冬蟲夏草在制備預(yù)防和/或治療黃熱病毒感染的藥物中的用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及冬蟲夏草的藥物用途，提供了一種冬蟲夏草在制備預(yù)防和/或治療黃熱病毒感染的藥物中的用途，所述藥物包括作為活性成分的冬蟲夏草和一種或多種可藥用輔料，所述冬蟲夏草選自天然冬蟲夏草、冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體、以及天然冬蟲夏草和冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體的提取物，所述提取物選自水提取物、醇提取物、酯提取物、醚提取物、氯仿提取物中的一種或幾種的組合。本發(fā)明通過對(duì)黃熱病毒的抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)了冬蟲夏草所具有的良好抑制作用，從而證實(shí)冬蟲夏草能夠用于預(yù)防和/或治療黃熱病毒感染，并具有效果顯著、副作用小、見效快等優(yōu)點(diǎn)。因此冬蟲夏草可被用于研制抗黃熱病毒引起的疾病的藥物，具有巨大的社會(huì)效益和研究?jī)r(jià)值。
【專利說明】
冬蟲夏草在制備預(yù)防和/或治療黃熱病毒感染的藥物中的 用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及冬蟲夏草的藥物用途，尤其涉及其在制備預(yù)防和/或治 療黃熱病毒感染的藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 熱病病毒(yellow fever virus，YFV)屬于黃熱病科黃熱病毒屬的病毒，為RNA病 毒，具有嗜內(nèi)臟性及嗜神經(jīng)性。黃熱病毒能夠引起黃熱病，該病為急性傳染病。黃熱病主要 經(jīng)蚊媒傳播，臨床特征主要為高熱、黃疸、蛋白尿和出血，病程大約兩周，病死率高達(dá)約so-so % 。 國(guó)際上 已將黃熱病定為檢疫傳染病 ，中 國(guó)也將其定為甲類傳染病 。該病主要在 中南美 洲和非洲的熱帶地區(qū)流行，亞洲的熱帶國(guó)家也有分布。黃熱病全年均可發(fā)生，3-4月份病例 較多。上世紀(jì)80年代以來，世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)告非洲、南美洲發(fā)生黃熱病的地區(qū)和病例 逐年上升。在1998年和1999年共有11個(gè)國(guó)家向WHO報(bào)告了黃熱病病例。在非洲，33個(gè)國(guó)家的 居民受到黃熱病的威脅。在美洲10個(gè)國(guó)家和1個(gè)加勒比島域，黃熱病呈地方性流行。2000年， 黃熱病再次在非洲暴發(fā)。該年12月，流行于幾內(nèi)亞的黃熱病造成近200人死亡。進(jìn)入21世紀(jì) 后，黃熱病疫情似乎又有再次盛行的跡象。2005至2007年，馬里、幾內(nèi)亞、布基納法索和科特 迪、塞內(nèi)加爾、蘇丹、多哥等地相繼報(bào)告黃熱病病例，引起世界衛(wèi)生組織高度重視。2007年5 月，世界衛(wèi)生組織近日決定向非洲12個(gè)國(guó)家提供5800萬(wàn)美元，用于這些國(guó)家的黃熱病疫苗 接種工作，以防止該疾病在非洲大規(guī)模傳播。
[0003] 迄今為止，中國(guó)尚無病例的報(bào)道，但是這并不能使我們放松對(duì)該病毒的警惕，因?yàn)?中國(guó)的氣候、地理環(huán)境復(fù)雜，蚊蟲種類繁多，具備傳播條件，同時(shí)隨著國(guó)際交流的日益頻繁， YFV傳入中國(guó)境內(nèi)的可能性非常大。因此，我們應(yīng)該高度重視對(duì)黃熱病毒的研究，加強(qiáng)對(duì)其 的科研力度，做好相關(guān)知識(shí)和藥物的儲(chǔ)備。
[0004] 冬蟲夏草是一種天然存在的稀有中藥材，富含了蟲草多糖、蟲草素、蟲草酸、蟲草 多肽、麥角留醇等多種單體活性成分。天然冬蟲夏草生長(zhǎng)條件苛刻，自然寄生率低，加上人 們的濫采，導(dǎo)致天然資源緊缺，價(jià)格昂貴。
[0005] 現(xiàn)代研究證明冬蟲夏草以其調(diào)節(jié)陰陽(yáng)、肺腎雙補(bǔ)之特性，補(bǔ)而不峻、溫而不火之優(yōu) 勢(shì)，廣泛應(yīng)用于免疫、心血管、呼吸、泌尿生殖、消化、神經(jīng)系統(tǒng)疾病，備受關(guān)注。但尚未有文 獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)過其具有預(yù)防和治療黃熱病毒感染的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種冬蟲夏草在制備預(yù)防和/或治療黃熱病毒感染的藥物 中的用途。該用途具有效果顯著、副作用小、見效快等優(yōu)點(diǎn)。
