專利名稱：包含活性化合物的顆粒的穩(wěn)定化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包括含酶混合物的顆粒，其中所述混合物添加到顆粒形成過(guò)程中時(shí)具有大于7的pH。本發(fā)明還涉及用于制造這種顆粒的方法。
背景技術(shù)：
本領(lǐng)域中已知通過(guò)將活性化合物摻入干燥的固體粒子(particles)或顆粒(granules)中，借以保護(hù)活性化合物免于失活，和/或保護(hù)環(huán)境免于活性化合物的影響。本領(lǐng)域中還已知通過(guò)將穩(wěn)定劑摻入到含有活性化合物的微粒中，借以保護(hù)活性化合物免于由環(huán)境中的攻擊性物質(zhì)導(dǎo)致的失活。
EP 206,417公開了包含酶核心和堿性緩沖鹽包覆層的酶顆粒組合物。
日本待審查專利申請(qǐng)(kokai)No.62-79298公開了防止含酶顆粒狀產(chǎn)品的酶活性降低的措施，在其描述的酶組合物中，含酶的核心部分用含有pH7-11的堿性緩沖鹽的保護(hù)層包覆。
EP 415652和EP 290223公開了含有被包覆的酶的漂白組合物，其中該包覆層可包含pH在11以上的堿性化合物，例如硅酸鈉。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供儲(chǔ)存穩(wěn)定性增加的含酶顆粒。
一個(gè)令人驚奇的發(fā)現(xiàn)是，通過(guò)將添加到顆粒形成過(guò)程中的酶混合物的pH調(diào)節(jié)到大于7，有可能提高含酶顆粒的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。
因此，本發(fā)明在第一個(gè)方面提供了用于制備酶顆粒的方法，其包括如下步驟a)制備包含酶的水成液，其中該水成液的pH大于7；b)將步驟a)的水成液添加到制粒設(shè)備；c)在制粒設(shè)備中制備粒子。
本發(fā)明還涉及可通過(guò)上述處理獲得的顆粒及所述顆粒的用途。
發(fā)明詳述定義本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“％RH”應(yīng)理解為空氣的相對(duì)濕度。100％RH是在固定溫度下被水氣飽和的空氣，因此％RH反映了空氣的百分比濕氣飽和度(percent moisture saturation)。
術(shù)語(yǔ)化合物或物質(zhì)的“恒定濕度”(constant humidity)(在本發(fā)明的內(nèi)容中有時(shí)縮寫為CH)可以理解為在具有給定溫度的密閉空間內(nèi)，與和所述化合物的固相接觸的所述化合物的飽和水溶液平衡的大氣的％RH。這個(gè)定義與《化學(xué)和物理學(xué)手冊(cè)》(“Handbook of chemistry and physics”，CRC Press，Inc.，Cleveland，USA，58th edition，p E46，1977-1978)一致。因此某化合物的CH20℃＝50％的意思是，在20℃條件下，50％濕度的空氣與該化合物的飽和水溶液平衡。因此，術(shù)語(yǔ)“恒定濕度”是化合物吸濕性質(zhì)的度量標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)含酶混合物的“pH”可以理解為將水性含酶混合物添加到制粒過(guò)程/制粒設(shè)備之前，在室溫測(cè)得的該含酶混合物的pH。
本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“含酶混合物”(enzyme comprising mixture)與術(shù)語(yǔ)“水性含酶混合物”(aqueous enzyme comprising mixture)覆蓋相同的范圍，應(yīng)理解為包含酶的水成液。所述混合物除了酶之外，還可以包含其他的組分。
本

發(fā)明內(nèi)容
中的“酶基質(zhì)”(enzyme matrix)理解為顆粒中包含酶的基質(zhì)。與“含酶混合物”的區(qū)別是，“酶基質(zhì)”是“含酶混合物”存在于制成的顆粒，即制備酶顆粒之后獲得的顆粒中時(shí)的干燥形式。
本

發(fā)明內(nèi)容
中使用的術(shù)語(yǔ)“酶濃縮液”(enzyme concentrate)應(yīng)理解為經(jīng)過(guò)處理提高了酶濃度的發(fā)酵濾出液。
引言顆粒中包含的酶的穩(wěn)定性在儲(chǔ)存時(shí)受到周圍環(huán)境，即可降低穩(wěn)定性的化學(xué)或物理因素的影響。特別地，濕度是對(duì)含酶顆粒的穩(wěn)定性而言的重要因素；尤其是高濕度會(huì)對(duì)穩(wěn)定性造成負(fù)面影響。
通常，將酶制粒中使用的酶濃縮液的pH調(diào)節(jié)到小于6，因?yàn)楣J(rèn)在略微酸性的環(huán)境中可以改善微生物穩(wěn)定性。
我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)提高在酶顆粒配制過(guò)程中使用的含酶水成液的pH可以顯著提高含酶顆粒的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)提高pH不會(huì)對(duì)酶造成危害。由于提高含酶液體在酶顆粒形成期間的pH，儲(chǔ)存之后顆粒的殘余酶活性顯著提高。
我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，通過(guò)添加附加的濕氣屏障(moisture barrier)，例如鹽包覆層(salt coating)，我們更進(jìn)一步地提高了儲(chǔ)存穩(wěn)定性，并獲得了更高的殘余酶活性。這種顯著的改善在更高的相對(duì)濕度下也可以見到。
本發(fā)明的顆粒本發(fā)明涉及包含核心和包覆層的顆粒，其中所述核心含有酶，該酶以含酶的水性混合物的形式添加到顆粒形成過(guò)程中，并且其中所述混合物的pH大于7。
本發(fā)明的顆粒含有由水性含酶混合物制備的酶基質(zhì)，該水性含酶混合物包括酶和任選的其他制粒材料。該顆粒還可包含至少一種包覆層，尤其是鹽包覆層。酶基質(zhì)存在于顆粒的核心，其或者被施加到無(wú)活性的核心微粒上或者本身作為核心。在本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案中，酶層被施加于無(wú)活性核心。
本發(fā)明的顆粒與用已知的pH小于7，例如小于6的水性含酶混合物制備的顆粒相比，儲(chǔ)存穩(wěn)定性得到改善。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含核心和包覆層的顆粒，其中所述核心包含酶，該酶以含酶水性混合物的形式添加到制粒過(guò)程中，其中所述含酶混合物的pH大于7，并且，與用pH小于7的含酶水性混合物制備的顆粒相比，該顆粒儲(chǔ)存時(shí)的酶穩(wěn)定性得到改善。在更具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有核心和包覆層的顆粒，其中所述核心包含在制粒過(guò)程中以含酶水性混合物的形式添加的酶。
本發(fā)明的顆粒儲(chǔ)存時(shí)的殘余酶活性得到提高在密封罐內(nèi)于40℃儲(chǔ)存13周后，測(cè)得超過(guò)5％，例如超過(guò)10％，甚至超過(guò)20％的增加。在具體的實(shí)施方案中，在密封罐內(nèi)40℃條件下儲(chǔ)存13周后的顆粒的殘余酶穩(wěn)定性增加了超過(guò)50％。
在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在密封罐內(nèi)于40℃儲(chǔ)存13周后，含酶核心粒子的殘余酶活性為至少5％，例如至少10％，至少15％，至少20％，甚至至少30％。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，在密封罐內(nèi)于40℃儲(chǔ)存13周后，本發(fā)明顆粒的殘余酶活性為至少50％，例如至少60％，至少70％，至少80％，甚至至少90％。
含酶混合物含酶混合物、含酶液體包含在液體，例如水中的酶和任選的其它制粒材料。
在本發(fā)明特殊的實(shí)施方案中，含酶混合物是酶濃縮液。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，含酶混合物是與其它制粒材料混合的酶濃縮液。
含酶混合物在制粒過(guò)程之前被調(diào)節(jié)到pH大于7，例如大于8，甚至大于9，例如大于10。在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，含酶混合物的pH為7-13。在本發(fā)明更加具體的實(shí)施方案中，含酶混合物的pH為8-12。在本發(fā)明更加具體的實(shí)施方案中，含酶混合物的pH為9-12。在本發(fā)明更加具體的實(shí)施方案中，含酶混合物的pH為9-11。在本發(fā)明最具體的實(shí)施方案中，含酶混合物的pH為10-11。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，含酶混合物的pH小于12，例如小于11。
含酶混合物的堿性pH可以通過(guò)向混合物中添加堿性化合物例如氫氧化鈉而獲得。
除了酶之外，含酶混合物可以用為混合物材料提供期望的功能性質(zhì)的任何方法或者任何材料構(gòu)建，例如該混合物可以由這樣的材料構(gòu)成，其允許酶在被導(dǎo)入水性介質(zhì)時(shí)容易地釋放。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，核心粒子由無(wú)活性核心構(gòu)建而成，其中含酶混合物吸收(absorb)到和/或被施加到該無(wú)活性核心表面上。
另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，如所謂的T顆粒中那樣制備核心，其中混合酶和制粒材料形成包含酶的顆粒，其中酶遍布于核心中，如在US4,106,991中描述的，例如實(shí)施例1。任何常規(guī)的方法和非酶材料都可以用于制備核心。已知的常規(guī)核心和材料的實(shí)例典型地在下列文獻(xiàn)中說(shuō)明US4,106,991，EP 170360，EP 304332，EP 304331，EP 458849，EP 458845，WO97/39116，WO 92/12645，WO 89/08695，WO 89/08694，WO 87/07292，WO91/06638，WO 92/13030，WO 93/07260，WO 93/07263，WO 96/38527，WO96/16151，WO 97/23606，US 5,324,649，US 4,689,297，EP 206417，EP 193829，DE 4344215，DE 4322229 A，DD 263790，JP 61162185 A，JP 58179492。
堿性化合物任何在添加到含酶混合物中時(shí)可提供大于7的pH的化合物都可以用于調(diào)節(jié)含酶混合物的pH。合適的化合物可以是堿，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀或堿性緩沖鹽。
合適的緩沖鹽可以是碳酸氫鉀、碳酸鉀、焦磷酸四鉀、三聚磷酸鉀、碳酸氫鈉和碳酸鈉。也可以使用其他合適的鹽。
酶本

