專利名稱：：革蘭陽性需氧菌鑒定板及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物制劑。具體涉及一種革蘭陽性需氧菌鑒定板及其制備方法。
背景技術(shù)：
：近20年來，由于臨床上廣泛大量地使用種類繁多的抗菌藥物，細(xì)菌的耐藥性越來越普遍，有的細(xì)菌可同時(shí)耐2-7種藥物，耐藥菌株的廣泛傳播給臨床治療帶來很大困難，特別是對(duì)于醫(yī)院內(nèi)感染的細(xì)菌。醫(yī)院內(nèi)感染是出現(xiàn)在醫(yī)院環(huán)境中的感染，并易發(fā)生流行，故又可將其稱為醫(yī)院獲得性感染(Hospitalacquiredinfection)。雖然發(fā)生醫(yī)院感染的病情有輕有重，但都給病人增加了額外的痛苦、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和不幸，同時(shí)也會(huì)由于延長住院時(shí)間而加重醫(yī)療和護(hù)理工作的負(fù)擔(dān)，影響病床周轉(zhuǎn)。嚴(yán)重的醫(yī)院感染往往使病人所患的疾病不能達(dá)到預(yù)期的療效，甚至產(chǎn)生難以治療的后遺癥或死亡。據(jù)美國的一次不完全統(tǒng)計(jì)資料報(bào)告，其住院病人中約有5%發(fā)生醫(yī)院感染，平均延長住院45d，每年約有10萬人死亡于醫(yī)院感染，估計(jì)每年由于醫(yī)院感染要多消耗20余億美元。從引起醫(yī)院感染的微生物來看，固然有些仍是所熟悉的致病性很強(qiáng)的微生物，但是近年來醫(yī)院感染的病原體種類有明顯變化的趨勢，革蘭氏陰性菌已取代了原來為主要病原的革蘭氏陽性球菌，其中腸桿菌科及假單胞菌約占醫(yī)院感染的60%-65%，并且主要為多耐藥性細(xì)菌。由于廣泛應(yīng)用抗生素，細(xì)菌的不斷變遷，助長了醫(yī)院內(nèi)感染的存在和發(fā)展，今日的臨床微生物學(xué)最重要的特點(diǎn)是向醫(yī)院感染方面轉(zhuǎn)變。微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)是主要應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室的高科技體外診斷產(chǎn)品，對(duì)輔助臨床各科室診斷治療具有重要意義。目前在國際上，對(duì)細(xì)菌的快速鑒定和藥敏分析己經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，微生物自動(dòng)化檢測產(chǎn)品逐步替代了手工檢測。目前，微生物自動(dòng)化檢測產(chǎn)品主要有法國生物-梅里埃公司的VITEK-AMS微生物分析系統(tǒng)、美國Dade-MicroSean公司的MicroScan自動(dòng)微生物鑒定和藥敏測試系統(tǒng)以及英國TrekDiagnosticSystemLtd.的SENSTITRE熒光法快速微生物鑒定和藥敏分析系統(tǒng)。它們的工作原理相近，主要是根據(jù)細(xì)菌理化性質(zhì)的差異，采用光電比色，測定細(xì)菌生長分解底物導(dǎo)致PH值改變而產(chǎn)生的不同顏色和濁度變化來判斷反應(yīng)情況，從而給出鑒定藥敏結(jié)果。但是，上述檢測產(chǎn)品在臨床推廣上，用于微生物鑒定主要存在以下幾個(gè)方面的問題(1)鑒定時(shí)間偏長，需要16-24小時(shí)給出結(jié)果；(2)鑒定范圍比較狹窄，可以鑒定的細(xì)菌種類少。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服上述不足之處，研究設(shè)計(jì)一種快速準(zhǔn)確革蘭陽性需氧菌鑒定板。本發(fā)明的鑒定檢測實(shí)驗(yàn)基于下列原理根據(jù)目前微生物鑒定領(lǐng)域權(quán)威的伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)，細(xì)菌的鑒定主要通過檢測細(xì)菌對(duì)各種營養(yǎng)物質(zhì)的利用情況，即通過檢測細(xì)菌生化反應(yīng)特性來鑒定細(xì)菌。