[0007] 進(jìn)一步地，所述藥物包括作為活性成分的冬蟲夏草和一種或多種可藥用輔料。
[0008] 進(jìn)一步地，所述冬蟲夏草選自天然冬蟲夏草、冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體、以及天然冬蟲 夏草和冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體的提取物。所述提取物選自水提取物、醇提取物、酯提取物、醚 提取物、氯仿提取物中的一種或幾種的組合，優(yōu)選天然冬蟲夏草和冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體的 水提取物。
[0009] 進(jìn)一步地，所述冬蟲草夏發(fā)酵菌絲體為冬蟲夏草菌（Cordyceps sinensis (Berkeley)Sacc)中蝙蝠蛾擬青霉、中華被毛孢(Hirsutela sinensis)、中華頭孢菌、蝙蝠 蛾被孢霉和/或中華束絲孢菌采用工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的冬蟲夏草菌絲體。
[00?0]進(jìn)一步地，所述發(fā)酵的培養(yǎng)基選自大米、小米、玉米、小麥、大麥、蕎麥、土豆汁、糊 精、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、麩皮、蠶蛹粉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉、氯化鎂、氯化 錳、氯化鉀、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳中的一種或幾種。
[0011] 進(jìn)一步地，所述可藥用輔料包括但不限于:填充劑如淀粉、蔗糖、糊精、乳糖、可壓 性淀粉、微晶纖維素、山梨醇等;粘合劑如纖維素衍生物（甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙纖 維素、羥丙甲纖維素、羧甲基纖維素鈉）、海藻酸鈉、明膠、聚乙烯吡咯烷酮等;濕潤(rùn)劑如水、 乙醇、甘油等;崩解劑如干淀粉、羧甲基淀粉鈉、羥丙甲纖維素、交聯(lián)聚維酮、泡騰崩解劑、瓊 月旨、碳酸鈣、碳酸氫鈉等;吸收促進(jìn)劑如季銨化合物;表面活性劑如十六烷醇;吸附載體如高 嶺土和皂粘土;潤(rùn)滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂和聚乙二醇等;注射溶劑如注射用水、 植物油、油酸乙酯、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、甘油、苯甲醇等；緩沖劑如醋酸-醋酸鈉、枸櫞 酸-枸櫞酸鈉、酒石酸-酒石酸鈉、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉-碳酸鈉等;抑菌劑如 苯甲醇、羥丙丁酯/甲酯、苯酚、三氯叔丁醇等；局麻劑利多卡因、苯甲醇、三氯叔丁醇等；等 滲調(diào)節(jié)劑如氯化鈉、葡萄糖、甘油等;抗氧劑如亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉等;助懸 劑如明膠、甲基纖維素、果膠等;保護(hù)劑乳糖、蔗糖、麥芽糖等;乳化劑如吐溫、司盤、泊洛沙 姆、十二烷基硫酸鈉、脂肪酸甘油酯;基質(zhì)如PEG6000、PEG4000、硬脂酸鈉、氫化植物油、蟲蠟 等。另外還包括色素、香味劑、甜味劑、助溶劑、吸收促進(jìn)劑等。
[0012] 進(jìn)一步地，所述藥物中冬蟲夏草的含量為0.1-99.9%重量百分比，優(yōu)選為1-95% 重量百分比、10-85 %重量百分比、15-70 %重量百分比、20-60 %重量百分比或25-50 %重量 百分比。
[0013] 進(jìn)一步地，所述藥物通過腸道或者非腸道途徑給藥。給藥制劑包括片劑、膠囊劑、 顆粒劑、注射劑、霜?jiǎng)?、軟膏劑、貼劑、噴霧劑、滴丸、混懸劑等。給藥途徑包括皮下、皮內(nèi)、動(dòng) 脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑液內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、病灶內(nèi)、顏內(nèi)注射或輸注，或者，□服、局 部、直腸、經(jīng)鼻、經(jīng)頰、陰道、舌下、皮內(nèi)、粘膜、氣管、尿道給藥，或者通過吸入氣霧或植入蓄 積或者針刺方式給藥。
