應(yīng)于線粒體融合轉(zhuǎn)錄物的線粒體DNA的微陣列以鑒定和癌癥相關(guān)的那些線粒體DNA。照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種篩選工具，其包含具有10、100或1000種線粒體融合轉(zhuǎn)錄物的多重分支DNA試樣以鑒定和癌癥相關(guān)的那些線粒體融合轉(zhuǎn)錄物。依照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種篩選工具，包含具有10、100或1000種對(duì) 應(yīng)于線粒體融合轉(zhuǎn)錄物的線粒體DNA的多重分支DNA試樣以鑒定和癌癥相關(guān)的那些線 粒體DNA。附圖概述現(xiàn)在將參照附圖僅通過(guò)例子的方式來(lái)對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行說(shuō)明，其中圖1是示出線粒體編碼基因的示意圖。圖2示出由3.4kb缺失的損失調(diào)用的前列腺樣品中的聚腺苷?；?polyadenalated)
融合轉(zhuǎn)錄物。圖3示出由4977kb常見(jiàn)缺失的損失調(diào)用的前列腺樣品中的聚腺苷酰化融合轉(zhuǎn)錄 物。圖4示出由線粒體基因組的3.4kb區(qū)段的損失調(diào)用的乳房樣品中的聚腺苷?；?合轉(zhuǎn)錄物。圖5a和5b示出基因剪接之前和之后線粒體DNA區(qū)域的例子。圖6a至6g描述了本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄物2、3、8、9、10、11和12在結(jié)腸直腸癌腫瘤
的鑒定中的結(jié)果。圖7a至7d描述了本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄物6、8、10和20在肺癌腫瘤的鑒定中的結(jié)果。圖8a至8g描述了本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄物6、10、11、14、15、16和20在黑色素瘤的
鑒定中的結(jié)果。圖9a至9h描述了本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄物1、2、3、6、11、12、15和20在卵巢癌的鑒
定中的結(jié)果。圖10至18描述了本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄物2、3、4、11、12、13、15、16和20在睪丸 癌的鑒定中的結(jié)果。發(fā)明詳述本發(fā)明提供用于預(yù)測(cè)、診斷和/或監(jiān)測(cè)癌癥的新型線粒體融合轉(zhuǎn)錄物和親代突 變的mtDNA分子。本發(fā)明還提供用于融合轉(zhuǎn)錄物和相關(guān)的mtDNA分子檢測(cè)的雜交探針 以及這種探針的用途。定義除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科技術(shù)語(yǔ)具有和本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的 普通技術(shù)人員的通常理解相同的意思。如本文中所使用的，“異?！被颉巴蛔儭卑ㄒ吧途€粒體DNA序列中的任 何修飾，所述修飾導(dǎo)致形成融合轉(zhuǎn)錄物，并且包括但不限于插入、易位、缺失、復(fù)制、 重組、重排或其組合。如本文中所定義的，“生物樣品”是指含有這樣的細(xì)胞的組織或體液，從該細(xì) 胞中可以獲得目標(biāo)分子。例如，生物樣品可衍生自組織，例如前列腺、乳房、結(jié)腸直 腸、肺和皮膚，或衍生自血液、唾液、腦脊液、痰、尿液、黏液、滑液、腹膜液、羊水 等。生物樣品可以是外科手術(shù)樣本或活組織檢查樣本。生物樣品可以以得自來(lái)源直接使 用或者在進(jìn)行預(yù)處理以改變樣品的特征后使用。因此，生物樣品可以(例如)通過(guò)下列 方式在使用前進(jìn)行預(yù)處理從血液中制備血漿或血清、分裂細(xì)胞、從固體材料中制備液體、稀釋粘性流體、過(guò)濾液體、蒸餾液體、濃縮液體、滅活干擾組分、添加試劑等。“連續(xù)”轉(zhuǎn)錄物是從剪接的基因的開(kāi)端到末端都保持閱讀框的融合轉(zhuǎn)錄物。 “末端”轉(zhuǎn)錄物是在另一剪接的基因的起始終止密碼子前導(dǎo)致形成提前終止密碼子的融
合轉(zhuǎn)錄物。如本文中所使用的，“線粒體DNA”或“mtDNA”是線粒體中存在的DNA。如本文中所使用的，表述“線粒體融合轉(zhuǎn)錄物”或“融合轉(zhuǎn)錄物”是指由于突 變的線粒體DNA序列的轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其中這種突變可包括線粒體缺失和 其他大量線粒體DNA重排。計(jì)算機(jī)分析和序列靶向如上所討論的，線粒體融合轉(zhuǎn)錄物已經(jīng)在大豆中報(bào)道過(guò)(Morgens等人， 1984)，并在患有罕見(jiàn)的神經(jīng)肌肉障礙的人中報(bào)道過(guò)(Nakase等人，1990)。然而，并未 描述和人類(lèi)癌癥相關(guān)的融合轉(zhuǎn)錄物。使用從對(duì)和癌癥相關(guān)的人線粒體基因組的大量缺失進(jìn)行作圖、對(duì)高頻率的這些 缺失進(jìn)行觀察、和轉(zhuǎn)錄活性的突變的mtDNA分子的另一種有機(jī)體與另一種疾病類(lèi)型中 的證據(jù)獲得的知識(shí)，申請(qǐng)人假設(shè)由于其涉及癌癥，因此這些缺失可比DNA分子、以及損 害和修復(fù)過(guò)程重要。為了驗(yàn)證該假設(shè)，進(jìn)行線粒體基因組的計(jì)算機(jī)分析，特定于重復(fù)元 件，這表明了許多潛在的缺失位點(diǎn)。在鑒定具有非鄰近或非串聯(lián)位置的線粒體序列中的 獨(dú)特重復(fù)的這種初始步驟后，使用過(guò)濾器以鑒定那些重復(fù)，在引發(fā)DNA分子中的缺失事 件后，那些重復(fù)將可能重新閉合或重新連接以產(chǎn)生具有可讀框(ORF)的融合的DNA序 列。然后選擇18個(gè)分子的亞型進(jìn)行靶向以調(diào)查是否1)它們以人的自然生物狀態(tài)存在； 和2)它們和惡性腫瘤相關(guān)。這些研究的結(jié)果在下文中描述?；蚪M突變線粒體DNA(mtDNA)動(dòng)力學(xué)是重要的診斷工具。mtDNA中的突變通常是正 在發(fā)生的疾病的初步指示物，并且起到指示和疾病發(fā)作有關(guān)的危險(xiǎn)因素的生物標(biāo)記的作 用。根據(jù)本發(fā)明，線粒體基因組中的大量重排突變導(dǎo)致產(chǎn)生給癌癥相關(guān)的融合轉(zhuǎn)錄物。 因此，提供編碼這種轉(zhuǎn)錄物的mtDNA和導(dǎo)向其的探針在檢測(cè)、診斷和監(jiān)測(cè)癌癥中的用 途。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將意識(shí)到，本發(fā)明的方法中使用的mtDNA分子可通過(guò)分離 天然存在的突變體而衍生到，或可基于本文中所述的任何融合轉(zhuǎn)錄物的互補(bǔ)序列。示例 性mtDNA序列和融合轉(zhuǎn)錄物在申請(qǐng)人的美國(guó)優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)No.61/040,616中有所公開(kāi)，其 通過(guò)引用的方式全部并入本文中。 突變基因組序列的檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明的突變mtDNA序列可包含導(dǎo)致產(chǎn)生融合轉(zhuǎn)錄物的任何修飾。這些修 飾的非限制性例子包括插入、易位、缺失、復(fù)制、重組、重排或其組合。盡管修飾或改 變的大小可以在從只有幾個(gè)堿基到數(shù)千堿基之間變化很大，但是優(yōu)選地，修飾導(dǎo)致大量 缺失或其他大量基因組異常。提取DNA以檢測(cè)存在這種突變可使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)進(jìn)行，然后對(duì)線粒體 基因組的全部或區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，并且可包括線粒體基因組的測(cè)序，如Current Protocols in Molecular Biology中所描述?？蛇x擇地，可以使用粗組織勻漿以及不需要對(duì)特定目標(biāo)片段進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)。