發(fā)明內(nèi)容
中的酶可以是任何酶或不同酶的組合。因此，當(dāng)指稱“酶”時(shí)，一般可以理解為包含一種酶或多種酶的組合。
應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語(yǔ)“酶”的含義也包括酶的變體(例如通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)的)。所述酶變體的實(shí)例在如下文獻(xiàn)中有公開，例如EP 251,446(Genencor)，WO 91/00345(Novo Nordisk)，EP 525,610(Solvay)and WO 94/02618(Gist-Brocades NV)。
酶可以根據(jù)NC-IUBMB，1992的《酶命名法》(Enzyme Nomenclature)手冊(cè)加以分類，另見互聯(lián)網(wǎng)上ENZYME站點(diǎn)http//www.expasy.ch/enzyme/。ENZYME是酶命名法相關(guān)信息的庫(kù)。它主要是根據(jù)國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)(International Union of Biochemistry and Molecular Biology，IUB-MB)命名委員會(huì)的推薦(Academic Press，Inc.，1992)，并且它描述了各類具有EC(酶學(xué)委員會(huì))編號(hào)的、已被定性的酶(Bairoch A.The ENZYMEdatabase，2000，Nucleic Acids Res 28304-305)。IUB-MB酶命名法是基于其底物特異性，偶爾是基于其分子機(jī)制；這種分類不反映這些酶的結(jié)構(gòu)特征。
數(shù)年前提出了另一種分類方法，即將某些糖基水解酶，例如內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶和α-半乳糖苷酶歸類為基于氨基酸序列相似性的家族。它們目前分成90個(gè)不同的家族見CAZy(ModO)互聯(lián)網(wǎng)地址(Coutinho，P.M.& Henrissat，B.(1999)Carbohydrate-Active Enzymes server)，URLhttp//afmb.cnrs-mrs.fr/～cazy/CAZY/index.html(相應(yīng)論文Coutinho，P.M.& Henrissat，B.(1999)Carbohydrate-active enzymesan integrated databaseapproach.該文收集于“Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering”；H.J.Gilbert，G.Davies，B.Henrissat and B.Svensson eds.，The Royal Society ofChemistry，Cambridge，pp.3-12；Coutinho，P.M.& Henrissat，B.(1999)Themodular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzymesanintegrated database approach.該文收集于“Genetics，Biochemistry and Ecologyof Cellulose Degradation”.；K.Ohmiya，K.Hayashi，K.Sakka，Y.Kobayashi，S.Karita and T.Kimura eds.，Uni Publishers Co.，Tokyo，pp.15-23).
可以摻入本發(fā)明顆粒中的酶的類型包括氧化還原酶(EC 1.-.-.-)、轉(zhuǎn)移酶(EC 2.-.-.-)、水解酶(EC 3.-.-.-)、裂合酶(EC 4.-.-.-)、異構(gòu)酶(EC 5.-.-.-)和連接酶(EC 6.-.-.-)。
已發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明特別適用于氧化還原酶。
本發(fā)明中優(yōu)選的氧化還原酶是過(guò)氧化物酶(EC 1.11.1)、漆酶(EC 1.10.3.2)和葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)。商業(yè)上可獲得的氧化還原酶(EC 1.-.-.-)實(shí)例有GluzymeTM(可從Novozymes A/S獲得的酶)。其他的氧化還原酶可以從其他供應(yīng)者獲得。優(yōu)選的轉(zhuǎn)移酶是歸于任一如下亞類中的轉(zhuǎn)移酶a.轉(zhuǎn)移一碳基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶(EC 2.1)；b.轉(zhuǎn)移醛或酮?dú)埢霓D(zhuǎn)移酶(EC 2.2)；?；D(zhuǎn)移酶(EC 2.3)；c.糖基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4)；d.轉(zhuǎn)移除甲基之外的烷基或芳基的轉(zhuǎn)移酶(EC 2.5)；和e.轉(zhuǎn)移含氮基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶(EC 2.6)。
本發(fā)明中一種最優(yōu)選類型的轉(zhuǎn)移酶是谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(蛋白質(zhì)-谷氨酰胺γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶；EC 2.3.2.13)。
合適谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶進(jìn)一步的實(shí)例在WO 96/06931(Novo Nordisk A/S)中有說(shuō)明。
本發(fā)明已被證實(shí)尤其可用于水解酶，例如植酸酶。
本

發(fā)明內(nèi)容
中優(yōu)選的水解酶是羧酸酯水解酶(EC 3.1.1.-)，例如脂肪酶(EC 3.1.1.3)；植酸酶(EC 3.1.3.-)，例如3-植酸酶(EC 3.1.3.8)和6-植酸酶(EC3.1.3.26)；糖苷酶(EC 3.2，其屬于本文稱作“糖酶”的類群)，例如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；肽酶(EC 3.4，也稱作蛋白酶)；和其他羰基水解酶。商業(yè)可獲得的植酸酶的實(shí)例包括Bio-FeedTM植酸酶(Novozymes)，RonozymeTMP(DSM Nutritional Products)，NatuphosTM(BASF)，F(xiàn)inaseTM(AB Enzymes)，和PhyzymeTM產(chǎn)品系列(Danisco)。其它合適的植酸酶包括在WO 98/28408，WO00/43503，和WO 03/066847中說(shuō)明的植酸酶。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明特別適用于糖酶，例如淀粉酶。
在本發(fā)明的內(nèi)容中，術(shù)語(yǔ)“糖酶”不僅指能夠降解碳水化合物鏈，特別是五元和六元環(huán)結(jié)構(gòu)的碳水化合物鏈(例如淀粉或纖維素)的酶(也就是糖苷酶，EC 3.2)，還包括能夠使碳水化合物異構(gòu)化的酶，所述碳水化合物例如六元環(huán)結(jié)構(gòu)如D-葡萄糖，和五元環(huán)結(jié)構(gòu)，如D-果糖。
重要的糖酶包括如下(括號(hào)內(nèi)是EC編號(hào))α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)，β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)，葡聚糖1，4-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.3)，內(nèi)切-1，4-β-葡聚糖酶(纖維酶，EC 3.2.1.4)，內(nèi)切-1，3(4)-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)，內(nèi)切-1，4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)，葡聚糖酶(EC 3.2.1.11)，幾丁質(zhì)酶(EC 3.2.1.14)，多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)，溶菌酶(EC3.2.1.17)，β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)，α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)，β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)，淀粉-1，6-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.33)，木聚糖1，4-β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)，葡聚糖內(nèi)切-1，3-β-D-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.39)，α-糊精內(nèi)切-1，6-α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.41)，蔗糖α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.48)，葡聚糖內(nèi)切-1，3-α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.59)，葡聚糖1，4-β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.74)，葡聚糖內(nèi)切-1，6-β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.75)，半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)，阿聚糖內(nèi)切-1，5-α-L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)，乳糖酶(EC 3.2.1.108)，殼聚糖酶(EC 3.2.1.132)和木糖異構(gòu)酶(EC 5.3.1.5)。
商業(yè)可獲得的蛋白酶(肽酶)的實(shí)例包括KannaseTM，EverlaseTM，EsperaseTM，AlcalaseTM，NeutraseTM，DurazymTM，SavinaseTM，OvozymeTM，PyraseTM，Pancreatic Trypsin NOVO(PTN)，Bio-FeedTMPro和Clear-LensTMPro(均可從Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark獲得)。其他優(yōu)選的蛋白酶包括在WO 01/58275和WO 01/58276中說(shuō)明的蛋白酶。
其他商業(yè)可獲得的蛋白酶包括RonozymeTMPro，MaxataseTM，MaxacalTM，MaxapemTM，OpticleanTM，PropeaseTM，PurafectTMand Purafect OxTM(可以從Genencor International Inc.，Gist-Brocades，BASF或DSM Nutritional Products獲得)。
商業(yè)可獲得的脂肪酶的實(shí)例包括LipexTM，LipoprimeTM，LipopanTM，LipolaseTM，LipolaseTMUltra，LipozymeTM，PalataseTM，ResinaseTM，NovozymTM435和LecitaseTM(均可從Novozymes A/S獲得)。
其他商業(yè)可獲得的脂肪酶包括LumafastTM(來(lái)自Genencor InternationalInc.的門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina)脂肪酶)；LipomaxTM(來(lái)自Gist-Brocades/Genencor Int.Inc.的產(chǎn)堿假單胞菌(Ps.pseudoalcaligenes)脂肪酶；和來(lái)自Solvay enzymes的一種芽孢桿菌(Bacillus sp.)脂肪酶)。更多的脂肪酶可以從其他供應(yīng)商獲得。
商業(yè)上可獲得的糖酶實(shí)例包括Alpha-GalTM，Bio-FeedTMAlpha，Bio-FeedTMBeta，Bio-FeedTMPlus，Bio-FeedTMWheat，Bio-FeedTMZ，NovozymeTM188，CarezymeTM，CelluclastTM，CellusoftTM，CelluzymeTM，CeremylTM，CitrozymTM，DenimaxTM，DezymeTM，DextrozymeTM，DuramylTM，EnergexTM，F(xiàn)inizymTM，F(xiàn)ungamylTM，GamanaseTM，GlucanexTM，LactozymTM，LiquezymeTM，MaltogenaseTM，NatalaseTM，PentopanTM，PectinexTM，PromozymeTM，PulpzymeTM，NovamylTM，TermamylTM，AMGTM(Amyloglucosidase Novo)，MaltogenaseTM，SweetzymeTM和AquazymTM(均可從Novozymes A/S獲得)。進(jìn)一步的糖酶可以從其他供應(yīng)商獲得，例如RoxazymeTM和RonozymeTM產(chǎn)品系列(DSM Nutritional Products)，AvizymeTM，PorzymeTM和GrindazymeTM產(chǎn)品系列(Danisco，F(xiàn)innfeeds)，和NatugrainTM(BASF)，PurastarTM和PurastarTMOxAm(Genencor)。
其他商業(yè)可獲得的酶包括MannawayTM，PectawayTM，StainzymeTM和RenozymeTM。
已經(jīng)證實(shí)，本發(fā)明特別適用于顯示有漆酶活性的酶的配制。
顯示漆酶活性的化合物可以是由國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUBMB)命名委員會(huì)頒布的酶分類EC 1.10.3.2包含的任何漆酶，或者由其衍生的并顯示有漆酶活性的任何片段，或者顯示有類似活性的化合物，例如兒茶酚氧化酶(EC 1.10.3.1)、鄰氨基苯酚氧化酶(EC 1.10.3.4)或膽紅素氧化酶(EC 1.3.3.5)。
優(yōu)選的顯示漆酶活性的漆酶和/或化合物是源自微生物的酶。這些酶可以源自植物、細(xì)菌或真菌(包括絲狀真菌和酵母)。
合適真菌來(lái)源的實(shí)例包括源自于如下菌株的漆酶曲霉屬(Aspergillus)，脈孢菌屬(Neurospora)，例如粗糙脈孢菌(N.crassa)，柄孢殼屬(Podospora)，葡萄孢屬(Botrytis)，金錢菌屬(Collybia)，層孔菌屬(Fomes)，香菇屬(Lentinus)，側(cè)耳屬(Pleurotus)，栓菌屬(Trametes)，例如，T.villosa和T.versicolor，絲核菌屬(Rhizoctonia)，例如，立枯絲核菌(R.solani)，鬼傘屬(Coprinus)，例如，灰蓋鬼傘(C.cinereus)，毛頭鬼傘(C.comatus)，費(fèi)賴斯鬼傘(C.friesii)，和褶紋鬼傘(C.plicatilis)，小脆柄菇屬(Psathyrella)，例如，P.condelleana，斑褶菇屬(Panaeolus)，例如，蝶形斑褶菇(P.papilionaceus)，毀絲霉屬(Myceliophthora)，例如，M.thermophila，柱頂孢屬(Schytalidium)，例如，S.thermophilum，多孔菌屬(Polyporus)，例如，P.pinsitus，射脈菌屬(Phlebia)，例如，射脈菌(P.radita)(WO 92/01046)，或擬革蓋菌屬(Coriolus)，例如，C.hirsutus(JP 2-238885)。
合適的細(xì)菌來(lái)源的實(shí)例包括源自于芽孢桿菌菌株的漆酶。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，漆酶源自于鬼傘屬，毀絲霉屬，多孔菌屬，柱頂孢屬或絲核菌屬。在更特殊的實(shí)施方案中，漆酶源自于灰蓋鬼傘，Myceliophthora thermophila，Polyporus pinsitus，Scytalidium thermophilum或立枯絲核菌。
漆酶或與漆酶有關(guān)的酶還可以是通過(guò)如下方法產(chǎn)生的酶，該方法包括用重組DNA載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，該重組DNA載體攜帶有編碼所述漆酶的DNA序列和編碼允許編碼漆酶的DNA序列表達(dá)的功能的DNA序列，在允許漆酶表達(dá)條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，和從培養(yǎng)物中回收漆酶。
在本發(fā)明特殊實(shí)施方案中，酶選自下組源自于鬼傘屬，毀絲霉屬，多孔菌屬，柱頂孢屬和絲核菌屬的漆酶。特別地，在WO 95/33836，WO96/00290，WO 95/33837和WO 95/07988中分別提到了源自于毀絲霉屬，多孔菌屬，柱頂孢屬和絲核菌屬的漆酶，本文引用它們的內(nèi)容作為參考。
確定漆酶活性(LACU)漆酶的活性(特別適用于多孔菌漆酶)可以由在有氧條件下丁香醛連氮的氧化加以確定。用光度計(jì)在530nm測(cè)量所產(chǎn)生的紫色。分析條件是19mM丁香醛連氮，23mM乙酸鹽緩沖液，pH5.5，30℃，1min反應(yīng)時(shí)間。
1漆酶單位(LACU)是在這些條件下每分鐘催化1.0mmol丁香醛連氮的轉(zhuǎn)化的酶量。
確定漆酶活性(LAMU)漆酶的活性可以通過(guò)有氧條件下丁香醛連氮的氧化來(lái)確定。在530nm測(cè)量所產(chǎn)生的紫色。分析條件是19mM丁香醛連氮，23mM Tris/馬來(lái)酸鹽緩沖液，pH7.5，30℃，1min反應(yīng)時(shí)間。
1漆酶單位(LAMU)是在這些條件下每分鐘催化轉(zhuǎn)化1.0mmol丁香醛連氮的酶量。
惰性核心(inert cores)惰性核心與無(wú)活性核心相同，指在添加到本發(fā)明過(guò)程中時(shí)基本上沒(méi)有酶的核心顆粒。惰性核心可以是載體核(carrier nuclei)、安慰劑核(placebonuclei)或上面可以形成含酶混合物層的種子(seed)。惰性核心可以包含無(wú)機(jī)鹽、糖、糖醇、有機(jī)小分子如有機(jī)酸或鹽、礦物質(zhì)如黏土或硅酸鹽、或上述各項(xiàng)中兩個(gè)或多個(gè)的組合。
在顆粒制備期間，酶可以吸附到核心上面/內(nèi)部。
在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，可以通過(guò)將含酶混合物施加到惰性核心上面來(lái)制備核心顆粒。
附加制粒材料顆粒中可以摻入的附加制粒材料可以是粘合劑、多糖、合成聚合物、蠟、增強(qiáng)劑(enhancing agents)、填充物(fillers)、纖維材料、酶穩(wěn)定劑、助溶劑(solubilising agent)、交聯(lián)劑、懸浮劑、粘度調(diào)節(jié)劑、輕質(zhì)球(lightspheres)、氯清除劑、增塑劑、色素、鹽、潤(rùn)滑劑(例如表面活性劑或抗靜電劑)和芳香劑(fragrances)。
附加制粒材料可以在將混合物添加到顆粒形成過(guò)程之前添加到含酶混合物中，或者可以將它們單獨(dú)添加到過(guò)程中。
粘合劑(binders)合適的粘合劑是具有高熔點(diǎn)或者根本沒(méi)有熔點(diǎn)、且為非蠟狀(non-waxy)性質(zhì)的粘合劑，例如聚乙烯吡咯烷酮、糊精、聚乙烯醇、纖維素衍生物如羥丙基纖維素、甲基纖維素或CMC。合適的粘合劑是碳水化合物粘合劑，例如糊精如Glucidex 21D和Avedex W80。
多糖本發(fā)明的多糖可以是未經(jīng)修飾的天然存在的多糖或經(jīng)過(guò)修飾的天然存在的多糖。
合適的多糖包括纖維素、果膠、糊精和淀粉。淀粉在水中可溶或不溶。
在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，多糖是淀粉。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，多糖是不溶性淀粉。
從多種植物來(lái)源的天然存在的淀粉可適用于本發(fā)明(或者作為淀粉本身，或者作為修飾淀粉的出發(fā)點(diǎn))，重要的淀粉包括來(lái)源于下列植物的淀粉稻(rice)、玉米(com)、小麥(wheat)、馬鈴薯(potato)、燕麥(oat)、木薯(cassava)、西谷椰子屬(sago palm)、yuca、大麥(barley)、甘薯(sweet potato)、高粱(sorghum)、薯蕷(yams)、黑麥(rye)、粟(millet)、蕎麥(buckwheat)、竹芋(arrowroot)、芋頭(taro)、箭葉黃體芋(tannia)，并且可以是例如面粉形式。
其中，木薯淀粉是本發(fā)明中優(yōu)選的淀粉；在這一點(diǎn)上需要指出，木薯和木薯淀粉已知有多種同義名，包括tapioca、manioc、mandioca和manihot。
如本