而細(xì)菌利用營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生生化反應(yīng)的過程中，會(huì)發(fā)生一系列的氧化還原反應(yīng)，這些氧化還原反應(yīng)中會(huì)產(chǎn)生NADH，而NADH能夠把四唑紫(2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride,TTC)指示劑由無色的氧化型轉(zhuǎn)變?yōu)樽仙倪€原型。因此我們使用四唑紫作為細(xì)菌發(fā)生生化反應(yīng)的指示劑，來檢測細(xì)菌的生化反應(yīng)特性，從而達(dá)到細(xì)菌鑒定的目的。不同細(xì)菌利用不同碳源或氮源進(jìn)入新陳代謝過程，而對(duì)其他一些碳源或氮源則無法利用，這些特性是細(xì)菌的遺傳物質(zhì)所決定的。目前現(xiàn)有的微生物鑒定板最多只有30個(gè)生化反應(yīng)，因此對(duì)于鑒定細(xì)菌的種類方面比較狹窄，可以鑒定的革蘭陽性菌種類最多只有150余種,且不同種類的細(xì)菌需要使用不同種類的板條進(jìn)行鑒定，同時(shí)需要通過補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證才能得出鑒定結(jié)果，操作比較繁瑣。因此，為了克服上述不足之處，達(dá)到鑒定所需細(xì)菌的目的，就需要選擇一組合適的碳源和氮源。本發(fā)明人選擇了500多種碳源和氮源,對(duì)多種細(xì)菌進(jìn)行檢測，通過對(duì)這些數(shù)據(jù)的分析整理，最終確定目前板條的碳源和氮源的組合(見下表)。該種鑒定板上的47個(gè)碳源和氮源組合可鑒定的革蘭陽性菌種類有300余種，可以鑒定葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、陽性桿菌等多種不同種類的細(xì)菌，且不需要進(jìn)行補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)就可以得出鑒定結(jié)果。10革蘭陽性需氧菌鑒定板底物表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>本發(fā)明提供了一種革蘭陽性需氧菌鑒定板，該鑒定板由反應(yīng)底物原液和肉湯培養(yǎng)基組成，所述反應(yīng)底物原液在鑒定板上的位置及其各成分的濃度為(g/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>H6，H12D-葡萄糖-6-磷酸酯2%所述肉湯培養(yǎng)基由下列成分組成(V/V)物質(zhì)名稱所占比例純水64%GP/MT(革蘭陽性菌鹽貯液)21.9%氯化銨NH4Cl水溶液4.4%GP(革蘭陽性菌)混合貯液0.88%50yM葉酸水溶液0.088%8mM維生素K3亞硫酸氫鈉水溶液4.4%結(jié)晶紫水溶液4.4%實(shí)中GP/MT(革蘭陽性菌鹽貯液)由下列成分組成(重量％濃度)物質(zhì)名稱所占比例純水[H20]80%2水合磷酸二氫鈉[NaH2P04-2H20]4.68o/0磷酸氫二鈉[Na2HP04]12.775%氯化鉀[KC1]2.61%十水合焦磷酸鈉[Na4P2(Vl0H2O]0.018%本發(fā)明的另一目的是提供了革蘭陰性需氧菌鑒定板的制備方法。由于革蘭陽性菌需氧菌鑒定板可以鑒定不同種類的細(xì)菌，包括一些營養(yǎng)成分要求比較高的苛養(yǎng)菌，因此必須有一種合適的營養(yǎng)物質(zhì)來滿足各種不同種類細(xì)菌生長的需要。本發(fā)明人通過以下實(shí)驗(yàn)對(duì)混合試劑中的成分組成進(jìn)行了選擇，研制發(fā)明了一種混合試劑，該混合試劑有多種細(xì)菌生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)混合組成。1、實(shí)驗(yàn)方法選取無機(jī)鹽基礎(chǔ)、氨基酸、磷酸緩沖液、維生素、蛋白胨、牛肉膏、麥芽膏等多種細(xì)菌生長營養(yǎng)物質(zhì)按不同的組合方式和適當(dāng)?shù)谋壤旌吓渲贸稍噭?，然后選取不同種類的細(xì)菌進(jìn)行試驗(yàn)，以確定合種組合方式可以滿足各種不同種類細(xì)菌的生長。