檢測(cè)突變的步驟可選自本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何技術(shù)。例如，分析 mtDNA可包括通過(guò)分支DNA選擇靶、對(duì)mtDNA進(jìn)行測(cè)序、通過(guò)PCR擴(kuò)增mtDNA、 Southern、Northern、Western South-Western 印跡雜交、變性 HPLC、雜交至微陣列、生物 芯片或基因芯片、分子標(biāo)記分析、生物傳感器、熔融溫度特性或上述任何的組合?？梢允褂脤?duì)線粒體DNA進(jìn)行測(cè)序的任何合適的方式。優(yōu)選地，在測(cè)序前mtDNA 通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。PCR的方法是本領(lǐng)域所熟知的，并且可如Mullis and Faloona， 1987，Methods Enzymol.，155 335中所述那樣進(jìn)行。PCR產(chǎn)物可直接進(jìn)行測(cè)序， 或克隆到載體中，然后置于細(xì)菌宿主中。DNA測(cè)序方法的例子在下列文獻(xiàn)中找到 Bramley, R.L.Jr.禾口 Smith, L.M., 1991， Rapid DNA sequencing by horizontal ultrathin gel electrophoresis, Nucleic Acids Res. 19 4121-4126 ；和 Luckey，J.Α.,等人，1993，High speed DNA sequencing by capillary gel electrophoresis, Methods Enzymol.218 154-172。 PCR 和 mtDNA 測(cè)序的聯(lián)合使用在 Hopgood，R.，等人，l"2，Strategies for automated sequencing of human mtDNA directly from PCR products, Biotechniques 13 82—92 禾口 Tanaka, Μ.等 人，1996, Automated sequencing of mtDNA, Methods Enzymol.264 407-421中找到。選擇合適的序列以制備各種引物的方法也是本領(lǐng)域已知的。例如，所述引 物可以使用常規(guī)固相合成法、利用市售設(shè)備來(lái)制備，例如所述市售設(shè)備得自Applied Biosystems USA Inc. (Foster City, California) > DuPont, (Wilmington, Del.)或 Milligen (Bedford, Mass.)。根據(jù)本發(fā)明的方面，為了確定候選物基因組序列，首先鑒定序列缺失的連接 點(diǎn)。序列缺失主要通過(guò)在待在5’和3’端缺失的序列側(cè)翼的直接和間接重復(fù)元件而鑒 定。從基因組中除去一段核苷酸、接著連接基因組導(dǎo)致新型連接點(diǎn)的形成。在鑒定連接點(diǎn)后，為了鑒定剪接的基因，測(cè)定在連接點(diǎn)側(cè)翼的基因的核苷酸。 典型地，剪接的基因包含來(lái)自第一基因的起始密碼子和第二基因的終止密碼子，并且可 表達(dá)為連續(xù)的轉(zhuǎn)錄物，即從剪接的基因的開(kāi)端到末端都保持閱讀框的轉(zhuǎn)錄物。還可能的 是，可以使用所述基因序列內(nèi)含有的替換起始或終止密碼子，如本文中所公開(kāi)的SEQ ID No 2和SEQ ID No 17所證明。表1中提供一些已知的線粒體缺失，所述線粒體缺失 被發(fā)現(xiàn)當(dāng)重排的序列在間接位點(diǎn)重新接合時(shí)具有可讀框(ORF)。下面提供本發(fā)明的方法中使用的示例性mtDNA分子，其已經(jīng)被證實(shí)在實(shí)驗(yàn)室中 存活。這些mtDNA基于已知線粒體基因組(SEQ ID NO: 1)的修飾，并且已經(jīng)被指派融 合或“FUS”的稱(chēng)號(hào)，其中A:B表示第一剪接的基因的最后線粒體核苷酸和第二剪接的 基因的第一線粒體核苷酸之間的連接點(diǎn)。括號(hào)中提供剪接的基因的鑒定，接著是對(duì)應(yīng)的 序列識(shí)別號(hào)。如下面所提供的，(AltMet)和(OrigMet)分別是指替換和初始翻譯的起始 位點(diǎn)。FUS 8469 13447 (AltMet) (ATP 合酶 FO 亞單位 8 至 NADH 脫氫酶亞單位)(SEQ ID No 2) FUS 10744 14124 (NADH脫氫酶亞單位4L (ND4L)至NADH脫氫酶亞單位 5 (ND5)) (SEQ ID No 3)
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FUS 7974 15496 (細(xì)胞色素c氧化酶亞單位II (COII)至細(xì)胞色素b (Cytb)) (SEQ ID No 4)FUS 7992 15730 (細(xì)胞色素c氧化酶亞單位II (COII)至細(xì)胞色素b (Cytb)) (SEQ ID No 5)FUS 8210 15339 (細(xì)胞色素c氧化酶亞單位II (COII)至細(xì)胞色素b (Cytb)) (SEQ ID No 6)FUS 8828 14896 (ATP合酶FO亞單位6 (腺苷三磷酸酶6)至細(xì)胞色素b (Cytb)) (SEQ ID No 7)FUS 10665 14856 (NADH 脫氫酶亞單位 4L (ND4L)至細(xì)胞色素 b (Cytb)) (SEQ ID No 8)FUS 6075 13799 (細(xì)胞色素c氧化酶亞單位I(COI)至NADH脫氫酶亞單位 5 (ND5)) (SEQ ID No 9)FUS 6325 13989 (細(xì)胞色素c氧化酶亞單位I(COI)至NADH脫氫酶亞單位 5 (ND5)) (SEQ ID No 10)FUS 7438 13476 (細(xì)胞色素c氧化酶亞單位I(COI)至NADH脫氫酶亞單位 5 (ND5)) (SEQ ID No 11)FUS 7775 13532 (細(xì)胞色素c氧化酶亞單位II(COII)至NADH脫氫酶亞單位 5 (ND5)) (SEQ ID No 12)FUS 8213 13991 (細(xì)胞色素c氧化酶亞單位II (COII)至NADH脫氫酶亞單位 5 (ND5)) (SEQ ID No 13)FUS 9191 12909 (ATP合酶FO亞單位6 (腺苷三磷酸酶6)至NADH脫氫酶亞單 位 5 (ND5)) (SEQ ID No 14)FUS 9574 12972 (細(xì)胞色素c氧化酶亞單位III(COIII)至NADH脫氫酶亞單位 5 (ND5)) (SEQ ID No 15)FUS 10367 12829 (NADH脫氫酶亞單位3 (ND3)至NADH脫氫酶亞單位 5 (ND5)) (SEQ ID No 16)FUS 8469 13447 (OrigMet) (ATP 合酶 FO 亞單位 8 至 NADH 脫氫酶亞單位)(SEQ ID No 17)FUS 9144 13816 ((ATP合酶FO亞單位6 (腺苷三磷酸酶6)至NADH脫氫酶亞 單位 5 (ND5)) (SEQ ID No 51)本發(fā)明還提供這些序列的變體或片段在預(yù)測(cè)、診斷和/或監(jiān)測(cè)癌癥中的用途。如本文中所使用的，“變體”是指區(qū)別于本發(fā)明的mtDNA序列、但是保持其基 本性能的核酸。通常，變體和選擇的mtDNA序列總的來(lái)說(shuō)非常類(lèi)似，并且在許多區(qū)域 中相同。具體而言，本發(fā)明的變體包含剪接的基因的連接點(diǎn)的核苷酸中的至少一種，并 且還可包含與其相鄰的一種或多種核苷酸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，變體序列和本 發(fā)明的mtDNA序列或其互補(bǔ)鏈中的任一者至少80%、85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%或99%相同。在本發(fā)明中，“片段”是指為公開(kāi)的基因組序列或其互補(bǔ)鏈的一部分的短核 酸序列。該部分包括包含剪接的基因的連接點(diǎn)的核苷酸中的至少一者，并且還可包含與其相鄰的一種或多種核苷酸。本發(fā)明的片段的長(zhǎng)度優(yōu)選至少約15nt，更優(yōu)選至少約 20nt,還更優(yōu)選至少約30nt，甚至更優(yōu)選至少約40nt、至少約50nt、至少約75nt或至少約 150nt。例如，片段的“長(zhǎng)度至少20nt”旨在包括上面列出的mtDNA序列中的任一者的 20或更多個(gè)連續(xù)的堿基。在上下文中，“約”包括在一個(gè)末端或兩個(gè)末端處的特定引 述的值、大于或小于數(shù)個(gè)(5、4、3、2或1)核苷酸的值。這些片段具有的用途包括但不 限于作為本文中所討論的診斷探針和引物。當(dāng)然，也涵蓋更大的片段(例如50、150、 500、600、2000 個(gè)核苷酸)。 因此，在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，mtDNA序列選自由下列序列及其片段或變 體構(gòu)成的組SEQ ID NO2 (FUS 8469 13447 ； AltMet)