[0014] 進(jìn)一步地，所述給藥制劑可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備，例如使冬蟲夏 草與一種或多種輔料混合，然后將其制成所需的劑型。
[0015] 本發(fā)明通過對(duì)黃熱病毒的抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)了冬蟲夏草所具有的良好抑制作用，從而 證實(shí)冬蟲夏草能夠用于預(yù)防和/或治療黃熱病毒感染，并具有效果顯著、副作用小、見效快 等優(yōu)點(diǎn)。因此冬蟲夏草可被用于研制抗黃熱病毒引起的疾病的藥物，具有巨大的社會(huì)效益 和研究?jī)r(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí) 施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。
[0017] 實(shí)施例1冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體的水提取物的制備
[0018] 冬蟲夏草菌(Cordyceps sinesis)中華被毛抱(Hirsutela sinensis)菌株經(jīng)液體 發(fā)酵培養(yǎng)所得菌絲體，用熱水浸提、離心過濾、再經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥得到冬蟲夏草發(fā)酵 菌絲體的水提取物。
[0019] 實(shí)施例2冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體的水提取物對(duì)Vero細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)
[0020] Vero細(xì)胞是熱病病毒的易感細(xì)胞，需首先檢測(cè)冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體的水提取物對(duì) Vero細(xì)胞的細(xì)胞毒性，為后續(xù)對(duì)熱病病毒的抑制實(shí)驗(yàn)提供數(shù)據(jù)參考。
[0021] 實(shí)驗(yàn)步驟如下：
[0022] 1:接種Vero細(xì)胞:用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每 孔5000-8000個(gè)細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種體積200yL;
[0023] 2:培養(yǎng)Vero細(xì)胞:在37°C，5% (v/v)CO2培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)48小時(shí)；
[0024] 3:加入冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體的水提取物:吸棄每個(gè)孔中的DMEM培養(yǎng)基，向各個(gè)孔 中加入200yL用含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度(0、6.25、12.5、25、50、 IOOmg · Γ1)的冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體的水提取物；
[0025] 4:呈色：培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加 MTT溶液10yL，在37°C，5% (v/v)C02培養(yǎng)條件下繼 續(xù)孵育4小時(shí)；吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150yL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩IOmin，直至 在普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Formazan全部溶解；
[0026] 5:測(cè)量:在490nm測(cè)定吸收值(見表1)。
[0027]表1不同濃度的冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體的水提取物對(duì)Vero細(xì)胞的毒性
[0029] 由此可見，即使冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體的水提取物在IOOmg · I/1的高劑量濃度條件 下，Vero細(xì)胞的存活率仍能達(dá)到92.22%，表明其細(xì)胞毒性很小。