發(fā)明內(nèi)容
所采用的，術(shù)語(yǔ)“變性淀粉”(modified starch)是指經(jīng)歷了某種至少部分的化學(xué)修飾、酶修飾和/或物理或物理化學(xué)修飾，并且一般顯示與“親本”淀粉不同的性質(zhì)的天然淀粉。
合成聚合物合成聚合物可以從如下選擇聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、多磺酸鹽(polysulfonate)、聚羧酸酯(polycarboxylate)及其共聚物，特別是水溶聚合物或共聚物。
蠟本發(fā)明中的“蠟”(wax)應(yīng)理解為熔點(diǎn)為25-150℃，具體為30-100℃，更具體為35-85℃，最具體為40-75℃的聚合物材料。蠟優(yōu)選地在室溫25℃條件下呈固態(tài)。下限優(yōu)選使得石蠟開始熔化的溫度與顆?；蚝蓄w粒的組合物通常儲(chǔ)存的溫度，即20-30℃之間有合理的距離。
對(duì)于某些顆粒，例如去污劑工業(yè)中使用的顆粒，蠟的一個(gè)優(yōu)選特征是，蠟應(yīng)是水溶性的或者水可分散性的，特別是在中性和堿性溶液中，從而在將本發(fā)明的包覆微粒被導(dǎo)入水溶液時(shí)，也就是用水稀釋它時(shí)，石蠟應(yīng)當(dāng)崩解(disintegrate)和/或溶解，使摻入微粒中的活性物(active)得以快速釋放和溶解到水溶液中。水溶性蠟的實(shí)例有聚乙二醇(PEG’s)?？煞稚⒃谒芤褐械乃蝗苄韵炗懈视腿?triglycerides)和油(oils)。對(duì)于某些顆粒，優(yōu)選地，包覆層含有一些不溶性蠟，例如飼料顆粒(feed granules)。
本發(fā)明的蠟組合物可以包括任何化學(xué)合成的蠟。它還可以同等合適地包括從自然來(lái)源分離的蠟或其衍生物。因此，本發(fā)明的蠟組合物可以包括從下面非限制性的蠟的列表中選擇的蠟。
-聚乙二醇，PEG.具有不同分子尺寸的不同PEG可以從商業(yè)上獲得，其中分子尺寸小的PEG熔點(diǎn)也低。合適的PEG的實(shí)例有PEG 1500，PEG2000，PEG 3000，PEG 4000，PEG 6000，PEG 8000，PEG 9000等，例如來(lái)自BASF(Pluriol E系列)或來(lái)自Clariant或Ineos。還可以使用聚乙二醇的衍生物。
-聚丙烯(polypropylens)(例如來(lái)自BASF的聚丙二醇(polypropylenglycol)Pluriol P系列)或聚乙烯(polyethylens)或其混合物。還可以使用聚丙烯和聚乙烯的衍生物。
-在室溫呈固體的非離子表面活性劑，例如具有高乙氧基水平的乙氧基化脂肪醇，如來(lái)自BASF的Lutensol AT系列，每分子具有不同量環(huán)氧乙烷(ehtyleneoxide)的C16-C18脂肪醇，例如Lutensol AT11，AT13，AT25，AT50，AT80，其中數(shù)字表示環(huán)氧乙烷基團(tuán)的平均數(shù)目。或者，環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷的聚合物或其共聚物是有用的，如用于嵌段共聚物，例如得自于BASF的Pluronic PE 6800中。乙氧基化脂肪醇的衍生物。
-從自然來(lái)源中分離的蠟，例如巴西棕櫚蠟(Carnauba wax)(熔點(diǎn)為80-88℃)，小燭樹蠟(Candelilla wax)(熔點(diǎn)為68-70℃)和蜂蠟。其他的天然蠟或其衍生物有來(lái)源于動(dòng)物或植物的蠟，例如海洋來(lái)源的蠟。氫化植物油或動(dòng)物脂(tallow)。這類蠟的實(shí)例有氫化牛脂(ox tallow)、氫化棕櫚油、氫化棉籽油(cotton seeds)和/或氫化豆油，其中本文使用的術(shù)語(yǔ)“氫化”理解為不飽和碳水化合物鏈，例如甘油三酯中不飽和碳水化合物鏈的飽和化，其中碳＝碳雙鍵被轉(zhuǎn)變成碳-碳單鍵。氫化棕櫚油可以從例如HobumOele und Fette GmbH-Germany或Deutche Cargill GmbH-Germany商購(gòu)。
-脂肪酸醇(fatty acid alcohols)，例如來(lái)自Condea ChemieGMBH-Germany的線性長(zhǎng)鏈脂肪酸醇NAFOL 1822(C18，20，22)，熔點(diǎn)為55-60℃。脂肪酸醇衍生物。
-單甘油酯和/或二甘油酯，例如硬脂酸甘油酯(glyceryl stearate)，是有用的蠟，其中硬脂酸甘油酯中的硬脂酸(stearate)是硬脂酸(stearic acid)和棕櫚酸的混合物。這類的實(shí)例有來(lái)自Danisco Ingredients，Denmark的Dimodan PM。
-脂肪酸，例如氫化的線性長(zhǎng)鏈脂肪酸和脂肪酸衍生物。
-石蠟(paraffines)，也就是固體碳?xì)浠衔铩?br> -微晶蠟(micro-crystalline wax)。
在其它的實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明的蠟可見于如下文獻(xiàn)中C.M.McTaggart et.al.，Int.J.Pharm.19，139(1984)或Flanders et.al.，Drug Dev.Ind.Pharm.13，1001(1987)，本文引入其內(nèi)容作為參考。
在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蠟是兩種或多種蠟的混合物。
在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，蠟從下組中選擇PEG、乙氧基化脂肪醇、脂肪酸、脂肪酸醇和甘油酯。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，蠟選自合成蠟。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蠟是PEG或非離子表面活性劑。在本發(fā)明一個(gè)最具體的實(shí)施方案中，所述蠟是PEG。
發(fā)酵液(fermentation broth)根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵液包含生物質(zhì)(biomass)，例如微生物細(xì)胞和/或其細(xì)胞碎片。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，發(fā)酵液包含至少10％的來(lái)源于發(fā)酵的生物質(zhì)，更優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少75％，最優(yōu)選至少90％或至少95％的源自于發(fā)酵的生物質(zhì)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，發(fā)酵液含有0-31％w/w干物質(zhì)，優(yōu)選0-20％w/w，更優(yōu)選0-15％w/w，例如10-15％w/w干物質(zhì)，0％干物質(zhì)被排除在所述范圍之外。生物質(zhì)可以占到干物質(zhì)的90％w/w，優(yōu)選地占到75％w/w，更優(yōu)選地占到干物質(zhì)的50％w/w，而酶可以占到干物質(zhì)的50％w/w，優(yōu)選地占到25％w/w，更優(yōu)選地占到干物質(zhì)的10％w/w。
發(fā)酵液可以通過(guò)過(guò)濾純化以獲得發(fā)酵濾液。
增強(qiáng)劑一些酶，如漆酶，往往底物特異性不夠?qū)?，從而在不引入增?qiáng)劑的條件下無(wú)法實(shí)際使用；增強(qiáng)劑提高底物的可得性(availability)，通過(guò)例如氧化底物。
增強(qiáng)劑特別適用于與漆酶組合使用以除去氣味，例如口臭導(dǎo)致的氣味。在具體的實(shí)施方案中，顆粒包含漆酶和增強(qiáng)劑。
增強(qiáng)劑可以從如下組中選擇脂肪族(aliphatic)、脂環(huán)族(cyclo-aliphatic)、含有＞N-OH部分的雜環(huán)或芳香化合物。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，增強(qiáng)劑是具有通式I的化合物 其中R1，R2，R3，R4從如下組中獨(dú)立選出氫、鹵素、羥基、甲?；Ⅳ然捌潲}和酯、氨基、硝基、C1-12-烷基，C1-6-烷氧基，羰基(C1-12-烷基)，芳基，特別是苯基、磺基、氨基磺?；被柞；㈧Ⅴ；㈧ⅤＱ趸?phosphonooxy)及其鹽和酯，其中R1，R2，R3，R4可以被R5取代，其中R5代表氫、鹵素、羥基、甲?；?、羧基及其鹽和酯、氨基、硝基、C1-12-烷基、C1-6-烷氧基、羰基(C1-12-烷基)、芳基，特別是苯基、磺基、氨基磺?；?、氨基甲?；?、膦?；㈧ⅤＱ趸?，及其鹽和酯；[X]表示從下組選出的基團(tuán)(-N＝N-)，(-N＝CR6-)m，(-CR6＝N-)m，(-CR7＝CR8-)m，(-CR6＝N-NR7-)，(-N＝N-CHR6-)，(-N＝CR6-NR7-)，(-N＝CR6-CHR7-)，(-CR6＝N-CHR7-)，(-CR6＝CR7-NR8-)，和(-CR6＝CR7-CHR8-)，其中R6，R7，和R8彼此獨(dú)立并選自下組H，OH，NH2，COOH，SO3H，C1-6-烷基，NO2，CN，Cl，Br，F(xiàn)，CH2OCH3，OCH3，和COOCH3；并且m是1或2。
術(shù)語(yǔ)“C1-n-羥基”，其中n可以是2-12，其在本文中代表具有1到指定數(shù)目的碳原子的枝化(branched)或直鏈羥基。典型的C1-6-羥基包括，但不僅限于，甲基、乙基、正丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、己基、異己基等。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，增強(qiáng)劑是具有通式II的化合物
其中R1，R2，R3，R4從如下組中獨(dú)立選出氫、鹵素、羥基、甲?；?、羧基及其鹽和酯、氨基、硝基、C1-12-烷基、C1-6-烷氧基、羰基(C1-12-烷基)、芳基，特別是苯基、磺基、氨基磺?；?、氨基甲?；?、膦酰基、膦酰氧基，及其鹽和酯，其中R1，R2，R3，R4可以用R5取代，其中R5代表氫、鹵素、羥基、甲?；?、羧基及其鹽和酯、氨基、硝基、C1-12-烷基、C1-6-烷氧基、羰基(C1-12-烷基)、芳基，特別是苯基、磺基、氨基磺?；被柞；㈧Ⅴ；?、膦酰氧基，及其鹽和酯。