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果本實(shí)驗(yàn)選取了金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、大鼠鏈球菌、馬紅球菌、極小棒桿菌、蠟樣芽孢桿菌、藤黃微球菌不同種類細(xì)菌加入不同混合試劑配置的鑒定板條中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>通過上述實(shí)驗(yàn)表明組合5的混合試劑可能滿足不同種類細(xì)菌生長的需要，因此本發(fā)明人確定了混合試劑的組合方式，該混合試劑的各物質(zhì)按下列比例混合配置成GP(革蘭陽性菌)混合試劑重量％濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>本發(fā)明方法包括下列步驟1、配置鑒定板反應(yīng)底物原液根據(jù)下列配置濃度要求配置各反應(yīng)底物的原液。(g/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>2、配置肉湯培養(yǎng)基(1)、下列各物質(zhì)的按比例混合配置GP/MT(革蘭陽性菌鹽貯液)重量％濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(2)、按下列各物質(zhì)配置濃度要求配置GP混合貯液(g/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(3)、根據(jù)下列配置濃度要求配置以下幾種物質(zhì)的水溶液。(g/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>、按下列各物質(zhì)的比例混合配置肉湯培養(yǎng)基(v/v)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>3、分裝(1)根據(jù)板條批量生產(chǎn)的數(shù)量要求將合適的步驟1配置的反應(yīng)底物原液分裝到96支試管中。(2)根據(jù)板條批量生產(chǎn)的數(shù)量要求將步驟2配置的肉湯培養(yǎng)基加入到(1)的試管中。4、加樣分裝板條使用分裝系統(tǒng)在96孔的相應(yīng)位置對(duì)指定的鑒定板條加樣，每孔加50ul;5、板條干燥上述板條常溫干燥16-18小時(shí)；6、包裝。7、板條存C由于本發(fā)明鑒定板上的47個(gè)碳源和氮源組合可鑒定的革蘭陽性菌種類有300余種，可以鑒定葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、陽性桿菌等多種不同種類的細(xì)菌，且不需要進(jìn)行補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)就可以得出鑒定結(jié)果，操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，因而，有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。具體實(shí)施例方式革蘭陽性需氧菌鑒定板，批量生產(chǎn)375塊產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝流程如下:配置鑒定板反應(yīng)底物原液(g/ml)孔位藥物名稱純水本批所需量(ml)藥物本批所需量(g)Al，A7水1818A2，A8糊精180.72A3，A9N-乙酰-D-葡糖胺180.72A4,A10N-乙酰-e-D-甘露糖胺180.72A5，All苦杏苷180.72A6，A12L-樹膠醛糖180.72Bl，B7對(duì)苯二酚葡萄糖苷180.72B2,B8D-纖維二糖180.72B3，B9D-半乳糖180.72B4,B10D-葡萄糖酸180.72B5,Blla-D-葡萄糖180.72B6，B12甘油180.72Cl，C7a-D-乳糖180.72<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>2、配置肉湯培養(yǎng)基(1)、將下列各物質(zhì)混合配置GP/MT<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>十水合焦磷酸鈉[N34P2Orl0H20]0.07lg(2)、按下列各物質(zhì)的比例混合配置GP混合貯液物質(zhì)名稱純水本批所需量(ml