SEQ ID NO3 (FUS 1074414124)
SEQ ID NO4 (FUS 7974 15496)
SEQ ID NO5 (FUS 7992 15730)
SEQ ID NO6 (FUS 8210 15339)
SEQ ID NO7 (FUS 8828 14896)
SEQ ID NO8 (FUS 1066514856)
SEQ ID NO9 (FUS 6075 13799)
SEQ ID NO10 (FUS 632513989)
SEQ ID NO11 (FUS 743813476)
SEQ ID NO12 (FUS 777513532)
SEQ ID NO13 (FUS 821313991)
SEQ ID NO14 (FUS 919112909)
SEQ ID NO15 (FUS 957412972)
SEQ ID NO16 (FUS 1036712829)
SEQ ID NO17 (FUS 846913447 ； OrigMet)
SEQ ID NO51 (FUS 914413816)，和
其片段和變體。
探針
本發(fā)明的另--個(gè)方面提供能夠識(shí)別本發(fā)明的異常mtDNA序列的雜交
fo如本
文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“探針”是指這樣的寡核苷酸，由于探針中的至少一個(gè)序列和靶區(qū) 域中的序列互補(bǔ)性，因此所述寡核苷酸和靶核酸中的序列形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。探針可以根 據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法來(lái)進(jìn)行標(biāo)記。在鑒定和特定疾病相關(guān)的異常mtDNA后，例如，雜交至寡核苷酸陣列的 mtDNA可用于鑒定特定突變，然而，可以使用任何已知的雜交方法。正如本發(fā)明的引物一樣，探針可以針對(duì)本發(fā)明的示例性mtDNA融合分子或者其 片段或變體而直接產(chǎn)生。例如，SEQ ID NO 2-17和51中闡述的序列和表1中公開(kāi)的 那些序列可用于設(shè)計(jì)檢測(cè)包含目標(biāo)融合序列的核酸序列的引物或探針。如本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員將理解的，雜交至這些核酸分子的引物或探針可在嚴(yán)格性強(qiáng)的雜交條件或嚴(yán)格性 弱的雜交條件下進(jìn)行，這些條件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，并且在(例如)CurrentProtocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons，New York (1989))，6.3.1-6.3.6 中找至 lj。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的探針含有和包含剪接的基因的連接點(diǎn)的 異常mtDNA中的至少一部分互補(bǔ)的序列。該部分包含包括在連接點(diǎn)A:B中的核苷酸中 的至少一者，并且還可包含與其相鄰的一種或多種核苷酸。就此而言，本發(fā)明包括將使 用包括在連接點(diǎn)A:B中和/或與其相鄰的核苷酸來(lái)選擇mtDNA分子的任何合適的靶向機(jī)理。本發(fā)明涵蓋本領(lǐng)域已知的各種類(lèi)型的探針。例如，探針可以是雜交探針，其 和靶核苷酸序列的結(jié)合可使用通常的DNA結(jié)合染料(例如溴化乙錠、SYBR Green、 SYBR Gold等)來(lái)檢測(cè)?？蛇x擇地，探針可引入一種或多種可檢測(cè)的標(biāo)記。可檢測(cè)的 標(biāo)記是這樣的分子或部分，其性能或特性可直接或間接檢測(cè)，并且被選擇為使得探針和 其靶序列雜交的能力不受影響。標(biāo)記核酸序列的方法是本領(lǐng)域熟知的(例如參見(jiàn)Ausubel 等人，(1997& updates) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New York)。適用于本發(fā)明的探針的標(biāo)記包括可直接檢測(cè)的那些，例如放射性同位素、熒光 圖、化學(xué)發(fā)光團(tuán)、酶、膠體顆粒、熒光微粒等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解可直接檢測(cè) 的標(biāo)記可需要附加組分(例如底物、觸發(fā)試劑、光等)，以能夠檢測(cè)所述標(biāo)記。本發(fā)明還 涵蓋使用間接檢測(cè)的標(biāo)記。本發(fā)明的探針的長(zhǎng)度優(yōu)選至少約15nt，更優(yōu)選至少約20nt，還更優(yōu)選至少約 30nt，甚至更優(yōu)選至少約40nt、至少約50nt、至少約75nt或至少約150nt。例如，探針的
“長(zhǎng)度至少20nt”旨在包括和本發(fā)明的mtDNA序列互補(bǔ)的20或更多個(gè)連續(xù)的堿基。當(dāng) 然，可優(yōu)選更大的探針(例如50、150、500、600、2000個(gè)核苷酸)。本發(fā)明的探針也將雜交至生物樣品中的核酸分子，從而使得本發(fā)明的方法成為 可能。因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面中，提供一種在癌癥的檢測(cè)中使用的雜交探針，其中 所述探針和異常mtDNA分子的至少一部分互補(bǔ)。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供一種探 針以及這種探針在檢測(cè)結(jié)腸直腸癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、睪丸癌、前列腺癌和/或 黑色素瘤皮膚癌中的用途(或使用方法)。測(cè)定測(cè)量生物樣品中異常mtDNA的水平可確定受試者中存在一種或多種癌癥。因 此，本發(fā)明包括用于預(yù)測(cè)、診斷或監(jiān)測(cè)癌癥的方法，該方法包括獲得一種或多種生物樣 品，從所述樣品中提取mtDNA，以及通過(guò)下列方法測(cè)定樣品的異常mtDNA:對(duì)樣品中 的一種或多種異常mtDNA序列的量進(jìn)行定量，然后將檢測(cè)的量和參照值進(jìn)行比較。如本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解的，參照值基于是否所述方法尋求預(yù)測(cè)、診斷或監(jiān)控癌癥。因 此，參照值可涉及從隨時(shí)間采集的一種或多種已知的非癌癥生物樣品、一種或多種已知 的癌癥生物樣品、和/或一種或多種生物樣品中收集的mtDNA數(shù)據(jù)。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種檢測(cè)哺乳動(dòng)物中的癌癥的方法，該方法包括測(cè) 定來(lái)自所述哺乳動(dòng)物的組織樣品中存在上述異常線粒體DNA。本發(fā)明還提供這樣的方 法，該方法包括通過(guò)使樣品和至少一種雜交探針雜交來(lái)測(cè)定來(lái)自所述哺乳動(dòng)物的組織樣 品。如本文中所描述的，探針可針對(duì)本發(fā)明的突變線粒體DNA序列而產(chǎn)生。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供上述方法，其中所述測(cè)定包括a)使用至少一種探針來(lái)進(jìn)行雜交反應(yīng)，以允許所述至少一種探針雜交至互補(bǔ)的異常線粒體DNA序列；b)通過(guò)對(duì)雜交至至少一種探針的線粒體DNA的量進(jìn)行定量，來(lái)對(duì)所述樣品中的 所述至少一種異常線粒體DNA序列的量進(jìn)行定量；以及c)將所述樣品中的線粒體DNA的量和至少一種已知參照值進(jìn)行比較。