增強(qiáng)劑還可以是式I或II的鹽或酯。
其它優(yōu)選的增強(qiáng)劑是雜環(huán)化合物的含氧衍生物(oxoderivatives)和N-羥基衍生物，和雜環(huán)化合物的含氧衍生物和甲酰衍生物的肟，所述雜環(huán)化合物包括五元含氮雜環(huán)，特別是吡咯(pyrrol)、吡唑和咪唑及它們對(duì)應(yīng)的氫化物(例如吡咯烷)以及三唑，例如1，2，4-三唑；六元含氮雜環(huán)，特別是單、二和三氮雜環(huán)己烷(mono-，di-and triazinanes)(例如哌啶和哌嗪)；嗎啉和它們對(duì)應(yīng)的不飽和物(例如吡啶和嘧啶)；和含有上述雜環(huán)作為亞結(jié)構(gòu)的稠雜環(huán)，例如吲哚、苯并噻唑、喹啉和苯并氮雜(benzoazepine)。
上述各類化合物中優(yōu)選的增強(qiáng)劑的實(shí)例有吡啶醛肟；N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxypyrrolidinediones)例如N-羥基丁二酰亞胺(N-hydroxysuccinimide)和N-羥基鄰苯二甲酰亞胺(N-hydroxyphthalimide)；3，4-二氫-3-羥基苯并[1，2，3]三嗪-4-酮；(3，4-dihydro-3-hydroxybenzo[1，2，3]triazine-4-one)；甲肟三聚體(formaloximetrimer)(N，N’，N”-三羥基-1，3，5-六氫三嗪)(N，N’，N”-trihydroxy-1，3，5-triazinane)；和紫尿酸(1，3-二氮雜環(huán)己烷-2，4，5，6-四酮-5-肟)(1，3-diazinane-2，4，5，6-tetrone-5-oxime)。
可用于本發(fā)明的更進(jìn)一步的增強(qiáng)劑包括芳香化合物的含氧衍生物和甲酰衍生物的肟，例如苯醌二肟(benzoquinone dioxime)和水楊醛肟(2-羥基苯甲醛肟(2-hydroxybenzaldehyde oxime))和N-羥基酰胺(N-hydroxyamides)和N-羥基酰苯胺(N-hydroxyanilides)，例如N-羥基乙酰苯胺(N-hydroxyacetanilide)。
優(yōu)選的增強(qiáng)劑從如下組中選擇1-羥基苯并三唑；1-羥基苯并三唑水合物；1-羥基苯并三唑鈉鹽；1-羥基苯并三唑鉀鹽；1-羥基苯并三唑鋰鹽；1-羥基苯并三唑銨鹽；1-羥基苯并三唑鈣鹽；1-羥基苯并三唑鎂鹽；和1-羥基苯并三唑-6-磺酸。
特別優(yōu)選的增強(qiáng)劑是1-羥基苯并三唑。
對(duì)所有上述N-羥基化合物的規(guī)定在任何相關(guān)情況下均可理解為包含互變異構(gòu)形式，例如N-氧化物(N-oxides)。
另一種優(yōu)選的增強(qiáng)劑基團(tuán)包含-CO-NOH-基團(tuán)，并具有通式III 其中A是 B與A相同，或者B是H或C1-12-烷基，所述烷基可以含有羥基、酯基或醚基(例如，其中醚氧直接與A-N(OH)C＝O-連接，因此包括N-羥基氨基甲酸酯衍生物)，R2，R3，R4，R5和R6彼此獨(dú)立，為H，OH，NH2，COOH，SO3H，C1-8-烷基，酰基，NO2，CN，Cl，Br，F(xiàn)，CF3，NOH-CO-苯基，CO-NOH-苯基，C1-6-CO-NOH-A，CO-NOH-A，COR12，苯基-CO-NOH-A，OR7，NR8R9，COOR10，或NOH-CO-R11，其中R7，R8，R9，R10，R11和R12是C1-12-烷基或酰基。
A的R2，R3，R4，R5和R6優(yōu)選是H，OH，NH2，COOH，SO3H，C1-3-烷基，酰基，NO2，CN，Cl，Br，F(xiàn)，CF3，NOH-CO-苯基，CO-NOH-苯基，COR12，OR7，NR8R9，COOR10，或NOH-CO-R11，其中R7，R8和R9是C1-3-烷基或?；琑10，R11和R12是C1-3-烷基；更優(yōu)選地，A的R2，R3，R4，R5和R6是H，OH，NH2，COOH，SO3H，CH3，?；?，NO2，CN，Cl，Br，F(xiàn)，CF3，CO-NOH-苯基，COCH3，OR7，NR8R9，或COOCH3，其中R7，R8和R9是CH3或COCH3；更優(yōu)選地，A的R2，R3，R4，R5和R6是H，OH，COOH，SO3H，CH3，?；?，NO2，CN，Cl，Br，F(xiàn)，CO-NOH-苯基，OCH3，COCH3，或COOCH3；特別地，A的R2，R3，R4，R5和R6是H，OH，COOH，SO3H，CH3，NO2，CN，Cl，Br，CO-NOH-苯基或OCH3。
B的R2，R3，R4，R5和R6優(yōu)選地是H，OH，NH2，COOH，SO3H，C1-3-烷基，酰基，NO2，CN，Cl，Br，F(xiàn)，CF3，NOH-CO-苯基，CO-NOH-苯基，COR12，OR7，NR8R9，COOR10，或NOH-CO-R11，其中R7，R8和R9是C1-3-烷基或?；?，R10，R11和R12是C1-3-烷基；更優(yōu)選地，B的R2，R3，R4，R5和R6是H，OH，NH2，COOH，SO3H，CH3，?；?，NO2，CN，Cl，Br，F(xiàn)，CF3，CO-NOH-苯基，COCH3，OR7，NR8R9，或COOCH3，其中R7，R8和R9是CH3或COCH3；更優(yōu)選地，B的R2，R3，R4，R5和R6是H，OH，COOH，SO3H，CH3，?；?，NO2，CN，Cl，Br，F(xiàn)，CO-NOH-苯基，OCH3，COCH3，或COOCH3；特別地，B的R2，R3，R4，R5和R6是H，OH，COOH，SO3H，CH3，NO2，CN，Cl，Br，CO-NOH-苯基或OCH3。
B優(yōu)選地是H或C1-3-烷基，所述烷基可以含有羥基、酯基或醚基；優(yōu)選地，所述烷基可以含有酯基或醚基；更優(yōu)選地，所述所述烷基可以含有醚基。
在一個(gè)實(shí)施方案中，A和B彼此獨(dú)立為 或者B是H或C1-3-烷基，所述烷基可以含有羥基、酯基或醚基(例如，其中醚氧直接與A-N(OH)C＝O-連接，因此包括N-羥基氨基甲酸酯衍生物)，R2，R3，R4，R5和R6彼此獨(dú)立，為H，OH，NH2，COOH，SO3H，C1-3-烷基，?；琋O2，CN，Cl，Br，F(xiàn)，CF3，NOH-CO-苯基，CO-NOH-苯基，COR12，OR7，NR8R9，COOR10或NOH-CO-R11，其中R7，R8和R9是C1-3-烷基或酰基，且R10，R11和R12是C1-3-烷基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，A和B彼此獨(dú)立為
或者B是H或C1-3-烷基，所述烷基可以含有羥基或醚基(例如，其中醚氧直接與A-N(OH)C＝O-連接，因此包括N-羥基氨基甲酸酯衍生物)，R2，R3，R4，R5和R6彼此獨(dú)立，為H，OH，NH2，COOH，SO3H，CH3，?；?，NO2，CN，Cl，Br，F(xiàn)，CF3，CO-NOH-苯基，COCH3，OR7，NR8R9或COOCH3，其中R7，R8和R9是CH3或COCH3。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，A和B彼此獨(dú)立為 或者B是H或C1-3-烷基，所述烷基可以含有羥基或醚基(例如，其中醚氧直接與A-N(OH)C＝O-連接，因此包括N-羥基氨基甲酸酯衍生物)，R2，R3，R4，R5和R6彼此獨(dú)立，為H，OH，COOH，SO3H，CH3，?；琋O2，CN，Cl，Br，F(xiàn)，CO-NOH-苯基，OCH3，COCH3，或COOCH3。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，A和B彼此獨(dú)立為 或者B是C1-3-烷基，所述烷基可以含有醚基(例如，其中醚氧直接與A-N(OH)C＝O-連接，因此包括N-羥基氨基甲酸酯衍生物)，R2，R3，R4，R5和R6彼此獨(dú)立為H，OH，COOH，SO3H，CH3，NO2，CN，Cl，Br，CO-NOH-苯基或OCH3。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“C1-n-烷基”，其中n可以是2-12，代表具有1到指定數(shù)目個(gè)碳原子的枝化或直鏈烷基。典型的C1-6-烷基包括，但不僅限于，甲基、乙基、正丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、己基、異己基等。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“?；笔侵赴ㄟ^(guò)羰基連接的C1-6-烷基的單價(jià)取代基；例如乙酰、丙酰、丁酰、異丁酰、新戊酰、戊酰等。
在一個(gè)實(shí)施方案中，A的取代基R2，R3，R4，R5和R6中至少一個(gè)是H，優(yōu)選地，A的取代基R2，R3，R4，R5和R6中至少兩個(gè)是H，更優(yōu)選地，A的取代基R2，R3，R4，R5和R6中至少三個(gè)是H，最優(yōu)選地，A的取代基R2，R3，R4，R5和R6中的至少四個(gè)是H，特別地，A的R2，R3，R4，R5和R6都是H。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，B的取代基R2，R3，R4，R5和R6中至少一個(gè)是H，優(yōu)選地，B的取代基R2，R3，R4，R5和R6中至少兩個(gè)是H，更優(yōu)選地，B的取代基R2，R3，R4，R5和R6中至少三個(gè)是H，最優(yōu)選地，B的取代基R2，R3，R4，R5和R6中至少四個(gè)是H，特別地，B的取代基R2，R3，R4，R5和R6都是H。