)藥物本批所需量(g)GP混合試劑5012.375(3)、根據(jù)配置濃度要求配置以下幾種物質(zhì)水溶液c物質(zhì)名稱純水本批所需量(ml)藥物本批所需量(g)0.5raM葉酸100.0022結(jié)晶紫500.9-1.058mM維生素K3亞硫酸氫鈉500.1-0.12氯化銨502.65(4)將下列各物質(zhì)混合配置肉湯培養(yǎng)基物質(zhì)名稱藥物本批所需量純水656mlGP/MT225ml氯化銨NH4C1水溶液45mlGP混合貯液9ml50uM葉酸水溶液0.9ml8mM維生素K3亞硫酸氫鈉水溶液45ml結(jié)晶紫水溶液45ml3、分裝(1)將配置的反應(yīng)底物原液分裝到相對(duì)應(yīng)的96支試管中，每管加入6.675ml。(2)將配置的肉湯培養(yǎng)基加入到96支試管中，每管加入8.95ml。4、加樣分裝板條將配置好的96根試管裝在加樣機(jī)上，使用加樣機(jī)對(duì)指定的鑒定板條加樣，每孔加50ul。(在這之前要先運(yùn)行分裝系統(tǒng)；整個(gè)程序大約需要3個(gè)小時(shí))。5、板條干燥將加樣好的板條放入干燥間進(jìn)行常溫干燥，24小時(shí)后板條可干燥完畢。6、板條包裝將干燥好的板條從干燥間經(jīng)傳遞窗送到包裝間進(jìn)行包裝。7、板條存貯包裝完畢的板條放入2-8'C冰箱進(jìn)行保存。權(quán)利要求1、一種革蘭陽性需氧菌鑒定板，其特征在于該鑒定板由反應(yīng)底物原液和肉湯培養(yǎng)基組成，所述反應(yīng)底物原液在鑒定板上的位置及其各成分的濃度為g/ml位置溶液名稱濃度A1，A7水100％A2，A8糊精4％A3，A9N-乙酰-D-葡糖胺4％A4，A10N-乙酰-β-D-甘露糖胺4％A5，A11苦杏苷4％A6，A12L-樹膠醛糖4％B1，B7對(duì)苯二酚葡萄糖苷8％B2，B8D-纖維二糖4％B3，B9D-半乳糖4％B4，B10D-葡萄糖酸4％B5，B11α-D-葡萄糖4％B6，B12甘油4％C1，C7α-D-乳糖4％C2，C8乳果糖4％C3，C9麥芽糖4％C4，C10麥芽三糖4％C5，C11D-甘露醇4％C6，C12D-蜜二糖4％D1，D73-甲基-葡萄糖4％D2，D8β-甲基-D-葡糖苷4％D3，D9帕拉金糖4％D4，D10D-阿洛酮糖4％D5，D11D-棉子糖4％D6，D12D-核糖4％E1，E7水楊甙4％E2，E8D-山梨糖醇4％E3，E9蔗糖4％E4，E10D-塔格糖4％E5，E11D-海藻糖4％E6，E12松二糖4％F1，F(xiàn)7木糖醇4％F2，F(xiàn)8丙酮酸甲基酯4％F3，F(xiàn)9單甲基琥珀酸4％F4，F(xiàn)10醋酸2％F5，F(xiàn)11α-羥基丁酸鈉2％F6，F(xiàn)12α-酮戊酸2％G1，G7L-乳酸4％G2，G8D-丙氨酸2％G3，G9L-丙氨酸2％G4，G10L-丙氨酰-甘氨酸3％G5，G11L-絲氨酸3％G6，G12腺苷2％H1，H72’-脫氧腺苷2％H2，H8肌苷2％H3，H9胸腺嘧啶脫氧核苷2％H4，H10尿嘧啶核苷2％H5，H11尿嘧啶核苷-5’-單磷酸酯2％H6，H12D-葡萄糖-6-磷酸酯2％所述肉湯培養(yǎng)基由下列成分組成v/v物質(zhì)名稱所占比例純水64％GP/MT21.9％氯化銨水溶液4.4％GP混合貯液0.88％50μM葉酸水溶液0.088％8mM維生素K3亞硫酸氫鈉水溶液4.4％結(jié)晶紫水溶液4.4％2、根據(jù)權(quán)利要求1所述一種革蘭陽性需氧菌鑒定板，其特征在于所述肉湯培養(yǎng)基中的GP/MT由下列成分組成重量％濃度物質(zhì)名稱所占比例純水[H20]80%2水合磷酸二氫鈉4.68%磷酸氫二鈉12.775%氯化鉀2.61%十水合焦磷酸鈉0.018%3、根據(jù)權(quán)利要求1所述一種革蘭陽性需氧菌鑒定板，其特征在于所述肉湯培養(yǎng)基中的GP混合貯液由下列成分組成的GP混合試劑加水配置而成。