本發(fā)明中還包括用于預(yù)測(cè)、診斷或監(jiān)測(cè)癌癥的方法，該方法包括如下所述的診 斷成像測(cè)定。本發(fā)明的診斷測(cè)定可容易地適用于高通量。高通量測(cè)定提供下列優(yōu)點(diǎn)同 時(shí)和大量處理多種樣品會(huì)減少篩選多種樣品所需要的時(shí)間。因此，本發(fā)明涵蓋在高通量 篩選或測(cè)定中使用本發(fā)明的核苷酸以檢測(cè)和/或定量多種測(cè)試樣品中的靶核苷酸序列。融合轉(zhuǎn)錄物本發(fā)明還提供在用于預(yù)測(cè)、診斷和/或監(jiān)測(cè)癌癥的方法中使用的融合轉(zhuǎn)錄物和 相關(guān)的雜交探針的鑒定。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將意識(shí)到這些分子可通過(guò)天然存在的轉(zhuǎn)錄 物的分離、或可選擇地通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的方法分離的mtDNA的重組表達(dá)而衍生得到。如 所討論地，這些mtDNA典型地包含具有來(lái)自第一基因的起始密碼子和第二基因的終止密 碼子的剪接的基因。因此，由其衍生的融合轉(zhuǎn)錄物包含和剪接的基因相關(guān)的連接點(diǎn)。融合轉(zhuǎn)錄物的檢測(cè)天然存在的融合轉(zhuǎn)錄物可從生物樣品中提取，并且根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何合適 的方法來(lái)鑒定，或者可根據(jù)實(shí)施例中所述的方法來(lái)進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中， 穩(wěn)定的聚腺苷?；诤限D(zhuǎn)錄物使用寡(dT)引物(其使用聚-A尾部靶向轉(zhuǎn)錄物)、然后使 用針對(duì)靶轉(zhuǎn)錄物設(shè)計(jì)的弓I物對(duì)進(jìn)行RT-PCR來(lái)鑒定。下列示例性融合轉(zhuǎn)錄物使用這些方法進(jìn)行檢測(cè)，并且發(fā)現(xiàn)在預(yù)測(cè)、診斷和/或 監(jiān)測(cè)癌癥中是有用的，如實(shí)施例中所描述。同樣，根據(jù)本發(fā)明的測(cè)定和方法，衍生自表
中鑒定的ORF序列的融合轉(zhuǎn)錄物可在預(yù)測(cè)、診斷和/或監(jiān)測(cè)癌癥中是有用的。
0121]SEQ ID NO0122]SEQ ID NO0123]SEQ ID NO0124]SEQ ID NO0125]SEQ ID NO0126]SEQ ID NO0127]SEQ ID NO0128]SEQ ID NO0129]SEQ ID NO0130]SEQ ID NO0131]SEQ ID NO0132]SEQ ID NO0133]SEQ ID NO0134]SEQ ID NO0135]SEQ ID NO0136]SEQ ID NO0137]SEQ ID NO
18(轉(zhuǎn)錄物1
19(轉(zhuǎn)錄物2
20(轉(zhuǎn)錄物3
21(轉(zhuǎn)錄物4
22(轉(zhuǎn)錄物5
23(轉(zhuǎn)錄物6
24(轉(zhuǎn)錄物7
25(轉(zhuǎn)錄物8
26(轉(zhuǎn)錄物9
27(轉(zhuǎn)錄物10
28(轉(zhuǎn)錄物11
29(轉(zhuǎn)錄物12
30(轉(zhuǎn)錄物14
31(轉(zhuǎn)錄物15
32(轉(zhuǎn)錄物16
33(轉(zhuǎn)錄物20 50 (轉(zhuǎn)錄物13
8469 10744 7974 7992 8210 8828 10665 6075 6325 7438 7775 8213 9191 9574 10367 8469 9144
13447 ； AltMet) 14124) 15496) 15730) 15339) 14896) 14856) 13799) 13989) 13476) 13532) 13991) 12909) 12972) 12829)
13447 ； OrigMet) 13816)。
此外，和本文中所述的那些特征類(lèi)似的融合轉(zhuǎn)錄物也涵蓋在臨床腫瘤學(xué)領(lǐng)域的 應(yīng)用中。融合轉(zhuǎn)錄物還可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的重組技術(shù)來(lái)制備。典型地，該技術(shù)包括 使用包含目標(biāo)mtDNA序列的表達(dá)載體來(lái)轉(zhuǎn)化(包括轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染)合適的宿主細(xì) 胞。還提供本文中鑒定的融合轉(zhuǎn)錄物的變體或片段。這些序列可堅(jiān)持上面相對(duì)于基 因組變體和片段而描述的尺寸限制和百分同一性，或者由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員合適地確定。另外，下面列出對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)錄物1-16和20的推定的蛋白序列。提供這些編碼假 設(shè)的融合蛋白的序列作為本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案。SEQ ID NO 34 (轉(zhuǎn)錄物 1)SEQ ID NO 35 (轉(zhuǎn)錄物 2)SEQ ID NO 36 (轉(zhuǎn)錄物 3)SEQ ID NO 37 (轉(zhuǎn)錄物 4)SEQ ID NO 38 (轉(zhuǎn)錄物 5)SEQ ID NO 39 (轉(zhuǎn)錄物 6)SEQ ID NO 40 (轉(zhuǎn)錄物 7)SEQIDNO 41 (轉(zhuǎn)錄物 8)SEQ ID NO 42 (轉(zhuǎn)錄物 9)SEQ ID NO 43 (轉(zhuǎn)錄物 10)SEQ ID NO 44 (轉(zhuǎn)錄物 11)SEQ ID NO 45 (轉(zhuǎn)錄物 12)SEQ ID NO 46 (轉(zhuǎn)錄物 14)SEQ ID NO 47 (轉(zhuǎn)錄物 15)SEQ ID NO 48 (轉(zhuǎn)錄物 16)SEQ ID NO 49 (轉(zhuǎn)錄物 20)SEQ ID NO 52 (轉(zhuǎn)錄物 13)探針在表征融合轉(zhuǎn)錄物后，可以開(kāi)發(fā)引物或探針以在生物樣品中靶向轉(zhuǎn)錄物。這 些引物和探針可使用任何已知的方法(如上述)或下面提供的實(shí)施例中所闡述的方法 來(lái)制備。例如，探針可對(duì)于融合轉(zhuǎn)錄物而產(chǎn)生，并且檢測(cè)技術(shù)，例如Panomics 的 QuantiGene 2.0 ,被用于檢測(cè)樣品中存在轉(zhuǎn)錄物。引物和探針可針對(duì)本發(fā)明的示例性融 合轉(zhuǎn)錄物或者其片段或變體而直接產(chǎn)生。例如，SEQIDNO: 18-33和50中闡述的序列 和表1中公開(kāi)的那些序列可用于設(shè)計(jì)檢測(cè)包含目標(biāo)融合序列的核酸序列的探針。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解的，設(shè)計(jì)雜交至本發(fā)明的融合轉(zhuǎn)錄物的探針含有 和表達(dá)剪接的基因的連接點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄物中的至少一部分互補(bǔ)的序列。該部分包括和表達(dá)的 連接點(diǎn)互補(bǔ)的核苷酸中的至少一者，并且還可包含與其相鄰的一種或多種互補(bǔ)核苷酸。 就此而言，本發(fā)明包括將使用包括在剪接的基因的連接點(diǎn)中和與其相鄰的核苷酸來(lái)選擇 融合轉(zhuǎn)錄物的任何合適的靶向機(jī)理。