[0030] 實(shí)施例3冬蟲夏草的高濃度水溶液對(duì)Vero細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)
[0031 ]按照實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)冬蟲夏草的高濃度水溶液對(duì)Vero細(xì)胞的細(xì)胞毒性。 [0032] 其中，步驟2向各個(gè)孔中加入200yL用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成 IOOmg · I/1的冬蟲夏草的高濃度水溶液(冬蟲夏草經(jīng)超微粉碎后制得冬蟲夏草極細(xì)粉后使 用）；對(duì)照孔中加200yL不含冬蟲夏草的10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(見表2)。
[0033]表2冬蟲夏草的高濃度水溶液對(duì)Vero細(xì)胞的毒性
[0035] 由此可見，即使冬蟲夏草水溶液在IOOmg · IZ1的高劑量濃度條件下，Vero細(xì)胞的存 活率仍能達(dá)到91.49%，表明其細(xì)胞毒性很小。
[0036] 實(shí)施例4冬蟲夏草對(duì)黃熱病毒的抑制實(shí)驗(yàn)
[0037] 以不同濃度的冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體的水提取物和不同濃度的冬蟲夏草水溶液分 別作用于已經(jīng)感染了黃熱病毒的Vero細(xì)胞，來獲得冬蟲夏草對(duì)病毒的抑制效率。所使用的 濃度均在使Vero細(xì)胞具有90%以上存活率的范圍內(nèi)，從而排除冬蟲夏草濃度過高而對(duì)實(shí)驗(yàn) 數(shù)據(jù)的影響。
[0038] 實(shí)驗(yàn)步驟如下：
[0039] 選擇Vero細(xì)胞為培養(yǎng)黃熱病毒的細(xì)胞，MOI為0.1。
[0040] 在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接入Vero細(xì)胞，20小時(shí)后細(xì)胞長(zhǎng)至單層(細(xì)胞覆蓋孔底的面 積約為90 % )。吸出培養(yǎng)基，接入病毒樣品200yL，37°C吸附2小時(shí)。吸附完成后，吸棄各孔中 的病毒液，用DMEM培養(yǎng)基洗去未吸附的病毒。加入用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀 釋的指定濃度(〇、6.25、12.5、25、50、10〇11^*1/1)的冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體的水提取物或冬蟲 夏草水溶液，于37°C、5% (VZV)CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，收集各個(gè)孔中的上清用于病毒 噬斑實(shí)驗(yàn)。
[0041] 病毒噬斑實(shí)驗(yàn):在24孔板中接入Vero細(xì)胞，20小時(shí)后細(xì)胞長(zhǎng)至單層(細(xì)胞覆蓋孔底 的面積約為90%)，吸棄各孔中的培養(yǎng)基，接入用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基10 X 系列稀釋的病毒樣品200μL，37°(：吸附2小時(shí)。吸附完成后棄去各孔的上清液，用10%(v/v) FBS的DMEM培養(yǎng)基洗去未吸附的病毒。加入新鮮的37°C預(yù)熱的半固定培養(yǎng)基(A成分:3% (v/ v)FBS，2XMEM培養(yǎng)基，青霉素和鏈霉素的終濃度分別為1001]/^、0.111^/1111^成分：1%(以 V)的瓊脂糖。A成分與B成分體積比為1:1)，于37°C、5% (v/v)C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。待 噬斑形成后用結(jié)晶紫染色(2% (w/v)結(jié)晶紫溶于10% (v/v)甲醛），2小時(shí)后用流水沖去結(jié)晶 紫和瓊脂糖，在顯微鏡下對(duì)每孔產(chǎn)生的細(xì)胞噬斑，根據(jù)噬斑數(shù)和稀釋倍數(shù)計(jì)算病毒的滴度 (PFU/ml，PFU:噬斑形成單位）JFU =病毒稀釋度XP/V，（P:空蝕斑數(shù)目；V:接種量）。結(jié)果見 表3 ο
[0042]表3不同濃度的冬蟲夏草對(duì)黃熱病毒滴度降低及抑制作用