在根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，增強(qiáng)劑從如下組中選擇4-硝基苯甲酸-N-羥基酰苯胺(4-nitrobenzoic acid-N-hydroxyanilide)；4-甲氧苯甲酸-N-羥基酰苯胺(4-methoxybenzoic acid-N-hydroxyanilide)；N，N′-二羥基-N，N′-二苯基對(duì)苯二甲酰胺(N，N′-dihydroxy-N，N′-diphenylterephthalamide)；癸酸-N-羥基酰苯胺(decanoic acid-N-hydroxyanilide)；N-羥基-4-氰乙酰苯胺(N-hydroxy-4-cyanoacetanilide)；N-羥基-4-乙酰乙酰苯胺(N-hydroxy-4-acetylacetanilide)；N-羥基-4-羥基乙酰苯胺(N-hydroxy-4-hydroxyacetanilide)；N-羥基-3-(N’-羥乙酰胺)乙酰苯胺(N-hydroxy-3-(N’-hydroxyacetamide)acetanilide)；4-氰基苯甲酸-N-羥基酰苯胺(4-cyanobenzoic acid-N-hydroxyanilide)；N-羥基-4-硝基乙酰苯胺(N-hydroxy-4-nitroacetanilide)；N-羥基乙酰苯胺(N-hydroxyacetanilide)；N-羥基-N-苯基-氨基甲酸異丙酯(N-hydroxy-N-phenyl-carbamic acidisopropyl ester)；N-羥基-N-苯基-氨基甲酸甲酯(N-hydroxy-N-phenyl-carbamic acidmethyl ester)；N-羥基-N-苯基-氨基甲酸苯基酯(N-hydroxy-N-phenyl-carbamic acidphenyl ester)；
N-羥基-N-苯基-氨基甲酸乙酯(N-hydroxy-N-phenyl-carbamic acid ethylester)；及N-羥基-N-(4-氰基苯基)-氨基甲酸甲酯(N-hydroxy-N-(4-cyanophenyl)-carbamic acid methyl ester)。
另一組優(yōu)選的增強(qiáng)劑是具有通式IV的酚化合物(丁香酸烷基酯(alkylsyringates)) 其中所述表達(dá)式中的字母A表示如下基團(tuán)，例如-D，-CH＝CH-D，-CH＝CH-CH＝CH-D，-CH＝N-D，-N＝N-D，或-N＝CH-D，其中D從如下組中選擇-CO-E，-SO2-E，-N-XY，和-N+-XYZ，其中E可以是-H，-OH，-R，或-OR，X、Y和Z可以相同或者不同，并且從-H和-R中選擇；R是C1-C16烷基，優(yōu)選C1-C8烷基，該烷基可以是飽和的或不飽和的，枝化或非枝化的，并且任選用羧基，磺基或氨基基團(tuán)取代；B和C可以相同或不同，并從CmH2m+1中選擇，其中m＝1，2，3，4或5。
在上面提到的通式IV中，A可以位于羥基的間位，而不是如圖所示的對(duì)位。
在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，增強(qiáng)劑從具有通式V的組中選擇 其中A是如下的基團(tuán)，例如-H，-OH，-CH3，-OCH3，-O(CH2)nCH3，其中n＝1，2，3，4，5，6，7或8。
另一組優(yōu)選的增強(qiáng)劑是具有通式VI的化合物 該通式中A代表單鍵或者下組中的一員(-CH2-)，(-CH＝CH-)，(-NR11-)，(-CH＝N-)，(-N＝N-)，(-CH＝N-N＝CH-)，或(＞C＝O)；并且在該通式中，取代基團(tuán)R1-R11可以相同或不同，并且獨(dú)立代表如下的任何基團(tuán)氫、鹵素、羥基、甲?；⒁阴；Ⅳ然捌漉ズ望}、氨基甲?；⒒腔捌漉ズ望}、氨磺?；⒓籽趸?、硝基、氨基、苯基、C1-8-烷基；所述氨基甲?；被酋；?、苯基和氨基還可以不被或被取代基R12取代一次或兩次；所述C1-8-烷基可以是飽和或不飽和的，枝化的或非枝化的，并還可以不被或被一個(gè)或更多的取代基R12取代；所述取代基R12代表任一如下基團(tuán)氫、鹵素、羥基、甲?；?、乙?；Ⅳ然捌漉ズ望}、氨基甲酰基、磺基及其酯和鹽、氨磺酰基、甲氧基、硝基、氨基、苯基或C1-8-烷基；其中氨基甲酰基、氨磺酰基和氨基還可以不被或被羥基或甲基取代一次或兩次；且該通式中R5和R6可以一起形成基團(tuán)-B-，其中B代表單鍵或者下組中的一員(-CH2-)，(-CH＝CH-)，(-CH＝N-)；或者B代表硫或氧。
在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，增強(qiáng)劑從具有通式VII的組中選擇 該通式中X代表單鍵、氧或硫；并且該通式中，取代基團(tuán)R1-R9可以相同或不同，并且獨(dú)立地代表任一如下的基團(tuán)氫、鹵素、羥基、甲酰基、乙酰基、羧基及其酯和鹽、氨基甲?；?、磺基及其酯和鹽、氨磺?；?、甲氧基、硝基、氨基、苯基或C1-8-烷基；所述氨基甲?；?、氨磺?；?、苯基和氨基還可以不被或被取代基團(tuán)R10取代一次或兩次；并且其中C1-8-烷基可以是飽和或不飽和的，枝化的或非枝化的，并還可以不被或被一個(gè)或更多取代基團(tuán)R10取代；其中取代基團(tuán)R10代表任何如下基團(tuán)氫、鹵素、羥基、甲?；?、乙酰基、羧基及其酯和鹽、氨基甲酰基、磺基及其酯和鹽、氨磺?；?、甲氧基、硝基、氨基、苯基或C1-8-烷基；其中氨基甲酰基、氨磺酰基和氨基還可以不被或被羥基或甲基取代一次或兩次。
填充物合適的填充物是水溶的和/或不溶的無(wú)機(jī)鹽，例如精細(xì)研磨的堿性硫酸鹽、堿性碳酸鹽和/或堿性氯化物、粘土、例如高嶺土(例如SPESWHITETM，English China Clay)、膨潤(rùn)土、滑石、沸石、白堊、碳酸鈣和/或硅酸鹽。
典型的填充物是硫酸二鈉和木素磺化鈣(calcium lignosulphonate)。其他的填充物是二氧化硅、石膏、高嶺土、滑石、硅酸鋁鎂和纖維素纖維。
纖維材料合適的纖維材料是純的或不純的纖維狀纖維素，例如鋸末(sawdust)、純纖維狀纖維素(pure fibrous cellulose)、棉花(cotton)和其他形式的純或不純纖維狀纖維素。此外，可以使用基于纖維狀纖維素的填充物輔料。市場(chǎng)上可以獲得多種品牌的纖維狀纖維素，例如CepoTM和ArbocellTM。優(yōu)選的纖維狀纖維素是ArbocelTMBFC200。同樣可以如EP 304331 B1所述地使用合成纖維，并且典型的纖維可以用聚乙烯、聚丙烯、聚酯，特別是尼龍、聚甲酸乙烯酯(polyvinylformat)、聚(甲基)丙烯酸化合物制成。
酶穩(wěn)定劑或酶保護(hù)劑酶穩(wěn)定劑或保護(hù)劑可以屬于多種類別堿性或中性材料、還原劑、抗氧化劑和/或第一過(guò)渡系金屬離子的鹽。這些中的每一種均可與相同或不同類別的其它保護(hù)劑聯(lián)用。堿性保護(hù)劑的實(shí)例有堿金屬硅酸鹽、碳酸鹽或碳酸氫鹽，其可通過(guò)主動(dòng)地中和例如氧化劑提供化學(xué)清除(chemical scavenging)作用。還原性保護(hù)劑的實(shí)例有亞硫酸鹽(sulfite)、硫代亞硫酸鹽(thiosulfite)或硫代硫酸鹽(thiosulfate)，而抗氧化劑的實(shí)例有甲硫氨酸、丁羥甲苯(BHT)或丁羥茴醚(BHA)。最優(yōu)選的劑有硫代硫酸鹽，例如硫代硫酸鈉。此外，酶穩(wěn)定劑可以是硼酸鹽、硼砂、甲酸鹽(formates)、二羧酸和三羧酸和所謂的可逆酶抑制劑(reversible enzyme inhibitors)，例如具有巰基的有機(jī)化合物或烷基化或芳基化硼酸。
交聯(lián)劑交聯(lián)劑例如酶相容性表面活性劑，如乙氧基化醇(ethoxylated alcohols)，特別是具有10-80個(gè)乙氧基的乙氧基化醇。
助溶劑當(dāng)被包覆的微粒是清潔劑制劑的組分時(shí)，顆粒的溶解性特別關(guān)鍵。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，通過(guò)多種方法，許多劑可提高制劑的溶解度，本領(lǐng)域已知的典型的劑可在國(guó)家藥典(National Pharmacopeia’s)中查到。
輕質(zhì)球輕質(zhì)球(light spheres)是具有低真密度的小微粒。通常，它們是中空(hallow)的球狀微粒，其中含有空氣或氣體。這類材料一般通過(guò)使固體材料膨脹來(lái)制備。這些輕質(zhì)球可以是無(wú)機(jī)性質(zhì)或者是有機(jī)性質(zhì)，例如可從PQ公司獲得的PM系列(塑性中空球)。輕質(zhì)球還能夠由諸如淀粉或其衍生物等多糖制備?？蓮腉ranTek Inc.獲得的Biodac是由纖維素(造紙業(yè)的廢物)制成的非中空輕質(zhì)材料的實(shí)例。這些材料可以包含在本發(fā)明的顆粒內(nèi)，或者單獨(dú)地，或者作為不同輕質(zhì)材料的混合物。
懸浮劑顆粒中可以摻入懸浮劑、調(diào)理劑(mediators)(用于在例如清洗應(yīng)用中當(dāng)微粒溶解時(shí)提高漂白作用)和/或溶劑。
粘度調(diào)節(jié)劑(viscosity regulating agents)顆粒中可以存在粘度調(diào)節(jié)劑。
增塑劑(plasticizers)可用于本發(fā)明中的顆粒中的增塑劑包括，例如多元醇(polyols)，如糖(sugars)、糖醇、甘油、甘油三甲醇丙烷(glycerol trimethylol propane)、新戊二醇、三乙醇胺、單、二和三甘醇或分子量小于1000的聚乙二醇(PEG)；尿素、鄰苯二甲酸酯，如鄰苯二甲酸二丁酯或鄰苯二甲酸二甲酯；硫氰酸酯(或鹽)(thiocyanates)、非離子表面活性劑，如乙氧基化醇和乙氧基化磷酸酯(或鹽)(ethoxylated phosphates)；和水。
色素(pigments)合適的色素包括，但不限于，細(xì)碎的增白劑，如二氧化鈦或高嶺土、彩色色素(colored pigments)、水溶著色劑(colorants)、以及一種或多種色素和水溶著色劑的組合。
鹽鹽可以是無(wú)機(jī)鹽，例如硫酸鹽、亞硫酸鹽、磷酸鹽、膦酸鹽、硝酸鹽、氯化物、碳酸鹽或簡(jiǎn)單有機(jī)酸(小于10個(gè)碳原子，例如6個(gè)或更少碳原子)的鹽，例如檸檬酸鹽、丙二酸鹽或醋酸鹽。這些鹽中的陽(yáng)離子實(shí)例有堿金屬或堿土金屬離子，盡管銨離子或第一過(guò)渡系金屬離子也可以，例如鈉、鉀、鎂、鈣、鋅或鋁。陰離子的實(shí)例包括氯、溴、碘、硫酸根、亞硫酸根、亞硫酸氫根、硫代硫酸根、磷酸根、磷酸二氫根、磷酸氫根、次磷酸根、焦磷酸二氫根(dihydrogen pyrophosphate)、四硼酸根、硼酸根、碳酸根、碳酸氫根、正硅酸根、檸檬酸根、蘋果酸根、馬來(lái)酸根、丙二酸根、琥珀酸根、乳酸根、甲酸根、醋酸根、丁酸根、丙酸根、苯甲酸根、酒石酸根、抗壞血酸根或葡萄糖酸根。特別地，可以使用堿金屬或堿土金屬的硫酸鹽、亞硫酸鹽、磷酸鹽、膦酸鹽、硝酸鹽、氯化物或碳酸鹽，或者簡(jiǎn)單有機(jī)酸例如檸檬酸、丙二酸或醋酸的鹽。具體的實(shí)例包括NaH2PO4，Na2HPO4，Na3PO4，(NH4)H2PO4，K2HPO4，KH2PO4，Na2SO4，K2SO4，KHSO4，ZnSO4，MgSO4，CuSO4，Mg(NO3)2，(NH4)2SO4、硼酸鈉、醋酸鎂和檸檬酸鈉。