本領(lǐng)域中已知的各種類(lèi)型的探針和標(biāo)記方法都涵蓋以制備轉(zhuǎn)錄物探針。這些類(lèi) 型和方法已經(jīng)相對(duì)于基因組序列的檢測(cè)而在上面描述。本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄物探針的長(zhǎng)度優(yōu)選 至少約15nt，更優(yōu)選至少約20nt，還更優(yōu)選至少約30nt，甚至更優(yōu)選至少約40nt、至少 約50nt、至少約75nt或至少約150nt。例如，探針的“長(zhǎng)度至少20nt”旨在包括和本發(fā) 明的mtDNA序列互補(bǔ)的20或更多個(gè)連續(xù)的堿基。當(dāng)然，可優(yōu)選更大的探針(例如50、 150、500、600、2000 個(gè)核苷酸)。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種在癌癥的檢測(cè)中使用的雜交探針，其中所述探 針和上面提供的線粒體融合轉(zhuǎn)錄物的至少一部分互補(bǔ)。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種探針以及這種探針在檢測(cè)結(jié)腸直腸癌、肺 癌、乳腺癌、卵巢癌、睪丸癌、前列腺癌或黑色素瘤皮膚癌中的用途(或使用方法)。測(cè)定測(cè)量生物樣品中線粒體融合轉(zhuǎn)錄物的水平可確定受試者中存在一種或多種癌 癥。因此，本發(fā)明提供用于預(yù)測(cè)、診斷或監(jiān)測(cè)癌癥的方法，該方法包括獲得一種或多種 生物樣品，從所述樣品中提取線粒體RNA，以及通過(guò)下列方法測(cè)定樣品的融合轉(zhuǎn)錄物 對(duì)樣品中的一種或多種融合轉(zhuǎn)錄物的量進(jìn)行定量，然后將檢測(cè)的量和參照值進(jìn)行比較。 如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解的，參照值基于是否所述方法尋求預(yù)測(cè)、診斷或監(jiān)控癌 癥。因此，參照值可涉及從隨時(shí)間采集的一種或多種已知的非癌癥生物樣品、一種或多 種已知的癌癥生物樣品、和/或一種或多種中生物樣品收集的轉(zhuǎn)錄物數(shù)據(jù)。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種檢測(cè)哺乳動(dòng)物中的癌癥的方法，該方法包括通 過(guò)使所述樣品和至少一種雜交探針雜交來(lái)測(cè)定來(lái)自所述哺乳動(dòng)物的組織樣品中存在本發(fā) 明的至少一種融合轉(zhuǎn)錄物，所述至少一種雜交探針具有和線粒體融合轉(zhuǎn)錄物中的至少一 部分互補(bǔ)的核酸序列。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供上述方法，其中所述測(cè)定包括a)使用至少一種上述探針來(lái)進(jìn)行雜交反應(yīng)，以允許所述至少一種探針雜交至互 補(bǔ)的線粒體融合轉(zhuǎn)錄物；b)通過(guò)對(duì)雜交至所述至少一種探針的所述轉(zhuǎn)錄物的量進(jìn)行定量，來(lái)對(duì)所述樣品 中的所述至少一種線粒體融合轉(zhuǎn)錄物的量進(jìn)行定量；以及c)將所述樣品中的所述線粒體融合轉(zhuǎn)錄物的量和至少一種已知參照值進(jìn)行比較。如上所討論的，本發(fā)明的診斷測(cè)定還可包含本文中所述的診斷方法和篩選工 具，并且可容易地適用于高通量。因此，本發(fā)明涵蓋在高通量篩選或測(cè)定中使用本發(fā)明 的融合轉(zhuǎn)錄物和相關(guān)的探針以檢測(cè)和/或定量多種測(cè)試樣品中的靶核苷酸序列。診斷方法和篩選工具本文中還涵蓋了用于診斷特定疾病或鑒定特定線粒體突變的方法和篩選工具。 可以使用任何已知的雜交方法來(lái)進(jìn)行這些方法，包括但不限于基于探針/引物的技術(shù)， 例如分支DNA和qPCR、單重和多重的。還可以使用陣列技術(shù)，其具有匹配野生型或突 變的區(qū)域的寡核苷酸探針和對(duì)照探針。市售陣列(例如微陣列)或基因芯片是核實(shí)后的。 這些陣列在玻片或微芯片上含有數(shù)千的匹配的和對(duì)照的探針對(duì)，并且能夠非常迅速地對(duì) 整個(gè)基因組進(jìn)行測(cè)序。描述微陣列在基因組和DNA序列分析中的用途的綜述文獻(xiàn)在線可
設(shè)計(jì)用于鑒定和給定的生物條件相關(guān)的靶的篩選工具可包括和特定疾病或紊亂 相關(guān)的核酸的特定排列。因此，依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供一種篩選工具，其包 含具有10、100或1000種線粒體融合轉(zhuǎn)錄物的微陣列以鑒定和一種或多種癌癥相關(guān)的那 些線粒體融合轉(zhuǎn)錄物。依照另一個(gè)實(shí)施方案，提供一種篩選工具，其包含具有10、100 或1000種對(duì)應(yīng)于線粒體融合轉(zhuǎn)錄物的線粒體DNA的微陣列以鑒定和一種或多種癌癥相關(guān) 的那些線粒體DNA。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供一種篩選工具，其包含具有10、100 或1000種線粒體融合轉(zhuǎn)錄物的多重分支DNA試樣以鑒定和一種或多種癌癥相關(guān)的那些線 粒體融合轉(zhuǎn)錄物。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種篩選工具，其包含具有10、 100或1000種對(duì)應(yīng)于線粒體融合轉(zhuǎn)錄物的線粒體DNA的多重分支DNA試樣以鑒定和一 種或多種癌癥相關(guān)的那些線粒體DNA。在臨床腫瘤學(xué)領(lǐng)域中有用的方案也涵蓋在本文中，并且可包括診斷成像技術(shù)， 例如正電子成像術(shù)(PET)、對(duì)比磁共振成像術(shù)(MRI)等。這些診斷方法是本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員熟知的，并且可在癌癥的診斷和預(yù)測(cè)中使用。診斷監(jiān)測(cè)本發(fā)明的方法還可包括基于一種或多種測(cè)定的結(jié)果而推薦監(jiān)測(cè)制度或治療路 線。這允許臨床醫(yī)生通過(guò)監(jiān)測(cè)患者的癌癥(例如通過(guò)在發(fā)生起始或隨后的突變時(shí)識(shí)別) 或治療(例如通過(guò)在突變穩(wěn)定時(shí)識(shí)別)的進(jìn)展來(lái)實(shí)施個(gè)性化用藥，例如癌癥的治療。使用手頭的序列變異的分界的知識(shí)，所述信息可用于診斷癌癥前病癥或現(xiàn)有癌 癥病癥。此外，通過(guò)對(duì)連續(xù)樣品中的異常mtDNA隨時(shí)間的量進(jìn)行定量，可以監(jiān)控癌癥 病癥的進(jìn)展，例如，為了確定異常是否已經(jīng)發(fā)生改變，可以將通過(guò)在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定患 者的組織以從野生型中檢測(cè)第一組突變而提供的數(shù)據(jù)和從隨后的測(cè)定提供的數(shù)據(jù)進(jìn)行比 較。如果在并未產(chǎn)生癌癥癥狀的個(gè)體中發(fā)現(xiàn)突變，突變可以是產(chǎn)生癌癥病癥的基因 易患性的指示?？苫谶@樣的信息在定性的基礎(chǔ)上進(jìn)一步評(píng)價(jià)疾病易患性的確定或其存 在的診斷，所述信息涉及在患者的家族史中癌癥病癥的流行性(如果有)和存在其他危險(xiǎn) 因素(例如暴露于環(huán)境因素)，以及是否患者的細(xì)胞也攜帶另一種突變。生物樣品本發(fā)明提供用于診斷的試驗(yàn)，所述試驗(yàn)包括獲得或收集一種或多種生物樣品。 在本發(fā)明的上下文中，“生物樣品”是指含有這樣的細(xì)胞的組織或體液，從該細(xì)胞中可 以獲得mtDNA和mtRNA。例如，生物樣品可衍生自組織，包括但不限于皮膚、肺、乳 房、前列腺、神經(jīng)、肌肉、心臟、胃、結(jié)腸、直腸組織等；或衍生自血液、唾液、腦脊 液、痰、尿液、黏液、滑液、腹膜液、羊水等。生物樣品可以得自癌癥或非癌癥組織， 并且可以但不限于是外科手術(shù)樣本或活組織檢查樣本。生物樣品可以以得自來(lái)源直接使用或者在進(jìn)行預(yù)處理以改善樣品的特征后使 用。因此，生物樣品可以(例如)通過(guò)下列方式在使用前進(jìn)行預(yù)處理從血液中制備血 漿或血清、分裂細(xì)胞、從固體材料中制備液體、稀釋粘性流體、過(guò)濾液體、蒸餾液體、 濃縮液體、滅活干擾組分、添加試劑等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，在單次時(shí)間可以測(cè)定多于一種的樣品類(lèi)型(即用于檢測(cè)多于一種的癌癥)。此外，如果需要一段過(guò)程的收集，例如用于隨著時(shí)間監(jiān)測(cè)癌 癥，可以單獨(dú)診斷給定樣品，或者和在整個(gè)試驗(yàn)期間采集的其他樣品一起診斷。就此而 言，生物樣品可以僅采集一次，或者以規(guī)則的間隔(兩周、一月、半年或一年)采集。試劑盒本發(fā)明提供用于在臨床環(huán)境下檢測(cè)癌癥的診斷/掃描試劑盒。這些試劑盒可包 括一種或多種取樣構(gòu)件并聯(lián)合根據(jù)本發(fā)明的一種或多種探針。