重量％濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>4、根據(jù)權(quán)利要求1所述一種革蘭陽性需氧菌鑒定板，其特征在于所述革蘭陽性需氧菌鑒定板的底物及其在鑒定板上的位置為-<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>5、一種革蘭陽性需氧菌鑒定板的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)配制鑒定板反應(yīng)底物原液根據(jù)下列配置濃度要求配置各反應(yīng)底物的原液g/ml位置溶液名稱濃度Al，A7水100%A2，A8糊精4%A3，A9N-乙酰-D-葡糖胺4%A4，A10N-乙酰-e-D-甘露糖胺4%A5，All苦杏苷4%A6，A12L-樹膠醛糖4%Bl，B7對(duì)苯二酚葡萄糖苷8%B2，B8D-纖維二糖4%B3，B9D-半乳糖4%B4，B10D-葡萄糖酸4%B5，Blla-D-葡萄糖4%B6,B12甘油4%Cl，C7a-D-乳糖4%C2，C8乳果糖4%C3,C9麥芽糖4%C4，C10麥芽三糖4%C5，CllD-甘露醇4%C6，C12D-蜜二糖4%Dl，D73-甲基-葡萄糖4%D2，D8e-甲基-D-葡糖苷4%D3，D9帕拉金糖4%D4，D10D-阿洛酮糖4%D5，DllD-棉子糖4%D6，D12D-核糖4%El，E7水楊式4%E2，E8D-山梨糖醇4%E3,E9蔗糖4%E4，E10D-塔格糖4%E5，EllD-海藻糖4%E6，E12松二糖4%Fl，F(xiàn)7木糖醇4%F2，F(xiàn)8丙酮酸甲基酯4。/。F3，F(xiàn)9單甲基琥珀酸4%F4，F(xiàn)10醋酸2%F5，F(xiàn)lla-羥基丁酸鈉2%F6,F12a-酮戊酸2%Gl，G7L-乳酸4%G2，G8D-丙氮酸2%G3，G9L-丙氨酸2%G4，G10L-丙氨酰-甘氨酸3%G5,GllL-絲氨酸3%G6，G12腺苷2°/。Hl，H72'-脫氧腺苷2%H2，H8肌苷2%H3，H9胸腺嘧啶脫氧核苷2。/。H4，H10尿嘧啶核苷2%H5，Hll尿嘧啶核苷-5'-單磷酸酯2%H6，H12D-葡萄糖-6-磷酸酯2%(2)配制肉湯培養(yǎng)基①下列各物質(zhì)按比例混合配制GP/MT重量％濃度物質(zhì)名稱所占比例純水80%2水合磷酸二氫鈉4.68%磷酸氫二鈉12.775%氯化鉀2.61%十水合焦磷酸鈉0.018。/。②按下列各物質(zhì)配制濃度要求配制GP混合貯液g/ml物質(zhì)名稱濃度GP混和試劑加水配置溶液0.475%③根據(jù)下列配制濃度要求配制以下幾種物質(zhì)的水溶液g/ml<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>④按下列各物質(zhì)的比例混合配制肉湯培養(yǎng)基v/v物質(zhì)名稱所占比例純水64%GP/MT21.9%氯化銨水溶液4.4%GP混合!t液0.88%50UM葉酸水溶液0.088%8mM維生素K3亞硫酸氫鈉水溶液4.4%結(jié)晶紫水溶液4.4%(3)分裝①根據(jù)板條批量生產(chǎn)的數(shù)量要求將合適的步驟1配制的反應(yīng)底物原液分裝到96支試管中；②根據(jù)板條批量生產(chǎn)的數(shù)量要求將步驟2配制的肉湯培養(yǎng)基加入到①的試管中；(4)加樣分裝板條使用分裝系統(tǒng)在96孔的相應(yīng)位置對(duì)指定的鑒定板條加樣，每孔加50ul;(5)板條干燥上述板條常溫干燥16-18小時(shí)；(6)包裝。(7)板條存貯。全文摘要本發(fā)明提供了革蘭陽性需氧菌鑒定板。本發(fā)明鑒定板上的47個(gè)碳源和氮源組合可鑒定的革蘭陽性菌種類有300余種，可以鑒定葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、陽性桿菌等多種不同種類的細(xì)菌，且不需要進(jìn)行補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)就可以得出鑒定結(jié)果，操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，因而，有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明提供了革蘭陽性需氧菌鑒定板的制備方法。文檔編號(hào)C12Q1/04GK101469340SQ20071017306公開日2009年7月1日申請(qǐng)日期2007年12月26日優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日發(fā)明者朱駿娜,鄒艷芳,陳弛宇申請(qǐng)人:上海復(fù)星佰珞生物技術(shù)有限公司;上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司