所述鹽還可以是水合鹽，也就是，帶有結(jié)晶化結(jié)合水的晶體鹽水合物，例如WO 99/32595描述的。水合鹽的實(shí)例包括七水硫酸鎂(MgSO4(7H2O))、七水硫酸鋅(ZnSO4(7H2O))、五水硫酸銅(CuSO4(5H2O))、七水磷酸氫二鈉(Na2HPO4(7H2O))、六水硝酸鎂(Mg(NO3)2(6H2O))、十水硼酸鈉、二水檸檬酸鈉和四水醋酸鎂。
潤(rùn)滑劑(lubricant)在本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“潤(rùn)滑劑”是指任何可減小表面摩擦、潤(rùn)滑顆粒表面、降低靜電積累趨勢(shì)和/或降低顆粒脆性的劑。潤(rùn)滑劑還可發(fā)揮相關(guān)作用通過(guò)減少包覆層中粘合劑的黏性(tackiness)改善包覆過(guò)程。因此，潤(rùn)滑劑可用作抗結(jié)塊劑(anti-agglomeration agents)和潤(rùn)濕劑(wetting agents)。合適潤(rùn)滑劑的實(shí)例有低級(jí)聚乙二醇(PEGs)、乙氧基化脂肪醇和礦物油、植物油和動(dòng)物油。潤(rùn)滑劑尤其是礦物油或非離子表面活性劑，更具體地，潤(rùn)滑劑不可與其他包覆材料溶混。
鹽包覆層(salt coating)酶顆粒對(duì)高相對(duì)濕度非常敏感，因此顆粒需要更加改進(jìn)的手段以獲得這種條件下可接受的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。我們發(fā)現(xiàn)，通過(guò)用鹽包覆層包覆顆粒，可以進(jìn)一步提高酶的穩(wěn)定性，尤其是高濕度下的穩(wěn)定性。特別地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，WO 00/01793中說(shuō)明的鹽包覆層適于用作本發(fā)明的包覆層。
本發(fā)明合適的鹽在上文其它制粒材料一節(jié)中有說(shuō)明。
本發(fā)明特別合適的鹽是Na2HPO4(CH20℃＝95％)，Na3PO4(CH25℃＝92％)，(NH4)H2PO4(CH20℃＝93.1％)，KH2PO4(CH20℃＝92％)，Na2SO4(CH20℃＝93％)，K2SO4(CH25℃＝99％)，KHSO4(CH20℃＝86％)，ZnSO4(CH20℃＝90％)和檸檬酸鈉(CH25℃＝86％)。在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述鹽選自Na2HPO4、Na3PO4、(NH4)H2PO4、KH2PO4、Na2SO4、K2SO4、KHSO4、ZnSO4和檸檬酸鈉。
包覆層包括至少60％w/w，例如65％w/w或70％w/w的鹽，其優(yōu)選地可以是至少75％w/w，例如至少80％w/w，至少85％w/w，例如至少90％w/w或至少95％w/w。
在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，鹽包覆層包含超過(guò)50％的鹽，例如超過(guò)70％的鹽，例如超過(guò)90％，例如100％的鹽。
在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，鹽包覆層的施加量超過(guò)酶核心的50％w/w，例如超過(guò)酶核心的100％w/w，甚至例如超過(guò)酶核心的200％w/w。
附加包覆層本發(fā)明的顆?？梢园粋€(gè)、兩個(gè)或多個(gè)附加包覆層。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，顆粒包含至少兩個(gè)包覆層。
附加包覆層可以施加到顆粒上，提供附加的特性或性質(zhì)。因此，例如，附加包覆層可以實(shí)現(xiàn)一種或多種如下效果(i)減少顆粒的粉塵(dust)形成趨勢(shì)；(ii)保護(hù)顆粒中的活性化合物對(duì)抗環(huán)境中的敵對(duì)化合物；(iii)在將顆粒引入到液體介質(zhì)(例如酸介質(zhì))中時(shí)以期望的速度溶解；(iv)為顆粒提供更好的物理強(qiáng)度。
任何具有期望性質(zhì)的附加常規(guī)包覆層均可施加，常規(guī)包覆層材料和包覆方法在例如下列文獻(xiàn)中有說(shuō)明US 4,106,991，EP 170360，EP 304332，EP304331，EP 458849，EP 458845，WO 97/39116，WO 92/12645，WO 89/08695，WO 89/08694，WO 87/07292，WO 91/06638，WO 92/13030，WO 93/07260，WO93/07263，WO 96/38527，WO 96/16151，WO 97/23606，US 5,324,649，US4,689,297，EP 206417，EP 193829，DE 4344215，DE 4322229 A，DD 263790，JP61162185 A，JP 58179492或PCT/DK/01/00628。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，附加包覆層是根據(jù)US 4,106,991或EP0,569,468的蠟包覆層，本文引用其內(nèi)容作為參考。對(duì)于合適的蠟，見上文的“蠟”一節(jié)。在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，附加包覆層可以包含PEG和/或棕櫚油。
附加包覆層材料包覆層可以包含附加包覆層材料，例如粘合劑、填充劑、纖維材料、酶穩(wěn)定劑、助溶劑、懸浮劑、粘度調(diào)節(jié)劑、輕質(zhì)球、增塑劑、鹽、潤(rùn)滑劑和芳香劑，如在上文“附加制粒材料”一節(jié)提到的。進(jìn)一步的包覆層成分可以是色素。
顆粒制備本發(fā)明也涉及本發(fā)明顆粒的制造。本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案是用于制備酶顆粒的方法，包括如下步驟a)制備pH大于7的含酶水性混合物；b)將步驟a)中的混合物添加到形成粒子的過(guò)程中，從而提供含酶的核心粒子；c)用至少一個(gè)包覆層包覆步驟b)的核心粒子。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中上述的步驟c)是在流化床裝置中進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，將步驟c)的含酶混合物施加到惰性核心微粒上。
本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案包括用于制備酶顆粒的方法，包括如下步驟a)制備含酶水成液，其中水成液的pH大于7；
b)將步驟a)中的水成液添加到制粒設(shè)備；c)在制粒設(shè)備中制備粒子。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，將含酶混合物的pH調(diào)節(jié)到大于8。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，將含酶混合物的pH調(diào)節(jié)到9-11。
在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，制備含酶水成液，并添加到制粒設(shè)備中，然后在制粒設(shè)備中將水成液的pH調(diào)節(jié)到大于7。
在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，用包覆層包覆在制粒設(shè)備中制備的含酶粒子。
在具體的實(shí)施方案中，包覆層是鹽包覆層。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，鹽包覆層中的鹽在20℃下具有大于60％的恒定濕度。進(jìn)一步，鹽包覆層中鹽從如下組中選擇NaH2PO4，Na2HPO4，Na3PO4，(NH4)H2PO4，K2HPO4，KH2PO4，Na2SO4，K2SO4，KHSO4，ZnSO4，MgSO4，CuSO4，Mg(NO3)2，(NH4)2SO4，NaCl，硼酸鈉、醋酸鎂和檸檬酸鈉。
在具體的實(shí)施方案中，酶從如下組中選擇氧化還原酶、糖酶(cabohydrase)和水解酶。進(jìn)一步地，氧化還原酶是漆酶。更進(jìn)一步地，漆酶得自于如下組鬼傘屬，毀絲霉屬，多孔菌屬，柱頂孢屬和絲核菌屬。
在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，酶顆粒的制備在制粒設(shè)備中發(fā)生。制粒設(shè)備是其中可以形成任何含酶粒子的設(shè)備。
在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，制粒設(shè)備從如下組中選擇流化床設(shè)備(fluid bed apparatuses)、噴霧干燥設(shè)備(spray-dring apparatuses)、流化床噴霧干燥設(shè)備(fluid bed spray-dring apparatuses)、擠出設(shè)備(extruder)、碾壓機(jī)(roller compactors)和混合設(shè)備(mixer apparatus)。
酶顆?？梢园诵暮桶矊?，其中核心包含酶基質(zhì)。在具體的實(shí)施方案中，核心粒子通過(guò)將含酶混合物施加到惰性核心粒子上制備。
用于制備核心和包覆層的方法可在Handbook of Powder Technology；Particle size enlargement by C.E.Capes；volume 1，1980 Elsevier中查到；制備方法包括已知的進(jìn)料和顆粒形成技術(shù)，即a)噴霧干燥產(chǎn)品，其中液態(tài)含酶溶液在噴霧干燥塔中霧化形成小液滴，它們?cè)诟稍锼邢陆档耐局懈稍镄纬珊肝⒘?particulate)材料。通過(guò)這種方法可以產(chǎn)生極小的粒子(Michael S.Showell(editor)；Powdered detergents；Surfactant Science Series；1998；vol.71；page 140-142；Marcel Dekker)。