試劑盒可以任選地包括需要用于進(jìn)行診斷測(cè)定的試劑，例如緩沖劑、鹽、檢測(cè) 試劑等。試劑盒中也可以包括其他組分，例如用于生物樣品的分離和/或處理的緩沖劑 和溶液。所述試劑盒的一種或多種組分可凍干，并且所述試劑盒還可包含適于凍干的組 分重建的試劑。如果需要，所述試劑盒還可包含反應(yīng)容器、混合容器和其他易于制備試樣的組 件。所述試劑盒還可任選地包括使用說(shuō)明，其可以以紙的形式或計(jì)算機(jī)可讀形式(例如 磁盤(pán)、CD、DVD等)提供。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種用于診斷癌癥的試劑盒，其包含取樣構(gòu) 件和本發(fā)明的雜交探針。將通過(guò)使用下列實(shí)施例描述來(lái)對(duì)本發(fā)明的各方面進(jìn)行說(shuō)明。本文中提供的實(shí)施 例僅起到描述本發(fā)明的某些特定實(shí)施方案的作用，并且并非旨在以任何方式限制本發(fā)明 的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1 線粒體融合轉(zhuǎn)錄物的檢測(cè)本申請(qǐng)人在PCT申請(qǐng)no.PCT/CA 2007/001711(其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用的方式并 入)中之前鑒定的線粒體4977 “常見(jiàn)缺失“和3.4kb缺失導(dǎo)致具有活性轉(zhuǎn)錄物的獨(dú)特的 可讀框，如在前列腺組織中通過(guò)寡-dT選擇所鑒定的(圖2和3)。乳房組織樣品的檢查 也揭示出源自3.4kb缺失的穩(wěn)定的聚腺苷?；诤限D(zhuǎn)錄物的存在(圖4)。用于缺失轉(zhuǎn)錄物檢測(cè)的反轉(zhuǎn)錄-PCR方案RNA 分離 cDNA 合成遵循制造商的說(shuō)明并使用Auram 總RNA脂肪和纖維組織試劑盒(Bio-Rad， Hercules, CA)，從速凍前列腺和乳房組織樣品(惡性腫瘤和腫瘤附近的正常樣品)中分 離總RNA。由于在該實(shí)驗(yàn)中避免了基因組DNA污染，因此在使用本領(lǐng)域通知的方法的 條件下包括NDA酶I處理步驟。使用ND-1000分光光度計(jì)(NanoDrop technologies) 來(lái)測(cè)定RNA的數(shù)量和質(zhì)量。從約IOOg的初始材料中，總RNA濃度從100至IOOOng/μ 1 之間變化，并且260/280比在1.89至2.10之間。將RNA濃度調(diào)解至IOOng/μ 1，并且遵 循制造商的說(shuō)明，使用用于RT-PCR的Superscript 第一鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen)將2 μ 1 的各模板用于第一鏈DNA的合成。為了鑒定穩(wěn)定的聚腺苷?；诤限D(zhuǎn)錄物，使用寡(dT) 引物，其使用聚-A尾部靶向轉(zhuǎn)錄物。PCR使用5 μ 1 的各 cDNA 模板和 iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA)在 DNA Engine Opticon 2 連續(xù)熒光檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad，Hercules, CA)上進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。靶向 4977bp缺失的引物對(duì)為8416F5' -CCTTACACTATTCCTCATCAC-3‘、 13637R 5 ‘ -TGACCTGTTAGGGTGAGAAG-3 ‘, 并且用于 3.4kb 缺失 的弓 I 物對(duì)為ND4LF 5 ‘ -TCGCTCACACCTCATATCCTC _3 ‘、ND5R 5 ‘ -TGTGATTAGGAGTAGGGTTAGG-3 ’。反應(yīng)閃爍液(reaction cocktail)包括 2X SYBR Green Supermix(100mM KCL，40mM Tris-HCl, pH 8.4, 0.4mM 的各 dNTP[dATP> dCTP、dGTP 禾口 dTTP]、iTaq DNA 聚合酶、50units/ml、6mM MgCl2、 SYBR Green 1、20nM的熒光素和穩(wěn)定劑)、250nM的各引物、和雙蒸水。PCR循環(huán) 參數(shù)如下(1)95°C 2分鐘，(2)95°C 30秒，(3)55°C (對(duì)于4977bp缺失)和63°C (對(duì)于 3.4kb缺失)30秒，(4)72°C45秒，(5)板讀取，接著進(jìn)行39個(gè)循環(huán)的步驟3至5，并且 最終在4°C下孵育。除了循環(huán)閾值和熔融曲線分析，將樣品在瓊脂糖凝膠上運(yùn)行以用于擴(kuò) 增產(chǎn)物的特定可視化(參見(jiàn)圖2至4)。圖2是示出由線粒體基因組的3.4kb的損失調(diào)用的前列腺樣品中的聚腺苷?；?合轉(zhuǎn)錄物的瓊脂糖凝膠圖。圖2的說(shuō)明為B-空白、泳道1-6為cDNA中檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄 物；泳道7-12為用于泳道1-6中的樣品的無(wú)反轉(zhuǎn)錄酶(RT)對(duì)照。圖3示出由4977kb常見(jiàn)缺失的損失調(diào)用的前列腺樣品中的聚腺苷?；诤限D(zhuǎn)錄 物。圖3的說(shuō)明為B-空白、泳道1-6為cDNA中檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄物；泳道7_12為用于泳 道1-6中的樣品的無(wú)RT對(duì)照。圖4示出由線粒體基因組的3.4kb的損失調(diào)用的乳房樣品中的聚腺苷?；诤限D(zhuǎn) 錄物。圖4的說(shuō)明為泳道2-8為來(lái)自乳房cDNA的轉(zhuǎn)錄物；泳道9為陰性對(duì)照(水)； 泳道10和11為用于泳道2和3中的樣品的陰性、無(wú)RT對(duì)照。這些結(jié)果證實(shí)存在穩(wěn)定的線粒體融合轉(zhuǎn)錄物。實(shí)施例2:融合產(chǎn)物的鑒定和靶向設(shè)計(jì)多種雜交探針以進(jìn)行檢測(cè)，并且進(jìn)一步 證實(shí)存在源自突變的線粒體基因組(例如3.4kb缺失)的新型轉(zhuǎn)錄物。為此，利用用于 定量基因表達(dá)分析的單重分支DNA平臺(tái)(QuantiGene 2.0 ，Panomics ) 該實(shí)施例中 列出的特定缺失和序列基于它們和整個(gè)mtDNA基因組(在SEQ ID NO 1中所示)的相 對(duì)位置。四種轉(zhuǎn)錄物(在該實(shí)施例中探針被設(shè)計(jì)用于所述轉(zhuǎn)錄物)的核酸序列在本文中 被鑒定為如下轉(zhuǎn)錄物1 (SEQ ID NO 18)、轉(zhuǎn)錄物2 (SEQ ID NO 19)、轉(zhuǎn)錄物3 (SEQ ID NO 20)和轉(zhuǎn)錄物 4 (SEQ ID NO 21)。使用基因ND4L (NADH脫氫酶亞單位4L)和ND5 (NADH脫氫酶亞單位5)產(chǎn)生 3.4kb線粒體基因組缺失的連續(xù)轉(zhuǎn)錄物的例子。具有和SEQ IDNO 19互補(bǔ)的序列的探針 被用于檢測(cè)轉(zhuǎn)錄物2。在ND4L中的位置10745-10754和在ND5中的位置14124-14133
產(chǎn)生重復(fù)元件。3.4kb缺失導(dǎo)致除去ND4L的3'端、全長(zhǎng)ND4基因、tRNA組氨酸、tRNA絲氨
酸2、tRNA亮氨酸2和ND5的大部分的5 ‘端(參見(jiàn)圖5a)，從而導(dǎo)致ND4L和ND5用 連接點(diǎn)10744 (ND4L) 14124 (ND5)進(jìn)行基因剪接(圖5b)。SEQ IDNO 3是以上述方 式檢測(cè)的RNA轉(zhuǎn)錄物(SEQ ID NO 19)的互補(bǔ)的DNA序列。類(lèi)似地，轉(zhuǎn)錄物1是腺苷三磷酸酶8與和位置8469 13447相關(guān)的ND5之間的 融合轉(zhuǎn)錄物(SEQ ID NO 18)。轉(zhuǎn)錄物3禾Π 4 (分別為SEQ ID NO 20和SEQ ID NO 21)是分別和核苷酸位置7974 15496與7992 15730相關(guān)的COII與Cytb之間的融合轉(zhuǎn)