[0044]由此可見，在IOOmg · I/1的濃度下，冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體的水提取物對(duì)黃熱病毒的 抑制率為86.34%，冬蟲夏草水溶液對(duì)黃熱病毒的抑制率為83.57 %。表明冬蟲夏草能夠有 效地抑制黃熱病毒的增殖，可進(jìn)一步開發(fā)為預(yù)防和/或治療黃熱病毒感染引起的疾病的藥 物，具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0045]實(shí)施例5冬蟲夏草片劑
[0046]稱取冬蟲夏草粉5g、淀粉60g、羥丙甲纖維素10g、泊洛沙姆8g，分別過100目篩，混 勻，加入0.5%PVP乙醇溶液制成軟材，用14目篩制粒后，置于60°C烘箱中干燥，用12目篩整 粒，加入硬脂酸鎂2g混勻后，壓片。
[0047]實(shí)施例6冬蟲夏草軟膠囊
[0048]將冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體干燥粉碎后，稱取5g與食用玉米油50g混合，充分?jǐn)噭蛑频?軟膠囊內(nèi)容物;稱取明膠、甘油和水各適量(質(zhì)量比為明膠:甘油:水=1: 〇. 5:1)制備囊材膠 液;采用旋轉(zhuǎn)模壓法，將內(nèi)容物和囊材膠液裝入自動(dòng)旋轉(zhuǎn)制囊機(jī)中，壓制得軟膠囊，適量液 狀石蠟作為潤(rùn)滑劑。
[0049] 實(shí)施例7冬蟲夏草混懸液
[0050] 取冬蟲夏草干燥細(xì)粉5g，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液作為溶劑配制成濃度為 20 %混懸液。
[0051 ]實(shí)施例8冬蟲夏草滴丸
[0052]稱取冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體干燥粉末40g，加入PEG4000 IKg作為基質(zhì)，適量液體石 蠟為冷卻劑；藥液溫度50 °C，滴速為每分鐘10滴，滴距4 . Ocm，冷卻柱長(zhǎng)25cm，滴口內(nèi)徑 2 · Ocm，冷卻劑溫度0°C (冰水?。?。
[0053]最后應(yīng)說明的是，以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可 以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 冬蟲夏草在制備預(yù)防和/或治療黃熱病毒感染的藥物中的用途。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物包括作為活性成分的冬蟲夏草和 一種或多種可藥用輔料。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述冬蟲夏草選自天然冬蟲夏草、冬蟲夏 草發(fā)酵菌絲體、以及天然冬蟲夏草和冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體的提取物。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述提取物選自水提取物、醇提取物、酯提 取物、醚提取物、氯仿提取物中的一種或幾種的組合。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述冬蟲草夏發(fā)酵菌絲體為冬蟲夏草菌 (Cordyceps sinensis(Berkeley)Sacc)中蝙蝠蛾擬青霉、中華被毛抱（Hirsutela s inens is)、中華頭孢菌、蝙蝠蛾被孢霉和/或中華束絲孢菌發(fā)酵生產(chǎn)的冬蟲夏草菌絲體。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述發(fā)酵的培養(yǎng)基選自大米、小米、玉米、 小麥、大麥、蕎麥、土豆汁、糊精、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、麩皮、蠶蛹粉、磷酸二氫鉀、磷酸氫 二鉀、氯化鈉、氯化鎂、氯化錳、氯化鉀、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳中的一種或幾種。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物的劑型選自由片劑、膠囊劑、顆粒 劑、注射劑、霜?jiǎng)?、軟膏劑、貼劑、噴霧劑、滴丸、混懸劑組成的組。
【文檔編號(hào)】A61P31/14GK106074627SQ201610519473
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月5日
【發(fā)明人】王玉花, 王輝, 韓貴香, 夏敏貞, 王麗, 羅成軍
【申請(qǐng)人】青海珠峰冬蟲夏草工程技術(shù)研究有限公司