b)分層產(chǎn)品(layered products)，其中含酶混合物圍繞預(yù)成型的無(wú)活性核心粒子包覆成層，其中含酶混合物被霧化，通常在含有流態(tài)化的預(yù)成型核心粒子的流化床裝置內(nèi)被霧化，并且含酶混合物附著到核心粒子上并干燥，在核心粒子的表面上形成一層干燥的酶層。如果可以發(fā)現(xiàn)具有期望尺寸的有用核心粒子，則通過(guò)這種方式能夠獲得具有期望尺寸的粒子。這類產(chǎn)品在例如中WO 97/23606有說(shuō)明。
c)吸收的核心顆粒，其中含酶混合物不是圍繞核心包覆成層，而是吸收到核心的表面上和/或里面。這種過(guò)程在WO 97/39116有說(shuō)明。
d)擠出或?；?pelletize)產(chǎn)品，其中含酶糊料(paste)被擠壓成團(tuán)粒(pellets)，或者在壓力下通過(guò)一個(gè)小開口被擠出并切割成粒子，隨后干燥。這種粒子通常具有相當(dāng)大的尺寸，因?yàn)殚_有擠出口的材料(通常是具有鉆孔的平板)限制了通過(guò)擠出開口可允許的壓力降。此外，當(dāng)使用小開口時(shí)，非常高的擠出壓力會(huì)增加活性化合物糊料的產(chǎn)熱，這對(duì)于活性化合物是有害的(Michael S.Showell(editor)；Powdered detergents；Surfactant ScienceSeries；1998；vol.71；page 140-142；Marcel Dekker)。
e)噴射造粒產(chǎn)品(Prilled products)，其中酶粉懸浮在熔融的蠟中，然后將懸浮物噴射到冷卻室內(nèi)，例如通過(guò)旋轉(zhuǎn)盤噴霧器(rotating disk atomizer)，液滴在冷卻室中迅速凝固(Michael S.Showell(編輯)；Powdered detergents；Surfactant Science Series；1998；vol.71；page 140-142；Marcel Dekker)。在所獲得的產(chǎn)品中，活性化合物均勻地遍布惰性材料，而不是集中分布在其表面。此外，US 4,016,040和US 4,713,245是與之有關(guān)的文獻(xiàn)。
f)混合器制粒產(chǎn)品，其中將酶液添加到由常規(guī)制粒組分構(gòu)成的干粉組合物中。液體和粉以合適的比例混合，隨著液體的水分被干粉吸收，干粉的組分開始粘著和結(jié)塊，生成粒子，并形成包含活性化合物的顆粒(granulates)。這種過(guò)程在US 4,106,991(NOVO NORDISK)和相關(guān)文獻(xiàn)EP 170360 B1(NOVO NORDISK)，EP 304332 B1(NOVO NORDISK)，EP304331(NOVO NORDISK)，WO 90/09440(NOVO NORDISK)和WO90/09428(NOVO NORDISK)中有說(shuō)明。在本過(guò)程的具體產(chǎn)品中，可以使用多種高剪切混合器作為制粒機(jī)，將由作為活性化合物的酶、填充物和粘合劑等組成的顆粒與纖維素纖維混合，以強(qiáng)化粒子，得到所謂的T顆粒(T-granulate)。經(jīng)過(guò)強(qiáng)化的粒子更加結(jié)實(shí)(robust)，釋放的酶粉塵更少。
g)尺寸減小，其中通過(guò)粉碎(milling)或壓碎(crushing)含有活性材料的較大粒子、團(tuán)粒、片、壓塊(briquette)等形成核心。將粉碎或壓碎的產(chǎn)品過(guò)篩，獲得期望的核心粒子部分。過(guò)大或過(guò)小的顆粒可以重新進(jìn)行循環(huán)。尺寸減小在(Martin Rhodes(編輯)；Principles of Powder Technology；1990；Chapter 10；John Wiley & Sons)中有說(shuō)明。
h)流化床制粒。流化床制粒涉及將微粒懸浮在空氣流內(nèi)，并通過(guò)噴嘴將酶液噴射到流態(tài)化粒子上。被噴霧液滴擊中的粒子被潤(rùn)濕并變成黏性。黏性的粒子與其它粒子碰撞，并與之粘著形成顆粒。
i)可以對(duì)核心進(jìn)行干燥，例如在流化床干燥器內(nèi)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以使用在酶工業(yè)中用于干燥顆粒的其它已知方法。干燥優(yōu)選地在25-90℃的產(chǎn)品溫度條件下發(fā)生。對(duì)于某些酶，含酶核心在用鹽包覆之前具有低的含水量是重要的。如果在除去多余的水之前，用鹽包覆對(duì)水敏感的活性化合物，則該鹽將被捕捉到核心內(nèi)部，對(duì)酶的活性產(chǎn)生負(fù)面影響。干燥之后，核心優(yōu)選地含有0.1-10％w/w的水。
鹽包覆層的制備可以通過(guò)在流化床內(nèi)噴霧到核心顆粒上而將鹽包覆層施加到含酶核心顆粒上，還可以在真空混合器(vacuum mixer)、糖衣(drageé)型包覆機(jī)(盤-筒包覆機(jī)(pan-drum coaters))、用于包覆種子的設(shè)備、包含旋轉(zhuǎn)底部的設(shè)備(eks.Roto Glatt，CF制粒機(jī)(Freund)，TORBED處理器(Gauda))中，或者例如Omnitex(Nara)等旋轉(zhuǎn)流化床處理器中施加鹽包覆層。
在施加了鹽層之后，可以任選地對(duì)顆粒進(jìn)行干燥。包覆了鹽的顆粒的干燥可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得的任何干燥方法實(shí)現(xiàn)，例如噴霧干燥、冷凍干燥、真空干燥、流化床干燥、盤筒包覆(pan drum coating)和微波干燥。包覆有鹽的顆粒的干燥還可以和包含使用流化床、流化床噴霧干燥器(FSD)或多級(jí)干燥器(MSD)的制粒方法組合。
附加包覆層的制備可以適當(dāng)?shù)夭捎帽绢I(lǐng)域已知的常規(guī)的包覆層和用于施加包覆層的方法，例如在丹麥專利申請(qǐng)2002 00473，WO 89/08694，WO 89/08695，270 608 B1和/或WO 00/01793中說(shuō)明的。常規(guī)包覆層材料的其他實(shí)例可以在如下文獻(xiàn)中查到US 4,106,991，EP 170360，EP 304332，EP 304331，EP 458849，EP 458845，WO 97/39116，WO 92/12645A，WO 89/08695，WO 89/08694，WO 87/07292，WO 91/06638，WO 92/13030，WO 93/07260，WO 93/07263，WO 96/38527，WO96/16151，WO 97/23606，WO 01/25412，WO 02/20746，WO 02/28369，US5879920，US 5,324,649，US 4,689,297，US 6,348,442，EP 206417，EP 193829，DE4344215，DE 4322229 A，DE 263790，JP 61162185 A和/或JP 58179492。
包覆層的制備可以使用與上文所述相同的方法。
所得的顆?？梢栽诶鏜arumeriserTM中進(jìn)行圓整(rounding off)(例如圓球化)(spheronisation)，或者壓實(shí)(compaction)。
包含本發(fā)明顆粒的組合物本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明顆粒的組合物。該組合物可以是任何組合物，但尤其合適的組合物是個(gè)人護(hù)理品(personal care)組合物、清潔組合物、紡織品處理組合物如漂白劑(bleaching)、藥物組合物、皮革處理組合物、紙漿或紙張?zhí)幚斫M合物、食品和飲料組合物和動(dòng)物飼料組合物。
清潔組合物包括去污劑和抗微生物組合物。紡織品處理組合物包括用于諸如粗斜紋棉布(denim)等紡織品的酶促漂白和/或石磨洗滌(stonewashing)的組合物。食品和飲料組合物包括在酒、油脂(oils and fats)、柑橘和果汁產(chǎn)品、淀粉和糖產(chǎn)品、酒精(alcohols)和/或釀造產(chǎn)品、大豆產(chǎn)品和焙烤面粉或生面團(tuán)的生產(chǎn)工業(yè)中使用的酶組合物。本發(fā)明特別適用于包含在如下物品中貓砂(cat litter)組合物、尿布、漱口劑組合物、口香糖和咀嚼薄荷糖(chewing mint)，用于去除氣味。本發(fā)明特別適用于除去由口臭導(dǎo)致的氣味。
本發(fā)明還涵蓋使用本發(fā)明的顆粒用于氣味清除、紡織品處理、皮革處理、紙漿處理、紙張?zhí)幚怼⑹称?、飲料、硬表面和人或?dòng)物機(jī)體的用途。顆粒還可以用于治療人或動(dòng)物機(jī)體的藥物。在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆?；蚪M合物用于除去來(lái)自液體肥料的氣味。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于除去氣味的方法，包括用包含本發(fā)明顆粒的組合物刷牙。還涉及用于除去氣味的方法，包括將包含本發(fā)明顆粒的組合物添加到貓盤(cat tray)中。還進(jìn)一步涉及用于除去氣味的方法，包括給人換用包含本發(fā)明顆粒的尿布。在具體的實(shí)施方案中，還涉及用于除去口腔氣味的方法，包括將薄荷糖、口香糖或漱口劑放到口腔里。
實(shí)施例實(shí)施例1用如下的方法制造毀絲霉漆酶顆粒。用Hüttlin HKC-5-TJ型流化床(fluidbed)將含有20％干物質(zhì)、pH5.5、活性為5275 LAMU/g的0.525kg濃縮液噴射到3.5kg氯化鈉核心上(平均尺寸315μm，跨距(span)0.94)，以使酶在核心上成層并干燥。Hüttlin床的參數(shù)為空氣入口溫度70℃產(chǎn)品溫度56℃空氣體積450m3/h霧化空氣1.5bar微氣候空氣(microclima air)0.65bar得到活性為777LAMU/g的顆粒。不另外進(jìn)行包覆，測(cè)試顆粒自身的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，條件為在密封罐內(nèi)25℃儲(chǔ)存26周；40℃儲(chǔ)存13周；及在暴露于40℃和60％相對(duì)濕度的敞開罐內(nèi)儲(chǔ)存4周。儲(chǔ)存測(cè)試的結(jié)果如表1所示。
表1