17錄物。表3提供了該實(shí)施例中使用的各種序列之間的關(guān)系的概述。表3包括檢測(cè)融合轉(zhuǎn) 錄物和與檢測(cè)的融合轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)的DNA序列。實(shí)施例3 應(yīng)用于前列腺癌使用四種融合轉(zhuǎn)錄物，即上面討論的轉(zhuǎn)錄物1至4，分析來(lái)自一位患者的兩種前 列腺組織樣品以評(píng)價(jià)新預(yù)計(jì)的融合轉(zhuǎn)錄物的定量差異。試驗(yàn)結(jié)果提供在下面的表2中， 其中“Homogl”是指患者的冷凍前列腺腫瘤組織的勻漿，“H0m0g2”是指患者的腫瘤 附近的冷凍正常前列腺組織的勻漿。這些樣品根據(jù)生產(chǎn)商的方案(QuantiGene Sample Processing Kit for Fresh or Frozen Animal Tissues ；禾口QuantiGene 2.0 Reagent System User Manual)以25.8mg的Homog 1和28.9mg的Homog 2 (測(cè)定安排示于表5a和5b中)開(kāi)始 進(jìn)行處理。明顯證實(shí)的是和正常附近的前列腺組織相比，前列腺癌組織中存在的線粒體融 合轉(zhuǎn)錄物增加。盡管水平非常低，但是融合轉(zhuǎn)錄物存在于正常組織中。探針雜交至靶轉(zhuǎn) 錄物而產(chǎn)生的相對(duì)發(fā)光單位(RLU)直接和各轉(zhuǎn)錄物的豐富程度成比例。表2還指出從樣 品采集的讀數(shù)的變異系數(shù)(CV，表示*%CV)。CV包含標(biāo)準(zhǔn)偏差除以平均值。這種在 癌癥組織中穩(wěn)定地轉(zhuǎn)錄的線粒體基因產(chǎn)物的顯著性暗示著疾病演變和發(fā)展。實(shí)施例4 應(yīng)用于乳腺癌使用和實(shí)施例3相同的方案，但只集中于轉(zhuǎn)錄物2，和3.4kb線粒體基因組缺失 有關(guān)的新型融合轉(zhuǎn)錄物，分析兩種乳房腫瘤組織樣品和兩種這些腫瘤附近的無(wú)腫瘤組織 的樣品、以及三種前列腺腫瘤組織樣品、一種包含附近的無(wú)腫瘤組織的樣品。表4中提 供了該實(shí)施例的結(jié)果。具有相應(yīng)的正常組織切片的前列腺腫瘤組織樣品證實(shí)和在實(shí)施例 3中分析的前列腺樣品類(lèi)似的圖案，因?yàn)檩^之正常附近的組織，腫瘤組織具有約2倍量的 融合轉(zhuǎn)錄物。當(dāng)和附近的無(wú)腫瘤組織相比時(shí)，乳房腫瘤樣品證實(shí)融合轉(zhuǎn)錄物水平顯著地 增加。使用以1 100稀釋的勻漿進(jìn)行該分析，因?yàn)槠湓趯?shí)施例3所引用的試驗(yàn)中最可 再生地進(jìn)行。因此，上面討論的結(jié)果表明了本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄物在前列腺和乳房組織的腫瘤的檢 測(cè)中的應(yīng)用。實(shí)施例5 應(yīng)用于結(jié)腸直腸癌該研究旨在確定本發(fā)明的一些轉(zhuǎn)錄物在檢測(cè)結(jié)腸直腸癌中的有效性?？偣仓苽?19種樣品，包括9種對(duì)照(良性)組織樣品(樣品1至9)和10種腫瘤(惡性)組織樣 品(樣品10至19)。將樣品根據(jù)生產(chǎn)商的建議(Quantigene Sample Processing Kit for Fresh or Frozen Animal Tissues ；禾口 Quantigene 2.0 Reagent System User Manual)進(jìn) 亍均質(zhì)
化。按照前面實(shí)施例中列出的方式制備7種靶轉(zhuǎn)錄物和1種持家轉(zhuǎn)錄物。轉(zhuǎn)錄物的特性 概述如下表7 乳腺癌轉(zhuǎn)錄物的特性
應(yīng)注意，轉(zhuǎn)錄物2和3和上面涉及實(shí)施例3和4所討論的那些相同。使用約25mg的來(lái)自O(shè)CT塊的組織制備勻漿，對(duì)于轉(zhuǎn)錄物2和4以1 1稀釋?zhuān)?對(duì)于轉(zhuǎn)錄物10和11以1 8稀釋。在Glomax 多檢測(cè)系統(tǒng)(Promega)上測(cè)量轉(zhuǎn)錄物 的量(相對(duì)熒光單位RLU)。對(duì)于每種轉(zhuǎn)錄物，所有樣品測(cè)定3次。也進(jìn)行3次背景測(cè) 量(無(wú)模板)。通過(guò)從樣品的RLU值中減去下限來(lái)分析計(jì)算背景。通過(guò)使用式lo&a RLU-lo&hRLU來(lái)計(jì)算輸入RNA，其中a是靶融合轉(zhuǎn)錄物，并且h是持家轉(zhuǎn)錄物。數(shù)據(jù)分析包括下列步驟a)確定三次測(cè)定的CV(變異系數(shù))，如果則可接受。b)確定靶融合轉(zhuǎn)錄物(a)和持家轉(zhuǎn)錄物(h)三次測(cè)定的平均RLU值。c)從背景RLU的三個(gè)值中確定下限⑴。d)從(a)中減去下限(I)。e)計(jì)算 lo& a RLU-Iog2 h RLU。結(jié)果概述上述分析的結(jié)果示于圖6a至6g中，其包括lo& a RLU-lo&hRLU對(duì)樣品數(shù)的 圖。還示出從各轉(zhuǎn)錄物的結(jié)果中確定的各ROC(接受者工作特征)曲線。轉(zhuǎn)錄物2 在正常組(ρ < 0.10)和惡性組(ρ > 0.09)的平均值之間存在統(tǒng)計(jì)上 顯著性差異。使用通過(guò)ROC曲線證實(shí)的3.6129的截?cái)嘀祵?dǎo)致靈敏度為60%，特異度為 89%,曲線下面積為0.73，這表明一般的檢驗(yàn)精確度?？梢哉{(diào)節(jié)選擇的閾值以增加用于 特定應(yīng)用的檢驗(yàn)的特異度或靈敏度。轉(zhuǎn)錄物3 在正常組(ρ < 0.05)和惡性組(ρ = 0.03)的平均值之間存在統(tǒng)計(jì)上 顯著性差異。使用通過(guò)ROC曲線證實(shí)的4.0813的截?cái)嘀祵?dǎo)致靈敏度為60%，特異度為 78%,曲線下面積為0.79，這表明一般至良好的檢驗(yàn)精確度?？梢哉{(diào)節(jié)選擇的閾值以增 加用于特定應(yīng)用的檢驗(yàn)的特異度或靈敏度。轉(zhuǎn)錄物8 在正常組(ρ < 0.1)和惡性組(ρ = 0.06)的平均值之間存在統(tǒng)計(jì)上顯 著性差異。使用通過(guò)ROC曲線證實(shí)的-6.0975的截?cái)嘀祵?dǎo)致靈敏度為60%，特異度為 89%,曲線下面積為0.76，這表明一般的檢驗(yàn)精確度?？梢哉{(diào)節(jié)選擇的閾值以增加用于 特定應(yīng)用的檢驗(yàn)的特異度或靈敏度。轉(zhuǎn)錄物9 在正常組(ρ < 0.1)和惡性組(ρ = 0.06)的平均值之間存在統(tǒng)計(jì)上顯 著性差異。使用通過(guò)ROC曲線證實(shí)的-7.5555的截?cái)嘀祵?dǎo)致靈敏度為60%，特異度為 89%,曲線下面積為0.76，這表明一般至良好的檢驗(yàn)精確度?？梢哉{(diào)節(jié)選擇的閾值以增 加用于特定應(yīng)用的檢驗(yàn)的特異度或靈敏度。
轉(zhuǎn)錄物10 在正常組(ρ < 0.01)和惡性組(ρ = 0.01)的平均值之間存在統(tǒng)計(jì)上 顯著性差異。使用通過(guò)ROC曲線證實(shí)的-3.8272的截?cái)嘀祵?dǎo)致靈敏度為90%，特異度為 67%,曲線下面積為0.84，這表明良好的檢驗(yàn)精確度?？梢哉{(diào)節(jié)選擇的閾值以增加用于 特定應(yīng)用的檢驗(yàn)的特異度或靈敏度。轉(zhuǎn)錄物11 在正常組(ρ < 0.1)和惡性組(ρ = 0.06)的平均值之間存在統(tǒng)計(jì)上 顯著性差異。使用通過(guò)ROC曲線證實(shí)的3.1753的截?cái)嘀祵?dǎo)致靈敏度為70%，特異度為 78%,曲線下面積為0.76，這表明一般至良好的檢驗(yàn)精確度。可以調(diào)節(jié)選擇的閾值以增 加用于特定應(yīng)用的檢驗(yàn)的特異度或靈敏度。轉(zhuǎn)錄物12 在正常組(ρ < 0.1)和惡性組(ρ = 0.06)的平均值之間存在統(tǒng)計(jì)上 顯著性差異。使用通過(guò)ROC曲線證實(shí)的3.2626的截?cái)嘀祵?dǎo)致靈敏度為70%，特異度為 78%,曲線下面積為0.76，這表明一般至良好的檢驗(yàn)精確度?？梢哉{(diào)節(jié)選擇的閾值以增 加用于特定應(yīng)用的檢驗(yàn)的特異度或靈敏度。結(jié)論上述結(jié)果示出轉(zhuǎn)錄物2、3、8、9、10、11和12在結(jié)腸直腸癌的檢測(cè)和辨別惡性 與正常結(jié)腸直腸組織中的實(shí)用性。如上所討論的，還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄物2和3具有在前列腺癌 檢測(cè)中的實(shí)用性。還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄物2具有在乳腺癌檢測(cè)中的實(shí)用性。還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄物11具 有在黑色素瘤皮膚癌檢測(cè)中的實(shí)用性。還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄物10具有在肺癌和黑色素瘤檢測(cè)中的 實(shí)用性。還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄物8具有在肺癌檢測(cè)中的實(shí)用性。所述7種轉(zhuǎn)錄物中的任一種可以 單獨(dú)或聯(lián)合用作在臨床環(huán)境下檢測(cè)結(jié)腸直腸癌的特征的工具。實(shí)施例6:應(yīng)用于肺癌該研究旨在確定本發(fā)明的一些轉(zhuǎn)錄物在檢測(cè)肺癌中的有效性。如實(shí)施例5中那 樣，將9種對(duì)照(良性)組織樣品(樣品1至9)和10種腫瘤(惡性)組織樣品(樣品 10 至 19)。根據(jù)生產(chǎn)商的建議(Quantigene Sample Processing Kit for Fresh or Frozen Animal Tissues ；和 Quantigene 2.0 Reagent System User Manual)進(jìn)行均質(zhì)化。將勻漿以
1 8稀釋?zhuān)⑶以贕lomax 多檢測(cè)系統(tǒng)(Promega)上測(cè)量4種靶轉(zhuǎn)錄物和1種持家轉(zhuǎn) 錄物的量(相對(duì)熒光單位RLU)。對(duì)于每種轉(zhuǎn)錄物，所有樣品測(cè)定3次。也進(jìn)行3次背 景測(cè)量(無(wú)模板)。制備下列轉(zhuǎn)錄物用于該實(shí)施例表8:肺癌轉(zhuǎn)錄物的特性該實(shí)施例中使用的組織樣品具有下列特性表9:肺癌樣品的特性
權(quán)利要求
1.一種和癌癥相關(guān)的分離的線粒體融合轉(zhuǎn)錄物。
2.權(quán)利要求1所述的線粒體融合轉(zhuǎn)錄物，其中所述轉(zhuǎn)錄物包含插入、易位、缺失、復(fù) 制、重組、重排或其組合。
3.權(quán)利要求2所述的線粒體融合轉(zhuǎn)錄物，其中所述轉(zhuǎn)錄物包含缺失。
4.權(quán)利要求3所述的線粒體融合轉(zhuǎn)錄物，其中所述轉(zhuǎn)錄物包含SEQIDNO : 18至33 或50中的任一者所闡述的序列。
5.權(quán)利要求3所述的線粒體融合轉(zhuǎn)錄物，其中所述轉(zhuǎn)錄物包含SEQIDNO : 18-21、 23、25-33或50中的任一者所闡述的序列。
6.權(quán)利要求3所述的線粒體融合轉(zhuǎn)錄物，其中所述轉(zhuǎn)錄物包含表1中所闡述的缺失序 列的表達(dá)RNA轉(zhuǎn)錄物。
7.—種線粒體融合蛋白，其對(duì)應(yīng)于權(quán)利要求4所述的融合轉(zhuǎn)錄物，并且具有SEQ ID NO 34至49和52中的任一者所闡述的序列。
8.一種編碼權(quán)利要求1所述的融合轉(zhuǎn)錄物的分離的線粒體DNA(mtDNA)。
9.權(quán)利要求8所述的分離的mtDNA，其具有SEQID NO 2-17或51中的任一者所 闡述的序列。
10.一種雜交探針，其具有和根據(jù)權(quán)利要求1至6中的任一項(xiàng)所述的線粒體融合轉(zhuǎn)錄 物或者權(quán)利要求8或9所述的mtDNA中的至少一部分互補(bǔ)的核酸序列。
11.一種檢測(cè)哺乳動(dòng)物中的癌癥的方法，該方法包括通過(guò)使樣品和至少一種雜交探針 雜交來(lái)測(cè)定來(lái)自所述哺乳動(dòng)物的組織樣品中存在和癌癥相關(guān)的至少一種線粒體融合轉(zhuǎn)錄 物，所述至少一種雜交探針具有和根據(jù)權(quán)利要求1至6中的任一項(xiàng)所述的線粒體融合轉(zhuǎn)錄 物中的至少一部分互補(bǔ)的核酸序列。
12.一種檢測(cè)哺乳動(dòng)物中的癌癥的方法，該方法包括通過(guò)使樣品和至少一種雜交探針 雜交來(lái)測(cè)定來(lái)自所述哺乳動(dòng)物的組織樣品中存在和癌癥相關(guān)的至少一種異常mtDNA，所 述至少一種雜交探針具有和根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的mtDNA中的至少一部分互補(bǔ)的核 酸序列。
13.權(quán)利要求11或12所述的方法，其中所述癌癥選自由前列腺癌、睪丸癌、卵巢 癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、黑色素瘤皮膚癌及其組合構(gòu)成的組。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述測(cè)定包括a)使用至少一種所述探針來(lái)進(jìn)行雜交反應(yīng)，以允許所述至少一種探針雜交至互補(bǔ)的 線粒體融合轉(zhuǎn)錄物或mtDNA ；b)通過(guò)對(duì)雜交至所述至少一種探針的所述轉(zhuǎn)錄物或mtDNA的量進(jìn)行定量，來(lái)對(duì)所述 樣品中的所述至少一種線粒體融合轉(zhuǎn)錄物或mtDNA的量進(jìn)行定量；以及C)將所述樣品中的所述線粒體融合轉(zhuǎn)錄物或mtDNA的量和至少一種已知參照值進(jìn)行 比較。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述測(cè)定使用診斷成像技術(shù)來(lái)進(jìn)行。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述診斷成像技術(shù)包括高通量微陣列分析。
17.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述測(cè)定使用分支DNA技術(shù)來(lái)進(jìn)行。
18.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述測(cè)定使用PCR來(lái)進(jìn)行。
19.一種用于進(jìn)行測(cè)定以檢測(cè)哺乳動(dòng)物中存在癌癥的試劑盒，所述試劑盒包含和權(quán)利要求1至6中的任一項(xiàng)所述的融合轉(zhuǎn)錄物或者權(quán)利要求8或9所述的mtDNA中的至少一 部分互補(bǔ)的至少一種雜交探針。
20.—種篩選工具，其包含具有10、100或1000種根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述 的線粒體融合轉(zhuǎn)錄物的微陣列以鑒定和癌癥相關(guān)的那些線粒體融合轉(zhuǎn)錄物。
21.—種篩選工具，其包含具有10、100或1000種根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的線粒體 DNA的微陣列以鑒定和癌癥相關(guān)的那些線粒體DNA。
22.—種篩選工具，其包含具有10、100或1000種根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述 的線粒體融合轉(zhuǎn)錄物的多重分支DNA測(cè)定以鑒定和癌癥相關(guān)的那些線粒體融合轉(zhuǎn)錄物。
23.—種篩選工具，其包含具有10、100或1000種根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的線粒體 DNA的多重分支DNA測(cè)定以鑒定和癌癥相關(guān)的那些線粒體DNA。
全文摘要
本發(fā)明提供用于預(yù)測(cè)、診斷和/或監(jiān)測(cè)癌癥的新型線粒體融合轉(zhuǎn)錄物和親代突變的mtDNA分子。本發(fā)明還提供在本發(fā)明的方法中使用的和它們互補(bǔ)的雜交探針。
文檔編號(hào)C40B40/06GK102016039SQ200980114773
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2009年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月28日
發(fā)明者凱麗·魯濱遜, 加布里埃爾·達(dá)庫(kù)波, 布賴(lài)恩·賴(lài)古伊, 珍妮弗·克里德, 瑞安·帕爾 申請(qǐng)人:米托米克斯公司