實(shí)施例2如實(shí)施例1所述地制備一系列顆粒，只是在噴霧之前，用1N NaOH將濃縮液的pH調(diào)節(jié)成7-10。如實(shí)施例1所述地檢測(cè)顆粒的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，表2A-B列出了實(shí)施例2的密封罐結(jié)果，顯示將濃縮液pH調(diào)高到10可以顯著提高密封罐內(nèi)的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。在40℃/60％RH的潮濕條件下，所有的殘余活性均低于1％，表明還需要濕氣屏障。
表2A

表2B

實(shí)施例3如實(shí)施例1所述地制備一系列顆粒，只是在噴霧之前將濃縮液的pH調(diào)節(jié)到pH10，pH10.5和pH11，并用GEA精密包覆機(jī)(GEA Precision Coater)流化床施加酶和最終的鹽層。對(duì)由pH10.5濃縮液制成的顆粒進(jìn)一步施加50％(以裝載了酶的核心的％計(jì)算)的氯化鈉包覆層。該包覆層是從所述鹽的24％的水基溶液施加的。如實(shí)施例1所述地檢測(cè)顆粒的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，表3A-C列出了實(shí)施例3的密封罐結(jié)果，顯示在更高的pH和補(bǔ)充鹽包覆層的條件下，溫度和濕度穩(wěn)定性均得到提高。
表3A


表3B

表3C

實(shí)施例4如實(shí)施例1所述地制備一系列裝載有漆酶的核心，其中在噴霧之前將濃縮液調(diào)節(jié)到pH10.5；并進(jìn)一步如實(shí)施例3所述地包覆鹽，不同之處在于核心是硫酸鈉，包覆層也是硫酸鈉。包覆層的施加量為裝載酶的核心的50％，100％和200％。水基包覆層溶液對(duì)硫酸鈉為26％，對(duì)糊精Avedex W80為1.3％。包覆層溶液的溫度保持為40-45℃，以避免形成芒硝。這一系列的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)如表4A-C所示。
表4A


表4B

表4C

實(shí)施例5漆酶顆粒的制備如下所述。
在50升Ldige混合器內(nèi)，將3.5kg活性為5630LAMU/g，pH為5.5的液體漆酶濃縮液噴霧并吸收到15kg的木薯(Cassava)核心(粒度為600-700μm)上，如(Cassava patent)(木薯專利)所述。吸收后，在常規(guī)流化床內(nèi)對(duì)裝載有酶的濕顆粒進(jìn)行干燥。
隨后在5升Ldige混合器內(nèi)，以如US 4,106,991所述的方式，用a)80gPEG 4000和b)240g高嶺土包覆2kg裝載有酶的干燥顆粒。
測(cè)試包覆顆粒本身的儲(chǔ)存穩(wěn)定性在密封罐內(nèi)25℃測(cè)試26周，40℃測(cè)試13周，在暴露于40℃和60％相對(duì)濕度的敞開罐內(nèi)測(cè)試4周。儲(chǔ)存測(cè)試結(jié)果如表5所示。
表5

實(shí)施例6如實(shí)施例5所述地制備一系列顆粒，只是在吸收前用1N NaOH將濃縮液的pH調(diào)節(jié)成7-10，在5升Ldige混合器中，用0.60kg經(jīng)過(guò)調(diào)節(jié)的漆酶濃縮液向2.0kg木薯核心噴霧。如實(shí)施例5所述地施加高嶺土/PEG4000包覆層。如實(shí)施例1所述地檢測(cè)顆粒的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，實(shí)施例6的密封罐結(jié)果如表VI A-B所示，顯示將濃縮液pH調(diào)節(jié)到10，儲(chǔ)存穩(wěn)定性獲得了顯著提高。在40℃/60％RH的潮濕條件下，所有的殘余活性均低于1％或稍高于1％，表明還需要濕氣屏障。
表6A

表6B


實(shí)施例7如實(shí)施例5所述地制備一系列漆酶顆粒，只是在吸收之前將濃縮液的pH調(diào)節(jié)成pH10，pH10.5和pH11。向由pH10.5的濃縮液制成的裝載酶的核心施加50％和100％的硫酸鈉包覆層(以裝載了酶核心的％計(jì)算)，取代所述的高嶺土/PEG包覆層。如實(shí)施例4所述地使用Hüttlin流化床從硫酸鈉溶液施加包覆層，參數(shù)為裝載酶的核心3kg，空氣入口溫度80℃，產(chǎn)品溫度50℃，空氣體積500m3/h。如實(shí)施例所述地檢測(cè)顆粒的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，實(shí)施例7的密封罐數(shù)據(jù)如表VII A-C所示，顯示在更高pH和具有補(bǔ)充鹽包覆層的情況下，溫度和濕度穩(wěn)定性均提高。
表7A

表7B

表7C

權(quán)利要求
1.用于制備酶顆粒的方法，包括如下步驟a)制備包含酶的水成液，其中水成液的pH大于7；b)將步驟a)的水成液添加到制粒設(shè)備；c)在制粒設(shè)備中制備粒子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，還包括用包覆層包覆粒子的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中pH大于8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中pH為9-12。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中包覆層包含鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中包覆層中的鹽在20℃的恒定濕度大于60％。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中包覆層中的鹽從下組選擇NaH2PO4，Na2HPO4，Na3PO4，(NH4)H2PO4，K2HPO4，KH2PO4，Na2SO4，K2SO4，KHSO4，ZnSO4，MgSO4，CuSO4，Mg(NO3)2，(NH4)2SO4，NaCl，硼酸鈉，醋酸鎂和檸檬酸鈉。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中酶從下組選擇氧化還原酶、糖酶和水解酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中氧化還原酶是漆酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中漆酶選自從鬼傘屬、毀絲霉屬、多孔菌屬、柱頂孢屬和絲核菌屬來(lái)源的組。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述水成液還包含增強(qiáng)劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述水成液是酶濃縮液。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，還包括將附加制粒材料添加到制粒設(shè)備的步驟。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在步驟b)中將所述水成液施加到惰性核心粒子上。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟a)中的制粒設(shè)備從下組中選擇流化床設(shè)備、噴霧干燥設(shè)備和混合制粒機(jī)。
16.通過(guò)權(quán)利要求1-15的方法可獲得的顆粒。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的顆粒，其中所述酶是漆酶，且其中所述顆粒還包含增強(qiáng)劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的顆粒，其中所述顆粒包含惰性核心粒子。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的顆粒，其中所述顆粒包含附加制粒材料。
20.一種組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求16-19中任一項(xiàng)的顆粒。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的組合物，其中所述組合物是口香糖。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的組合物，其中所述組合物是咀嚼薄荷糖。
23.根據(jù)權(quán)利要求20的組合物，其中所述組合物是漱口劑組合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求20的組合物，其中所述組合物是牙膏。
25.根據(jù)權(quán)利要求20的組合物，其中所述組合物是貓砂組合物。
26.根據(jù)權(quán)利要求20的組合物，其中所述組合物是尿布。
27.根據(jù)權(quán)利要求16的顆?；蚋鶕?jù)權(quán)利要求20的組合物用于清除氣味的用途。
28.根據(jù)權(quán)利要求16的顆粒或根據(jù)權(quán)利要求20的組合物用于清除來(lái)自液體肥料的氣味的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備酶顆粒的過(guò)程，包括向顆粒形成過(guò)程中添加水性含酶混合物，且其中所述混合物的pH大于7。
文檔編號(hào)C11D3/386GK101061220SQ200580039311
公開日2007年10月24日 申請(qǐng)日期2005年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月17日
發(fā)明者埃里克·K·馬庫(kù)森, 波爾·E·詹森 申請(qǐng)人:諾維信公司